人源化抗cd3單克隆抗體的制作方法

專利名稱：人源化抗cd3單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體技術，抗體人源化技術，以及基因重組技術。尤其是抗CD3的人源化單克隆抗體。
背景技術：
CD3分子是廣泛分布于人成熟T淋巴細胞表面的膜抗原，它與T細胞表面膜受體TCR形成復合體，在細胞內信息傳遞過程中起著重要的作用。已有的研究表明抗人T細胞CD3的單抗具有激活和抑制T細胞的雙向功能。其療效已在急性抗排異沖擊療法、治療移植物抗宿主反應及器官移植前的預防性脫敏中得到充分的證實，并在抗腫瘤、抗多種器官移植排斥反應及再生障礙貧血的治療中顯示出廣闊的應用前景。
mOKT3是由美國Ortho藥物公司生產的鼠源抗人CD3的單抗，它對預防和治療器官移植免疫排斥反應有良好的效果。但是，mOKT3作為鼠源性單抗，其免疫原性導致50％以上的病人產生抗mOKT3抗體，這些抗體主要有兩種抗個體型和抗同種型。前者通過中和抗原結合位點而阻斷mOKT3與CD3的結合，后者除加速單抗的清除外還可能引起嚴重的副反應。
因而，克服鼠源性和首劑效應成為其臨床廣泛應用的關鍵。使用人源抗體或人源化抗體是克服人抗鼠源抗體反應(HAMA反應)的兩種可能的方法。由于特異性強、親和力高的人源抗體不易得到，目前主要采取鼠源單克隆抗體人源化的方法。

發明內容
本發明的目的在于提供具有潛在醫學及藥學價值的人源化抗人CD3單克隆抗體，其相關DNA序列和含有該序列的宿主細胞。
為了實現上述目的，本發明提供以下技術發案。
本發明提供一種人源化的抗人CD3單克隆抗體，其中原人抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別被非人源重鏈可變區和輕鏈可變區所取代，所述非人源重鏈可變區選自SEQ IN NO1或SEQ IN NO5，所述非人源輕鏈可變區選自SEQ INNO2或SEQ IN NO6。
本發明還提供一種DNA分子，其中包含上述非人源重鏈可變區的編碼序列和/或上述非人源輕鏈可變區的編碼序列。
本發明的實施方式之一中，上述非人源重鏈可變區的編碼序列選自SEQ INNO3或SEQ IN NO7，所述非人源輕鏈可變區的編碼序列選自SEQ IN NO4或SEQ IN NO8。
本發明的實施方式之一中，所述DNA分子的形式一種載體，尤其是表達載體。
本發明還提供一種宿主細胞，它含有本發明的DNA分子，尤其是包含于宿主相容性表達系統中的所述DNA分子。所述的宿主細胞可以是從大腸桿菌等原核細胞例如到CHO等哺乳動物細胞各種適合的細胞。其選擇是本領域的常規技術。
本發明還提供本發明抗體和本發明DNA分子在制備診斷和/或治療CD3相關疾病的制劑中的用途。
本發明通過對抗CD3單抗進行人源化改造，獲得了抗排異能力強、免疫原性和毒副作用小的有效免疫抑制劑，并且提高了融合抗體在哺乳動物細胞內的表達。


圖1是本發明用于合成人源化重組VH和VL編碼序列的重疊PCR的示意圖。
圖2是本發明中使用的表達載體pMG18-3K的圖譜。其中，Ck表示人抗體kappa輕鏈的恒定區編碼序列；IgG1恒區表示人抗體IgG1的重鏈恒定區編碼序列；pA表示SV40加poly(A)位點。
圖3反映抗體接合親合性熒光染色結果。其中縱坐標為熒光染色的細胞流量，單位是細胞數/秒，橫坐標是熒光強度，單位是10-4W/cm2。分圖A用的主抗體是作為陰性對照的抗CD20單克隆抗體Rituxan(購自Genentech)，第二抗體是兔抗人-FITC；分圖B用的主抗體是作為陽性對照的抗CD3的mOKT3，第二抗體是兔抗鼠FITC；分圖C用的主抗體是本發明的cGD3，第二抗體是兔抗人-FITC；分圖D用的主抗體是本發明的huGD，第二抗體是兔抗人-FITC。
優選實施方式一.抗CD3單抗的制備與鑒定采用純合CD3蛋白作為免疫原，加入完全弗氏佐劑，充分研磨至完全乳化后常規皮下多點注射10日齡Balb/c小鼠，每點注射50微升，共6點。然后以1周間隔共5次重復注射以加強免疫反應，并對血清抗體水平進行監測。最后一次靜脈注射5×106新鮮細胞/PBS混合液，3日后殺死小鼠，取出脾臟。
常規方法分離脾臟單細胞，并確定細胞活性＞90％。將脾臟細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞10∶1混合離心共沉淀，在37C水浴鍋中加入PEG(1400MW)進行細胞融合，融合時間為1分鐘、2分鐘、5分鐘和10分鐘。間隔5分鐘加入新鮮無血清培養基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。離心沉淀后將細胞加入到20％FCSRPMI-1640培養液中，轉入96孔板進行培養。24小時后加入1×HAT選擇培養液。每3天更換新鮮培養基1次，至長出克隆。
選擇單克隆形成孔，在第14天取出上清液，用ELISA法測定抗體表達量，挑選陽性孔亞克隆，在常規條件下傳代，穩定至第5代。據此挑選出表達量最高的位置編號為GD3的細胞系，作為繼續研究的材料。二.抗CD3單抗可變區的擴增與測序采用5’RACE(Rapid amplification of cDNA ends)的方法來獲取抗CD3鼠源單抗mGD3的可變區編碼序列。
設計并合成以下因為1.引物設計GSP1-H5’-AGC TGG GAA GGT GTG CAC ACC A CT-3’(SEQ ID NO9)GSP2-H5’-CAG AGT TCC AGG TCA AGG TCA-3’(SEQ ID NO10)GSP3-H5’-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3’(SEQ ID NO11)GSP1-L5’-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3’(SEQ ID NO12)GSP2-L5’-TGT CGT TCA CTG CCA TCA ATC TT-3’(SEQ ID NO13)GSP3-L5’-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3’(SEQ ID NO14)AAP5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’(SEQ IDNO15)AUAP5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’(SEQ ID NO16)其中，GSP表示基因特異性引物，AAP代表5’-RACE截短錨引物，AUAP代表截短通用擴增引物。GSP1距離可變區基因最遠，用于逆轉錄反應。GSP2和GSP3用于嵌套PCR，其中GSP3在GSP2內。
用Gibco公司的Trizol Reagent試劑分別提取2×106雜交瘤細胞mGD3的總RNA。按照5’-RACE試劑盒(Pharmacia公司產品)說明書以GSP1為引物將總RNA逆轉錄成cDNA。然后給第一鏈cDNA的3’末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP為引物進行PCR擴增，將擴增產物稀釋100倍再以AUAP和GSP3為引物進行嵌套PCR擴增。兩次PCR反應均采用熱啟動，反應條件94℃5分鐘；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30個循環；72℃7分鐘。嵌套PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度約320bp，重鏈長度約360bp)。克隆到pGEM-T(Promega)載體中，轉化大腸桿菌TG1細胞后在IPTG/X-gal平板上進行篩選，取8個白色菌斑接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質粒抽提試劑盒抽提質粒并進行測序，確定了mGD3的重鏈和輕鏈可變區的DNA序列，并據此得出推斷氨基酸序列mGD3重鏈可變區(VH)的氨基酸序列(119氨基酸)QVQKSDSGGGVKQPGRSLRLSGKASGYTFTSYTAHWVRQAPGKGWNPLAYINPSSGYTKSGDKFKDRFTISRKKDKNTLFLQMDSLRPEDTGDYFCARWQDYDVYFDYWGQACLVTVSS(SEQ ID NO1)mGD3輕鏈可變區(VL)的氨基酸序列(107氨基酸)DIKLNQSPSSMNASVGDRVTISKLDSSSVSYMDDYQQTPIKAPKLLIYATSNLASGVPSTFSGSGSGTDYTFTISSQDPEDIATYYCQQWSSDNPTFGQGTKSDKTR(SEQ ID NO2)mGD3 VH的DNA序列(357核苷酸)CAGGTTCAGAAATCTGACTCTGGTGGTGGTGTTAAACAGCCGGGTCGTTCTCTGCGTCTGTCTGGTAAAGCTTCTGGTTACACCTTCACCTCTTACACCGCTCACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTTGGAACCCGCTGGCTTACATCAACCCGTCTTCTGGTTACACCAAATCTGGTGACAAATTCAAAGACCGTTTCACCATCTCTCGTAAAAAAGACAAAAACACCCTGTTCCTGCAGATGGACTCTCTGCGTCCGGAAGACACCGGTGACTACTTCTGCGCTCGTTGGCAGGACTACGACGTTTACTTCGACTACTGGGGTCAGGCTTGCCTGGTTACCGTTTCTTCT(SEQ ID NO3)mGD3 VL的DNA序列(321核苷酸)GACATCAAACTGAACCAGTCTCCGTCTTCTATGAACGCTTCTGTTGGTGACCGTGTTACCATCTCTAAACTGGACTCTTCTTCTGTTTCTTACATGGACGACTACCAGCAGACCCCGATCAAAGCTCCGAAACTGCTGATCTACGCTACCTCTAACCTGGCTTCTGGTGTTCCGTCTACCTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTACACCTTCACCATCTCTTCTCAGGACCCGGAAGACATCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCTTCTGACAACCCGACCTTCGGTCAGGGTACCAAATCTGACAAAACCCGT(SEQ ID NO4)三.人源化嵌合單克隆抗體表達載體的構建采用PCR反應分別給以上的抗體可變區加上適當的酶切位點。其中重鏈可變區的5′端設計Xba I酶切位點，3′端加上Nhe I位點，在輕鏈可變區編碼序列5′端設計HindIII位點，3′端加上BsiWI位點。
所用的PCR引物為重鏈正向引物5’-ctctctagaCAGGTTCAGAAATCTG-3’(SEQ ID NO17)重鏈反向引物5’-gacgctagcAGAAGAAACGGTAAC-3’(SEQ ID NO18)輕鏈正向引物5’-ctgaagcaaGACATCAAACTGAACCAG-3’(SEQ ID NO19)輕鏈反向引物5’-gaccgtacgacgggttttgtc-3’(SEQ ID NO20)以前述含有重鏈可變區和輕鏈可變區的質粒pGEM-T為模板進行普通PCR。將所得PCR產物克隆到pGEM-T(Promega出品)中進行序列測定確證為所需的正確目的序列。然后用Xba I和Nhe I將抗體重鏈可變區編碼序列從載體pGEM-T上切下插入到表達載體pMG18-3K相應位點，再用Hind III和Bsi WI將抗體輕鏈可變區從載體pGEM-T上切下插入到表達載體pMG18-3K相應位點(參見DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ONINCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas Schoolof Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK andFaculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State University Scorina Av.4，Minsk220080Belarus)。最后構成了嵌合抗體的表達載體pcGD3。四.人源化重組單克隆抗體VL和VH的設計本發明對抗CD3單克隆抗體mGD3的VL和VH進行了人源化設計，同時兼顧哺乳動物細胞使用密碼子的偏愛性，設計發案如下人源化抗體huGD3的重鏈可變區氨基酸序列(119氨基酸)QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDRFTISADNSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARWQDYDVYFDYWGQGTPVTVSS(SEQ ID NO5)人源化抗體huGD3的輕鏈可變區氨基酸序列(107氨基酸)DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQTPGKAPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLQITR(SEQ ID NO6)人源化抗體huGD3的重鏈可變區編碼序列(5′→3′，357bp)001 CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGCGGTGGA GTGGTCCAGC CCGGCCGCAG051 CCTGAGGCTG TCCTGCAAGG CCAGCGGCTA CACCTTCACC AGCTACACGA101 TGCACTGGGT GCGCCAAGCC CCCGGAAAGG GCCTCGAATG GATTGGCTAC151 ATTAATCCTA GCAGTGGTTA TACTAAGTAC AATCAGAAGT TCAAGGACAG201 ATTTACAATA TCAGCCGACA ACAGCAAGTC CACCGCCTTC CTACAAATGG251 ACAGCTTGCG TCCAGAGGAC ACCGCCGTAT ACTACTGTGC GCGCTGGCAG301 GATTACGACG TCTACTTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACTC CAGTCACCGT351 CTCCTCT(SEQ ID NO7)人源化抗體huGD3的輕鏈可變區編碼序列(5′→3′，321bp)001 GACATCGTTC TCACTCAGAG CCCATCCAGC TTGAGCGCAT CAGTAGGCGA051 CCGCGTAACG ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGCACT101 GGTACCAGCA GACTCCCGGC AAAGCCCCAA AGCCCTGGAT TTATGCCACA151 TCCAACCTGG CTTCTGGCGT GCCATCACGC TTTAGCGGCA GCGGGTCCGG201 TACAGATTAC ACGTTCACCA TTAGCAGTCT GCAGCCTGAG GACATAGCCA251 CCTACTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTAACC CACCGACGTT TGGCCAGGGA301 ACTAAACTGC AGATTACTCG A(SEQ ID NO8)五.人源化抗體可變區編碼序列的合成我們在人源化抗體重鏈編碼序列的5′端設計XbaI酶切位點，3′端加上NheI位點，在輕鏈編碼序列5′端設計HindIII位點，3′端加上BsiWI位點。針對以上人源化重鏈和輕鏈的DNA序列，分別合成8段長為75bp左右且相互間有20bp重疊的寡核苷酸引物，經過三次重疊PCR(見圖1)①將引物a和b，c和d，e和f，g和h分別混合進行PCR反應，得到產物ab、cd、ef、gh。②將引物a、d與上一輪PCR產物ab、cd相混合后進行擴增，同樣將引物e、h與上一輪PCR產物ef、gh相混合進行擴增，分別得到產物ad和eh。③將引物a、h與上一輪PCR產物ad、eh相混合進行PCR擴增，得到產物ah。上述PCR采用Roche公司的高保真擴增系統，分別合成以上可變區編碼序列。PCR反應條件均為95C5分鐘；94C 45秒，55C 45秒，72C 55秒，30個循環；72C 7分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，分別回收目的條帶(重鏈長度360bp左右，輕鏈長度320左右)并克隆到pGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序，確認分別得到了上述人源化單抗huGD3的VH和VL的編碼序列。六.人源化重組單克隆抗體表達載體的構建用XbaI和NheI將重鏈可變區編碼序列從載體pGEM-T上切下插入到表達載體pMG18-3K的相應位點。再用HindIII和BsiWI將輕鏈可變區從載體pGEM-T上切下插入到表達載體pMG18-3K中相應位點(參見圖2)，得到人源化重組單克隆抗體表達載體phuGD3。七.人源化抗體的表達用前文步驟三構建的pcGD3和以上構建的phuGD3轉染大腸桿菌DH5a。接種100ml LB培養基中，按照常規方法進行擴增。收獲培養物，用Qiagen公司的UltraPure質粒DNA純合試劑盒抽提純化質粒DNA。將上述純化的質粒DNA采用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒轉染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉化的CHO細胞在選擇培養基(含有0.05～10mM氨甲基蝶呤的HAT選擇培養基)上進行連續9周的選擇，最后在96孔板上進行極度稀釋培養，連續進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPM1641培養基上進行培養。對上清進行Western印跡實驗，根據染色反應判斷表達強度。選擇高表達克隆進行后續研究。結果選得分別以phuGD3轉染的克隆huGD3，和以pcGD3轉染的克隆cGD3。
用蛋白A親和層析柱從上述6個細胞系的培養上清中直接分離純化本發明的人源化單克隆抗體。SDS-PAGE電泳檢查證明，所得產物純度大于90％。
以上親和層析的產物再次經過分子篩層析研究，獲得了純度＞98％的樣品。所得抗體可用于以下的進一步研究分析。八.人源化抗體表達量的研究用ELISA方法對上述小鼠雜交瘤(mGD3)、嵌合單抗(cGD3)和人源化單抗(huGD3)的CHO細胞株的表達量進行了研究。將所述細胞株37度5％CO2培養箱中培養72小時后取5ml細胞，于5000RPM離心10分鐘，取上清進行DOT ELISA。其第二抗體為HRP標記的兔抗人抗體。顯色采用DAB系統(購自Ameresco公司)，參照廠家的說明進行染色。
多克隆抗體表達量的研究結果表達量(mg/ml)陽性對照1(mOKT3) 25.6陽性對照2(Rituxan，Genetech產品) 38.8mGD3 20.1cGD3 66.9huGD3 224.3上述結果說明，我們的小鼠雜交瘤細胞的表達量不如兩個對照但是差別不大，但是我們構建的嵌合細胞系的表達量比對照嵌合抗體表達量高出70％以上，我們的人源化抗體細胞系比兩個陽性對分別高出8.8倍和5.8倍。
如前文第6部分所述，用Protein A親和層析柱分離純化雜交瘤分泌的多克隆抗體，分別獲得鼠源抗體mGD3及人源化抗體cGD3和huGD3。九.CD3人源化單克隆抗體的生物活性鑒定人源化抗體的親和力測定用FITC標記鼠GD3(mGD3)，將飽和濃度的FITC-mGD3和一系列不同稀釋度未標記的huGD3混合后，與靶細胞(5×105人外周血單核細胞(PBMC))在4℃溫育60min。將細胞用PBS沖洗后固定，用流式細胞儀進行檢測，并計算熒光陽性細胞百分率。mGD3的親和力常數Ka用Scatchard做圖法得出。人源化抗體的親和力常數用公式[X]-[mGD3]＝(1/Kx)-(1/Ka)計算，其中Ka是mGD3的親和力常數，[X]是標記抗體的“接合/游離”值為R0/2時競爭抗體的濃度，R0表示最大熒光細胞數。結果如下mGD3 的親和力常數為1.7×109M-1huGD3的親和力常數為1.6×109M-1從結果看，本發明huGD3的親和力常數已達到了1.6×109M-1，完全達到了鼠源抗體的親和力。由此證明，這樣，我們所得的人源化抗體保持了原鼠源抗體的親和力。
熒光染色以T淋巴細胞瘤細胞HPBLL或者Jarket細胞為CD3陽性靶細胞，5×106個細胞分成5管，平均每管1×106細胞。結果如圖3所示，我們研制的重組嵌合和人源化CD3單克隆抗體比陽性對照mOKT3的親和力高2個數量級，在臨床上可以大大減少用量和降低可能的副反應，具有極大的經濟價值。
為了確定cGD3和huGD3兩種單抗與Rituxan的等效劑量，另外進行熒光染色試驗。結果如下不同單抗親和力與其濃度的關系

上述結果說明，我們研制的嵌合單抗在濃度為0.1ug/ml時，即可達到陽性對照Rituxan 1μg/ml時效果的兩倍，即我們的抗體親和力相當于對照的20倍。而我們的人源化單抗的親和力與陽性對照大體相當。
T細胞細胞膜CD3抗原調變試驗對人淋巴細胞CD3抗原的調變作用是CD3的主要免疫學功能，為了檢測人源化抗體是否還具有調變CD3分子的能力，用不同稀釋度的抗體與人PBMC(1ml)相混合后37℃溫育24h，收獲細胞用mOKT3(購自Genetech公司)-FITC(選擇mOKT3-FITC是因為它結合的表位不同于mOKT3和其他的抗CD3單抗，可直觀表示沒有被調變的CD3分子)染色，細胞用PE標記的抗CD5單抗復染(以區別出T細胞)，然后用流式細胞儀進行分析，每次結果均為3次實驗的平均值。
計算不同抗體對CD3的調變能力的公式為

人源化抗體對人淋巴細胞的調變作用試驗結果

從以上數據可以看出，huGD3對人淋巴細胞的調變作用已達到了鼠源抗體的強度，是一個保持了mGD3主要免疫功能的人源化抗體。
序列表<110>上海蘭生國健藥業有限公司<120>人源化抗CD3單克隆抗體<130>016014<160>20<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>119<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>1Gln Val Gln Lys Ser Asp Ser Gly Gly Gly Val Lys Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Gly Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Thr Ala His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Trp Asn Pro Leu35 40 45Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Ser Gly Asp Lys Phe50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Lys Lys Asp Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Asp Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Ala100 105 110Cys Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>2<211>107<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Asp Ile Lys Leu Asn Gln Ser Pro Ser Ser Met Asn Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Ser Lys Leu Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asp Asp Tyr Gln Gln Thr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Gln Asp Pro Glu65 70 75 80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Asn Pro Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Ser Asp Lys Thr Arg100 105<210>3<21l>357<212>DNA<213>小鼠(Mus nlusculus)<400>3caggttcaga aatctgactc tggtggtggt gttaaacagc cgggtcgttc tctgcgtctg 60tctggtaaag cttctggtta caccttcacc tcttacaccg ctcactgggt tcgtcaggct 120ccgggtaaag gttggaaccc gctggcttac atcaacccgt cttctggtta caccaaatct 180ggtgacaaat tcaaagaccg tttcaccatc tctcgtaaaa aagacaaaaa caccctgttc 240ctgcagatgg actctctgcg tccggaagac accggtgact acttctgcgc tcgttggcag 300gactacgacg tttacttcga ctactggggt caggcttgcc tggttaccgt ttcttct357<210>4<211>321<212>DNA<213>小鼠(Mus nusculus)<400>4gacatcaaac tgaaccagtc tccgtcttct atgaacgctt ctgttggtga ccgtgttacc 60atctctaaac tggactcttc ttctgtttct tacatggacg actaccagca gaccccgatc 120aaagctccga aactgctgat ctacgctacc tctaacctgg cttctggtgt tccgtctacc 180ttctctggtt ctggttctgg taccgactac accttcacca tctcttctca ggacccggaa 240gacatcgcta cctactactg 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27<210>20<211>21<212>DNA<213>引物<400>20gaccgtacga cgggttttgt c 2權利要求
1.一種人源化的抗人CD3單克隆抗體，其中原本人抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別被非人源重鏈可變區和輕鏈可變區所取代，所述非人源重鏈可變區選自SEQ IN NO1或SEQ IN NO5，所述非人源輕鏈可變區選自SEQ IN NO2或SEQ IN NO6。
2.一種DNA分子，其中包含權利要求1所述非人源重鏈可變區的編碼序列和/或權利要求1所述非人源輕鏈可變區的編碼序列。
3.根據權利要求2所述的DNA分子，所述非人源重鏈可變區的編碼序列選自SEQ IN NO3或SEQ IN NO7，所述非人源輕鏈可變區的編碼序列選自SEQ INNO4或SEQ IN NO8。
4.根據權利要求2所述的DNA分子，它是一種載體。
5.一種宿主細胞，它含有權利要求2至4中任一項所述的DNA分子。
6.限據權利要求5所述的細胞，所含的所述DNA分子包含在宿主相容性表達系統中。
7.根據權利要求5所述的細胞，它是哺乳動物細胞。
8.權利要求1所述抗體在制備診斷和/或治療CD3相關疾病的制劑中的用途。
9.權利要求2所述DNA分子在制備診斷和/或治療CD3相關疾病的制劑中的用途。
全文摘要
本發明提供了新人源化抗CD3單克隆抗體，其DNA編碼序列及含有該編碼序列的宿主細胞。本發明獲得了抗排異能力強、免疫原性和毒副作用小的有效免疫抑制劑，并且提高了所述抗體在哺乳動物細胞內的表達，可廣泛用于CD3相關疾病的診斷和/或治療。
文檔編號C12N15/11GK1421459SQ0113228
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月23日 優先權日2001年11月23日
發明者李春澍, 萬國光 申請人:上海中信國健藥業有限公司