專利名稱：番茄花葉病毒弱毒株k的病毒表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病毒基因工程領域，特別是涉及煙草花葉病毒屬的番茄花葉病毒弱毒株K的病毒表達載體及其構建方式。
植物病毒表達載體可簡單地用電擊和機械感染方法接種，適用多種植物，可在短時間內建立多種植物的表達系統。因為病毒復制快，有可能在短時間內使其所攜帶的目的基因產生較高的表達量，具有潛在的經濟價值。植物病毒表達載體不僅具有在植物中生產藥用蛋白的能力，還可以成為研究植物病毒學和植物分子生物學的有效工具。迄今為止，用于構建表達載體的植物病毒已有幾十種，其中包括雙鏈非整合的DNA病毒，單鏈DNA病毒和正鏈RNA病毒。主要包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)和豇豆花葉病毒(CPMV)等，其中超過150多種的蛋白多肽在TMV載體中成功表達(Grill LK.1998)。
植物病毒表達載體的構建可以通過以下四種方法基因替換、基因插入、融合抗原及基因互補(Cholthof，etal.，1996)。病毒基因組 基因替換 基因插入 融合抗原 基因互補 白色框為病毒基因組，黑色部分代表外源基因基因插入載體是將外源基因插入病毒的一特定位點而構建的。玉米線條病毒(maize streak virus，MSV)可以表達它攜帶的抗除草基因bar，使得接種葉片能抗除草劑Bastar，但在系統擴散中卻回復成野生型(Shenand Hehn，1995)。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)被廣泛用于插入型載體的研究，雖然它也能表達插入的基因，但外源基因在隨后的擴散中也很快丟失(Dawson et al.，1989；Dawson and Lento1990)，后來采用源于其他病毒的同源性表達元件替換本身的外殼蛋白表達框，以減少其同源重組的可能性，構建了新的載體，確比單純的插入要穩定得多。馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)和煙草蝕紋病毒(tobacco etchvirus，TEV)等也用于構建插入型載體。到目前為止，植物病毒載體均采用強病毒構建，因此還不能用于農業作物的性狀改良或增加其營養和藥用價值，這其中最主要的原因是大部分已知植物病毒能引起寄主植物產量的明顯下降。此外，在田間，病毒能通過它們的天然媒介傳播給其它植物，引起病毒擴散(Matthews，1991)。要使植物病毒載體用于農業作物的性狀改良，就必須使其不影響植物的生長和產量，且不引起病毒擴散。因此，尋找一種環境安全的病毒載體來表達各種外源基因勢在必行。植物病毒弱毒株在防治植物攻擊病毒侵害中發揮著重要作用，它能夠在植物體內生存和繁殖，卻不危害植物的正常生長、開花和種子生產，而對攻擊病毒侵染植物具有防御作用。
利用植物病毒弱毒株來構建表達載體，是本發明的獨特之處，本發明的意義在于利用弱毒插入型載體來表達外源蛋白多肽，將為目的蛋白生產開辟一條新的經濟有效的途徑，若利用可食植物，將為口服疫苗生產提供廣闊的應用前景，同時具有生物安全性。利用本發明構建的載體進行病毒與宿主關系的機理研究也具有重要的理論意義。
為了更好地理解本發明，通過以下附圖
進一步予以詳細說明。
圖二體外轉錄表達載體pTOMV-KA構建流程圖番茄花葉病毒弱毒株K侵染性cDNA克隆pN14為本實驗室收藏或制備(楊恭等，2000)。
圖三農桿菌介導表達載體pTOMV-KB構建流程圖pNBS(1-3330，pUC18插入位點BamH I/Sma I)為本實驗室收藏或制備(楊恭等，2000)；pBI121為中國科學院植物生物技術開放實驗室贈送。
1.2以帶有弱毒疫苗ToWK的cDNA克隆的質粒pNBH(5.7kb)為模板進行PCR。
1.2.1 PCR擴增ToMV-K基因(5461-5711)序列片段按已發表的ToMV-K基因組全序列設計引物，并在上游引物的5’端設計Kpn I酶切位點，在下游引物5’端設計Xho I酶切位點并引入一點突變(AGG)，引物序列如下上游引物(Primer1) (24bases，下劃線為Kpn I酶切位點，方框內為Ncol I酶切位點)下游引物(Primer2) (26bases，下劃線為Xho I酶切位點，方框內為點突變堿基)1.2.2 PCR擴增循環條件為94℃預變性2分鐘后；94℃ 30秒，45℃30秒，72℃ 1分鐘，30個循環后；72℃延伸10分鐘。
1.3 PCR擴增ToMV-K基因(5712-6103)序列片段1.3.1按已發表的ToMV-K基因組全序列設計引物，并在下游引物的5’端設計 Sac I酶切位點，引物序列如下上游引物(Primer3)TCAATCACTTCTCCATCG(18bases)下游引物(Primer4) (29bases，下劃線為Sac I酶切位點，方框內為Spe I酶切位點)1.3.2 PCR擴增循環條件為94℃預變性2分鐘后；94℃ 30秒，52℃30秒，72℃ 1分鐘，30個循環后；72℃延伸10分鐘。
2.以含有TMV(3334-6395)序列cDNA克隆的質粒pTBH為模板，設計引物，PCR擴增TMV CP啟動子區(5553-5720)2.1在上游引物5’端加上His-Tag和SacII酶切位點上游引物(Primer5)(44bases，下劃線為Sac II酶切位點，斜體為His-Tag)CTCCGCGGATGATGATGATGATGATGAGTGATGTCCGTAAAGGG下游引物(Primer6)GTAAGACATATTTAAAACG(19bases)2.2 PCR擴增循環條件為94℃預變性2分鐘后；94℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 1分鐘，30個循環后；72℃延伸10分鐘。
3.對1.2、1.3、2中的PCR產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳、鑒定。
4.用Sac I酶切1.3的PCR產物，用Sac II酶切2的PCR產物，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA連接酶連接。
5.用Kpn I和Xho I雙酶切1.2的PCR產物；用Kpn I和Xho I酶切1.1得到的pBluescriptΔBamH I-Spe I質粒；將上述酶切產物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA連接酶連接。
6.用Sac II和Sac I雙酶切4的連接產物；用Sac II和Sac I雙酶切5的連接產物；將上述酶切產物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5a后提取質粒，得到中間克隆載體pTOMV-KC。
7.體外轉錄表達載體pTOMV-KA的構建用Nco I、Soe I雙酶切6得到的中間載體pTOMV-KC；用Nco I、Spe I雙酶切pN14；將構建的表達盒克隆進pN14載體，轉化大腸桿菌DH5a后，提取質粒，得到體外轉錄表達載體pTOMV-KA，用Sph I將其線形化，進行體外轉錄。
8.農桿菌介導的表達載體pTOMV-KB的構建8.1用Sac I酶切pNBS并用DNA聚合酶I Klenow片段將其補成平端，再用BamH I酶切；用Xba I酶切pBI121并用DNA聚合酶I Klenow片段將其補成平端，再用BamH I酶切；將上述酶切產物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA連接酶連接。
8.2用Nco I、Spe I雙酶切6得到的中間載體pTOMV-KC，用Nco I、Spe I雙酶切pNBH，將構建的表達盒克隆進pNBH；用Sph I酶切該產物并用DNA聚合酶I Klenow片段將其補成平端，之后用BamH I酶切；用Sma I酶切8.1的連接產物后，再用BamH I酶切，將上述酶切產物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5a后，提取質粒，得到農桿菌介導的表達載體pTOMV-KB。
9.體外轉錄及感染煙草按轉錄試劑盒的操作說明進行體外轉錄，轉錄產物不經DNase處理，直接用于侵染煙草。先接種枯斑三生煙，出現枯斑后，轉接普通煙，觀察系統癥狀和枯斑形成情況。
10.用農桿菌注射煙草葉片用8.2中得到的表達載體pTOMV-KB轉化農桿菌LBA4404，陽性克隆經培養后注射煙草葉片，觀察其感染癥狀。
參考文獻Ahlquist P，French R，janda M，et al，(1983).Multicomponent RNA plantvirus infection derived from cloned viral cDNA.Proc.Natl.Acad.sci USA817066-7070Cholthof，H B.et a1.，1996.Annu，Rev.Phytopathol，34299-323Dawson W O，Lehto K M(1990).The regulation of tabacomovirus geneexpression.Adv.Virus.Res.38307-342Dawson W O，Lewandowski D J，Hilt ME，et al.(1989).A tobacco mosaicvirus hybrid expresses and losses as added gene.Virology172285-292Gopinath.K.et al.，2000.Engineering cowpea mosaic virus RNA-2 into avector to express heterologous proteins in plants.Virology267，159-173.Grill L K.PBI Bulletin，1998，113-14Hendy.S，Chen，Z.C.et al.，1999.Rapid production of single-chain Fvfragments in plants using a potato virus X episomal vector.J.Immunol.Meth.231，137-146.Kumagai，M.H，et al.，2000.Rapid，high-level expression of glycosylated ricealpha-amylase in transfected plants byan RNA viral vector.Gene 245，169-174.Matthews，R.E.F.，1991.Plant Virology，3rd.Academic Press，New York.McCormick，A.A.et al.，1999.Rapid production of specific vaccines forlymphoma by expression of the tumor-derived single chain Fv epitopes intobacco plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，703-708.Shen W-H，Hohn B(1995).Vectors based on maize streak virus can reficate tohigh copy numbers in maize plants.J Gen.Virol.76965-969Zhang，G.，et al.，2000.In planta expression of HIV-1 p24 protein using anRNA plant virus-based expression vector.Mol.Biotechnol.14，99-107.楊恭，邱并生，生物工程學報，2000，16(2)207-210楊恭，劉相國，邱并生，生物工程學報，2000，16(4)437-44權利要求
1.一種以番茄花葉病毒弱毒株K的cDNA基因組為基礎構建的植物病毒表達載體，其特征在于，它是由SP6啟動子、番茄花葉病毒弱毒株K的復制酶基因、運動蛋白基因、番茄花葉病毒弱毒株K的外殼蛋白啟動子及調控區、表達盒、TMV外殼蛋白啟動子及調控區、番茄花葉病毒弱毒株K的外殼蛋白基因組成的體外轉錄表達載體pTOMV-KA。
2.一種以番茄花葉病毒弱毒株K的cDNA基因組為基礎構建的植物病毒表達載體，其特征在于，它是由35S啟動子、番茄花葉病毒弱毒株K的復制酶基因、運動蛋白基因、番茄花葉病毒弱毒株K的外殼蛋白啟動子及調控區、表達盒、TMV外殼蛋白啟動子及調控區、番茄花葉病毒弱毒株K的外殼蛋白基因組成的農桿菌介導表達載體pTOMV-KB。
3.一種便于外源目的基因插入的中間克隆載體pTOMV-KC，由以下兩部分pBluescriptΔBamH I-Spe I和表達盒組成。
4.根據權利要求1或2或3所述載體的表達盒，其DNA序列如下所示
5.根據權利要求1或2或3所述的表達載體，在茄科、豆科和藜科植物的生物防治，或者在生物制藥中的應用。
全文摘要
本發明涉及植物病毒基因工程領域，通過基因插入重組的方式，將具有弱毒保護功能的番茄花葉病毒弱毒株K的cDNA基因組進行重組，構建成高效、穩定表達外源基因的重組病毒載體。經體外轉錄成RNA后直接感染植物或用轉化的農桿菌感染植物后獲得重組病毒。重組病毒經分離、純化后可再次接種寄主植物，并在植物體內連續、多代高效表達外源基因。以天然形式表達的目的蛋白可以制成口服制劑；以融合形式表達的目的蛋白，經純化后可制成高純度的生物制劑。
文檔編號C12N7/01GK1412314SQ01136130
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月16日 優先權日2001年10月16日
發明者邱并生, 李勇, 劉廣超 申請人:中國科學院微生物研究所