專利名稱：一種將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過化學(xué)誘導(dǎo)將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，尤其是涉及一種利用聚乙二醇-氯化鈣轉(zhuǎn)化緩沖液(PTC)將外源基因高效轉(zhuǎn)入靈芝的方法。
靈芝是一種珍貴的藥用和食用菌，由于對(duì)多種疾病尤其是當(dāng)今醫(yī)學(xué)上的一些頑癥如肝炎、心血管疾病、癌癥等具有顯著的療效，因而已引起了國際醫(yī)學(xué)界的矚目。中國、日本、韓國、英國、美國已廣泛開展了靈芝的生化、藥理、臨床等方面的研究。但是關(guān)于靈芝的分子生物學(xué)方面的研究，目前很少見報(bào)道，迄今尚未有外源基因轉(zhuǎn)入靈芝中的報(bào)道。為了進(jìn)行靈芝的分子生物學(xué)研究，建立一個(gè)高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是必需的，也是利用現(xiàn)代基因工程定向改良靈芝的藥用品質(zhì)的前提。此外，靈芝是一種對(duì)人體無任何毒副作用的大型藥用和食用真菌，以它作為外源基因的受體菌，對(duì)人體安全可靠，具有與細(xì)菌、酵母菌等不同的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，它是一種應(yīng)用前景很廣的異源基因表達(dá)系統(tǒng)。因此，通過基因工程技術(shù)建立穩(wěn)定、高效的靈芝轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對(duì)充分利用和開發(fā)靈芝這一珍貴的資源有著重要的意義。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因高效轉(zhuǎn)入靈芝的方法，以便建立穩(wěn)定、高效的靈芝外源基因轉(zhuǎn)化體系，從而能夠直接有效地獲得具有優(yōu)良遺傳性狀或重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因靈芝新菌種。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的用溶壁酶將靈芝菌絲體酶解成原生質(zhì)體，所制備的原生質(zhì)體經(jīng)精制、純化后，利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，以純化的靈芝原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞，將含有外源基因的真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入靈芝原生質(zhì)體中，再將轉(zhuǎn)化后的靈芝原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng)，從而獲得靈芝轉(zhuǎn)化株。本方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)60-100個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA.107轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明包括以下具體步驟(1)靈芝原生質(zhì)體的制備用PDA液體培養(yǎng)基26-28℃，120-180rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘；接種3mL菌絲懸液到100mL MYG液體再生培養(yǎng)基中，160-200rpm搖床培養(yǎng)3天；用由1-5g溶壁酶溶解于100mL0.1-1.0mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑溶液而成的溶壁酶液，按每300mg靈芝菌絲體加1mL溶壁酶液計(jì)算，在30℃、pH值為6.0條件下酶解3-4小時(shí)；將所得原生質(zhì)體用滅菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑洗滌一次，然后用15mL STC洗滌一次，最后溶于1mL STC中；血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后稀釋到108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆茫?2)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化取160μl靈芝原生質(zhì)體(約2×107個(gè))，加入30-70μL PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入10-50μL真菌表達(dá)載體、濃度為10-100mmol/L的ATA 10-100μL和濃度為10-100mmol/L亞精胺5-50μL，充分混勻后，冰浴45分鐘；然后加入1-2mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘；4℃8000g離心5分鐘，然后用500μL STC重懸后于4℃、5000g離心5分鐘，再用1-2mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28℃放置18-24小時(shí)后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固體再生培養(yǎng)基平板；一般2-3個(gè)星期后，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
本發(fā)明中所述的真菌表達(dá)載體通常為含有外源目的基因的pAN7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒；該質(zhì)粒所帶的大腸桿菌hph基因上游和下游分別與構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gpd)啟動(dòng)子和色氨酸合成酶C基因(trpC)轉(zhuǎn)錄終止序列連接而能在真菌中表達(dá)。
本發(fā)明中所述的MYG液體再生培養(yǎng)基為麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L；再在該MYG液體培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
本發(fā)明中所述的滲透壓穩(wěn)定劑為硫酸鎂、葡萄糖或甘露醇。
本發(fā)明中所述的PTC緩沖液由濃度為10-80％(w/v)的PEG4000，濃度為1-10mmol/L的CaCl2，濃度為1-10mmol/L的Tris混合而成。
在本發(fā)明中所述的STC緩沖液由濃度為0.1-0.8mol/L的山梨醇，濃度為的10-100mmol/L Tris.Cl，濃度為10-100mmol/L的CaCl2混合而成。
本發(fā)明方法適用于現(xiàn)有的各種靈芝菌種，例如泰山赤靈芝，日本靈芝，韓國靈芝等，可用于轉(zhuǎn)化的外源基因包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌等各種來源的基因。以下以p53基因(一種抑癌基因)的轉(zhuǎn)化為例，并結(jié)合
本發(fā)明方法的效果。
從圖1至圖3可以看出，經(jīng)本發(fā)明方法用含有p53基因的pAN7-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化處理的靈芝原生質(zhì)體在含有100μg/mL HmB的MYG平板上生長(zhǎng)出眾多菌株，而且這些菌株在無選擇壓力的情況下經(jīng)過5次傳代后，仍能保持良好的HmB抗性；而未經(jīng)本發(fā)明方法處理的靈芝原生質(zhì)體則全部不能在含HmB的MYG平板上生長(zhǎng)；說明本發(fā)明方法已有效地將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入靈芝中，并且使該質(zhì)粒上的hph基因在靈芝中得到穩(wěn)定、高效表達(dá)，圖4中，野生型靈芝菌株總DNA與探針之間沒有形成雜交帶，而轉(zhuǎn)化株p53-1#、2#未酶切的基因組DNA樣品，在高分子量的位置與探針形成雜交帶。證明含有p53基因的外源質(zhì)粒已經(jīng)整合到這兩株靈芝的基因組DNA中。轉(zhuǎn)化株p53-1#基因組DNA用BamHI單酶切的樣品，則在約2kb和4kb處各產(chǎn)生1條雜交帶(兩條雜交帶的大小系根據(jù)圖中各電泳條帶的遷移率估算得出的)，證明可能有2個(gè)拷貝的p53基因整合到p53靈芝轉(zhuǎn)化株1#的基因組DNA中。從圖5中，我們測(cè)得轉(zhuǎn)基因菌株p53-1#和p53-2#的OD630分別為0.363和0.469，扣除陰性對(duì)照孔(來自非轉(zhuǎn)化靈芝菌絲的總蛋白)的OD630值0.093后，二者的凈OD值分別為0.270和0.303，根據(jù)線性回歸方程求得二者的濃度分別為8.45U/ml和11.22U/ml，換算成干菌絲含量分別為16.90U/g和22.44U/g。即1#、2#轉(zhuǎn)基因靈芝菌株中，每克靈芝干菌絲中可表達(dá)p53蛋白16.90U和22.44U。
從5張圖的顯示結(jié)果已充分說明本發(fā)明方法能有效地將外源基因高效轉(zhuǎn)化入靈芝中，并使之得到穩(wěn)定的復(fù)制、傳代和表達(dá)，從而建立了靈芝的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
本發(fā)明方法所建立的靈芝轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為靈芝開辟了廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，將使靈芝這一寶貴資源得到更充分的利用和開發(fā)。具體說來，主要包括1.靈芝有著很高的蛋白質(zhì)分泌能力，能正確進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工，包括肽鏈剪切和糖基化等，且糖基化的方式與高等真核生物的類似，而且靈芝還是已經(jīng)確認(rèn)的安全菌株，對(duì)人體有益無害，并有成熟的發(fā)酵和后處理工藝，因而可以利用靈芝轉(zhuǎn)化技術(shù)將一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的、來自高等生物的外源基因?qū)腱`芝中表達(dá)。這樣，利用靈芝發(fā)酵方法即可快速、大規(guī)模、廉價(jià)地生產(chǎn)具有活性的外源蛋白質(zhì)。
2.通過靈芝轉(zhuǎn)化技術(shù)將一些與優(yōu)良性狀有關(guān)的基因?qū)腱`芝中，可在短時(shí)間內(nèi)快速定向改良靈芝菌株，培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的靈芝新品種。
3.在基礎(chǔ)研究方面，靈芝的轉(zhuǎn)化作為真菌的基因克隆和表達(dá)系統(tǒng)，可用于基因分離、基因組結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及其調(diào)控等方面的研究，并且可為建立其它大型真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
下面對(duì)附圖作具體說明。
圖1是未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的靈芝原生質(zhì)體在含有100μg/mL HmB(潮霉素)的MYG平板上培養(yǎng)15天后的結(jié)果。
圖2是用本發(fā)明方法將含有p53基因的pAN7-1質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理后的靈芝原生質(zhì)體在含有100μg/mL HmB的MYG平板上培養(yǎng)15天后的結(jié)果。
圖3是從圖2中的轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取3個(gè)含有p53基因的抗性轉(zhuǎn)化子，將這3株轉(zhuǎn)化子先在不含HmB的MYG平板上連續(xù)傳代5代后，再接種到一個(gè)含有100μg/mL HmB的MYG平板上培養(yǎng)3星期后的結(jié)果。
圖4是將2個(gè)隨機(jī)選取的p53基因靈芝轉(zhuǎn)化菌株和一株未轉(zhuǎn)化的野生型靈芝菌株進(jìn)行Southern blot分析的結(jié)果。其中，1號(hào)泳道為質(zhì)粒pAN7-1(6.7kb長(zhǎng)，酶切成線狀質(zhì)粒)的Southern blot結(jié)果，作為正對(duì)照。2號(hào)泳道為野生型靈芝基因組DNA的Southern blot結(jié)果，作為負(fù)對(duì)照。3號(hào)泳道為轉(zhuǎn)化株p53-1#基因組DNA不作酶切的Southern blot結(jié)果。4號(hào)泳道為轉(zhuǎn)化株p53-2#基因組DNA不作酶切的Southern blot結(jié)果。5號(hào)泳道為轉(zhuǎn)化株p53-1#基因組DNA BamHI酶切的Southern blot結(jié)果。
圖5是將上述兩株p53基因靈芝轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行ELISA分析的結(jié)果。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
用PDA液體培養(yǎng)基于28℃，180rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到100mLMYG再生培養(yǎng)基中，200rpm搖床培養(yǎng)3天，然后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，去上清液，用0.6mol/L的硫酸鎂溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
稱取1克靈芝濕菌絲，加3mL由2g溶壁酶溶于100mL0.6mol/L的硫酸鎂溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解2小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗滌1次，再用15mL STC洗滌1次，最后溶于1mL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
取160μl靈芝原生質(zhì)體(約2×107個(gè))，加入30μL PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入20μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒(約10μg)和50μL、10mmol/L ATA，5μL、20mmol/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入1mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4℃8000g離心5分鐘，然后用500μL STC重懸后于4℃、5000g離心5分鐘，再用1mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28℃放置18-24小時(shí)后，取100μL涂于含有濃度為100μg/mL HmB的MYG固體再生培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。轉(zhuǎn)化頻率約為60個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA.107原生質(zhì)體。
本實(shí)施例1中的MYG液體再生培養(yǎng)基為麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L；再在該MYG液體培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
本實(shí)施例1中的PTC緩沖液由濃度為10％(w/v)的PEG4000，濃度為1mmol/L的CaCl2，濃度為1mmol/L的Tris混合而成。
本實(shí)施例1中的STC緩沖液由濃度為0.1mol/L的山梨醇，濃度為的10mmol/L Tris.Cl，濃度為10mmol/L的CaCl2混合而成。
實(shí)施例2用PDA液體培養(yǎng)基于26℃，140rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體4天，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到100mLMYG再生培養(yǎng)基中，180rpm搖床培養(yǎng)3天，然后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
稱取2克靈芝濕菌絲，加5mL由2.5g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的甘露醇溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解2.5小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗滌1次，再用15mL STC洗滌1次，最后溶于1mL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
取160μl靈芝原生質(zhì)體(約2×107個(gè))，加入50μL PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入15μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒(約15μg)和20μL、20mmol/L ATA，10μL、10mmol/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入1.5mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4℃8000g離心5分鐘，然后用500μL STC重懸后于4℃、5000g離心5分鐘，再用1.5mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28℃放置18-24小時(shí)后，取100μL涂于含有濃度為100μg/mL HmB的MYG固體再生培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。轉(zhuǎn)化頻率約為85個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA.107原生質(zhì)體。
本實(shí)施例2中的MYG液體再生培養(yǎng)基為麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L；再在該MYG液體培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
本實(shí)施例2中的PTC緩沖液由濃度為40％(w/v)的PEG4000，濃度為5mmol/L的CaCl2，濃度為5mmol/L的Tris混合而成。
本實(shí)施例2中的STC緩沖液由濃度為0.4 mol/L的山梨醇，濃度為的50mmol/L Tris.Cl，濃度為50mmol/L的CaCl2混合而成。
實(shí)施例3用PDA液體培養(yǎng)基于27℃，150rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到100mLMYG培養(yǎng)基中，130rpm搖床培養(yǎng)4天，然后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
稱取5克靈芝濕菌絲，加15mL由3g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的葡萄糖溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解3小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.6mol/L甘露醇洗滌1次，再用15mL STC洗滌1次，最后溶于1mL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
取160μl靈芝原生質(zhì)體(約2×107個(gè))，加入70μL PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入50μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒(約20μg)和50μL、100mmol/L ATA，20μL、30mmol/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入2mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4℃8000g離心5分鐘，然后用500μL STC重懸后于4℃、5000g離心5分鐘，再用2mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28℃放置18-24小時(shí)后，取100μL涂于含有濃度為100μg/mL HmB的MYG再生固體培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。轉(zhuǎn)化頻率約為75個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA.107原生質(zhì)體。
本實(shí)施例3中的MYG液體再生培養(yǎng)基為麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L；再在該MYG液體培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
本實(shí)施例3中的PTC緩沖液由濃度為80％(w/v)的PEG4000，濃度為10mmol/L的CaCl2，濃度為10mmol/L的Tris混合而成。
本實(shí)施例3中的STC緩沖液由濃度為0.8mol/L的山梨醇，濃度為的100mmol/L Tris.Cl，濃度為100mmol/L的CaCl2混合而成。
權(quán)利要求
1.一種利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是用溶壁酶將靈芝菌絲體酶解成原生質(zhì)體，所制備的原生質(zhì)體經(jīng)精制、純化后，利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，以純化的靈芝原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞，將含有外源基因的真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入靈芝原生質(zhì)體中，再將轉(zhuǎn)化后的靈芝原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng)，從而獲得靈芝轉(zhuǎn)化株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是包括以下具體步驟(1)靈芝原生質(zhì)體的制備用PDA液體培養(yǎng)基26-28℃，120-180rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘；接種3mL菌絲懸液到100mL MYG液體再生培養(yǎng)基中，160-200rpm搖床培養(yǎng)3天；用由1-5g溶壁酶溶解于100mL0.1-1.0mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑溶液而成的溶壁酶液，按每300mg靈芝菌絲體加1mL溶壁酶液計(jì)算，在30℃、pH值為6.0條件下酶解3-4小時(shí)；將所得原生質(zhì)體用滅菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑洗滌一次，然后用15mL STC洗滌一次，最后溶于1mL STC中；血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后稀釋到108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆茫?2)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化取160μl靈芝原生質(zhì)體(約2×107個(gè))，加入30-70μL PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入10-50μL真菌表達(dá)載體、濃度為10-100mmol/L的ATA 10-100μL和濃度為10-100mmol/L亞精胺5-50μL，充分混勻后，冰浴45分鐘；然后加入1-2mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘；4℃8000g離心5分鐘，然后用500μL STC重懸后于4℃、5000g離心5分鐘，再用1-2mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28℃放置18-24小時(shí)后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固體再生培養(yǎng)基平板；一般2-3個(gè)星期后，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是所述的真菌表達(dá)載體通常為含有外源目的基因的pAN7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒；該質(zhì)粒所帶的大腸桿菌hph基因上游和下游分別與構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gpd)啟動(dòng)子和色氨酸合成酶C基因(trpC)轉(zhuǎn)錄終止序列連接而能在真菌中表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是所述的MYG液體再生培養(yǎng)基為麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L；再在該MYG液體培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是所述的滲透壓穩(wěn)定劑為硫酸鎂、葡萄糖或甘露醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是所述的PTC緩沖液由濃度為10-80％(w/v)的PEG4000，濃度為1-10mmol/L的CaCl2，濃度為1-10mmol/L的Tris混合而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，其特征是所述的STC緩沖液由濃度為0.1-0.8mol/L的山梨醇，濃度為的10-100mmol/L Tris.Cl，濃度為10-100mmol/L的CaCl2混合而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法,用溶壁酶將靈芝菌絲體酶解成原生質(zhì)體,所制備的原生質(zhì)體經(jīng)精制、純化后,利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液,以純化的靈芝原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞,將含有外源基因的真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入靈芝原生質(zhì)體中,再將轉(zhuǎn)化后的靈芝原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng),從而獲得靈芝轉(zhuǎn)化株。本方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)60－100個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA.10
文檔編號(hào)C12N1/14GK1358840SQ0112974
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2001年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月11日
發(fā)明者李剛, 李寶健 申請(qǐng)人:李剛, 李寶健