專利名稱：一種利用膠帶獲取人體dna的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體地講，本發明涉及人體DNA的制備方法及其用途。
現代親子鑒定和法醫學鑒定多以短串聯重復序列(STR)作為遺傳學標記。短串聯重復序列(STR)廣泛分布于人的23對染色體上，是由2-7個重復序列的堿基所組成的一百至數百堿基對長的DNA片段，在人群中具有高度的多態性；利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術可以大量、迅速和特異地擴增目標DNA。極微量的樣品經PCR擴增后也可被檢測，且結果可完全符合法醫學的要求。
近年來，可在DNA或基因水平上診斷越來越多的遺傳病。以Duchenne型肌營養不良為例進行說明。Duchenne型肌營養不良是一組原發于肌肉的遺傳性變性疾病，發病率為1/3500活產男嬰，主要臨床特征為受累的骨骼肌肉進行性無力和萎縮。現代分子遺傳學研究證明，Duchenne型肌營養不良是由X染色體短臂上Xp21-Xp223序列的基因缺陷所致，該段基因控制著肌細胞膜的骨架成份抗肌萎縮蛋白(dystrophine)的合成，這個基因非常龐大，約2.4Mb，含有79個外顯子，78個內含子，如此巨大的基因一旦發生基因缺失突變或點突變，都會嚴重影響編碼蛋白的合成。研究表明絕大部分的Duchenne型肌營養不良是由于缺失突變所致，這些缺失突變有兩個高發區，一個在基因的5′端1-7外顯子區域，另一個在基因的3′端45-55外顯子區域。利用PCR技術可以直接檢測到這些缺失突變，從而對缺失型患者或帶有基因缺陷者進行診斷。
對每一個人而言，DNA終其一生基本不變，而且除精子、卵子外人體各處組織的DNA大都雷同，所以DNA樣品可以取自血液、精液、唾液、尿液、頭發、牙齒、指甲、骨頭、口腔上皮細胞、羊水、甚至皮屑。但是，目前采集人體DNA的幾種方法均有不足之處。
例如，采血是法醫學鑒定和疾病診斷常規的取樣方法，但采血過程復雜，限制繁多。例如，采集血樣者必須是專業醫務人士，如醫生或護士；被采樣者有不舒服或疼痛的感覺甚至恐懼心理；被采樣者如有疾病，如肝炎、艾滋病或其他傳染病，那么從業者便有在血樣處理過程中被感染之虞。此外，基于年齡、健康、宗教、法律或其他原因，血樣可能難以得到。
本發明人發現在人指接觸固體表面或按指紋時有少量的表皮細胞脫落，可成為DNA的來源。指紋是法醫學鑒定中最常采集的物證，以指紋作為DNA的來源不失為一個簡單有效的方法。因此使用膠帶直接或間接獲得指紋或身體其它部位的紋印，籍此獲得上皮細胞，然后從中抽取人體DNA很具實際意義和應用價值。采得的DNA可以用于個體鑒別和遺傳特征包括遺傳病的篩選、鑒定和確定。本發明的方法包括如下步驟
(a)用膠帶直接或間接地粘取人體的上皮細胞；(b)在Chelex-100懸浮液中于55℃-65℃，優選56℃-60℃保溫2小時至過夜，例如保溫4小時，6小時或12小時；(c)沸水浴6-10分鐘，優選7-8分鐘；(d)以每分鐘3000-13000轉，優選6000-13000轉的速度離心3-5分鐘，取上清液備用。
本發明使用膠帶直接或間接地獲取人體上皮細胞，從中成功地抽提人體DNA并進行DNA分型，用于遺傳學、法醫學、親子鑒定等個體鑒定以及遺傳特征包括遺傳病的篩選、鑒定和確定。
本發明的方法還優選包括用事先清洗并消毒的剪切工具如剪刀將粘有上皮細胞的膠帶剪碎。
本發明的方法還優選包括在步驟(b)加入Chelex-100懸浮液之后，在溫浴之前以每分鐘100-3000，優選2000次的頻率振蕩10-20秒。
本發明的方法還優選包括在步驟(b)溫浴完成之后以每分鐘100-3000，優選2000次的頻率振蕩10-20秒。
本發明的方法還優選包括在步驟(c)沸水浴完成之后以每分鐘100-3000，優選2000次的頻率振蕩10-20秒。
上述Chelex-100懸浮液優選為新鮮配制的2-10％，優選4-8％，更優選5％的Chelex-100懸浮液，其用量為50-500微升，優選100-300微升，更優選200微升。
本發明的方法中，所述上皮細胞可來自手指、手掌、腳趾、腳掌或身體的其它部位。
本發明的方法中，所述上皮細胞優選是將測試者的指肚部分直接壓在膠帶的粘性面上而獲得的或利用膠帶粘取遺留在物體表面上的指紋而獲得的。
本發明的方法中對所用的膠帶的基質沒有任何限制，它可以是塑料的或紙質的，可以是透明或非透明的。
本發明的上下文所述的上皮細胞包括上皮細胞的碎片。
直接獲得指紋的方法將手指的指肚部分或身體的其它部位如手掌、腳趾、腳掌等直接用力按壓在膠帶的粘膠面上，留下指紋或其它部位的紋印。
間接獲得指紋的方法利用膠帶的粘膠層將遺留在物體，如光滑的木頭、玻璃以及不銹鋼表面的指紋或其它身體部位的紋印取下。
以下以粘有指紋的膠帶為例描述本發明優選的提取DNA的過程，以及利用所獲得的DNA通過PCR擴增來診斷Duchenne肌營養不良癥。
將粘有指紋部分的膠帶用事先清洗并經高壓蒸氣滅菌和紫外線消毒的醫用剪刀剪碎，移入離心管；加入100-300微升4-8％的Chelex-100(Bio-Rad，UAS)懸浮液，以每分鐘100-3000次的頻率振蕩10-20秒；56-60℃保溫2小時至過夜；再以每分鐘100-3000次的頻率振蕩10-20秒；然后沸水浴8-10分鐘，完成之后以每分鐘100-3000次的頻率振蕩10-20秒；最后以每分鐘6000-13000轉的速度離心3-5分鐘，將上清液移入新的離心管內保存于-20℃冰箱備用。DNA指紋圖譜的建立按本發明的方法獲取DNA之后，以PE公司的AmpF1 STR試劑盒進行擴增，擴增產物使用ABI PRISM310 Genetic Analyzer分析后產生DNA指紋圖譜。
另外，為進行遺傳分析或遺傳疾病的篩選目的，在如上按本發明方法獲取DNA之后，還可如下進行PCR擴增。例如，針對Duchenne肌營養不良，可如下進行擴增在Duchenne型肌營養不良突變高發區選擇四對引物擴增缺失熱點的四個外顯子(Beggs，A.H.et al(1990)Detection of 98％ofDMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction.Hum Genet.8645-48)，該PCR擴增所用引物如下表所示。其中一對位于基因的5′端，另三對位于基因的3′端，分別為外顯子3、外顯子43、外顯子48和外顯子51，擴增產物長度分別為410bp、357bp、506bp和388bp。擴增后對擴增產物進行凝膠電泳分析，以進行疾病的篩查和診斷。
本發明克服了現有方法的不足，無論在指紋提取方法上還是DNA抽提方法上都更加簡便。提取身體表面所得紋印不必使用特殊的專用膠帶。以指紋為例，只需要指肚部分的指紋已足夠，不需要提取整個手掌紋。同時DNA提取也更加簡單，不需要使用蛋白酶K，整個過程更快捷簡單可靠。
本發明方法所獲得的DNA適用于遺傳學分析、法醫學鑒定、親子鑒定等個體鑒定以及遺傳特征包括遺傳病的篩選、鑒定和確定。
以下以具體實施實例描述本發明。實施例1利用膠帶直接獲得指紋一志愿者將其食指的指肚用力按壓在透明膠帶的粘膠面上，將粘有指紋部分的膠帶用事先清洗并經高壓蒸氣滅菌和紫外線消毒的醫用剪刀剪碎，移入1.5毫升的離心管；加入200微升新鮮配制的5％的Chelex-100(Bio-Rad，USA)懸浮液，以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；56℃保溫過夜；再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒，然后沸水浴10分鐘，再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；最后以每分鐘13000轉的速度離心3分鐘，將上清液移入新的離心管內保存于冰箱備用。按上述方法從該透明膠帶上提取DNA后，取3微升按照制造商的說明使用PE公司的AmpF1 STR試劑盒進行PCR擴增，擴增產物用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer分析后得到DNA指紋圖譜，該志愿者的STR圖譜為，男性，THO17/9，TPOX8/11，CSF1PO10/10，D3S135817/17，vWA17/18，FGA24/24，D5S8189/13，D13S3178/8；D7S82010/11；該結果與取該志愿者血液而測定的結果完全一致(參見
圖1)。實施例2利用膠帶間接獲得指紋利用膠帶獲得一志愿者留在木質桌面上的三枚指紋，將粘有指紋部分的膠帶用事先清洗并經高壓蒸氣滅菌和紫外線消毒的醫用剪刀剪碎，移入1.5微升的離心管；加入200微升新鮮配制的5％的Chelex-100(Bio-Rad，USA)懸浮液，以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；56℃保溫過夜；再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒，然后沸水浴10分鐘，再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；最后以每分鐘13,000轉的速度離心3分鐘，將上清液移入新的離心管內保存于冰箱備用。按上述方法從該透明膠帶上提取DNA后，取3微升按照制造商的說明使用PE公司的AmpF1 STR試劑盒進行PCR擴增。擴增產物使用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer分析后得到DNA指紋圖譜，該志愿者的STR圖譜為，男性，THO18/9，TPOX8/11，CSF1PO10/12，D3S135814/16，vWA16/18，FGA18/21，D5S81811/12，D13S31710/10；D7S8208/11；該結果與取該志愿者血液而測定的結果完全一致(參見圖2)。實施例3疾病基因的檢測一志愿者將其食指的指肚用力按壓在透明膠帶的粘膠面上，將粘有指紋部分的膠帶用事先清洗并經高壓蒸氣滅菌和紫外線消毒的醫用剪刀剪碎，移入1.5毫升的離心管；加入200微升新鮮配制的5％的Chelex-100(Bio-Rad，USA)懸浮液，以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；56℃保溫過夜；再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒，然后沸水浴10分鐘，再以每分鐘2000次的頻率高速振蕩15秒；最后以每分鐘13,000轉的速度離心3分鐘，將上清液移入新的離心管內保存于冰箱備用。按上述方法從該透明膠帶上提取DNA后，取5微升DNA分別加入PCR緩沖液(100mM Tris HCl pH8.3，500mM KCl)3.75微升，25mM MgCl22微升，10mM dNTPs 2微升，DMSO 1.25微升，水8.75微升，PCR引物2微升以及Taq聚合酶0.25微升(5U/微升)，PCR反應體積為25微升，反應條件為95℃ 3分鐘，然后30個循環為94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘和72℃ 2-4分鐘(延伸時間每10個循環增加1分鐘)，最后72℃延伸反應5分鐘結束。擴增產物經過2％的凝膠電泳和溴乙錠染色，結果見圖3。圖3B中泳道M為分子量對照，泳道N為PCR陰性對照，泳道1為外顯子3擴增產物，泳道2為外顯子43擴增產物，泳道3為外顯子48擴增產物，泳道4為外顯子51擴增產物，該結果與取該志愿者唾液而測定的結果(圖3A)完全一致。
雖然本發明的實施例以指紋為例進行描述，本領域的技術人員在閱讀本發明書之后，即可從用膠帶粘取被測試者身體其它部位如手掌、腳趾、腳掌或身體其它表面紋印中提取DNA，用于遺傳學分析、法醫學鑒定、親子鑒定等個體鑒定以及遺傳特征包括遺傳病的篩選、鑒定和確定，這一點是顯而易見的。
本發明不受上述具體文字描述的限制，本發明可在權利要求書所概括的精神和實質的范圍內做各種變形和改變。這些變形和改變均在本發明的范圍之內。
序列表<110>香港中文大學<120>一種利用膠帶獲取人體DNA的方法<130>SPI010824-09<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1tcatccatca tcttcggcag attaa 25<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2caggcggtag agtatgccaa atgaaaatca 30<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>3gaacatgtca aagtcactgg acttcatgg 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4atatatgtgt tacctaccct tgtcggtcc29<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>5ttgaatacat tggttaaatc ccaacatg28<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>6cctgaataaa gtcttcctta ccacac 26<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>7gaaattggct ctttagcttg tgtttc 26<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>8ggagagtaaa gtgattggtg gaaaatc 2權利要求
1.一種提取DNA的方法，該方法包括下列步驟(a)利用膠帶粘取人體上皮細胞；(b)將膠帶在2-10％Chelex-100懸浮液中于55℃-65℃保溫2小時至過夜；(c)沸水浴6-10分鐘；(d)以每分鐘3000-13000轉的速度離心3-5分鐘，取上清液備用。
2.根據權利要求1所述的方法，還包括在加入Chelex-100懸浮液之前用事先清洗并消毒的剪切割工具將粘有指紋部分的膠帶破碎。
3.根據權利要求1所述的方法，還包括在步驟(c)沸水浴之前以每分鐘100-3000次的頻率振蕩10-20秒。
4.根據權利要求1所述的方法，還包括在步驟(d)沸水浴之后以每分鐘100-3000次的頻率震蕩10-20秒。
5.根據權利要求1-4所述的方法，其中所用的Chelex-100懸浮液為新鮮配制，用量為50-500微升。
6.根據權利要求1-5所述的方法，其中步驟(b)為將膠帶在4-8％的Chelex-100懸浮液中于55℃-60℃保溫2小時至過夜。
7.根據權利要求6所述的方法，其中步驟(b)為將膠帶在5％的Chelex-100懸浮液中于55℃-60℃保溫2小時至過夜。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述的上皮細胞來自手指、手掌、腳趾、腳掌或身體表面的其他部位。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述的上皮細胞由測試者的手指、手掌、腳趾、腳掌或身體表面的其他部位直接按壓在膠帶上而獲得。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的上皮細胞由測試者的指肚部分直接按壓在膠帶上而獲得。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述的上皮細胞是使用膠帶粘取遺留在物體表面上的手指、手掌、腳趾、腳掌或身體表面其他部位的紋印而獲得。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述的上皮細胞是利用膠帶粘取遺留在物體表面的指紋而獲得。
13.根據權利要求1所述的方法，其中膠帶的基質是塑料的或紙質的，透明的或非透明的。
14.一種膠帶的用途，利用所述膠帶直接或間接獲取被測試者的上皮細胞和/或細胞碎片。
15.根據權利要求1-14中任何一項方法獲得的DNA的用途，用于個體鑒定或遺傳特征分析或遺傳病的篩選、鑒定和確定。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，具體公開了一種利用膠帶直接或間接地獲取人體上皮細胞，然后提取高質量DNA的方法，本發明不需要使用蛋白酶K，無論在體表紋印的提取上還是DNA抽提方法上都更加快捷、簡單和可靠。本發明適用于法醫學、遺傳學、親子鑒定等個體鑒定以及遺傳特征包括遺傳病的篩選、鑒定和確定。
文檔編號C12Q1/68GK1414007SQ0113423
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月26日 優先權日2001年10月26日
發明者王駿, 廖湘海 申請人:香港中文大學