專利名稱：耐高溫丙酮酸羧化酶基因及其編碼的多肽和制備方法
技術領域：
本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫丙酮酸羧化酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。
背景技術：
丙酮酸羧化酶(Pruvate carboxylase)生物體中間產物代謝過程中起非常重要的作用，它催化由羧基供體與丙酮酸形成草酰乙酸，同時伴隨ATP的水解。該反應為三羧酸循環形成脂肪酸，氨基酸和神經遞質等提供重要的中間產物---草酰乙酸。丙酮酸羧化酶具有高度的保守性，在幾乎所有的生物如細菌，真菌，高等植物和動物中都發現該酶的存在，是生物素依賴性酶家族中的一員。生物素輔基與該酶的多肽鏈共價性結合。在正常情況下該酶由四條相同的多肽鏈構成四聚體。丙酮酸羧化酶催化的整個反應包括兩步反應，并且發生在細胞內空間上隔離的兩個不同位點，與之共價結合的生物素則作為羧基團的攜帶者。第一步反應是生物素在ATP供能和羧基供體作用下羧基化，并同時作為下一步反應的底物。第二步反應是將羧化生物素的羧基轉移給丙酮酸。部分化學反應的機理和該酶的一些氨基酸殘基在反應中扮演的角色已經被闡明，通過對具有相似功能的酶之間的氨基酸序列的同源性比較，酵母丙酮酸羧化酶的功能結構域已經被推測出來，對該酶的四級結構的研究正在進行，已知它是由四個亞基組成一個四面體結構，酶活性的主要調節者是乙酰輔酶A，其首先激活第一步反應中的ATP裂解，同時伴隨四聚體結構構象的變化，ATP依賴的生物素羧化域使連接于生物素/羧基攜帶域(BCCP)的一個特異賴氨酸殘基上的生物素附屬基團羧基化。乙酰輔酶A通過增加ATP的裂解率來激活該反應。在第二步反應中，BCCP域將羧基提供給丙酮酸，由該酶的轉移羧基酶活性區催化。過去由于缺乏該酶結構的信息，使研究該酶的作用機理以及調控機理受到很大的限制，其他的生物素依賴酶的研究也一樣。隨著在各種不同的生物體中克隆該酶的成功和三維結構的研究不斷深入，相信對該酶的反應機理的研究將取得更大進展。目前雖然還未有該酶的高分辨的X射線晶體的三維結構圖，但已有電子顯微鏡觀察，有限蛋白質水解分析和基因的克隆測序分析等。已知該酶由四個相同的亞基構成四面體結構，每個亞基有三個功能結構域生物素羧化域，羧基轉移域，和生物素羧化域。
騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我國云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現并進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430T＝JCM 11007T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫丙酮酸羧化酶也具有自己特有的結構。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的核苷酸序列。
本發明的目的之二是提供一種分離的，具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性多肽。
本發明的目的還提供了嗜熱厭氧菌的丙酮酸羧化酶重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及生產蛋白的方法。
本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與丙酮酸羧化酶相關。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
本發明另一方面提供了一種耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽。該多肽具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
生產耐高溫丙酮酸羧化酶的方法為1)分離出編碼耐高溫丙酮酸羧化酶的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫丙酮酸羧化酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫丙酮酸羧化酶。
本發明涉及嗜熱厭氧菌的耐高溫丙酮酸羧化酶基因的分離及表達。以騰沖嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎，克隆分離了耐高溫丙酮酸羧化酶基因。該基因對于制備用于生產耐高溫丙酮酸羧化酶的轉基因微生物或動植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了制備，分離，純化具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的方法。
圖1是測序文庫構建步驟流程圖；圖2是測序與數據分析流程圖；圖3是正反向測序結果分析示意圖；圖4部分Cosmid末端測序結果示意圖；
具體實施例方式
首先，本發明提供了分離的，編碼耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是通過對騰沖嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析而獲得的，具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列，它編碼具有465氨基酸閱讀框的多肽，推測分子量為52875道爾頓。
本發明還涉及一種重組載體，該載體包含本發明的分離的核苷酸分子，以及包含有重組載體的宿主細胞。同時，本發明包括構建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組工程技術生產耐高溫丙酮酸羧化酶的方法。
本發明進一步地提供了一種分離的耐高溫丙酮酸羧化酶或多肽，其特征在于具有SEQ.ID NO.2氨基酸序列，或至少70％相似，更佳地，至少具有90％，95％，99％的相同。
在本發明中，“分離的”DNA是指該DNA或片斷已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片斷已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，“耐高溫丙酮酸羧化酶基因”指編碼具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ.ID NO.1的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指該序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于公知的密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
在本發明中，“分離的”蛋白的多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組份。
在本發明中，“耐高溫丙酮酸羧化酶”指具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的SEQID NO.2序列的多肽。該術語還包括SEQ ID NO.2序列的變異體，這些變異體具有與天然耐高溫丙酮酸羧化酶相同的功能。這些變異體包括(但不限于)若干個氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末段和/或N末端添加一個或數個氨基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，為本領域所公知的，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括耐高溫丙酮酸羧化酶的活性片斷和活性衍生物。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒，噬菌體及反轉錄病毒等。在生產本發明的耐高溫丙酮酸羧化酶時，可以將耐高溫丙酮酸羧化酶基因序列可操作低連于表達調控序列，從而形成耐高溫丙酮酸羧化酶表達載體。表達載體含有復制起始點和表達調控序列，啟動子，增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有可供選擇的標記基因，如a)提供對抗生素或其它毒性物質(氨芐青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質或b)互補營養缺陷型蛋白質或c)提供復合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知或生產廠商說明書著名的。這些表達載體可以用本領域技術人員公知的重組DNA技術制備，如可參考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。
重組表達載體可以用本領域熟知的方法引入宿主細胞，這些方法包括電轉化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導入宿主細胞的過程稱為“轉化”。通過培養宿主細胞，誘導所需蛋白的表達，并通過本領域所熟知的蛋白分離技術，如柱層析等得到所需的蛋白質。也可采用固相技術等人工合成該蛋白質。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞，或各種動植物細胞。
本發明的耐高溫丙酮酸羧化酶基因全長序列或其片斷通常可以用PCR擴增法，重組法，或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法制備的嗜熱厭氧菌全基因組DNA為模板，擴增而得到有關序列。一旦獲得了有關序列，就可以將其克隆入有關載體，再轉入宿主細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到大批量的有關序列。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1構建測序文庫測序文庫的構建采用全基因組霰彈法(shotgun)進行。首先培養騰沖嗜熱厭氧菌，培養方法按(Yanfen Xue，2000)改進的MB培養基(Balch et al.，1979)，按Marmur(1961)方法收集細菌，提取總DNA。為了保證測序文庫構建的隨機性，最大程度地避免產生斷裂熱點的問題，采用多種方法、不同條件的建庫原則。。先采用物理剪切方法(包括超聲波法及用Hydroshear Machine進行剪切)，其次根據該菌基因組特征選用AluI進行隨機部分酶切。物理剪切時采用不同強度處理樣品，酶切時通過設置酶量梯度處理樣品。處理后的樣品經平末端處理后，采用電泳分部收集1.5-4kb DNA片段，與去磷酸化的經SmaI酶切的pUC18進行連接，連接產物通過電轉化E.coli DH5α構建了隨機測序的文庫。同時，為了便于以后長片斷(contig)的搭接還構建了長插入片段(10kb左右)的測序文庫(將基因組DNA以Sau3AI隨機部分酶切，電泳收集10kb左右的片段，與去磷酸化的經BamHI酶切的pUC18進行連接、構建文庫)。該文庫經兩個末端的測序在完成圖(finishing)的過程中可以得到contig之間的關系，并可以解決較大的gap對補洞造成的困難。建庫流程如(見圖1)。
實施例2基因組測序在完成騰沖嗜熱厭氧菌基因組的測序時，主要使用了兩種全自動測序儀ABI377和MegaBACE 1000。這兩種測序儀都是利用電泳原理進行測序(見圖2)，每次可完成96個樣品。ABI377是PE公司的產品，是ABI系列的一種。它屬于平板凝膠電泳測序儀。MegaBACE 1000是法瑪西亞公司的產品，屬于毛細管凝膠電泳測序儀。
實施例3Basecalling和測序質量監控所謂Basecalling是指從測序儀上得到的原始數據文件中得到正確的堿基序列的過程。由于測序儀上得到的是A，T，G，C四種堿基對應的不同波長的光的強度變化軌跡(trace)，需要用計算機采取一定的算法從中正確識別出不同的軌跡對應的堿基。我們使用的是Phred軟件(Ewing B，Hillier L，1998)，原因是其結果更可靠，并且其結果輸出更便于同一軟件包中的其他程序進行進一步的分析。
Phred進行Basecalling的算法原理，是根據軌跡中各個峰的形狀，間距，以及信噪比等因素，判斷堿基類型，同時對這個堿基給出可信度信息，即堿基的測序質量。在大規模測序中，測序質量的監控是十分重要的，它直接影響對測序的決策，包括文庫的構建，覆蓋率的大小。同時對測序實驗中可能出現的失誤能及時反饋。
實施例4序列拼接所謂序列拼接，就是把全基因組霰彈法，又稱鳥槍法隨機測序得到的樣品序列組裝成連續的長片斷(contig)，主要利用它們之間的重疊序列作參考。考慮到測序中存在載體的影響，需要先對樣品序列進行去載體處理。這里所用的軟件cross_match和后面拼接所用的軟件Phrap都是美國Washington大學的軟件(Gordon D，Abajian C，1998)，其基本原理為Swith-Waterman算法(WatermanMS，1990)。這是一種動態算法，在考慮了兩兩序列之間的比較之后，可以得到一組序列的公有序列(consensus sequence)。去除載體后的樣品序列再用Phrap進行拼接。在拼接時，堿基的測序質量也被考慮了，所得到的公有序列各堿基的可信度，由組成該公有序列的樣品的測序質量計算得到。
實施例5基因注釋在大體得到基因組的大部分序列(完成工作框架圖)后，就需要對基因組進行注釋，包括進行開讀框架(Open Reading Frame，ORF)的預測，基因功能的預測，以及特殊RNA片斷的分析等。
第一步采用缺省參數的GLIMMER2.0(Delcher，A.L.，Harmon，D.1999)和ORPHEUS(Frishman，D.1998)軟件預測基因編碼序列，然后所有預測的開讀框和非編碼區(intergenic region)都用BLAST軟件(Altschul，S.F.et al.1997)與NCBI的無冗余蛋白數據庫(non-redundant protein database)比較來發現可能漏掉的基因。在判斷一個基因的起始點時，將參考各種相關信息，如序列同源性，核糖體結合位點，可能的信號肽序列和啟動子序列等。如果在一個開讀框內出現多個啟動子時，一般采用第一個啟動子作為基因的起始點。采用TransTerm軟件(Ermolaeva，M.D.2000)在非編碼區預測不依賴于Rho(ρ)因子的轉錄終止子。如果該終止子位于一個基因的下游區的太遠處，則可能暗示一個小基因的丟失或測序錯誤人為地縮短了該基因，可作為進一步分析的參考。在確定移框突變和點突變時，主要根據與數據庫中的蛋白質的相似性來判斷。如果出現一個蛋白質對應于兩個彼此相鄰的編碼序列的情況，則被認為是一個無活性基因(假基因pseudogenes)，因為這說明這兩個編碼序列之間由于突變而產生異常中止現象，進而使基因失去活性。所有分析結果再用Artemissequence viewer軟件(Rutherford，K.et al.2000)進行手工分析。一些明顯與其它編碼序列有重疊的開讀框，長度小于150堿基對并且在已有數據庫中沒有同源性和其中沒有明顯的啟動子或終止區域的開讀框將被去除。
蛋白質的功能片斷(motif)和功能區域(domain)分別采用與Pfam、PRINTS、PROSITE、ProDom和SMART數據庫進行比對分析，結果再用InterPro數據庫(Apweiler，R.et al.2001)進行匯總分析。根據NCBI的COGs數據庫(Tatusov，R.L.et al.2001)并且參照其他數據庫的查詢結果來確定蛋白質在COGs分類中的功能分類和可能的代謝途徑。用TMHMM軟件(Krogh，A.et al.2001)來確認膜蛋白、ABC轉運蛋白和跨膜功能域。采用革蘭氏陰性菌為參數，用SIGNALP2.0軟件(Nielsen，H.et al.1999)分析信號肽區域。(4)補洞在完成基因組的工作框架圖之后，就要進行更加困難的補洞工作，即完成整個基因組100％的測序，得到一個環形基因組。主要工作就是把前面得到的contig連接起來。這是一項十分具體而又繁雜的工作。主要方法包括A.利用測序中的正反向測序樣品信息在測序過程中，我們有意對某些樣品進行了雙向測序，即同時測序某個插入片斷的兩端，再將所得序列與其他序列一起進行拼接。由于這一對序列在基因組上的關系一定，其之間的距離大致已知，根據這一信息，一可以確認某段contig是否可靠，二是當這一對序列分別位于不同的contig上時，可以確定這兩個contig的方向關系和位置關系，為進一步設計實驗提供參考(見圖3)。
B.長插入片斷及Cosmid末端測序基于同樣的原理，我們可以構建不同長度的插入片斷文庫，只對其兩端測序，然后拼接，分析其具體位置。這些文庫包括長度為9-12Kb的長插入片斷庫和20-40Kb左右的Cosmid文庫。具體分析方法同上所述。圖4所示為部分Cosmid末端測序結果。
C.PCR和末端延伸Walking實驗根據A和B所提供的contig方向和位置關系，進一步的生物化學實驗就可以進行了。如設計一對引物進行PCR擴增，或以某一contig末端序列合成引物進行末端延伸(Walking)來補洞等。
實施例6丙酮酸羧化酶的制備和提純根據實施例中基因注釋得到的丙酮酸羧化酶全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的測序文庫的質粒DNA為模板，經PCR擴增后，在保證閱讀框正確的前提下重組至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。再將重組載體轉化入大腸桿菌DH5α中(轉化方法為CaCL2法或電轉化法)。篩選鑒定的到含有表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-PycA。
挑取單菌落的工程菌DH5α-pGEX-2T-PycA于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養37℃過夜，按1∶100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續于37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導表達所需蛋白的工程菌后，將細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結合了所需蛋白的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，上清即為洗脫的蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在52875道爾頓處的蛋白質條帶即為丙酮酸羧化酶。
序列表1.SEQ ID NO.1(1)序列特征a.長度1398堿基對b.類型DNAc.鏈型雙鏈d.幾何結構線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述atggaaaggagagttaaaataacagaaacagttctaagagatgcccatcagtctttgatggctactcgcatgactacagaggaaatgctgcctattgcagaaaagcttgataaggtgggatatcattctcttgaggtttggggaggagctacctttgatgcttgtctcaggtttttaaatgaagacccgtgggagaggctgcgggaattaaaaaagaggataaaaaatacacccctgcaaatgcttttaagagggcaaaatctggtaggatacagacattatccggatgacattgtagaaaaatttatagaaaaggctgtagctaatggaatagacataataaggatctttgatgctttgaatgatgtgagaaatttggaagtttccataaaggcgacaaaaagggtaggagcccatgcgcaagggactcttgtctatactataagccctgtccacactatagaccactacataagagtggcaaaagaactggtagaattaggtgtagattctatctgcataaaggacatgtcgggcatattgagcccttatgtagcctatgaactggtgaagaggctcaaagagacagttaatgttcccatacagctgcacggccattacacgagtggaatggcttccatgacttatttaaaagccatagaagcaggggtggatgcgatagatacagcaatttctcctttagctttgggcacttctcagcctgctacagagaccatggtggcagctttgaagggaactcaatatgatacagggcttgaccttgaacttctctcagaaattgcttcatattttaaggaagtaaagcgaaatcactataaagaaacagatttctcaatggtaatgggtatagatactgatgtgcttgtctaccaggttccgggaggaatgctttcaaatctcattgcacagctaaaagagcaaaaagcgcttgacaagtataaagaagttctagaagagataccgagggtgagagaggacctaggatatccgcctctagttactccaatgagtcaaatggtaggtacacaggcggttttaaatgtgataactggtgagaggtataaaatggttccaaaagagataaaggattatgtcaagggactgtacggcaggcctcctgcaccaatttctgatgagataaagaggaaaataataggtgatgaagaggtaattgagataaggccggcggacctcttaaaaccacagtttgaagaggtaaaagaagaaataaaagagtattacgaacaggaagaggatgtactgacatatgctctttttccgcaagtggctaaaaagttttttgagtacagaagggcgaaaaagtattttatagattctagtatggttggtgagggaaacagagtgtatcctgtctaa2.SEQ ID NO.2(1)序列特征a.長度465氨基酸b.類型多肽c.鏈型單鏈d.幾何結構立體(2)分子類型蛋白質(3)序列描述MERRVKITETVLRDAHQSLMATRMTTEEMLPIAEKLDKVGYHSLEVWGGATFDACLRFLNEDPWERLRELKKRIKNTPLQMLLRGQNLVGYRHYPDDIVEKFIEKAVANGIDIIRIFDALNDVRNLEVSIKATKRVGAHAQGTLVYTISPVHTIDHYIRVAKELVELGVDSICIKDMSGILSPYVAYELVKRLKETVNVPIQLHGHYTSGMASMTYLKAIEAGVDAIDTAISPLALGTSQPATETMVAALKGTQYDTGLDLELLSEIASYFKEVKRNHYKETDFSMVMGIDTDVLVYQVPGGMLSNLIAQLKEQKALDKYKEVLEEIPRVREDLGYPPLVTPMSQMVGTQAVLNVITGERYKMVPKEIKDYVKGLYGRPPAPISDEIKRKIIGDEEVIEIRPADLLKPQFEEVKEEIKEYYEQEEDVLTYALFPQVAKKFFEYRRAKKYFIDSSMVGEGNRVYPV
權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特征在于它是編碼具有耐高溫丙酮酸羧化酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于所說的核苷酸序列編碼具有SEQ.ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與耐高溫丙酮酸羧化酶相關。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于所說的核苷酸序列具有SEQID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
4.一種分離出的多肽，其特征在于它具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于它具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.一種載體，其特征在于它含有權利要求1中之DNA。
7.一種宿主細胞，其特征在于它是用權利要求6所述載體轉化的原核細胞或真核細胞。
8.一種制備耐高溫丙酮酸羧化酶的方法，其特征在于該方法包括1)分離出編碼耐高溫丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫丙酮酸羧化酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫丙酮酸羧化酶。
全文摘要
本發明涉及編碼具有活性或其功能等同變異體的分離的DNA和利用重組DNA技術以所述分離的DNA生產具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽或其功能等同變異體。以騰沖嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎，克隆分離了耐高溫丙酮酸羧化酶基因。該基因對于制備用于生產耐高溫丙酮酸羧化酶的轉基因微生物或動植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了制備，分離，純化具有耐高溫丙酮酸羧化酶活性的多肽的方法。
文檔編號C12N15/63GK1418959SQ0113478
公開日2003年5月21日 申請日期2001年11月12日 優先權日2001年11月12日
發明者包其郁, 楊煥明, 胡詠武, 胡松年, 李蔚 申請人:杭州華大基因研發中心