專利名稱：帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和p10基因啟動子序列的快速供體質粒及構建方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和生物工程技術領域，具體涉及一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒，還涉及該質粒的構建方法。
背景技術：
桿狀病毒廣泛用于農林害蟲的生物防治。同時桿狀病毒-昆蟲(細胞)系統還是十分優良的真核表達系統，已用于外源基因、診斷試劑和疫苗等的研究和生產。和其它桿狀病毒一樣，中國棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(Helicoverpaarmigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovims，以下簡稱野生型病毒或HaSNPV)作為殺蟲劑由于存在殺蟲速度慢的缺點，致使其大面積控制棉鈴蟲危害的作用受到限制；而不斷提高病毒表達系統的表達量也一直是當今生物工程領域的研究熱點。對桿狀病毒分子生物學的研究，特別是對病毒基因的結構與功能的研究將有助于揭示病毒的復制和侵染規律，為重組病毒殺蟲劑和快速、高效表達載體的開發和應用奠定基礎。
自1983年Smith和Summers首次報道利用苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒在Sf9細胞中表達人-β干擾素基因，桿狀病毒表達載體因其能在昆蟲細胞和昆蟲幼蟲中高效表達外源基因，且在大多數請況下桿狀病毒表達系統具有加工和修飾表達產物的能力，如信號肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多數表達產物具有很高的生物活性等優點，使其成為十分重要的真核表達系統。目前應用桿狀病毒表達系統已表達了幾百種不同來源的外源基因。
傳統的重組桿狀病毒構建需要按以下兩步進行首先必須將外源基因克隆到轉移載體質粒的多克隆位點上，通常多克隆位點位于桿狀病毒的強啟動子控制下。將轉移載體同桿狀病毒DNA共轉染到昆蟲細胞內，經同源重組產生重組病毒，重組率通常在0.1-1％之間。其次需用空斑法鑒定和純化重組病毒。由于重組病毒的產生率低以及空斑純化法操作復雜、耗時，往往需數月甚至更長的時間構建一個完整的重組病毒。鑒于桿狀病毒表達系統存在上述兩個缺陷，Kuckow發明了一種快速、有效構建重組桿狀病毒的方法，即桿狀病毒穿梭表達載體系統，能在7天內完成重組病毒的構建和外源基因的高效表達。該系統由穿梭表達載體(Bacmid)和快速供體質粒(pFastBacTM)兩部分組成。穿梭表達載體(Bacmid)含有一個低拷貝數的細菌DNA復制子(mini-F replicon)、一個卡那霉素抗性基因和一個半乳糖苷酶基因(lacZα)的8.5kb的DNA片段，同時一個作為細菌轉位子插入位點(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，該片段的插入并不改變lacZα基因的閱讀框。該穿梭表達載體(Bacmid)既能在E.coli內復制又可在昆蟲細胞內復制形成完整的病毒粒子。快速供體質粒(pFastBacTM)則是由一個mini-Tn7轉位因子組成，在mini-Tn7左右臂之間插入一個慶大霉素抗性基因、一個桿狀病毒特異強啟動子、一個多克隆位點和猴多泡病毒40多聚A(SV40(A)poly)信號序列組成的表達框。在輔助質粒提供的轉位酶的作用下，克隆于快速供體質粒(pFastBacTM)多克隆位點的外源基因能轉位至穿梭表達載體(Bacmid)的mini-attTn7位點上，通過抗生素抗性篩選和藍白斑篩選鑒定重組穿梭表達載體(Bacmid)，隨后從E.coli內提取穿梭表達載體DNA轉染到昆蟲細胞內進行外源基因的表達。該方法具有重組率高、重組病毒篩選方便等優點。但該穿梭表達載體為一個缺失多角體基因的不完整病毒，因而僅能在細胞內產生病毒，不易判定細胞是否被重組病毒感染。另外，由于缺失多角體基因，重組病毒不能感染昆蟲，就是說不能在昆蟲體內表達外源基因。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒，將外源基因快速插入HZ8表達載體上，快速獲得重組病毒，并在細胞內表達外源基因，同時在P10強啟動子的調控下，高效表達外源基因，快速鑒定重組病毒。
本發明的另一個目的是提供該供體質粒的構建方法。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案構建了帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒pFastPhP10，CCTCC M201047。帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒(pFastPhP10)轉化到Eschrichia Coli DH5α株內，-80℃保藏。在帶有苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列的雙向供體質粒(pFastBacdual)的基礎上成功構建了帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒(pFastPhP10)，并將綠色熒光蛋白(eGFP)基因插入到P10啟動子控制下的多克隆位點，經在DH10B受體菌中轉位后，將插入有多角體基因和綠色熒光蛋白基因的重組穿梭表達載體(HZ8Ph+eGFP)DNA轉染到棉鈴蟲細胞內進行表達，至此已成功構建一套完善的棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達載體的表達系統。HZ8是利用同源重組的方法將一個含有低拷貝數的細菌DNA F復制因子(mini-F replicon)、一個卡那霉素抗性基因和一個lacZα基因、一個作為細菌轉位子插入位點(mini-attTn7)的短片段同時插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置換到病毒基因組的多角體基因位點上，因此，所構建的HZ8是缺少多角體基因的重組病毒，用這種重組病毒感染HzAm1細胞僅能產生細胞病變，但不能在細胞核內形成包涵體，在利用pFastPhP10供體質粒將外源基因轉位到HZ8的轉位子插入位點(mini-attTn7)后，其DNA轉染HzAm1細胞后，能形成具有感染性的重組病毒粒子，并能在多角體啟動子和P10啟動子控制下表達外源基因。與苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒穿梭表達系統(AcBacmid)不同的是所構建的供體質粒(pFastPhP10)既有P10啟動子控制下的多克隆位點又插入帶有多角體啟動子序列的完整的多角體基因。
其優點是當外源基因插入到P10控制下的多克隆位點后，經轉位將外源基因和多角體基因同時插入到棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達載體(HaBcmid)中的轉位子插入位點，轉染到棉鈴蟲細胞(HzAm1)后，能在光學顯微鏡下觀察細胞內是否形成包涵體，如細胞內形成包涵體，證明轉染獲得成功，隨后可收集重組病毒粒子再感染細胞，并可進行外源基因表達水平的檢測。因此多角體基因的表達和包涵體的形成可作為轉染成功的重要識別標記。另外，由于重新將多角體基因插入到病毒基因組，所產生的重組病毒是一個不缺失任何基因的重組病毒，因而該重組病毒不僅能在昆蟲細胞內也可在昆蟲幼蟲體內表達外源基因。另一個重要優點是便于插入對昆蟲有特異性毒殺作用的毒素基因，構建高效、快速的重組病毒殺蟲劑。
圖1為一種pFastPhP10供體質粒構建流程圖；圖2為一種pFastPhP10供體質粒的物理圖譜；圖3為一種pFastPhP10供體質粒的工作原理示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述根據圖1、圖2、圖3可知，利用一對特異棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(HaSNPV)的多角體基因的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴增出帶有啟動子序列的多角體基因。
引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG；利用一對特異棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(HaSNPV)的P10啟動子的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴增出HaP10啟動子序列。
引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG；將兩者分別克隆到pGEMT-ease載體上，得到pGEMTP10和pGEMTPh質粒；利用Pst I和Bgl II限制性內切酶切割pGEMTP10質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的pGEMTP10質粒；利用Pst I和BamH I限制性內切酶切割pGEMTPh質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的帶有啟動子的多角體基因；利用DNA連接酶將多角體基因連接到pGEMTP10質粒上，得到帶有多角體基因和P10啟動子的重組質粒，命名為pHZT PhP10質粒；用Nhe I和BamH I限制性內切酶切割pFastBacdual質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的大pFastBacdual質粒片段；用Spe I和BamH I限制性內切酶切割pHZTPhP10質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因和P10啟動子序列的片段；將含有多角體基因和P10啟動子序列的片段連接到第7步制備的大pFastBacdual質粒片段上，構建成供體重組質粒，命名為pFastPhP10質粒。
權利要求
1.一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒，pFastPhP10，CCTCC M201047，在帶有苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列的雙向供體質粒上用棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因和P10基因的啟動子序列取代苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列；載體組裝于Tn7轉座子的左右臂序列和帶有自身啟動子的棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒多角體基因和棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10基因的強啟動子序列和一個多克隆位點。
2.一種實現權利要求1所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒的構建方法，包括下列步驟A、利用一對棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴增出帶有啟動子序列的多角體基因；B、利用一對棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10啟動子的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴增出P10啟動子序列；C、將兩者分別克隆到pGEMT-ease載體上，得到pGEMTP10和pGEMTPh質粒；D、用Pst I和Bgl II限制性內切酶切割pGEMTP10質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的pGEMTP10質粒；E、利用Pst I和BamH I限制性內切酶切割pGEMTPh質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的帶有啟動子的多角體基因；F、利用DNA連接酶將多角體基因連接到pGEMTP10質粒上，得到帶有多角體基因和P10啟動子的重組質粒；G、用Nhe I和BamH I限制性內切酶切割pFastBacdual質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的大pFastBacdual質粒片段；H、用Spe I和BamH I限制性內切酶切割pHZTPhP10質粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因和P10啟動子序列的片段；J、將含有多角體基因和P10啟動子序列的片段連接到第G步制備的大pFastBacdual質粒片段上，構建成供體重組質粒。
3.根據權利要求2所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒的構建方法，其特征在于棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因的上下游引物，引物序列引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG。
4.根據權利要求2所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒的構建方法，其特征在于棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10啟動子的上下游引物，引物序列引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG。
全文摘要
本發明公開了一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質粒的構建方法，當外源基因插入到P10控制下的多克隆位點后，經轉位將外源基因和多角體基因同時插入到棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達載體中的轉位子插入位點，轉染到棉鈴蟲細胞后，能在光學顯微鏡下觀察細胞內是否形成包涵體，如細胞內形成包涵體，證明轉染獲得成功，隨后收集重組病毒粒子再感染細胞，并可進行外源基因表達水平的檢測。本發明將外源基因快速插入到HZ8表達載體上，僅需7－14天就能獲得重組病毒并能在HzAml細胞內表達外源基因；在P10強啟動子的調解下能高效表達外源基因；能通過多角體表型快速鑒定重組病毒。
文檔編號C12N7/01GK1429903SQ0113837
公開日2003年7月16日 申請日期2001年12月31日 優先權日2001年12月31日
發明者王漢中, 陳新文, 胡志紅 申請人:中國科學院武漢病毒研究所