人受精促進肽受體tcp11及其編碼序列及制法和用途的制作方法

專利名稱：人受精促進肽受體tcp11及其編碼序列及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)，更具體地說，本發(fā)明的多肽被命名為人受精促進肽受體TCP11。
在正常的生理狀態(tài)下，哺乳動物的精子要進行成功的受精，必須經(jīng)過獲能和隨后的頂體反應(yīng)。頂體反應(yīng)這一細胞外的事件使精子穿透透明帶并和卵細胞的質(zhì)膜融合，而獲能過程則使精子在正確的時間和地點獲得受精能力。在正常的生理狀態(tài)下，僅有極少數(shù)的精子能真正到達受精地點，而這種對于精子群體的選擇壓力有助于確保“最合適的”精子能夠受精，因此，對于精子獲能過程的調(diào)控機制的研究具有重要的理論意義和臨床意義(Fraser LR.(1998)Sperm capacitation and the acrosome reaction.Hum Reprod.Suppl 19-19)1991年，Mazarakis等采用差異篩查的方法克隆了鼠Tcp11基因(Mazarakis，N.D.，et al.(1991).Isolation and characterization of a testis-developmentally regulated gene from the distalinversion of the mouse t-complex.Devolopment 111(2)561-567.)。首先制備睪丸cDNA文庫，用來源于鼠肝和睪丸的隨機cDNA探針篩查該文庫，得到600個“睪丸特異的”克隆。再用2周和3周來源的cDNA探針篩查這些克隆，得到259個克隆。為了區(qū)分減數(shù)分裂前(2 weeks)和減數(shù)分裂期、減數(shù)分裂后(3 weeks)各個階段，用3周來源的cDNA探針篩查，得到12個克隆。隨后用來自這12個克隆的cDNA探針與2周和3周來源的睪丸、腎、肝、腦的總RNA進行雜交，得到了2個克隆與三周鼠的睪丸總RNA有雜交信號。其中，Clone46作進一步研究。以Clone46來源的cDNA探針與17天→27天的鼠的睪丸總RNA進行Northern雜交，顯示從減數(shù)分裂粗線期的較后階段或次級精母細胞的較早階段開始表達，具有階段性。對此克隆測序，獲得1515bp的部分序列。用此片段作探針篩查t6/tw1鼠睪丸cDNA文庫，得到一個含有2028bp的克隆，并含有完整的開讀框架，編碼566個氨基酸，對比Clone46和pBs13的序列，在510、789有2個靜止突變，而在508位的G→C的轉(zhuǎn)換使pBs13編碼的Gly→Clone46編碼的Arg，而修飾了一個PKC的磷酸化位點。pBs13即鼠Tcp11基因定位于鼠17號染色體t complex的distal inversion。
用Ecoli重組蛋白制備的anti-Tcp11抗體識別后期精子，Western blot顯示，抗體結(jié)合一個來自于睪丸的68KD的蛋白質(zhì)，而在其他組織來源的蛋白質(zhì)中未檢測到雜交信號。對比TCP11 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，顯示了該基因處于翻譯調(diào)控之下(Hosseini，R.，etal.(1994).The mouse t-complex gene，Tcp-11，is under translational control.Mech.Dev.47(1)73-80.)1997年，F(xiàn)raser等通過anti-Tcp11 IgG抗體證實Tcp11蛋白位于精子頂體的Cap區(qū)域，但是在頂體反應(yīng)的精子的頭部未檢測到。當附睪精子在anti-Tcp11 IgG Fab片段孵育120min后，進行CTC分析，觀察到anti-Tcp11 IgG Fab片段對獲能的促進作用和偶然頂體丟失的抑制，提示處理組比未處理組的精子具有更高的受精能力。體外受精試驗也證實，anti-Tcp11 IgG Fab片段能更快地受精和維持更高的受精能力。
因為anti-Tcp11 IgG Fab片段的這些反應(yīng)與FPP和Adenosine的作用類似，同時進行三組實驗，結(jié)果顯示Fab片段的作用位點與FPP相同而與Adenosine相區(qū)別。同時FPP的競爭性抑制劑Gln-FPP抑制Fab片段的作用，而FPP的濃度效應(yīng)抑制Fab片段的促進作用，提示Tcp11是FPP的受體(Fraser，L.R.et al.(1997).TCP-11，the product of a mouse t-complex gene，plays a role in stimlation of capacitation and inhibition of the spontaneous acrosome reaction.MolReprod Dev 48(3)375-378)。
進一步的實驗也證實了這一點，特異性的3H-FPP對于精子膜的結(jié)合，可以顯著地被Gln-FPP和anti-Tcp11 IgG Fab片段抑制。因此證實，F(xiàn)PP、Gln-FPP、anti-Tcp11 IgG Fab片段競爭同一個結(jié)合位點。此外，用抗血清A231287有到頂體反應(yīng)的精子比未處理的精子結(jié)合的3H-FPP顯著地減少，提示大部分FPP的結(jié)合位點與精子頂體的Cap域有關(guān)，Tcp11正定位于此(Adeoya-Osiguwa S.A.et al.(1998).FPP modulates mammalian sperm function via TCP-11 andthe adenlyl cyclase/cAMP pathway.Mol.Reprod.Dev.51(4)468-476)。
同時有實驗證實，100nM的FPP顯著地促進cAMP的產(chǎn)生，Gln-FPP抑制FPP的這種作用，但不抑制Adenosine的作用。而anti-Tcp11 IgG Fab片段(1/25 dilution)促進cAMP的產(chǎn)生。這些證據(jù)均支持Tcp11蛋白是FPP的受體(Fraser LR et al.(1997)A fertilization promoting peptide(FPP)-related tripeptide competitively inhibits responses to FPPa cause of male subfertility？Mol Reprod Dev.48(4)529-35)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼人受精促進肽受體基因TCP11的蛋白，本發(fā)明新的人類基因被命名為人TCP11。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人MGRF-2的方法。
本發(fā)明還涉及這種人TCP11核酸序列利多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQID NO7所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO6從核苷酸185-1510位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人TCP11蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，較佳的，該多肽是具有SEQ ID NO7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人TCP11蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人TCP11蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人TCP11蛋白的重組細胞。
(c)在適合表達人TCP11蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞。
(d)分離出具有人TCP11蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1722個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO6，其中開放讀框位于185-1510位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”和“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核苷酸的組份分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TCP11蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO6中185-1510位核苷酸序列及其簡并序列，該簡并序列是指，位于SEQ ID NO6序列的編碼框185-1510位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO6中185-1510位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO74所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，較佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO6從中核苷酸185-1510位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該主語還包括與SEQ ID NO6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人TCP11相同功能的蛋白的、SEQ ID NO6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)，純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度，基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TCP11蛋白多肽”指具有人TCP11蛋白活性的SEQ ID NO7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人TCP11相同功能的、SEQ ID NO7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人TCP11蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人TCP11 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。以及利用抗人TCP11多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白，本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人TCP11多肽或其片段的融合蛋白，除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了TCP11多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人TCP11多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供人TCP11蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人TCP11多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體，誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)，類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的類似物，應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化，修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽，這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人保守性TCP11變異多肽”指與SEQ ID NO7的氨基酸序列性質(zhì)相比，有至多10個，較佳的至多8個，更佳的至多5個，最佳的至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發(fā)明還包括人TCP11多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)人TCP11的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有人TCP11核苷酸序列的5-110個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人TCP11的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人TCP11核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于人TCP11多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。
本發(fā)明所述“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列，一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酶母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞，COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人TCP11 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人TCP11基因產(chǎn)物或片段，較佳地，指那些能與人TCP11基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人TCP11蛋白的分子，也包括那些并不影響人TCP11蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人TCP11基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO 4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人TCP11基因產(chǎn)物或其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人TCP11或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人Eur.J.Immunol.6611，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人TCP11功能的抗體以及不影響人TCP11功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人TCP11基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人TCP11基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與釋放后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人TCP11核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得，對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
只要獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時，通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個實施方案中，多核苷酸全長為1722個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO6，其中開放讀框位于185-1510位核苷酸。
同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基因同小Tcp-11高度同源。在氨基酸水平上它與小鼠的相關(guān)基因Tcp-11的一致性為78％(

圖1)。可以推測本發(fā)明的基因是小鼠Tcp-11在人體中的同源基因。
在附圖中，圖1為本發(fā)明的人TCP11蛋白(上方)與小鼠Tcp-11蛋白(下方)的氨基酸序列同源比較圖，其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“*”標出，相似的氨基酸用“.”或“”標出。
圖2為本發(fā)明的人TCP11基因的CDNA序列及編碼的氨基酸。其中ATG為起始密碼，TGA為終止密碼，AATAAA為加尾信號。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
實施例1人TCP11的cDNA序列的克隆和測定1、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及3’-cDNA末端快速擴增((Rapid amplification of cDNA ends，RACE)。
按QIAGEN公司總RNA提取試劑盒提供的方法提取和處理睪丸組織總RNA，取3ul用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech)進行。3’-RACE-Ready cDNA由健康成人睪丸總RNA逆轉(zhuǎn)錄而來。3’-通用引物(Universal primer mix，UPM)由試劑盒提供。TCP11等位基因特異的引物(the gene specific primer，GSP)序列為5’-CGA AAT ATC CTG GCG ACT CAG AGG-3’(SEQ ID No1)PCR反應(yīng)條件94℃ 2min；94℃ 30sec，68℃-0.5℃/cycle 30sec，72℃ 2min，10cycles；94℃ 30sec，63℃ 30sec，72℃ 2min，22cycles；最后72℃延伸10min。
2、PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜霁@得的PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T easy載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM107，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，然后在ALF express DNA sequencer進行雙向測序。最后用電腦軟件Omiga2.0拼接序列，獲得全長cDNA序列，共1722bp，詳細序列見SEQ ID NO6，其中開放讀框位于185-1510位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導出人TCP11的氨基酸序列，共441個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO7。
實施例2同源比較用本發(fā)明的人TCP11的全長cDNA序列，用NCBI的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)與已收錄的ESTs和nr數(shù)據(jù)庫進行核酸同源性分析，用預測的全長開讀框架的核酸序列與相應(yīng)的氨基酸序列搜索nr和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫，進行氨基酸同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基因同小鼠Tcp11高度同源。在氨基酸水平上它與小鼠的Tcp11的相同性為78％(圖1)。可以確定本發(fā)明的人TCP11基因是小鼠Tcp11在人體中的同源基因。
此外，本發(fā)明人TCP11(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人TCP11的表達水平或者抑制人TCP11的過度表達。本發(fā)明的人TCP11蛋白或其活性多肽片段可能施用于病人，以治療或減輕因人TCP11缺失、無功能或異常而導致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預后判斷，尤其是對因為該基因功能受損而引起的男性不育患者。
實施例3人TCP11在大腸桿菌中的表達編碼人TCP11的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中含全長cDNA質(zhì)粒為模板進行擴增，以合成插入片段。
5’寡核苷酸引物序列為5’-TTGCGGATCCATGGCACCAAAAGGCATATTGGG(SEQ ID NO2)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人TCP11編碼序列的23個核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTCAAACAGACTCCACTTTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO3)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個釋放終止子和人TCP11的編碼序列。
限制性同切酶的酶切位點對應(yīng)于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操作子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和SaII消化pQE-9載體、插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始，隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自O(shè)iagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Konr)。在含有Amp和Kau的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒，用BstXI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證結(jié)果表明人TCP11的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-產(chǎn)乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000mg，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人TCP11。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人TCP11，可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO7的序列一致。
實施例4人TCP11在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人TCP11的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中含全長cDNA質(zhì)粒為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TTGCGAGCTCATGGCACCAAAAGGCATATTGGG(SEQ ID NO4)該物引含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，按之是由起始密碼子開始的人TCP11編碼序列的19個核苷酸。
3’端引物序列為5’-GTTCGGATCCTCA AACAGACTCCACTTTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO5)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和人TCP11的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗體(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(flori)、一個病毒復制起點(SV 40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的poly A順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用SacI、BamHI消化pcDNA3載體、插入片段，隨后將插入片段連接到poDNA3載體，隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證結(jié)果表明人TCP11的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的，轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力，去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％ Triton的50mM Tris HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰，再用50mM Tris HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(Ph8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析，最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO7的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下，重組分子用層析法進行分離后備用，也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化，用50-100ug/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100ug/0.2ml的劑量進行腹內(nèi)注射以加強免疫，每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次，獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人TCP11基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
序列表(1)一般信息(i)申請人四川大學華西醫(yī)院(ii)發(fā)明名稱人受精促進肽受體TCP11及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO 1的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 1CGA AAT ATC CTG GCG ACT CAG AGG(2)SEQ ID NO 2的信息(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 2TTG CGG ATC CAT GGC ACC AAA AGG CAT ATT GGG(3)SEQ ID NO 3的信息(i)序列特征A)長度35堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 3GTT CGT CGA CTC AAA CAG ACT CCA CTT TTG TTT CC(4)SEQ ID NO 4的信息(i)序列特征A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 4TTG CGA GCT CAT GGC ACC AAA AGG CAT ATT GGG(5)SEQ ID NO 5的信息(i)序列特征A)長度35堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 5GTT CGG ATC CTC A AA CAG ACT CCA CTT TTG TTT CC(6)SEQ ID NO 6的信息(i)序列特征A)長度1722堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 61 cgaaatatcc tggcgactca gagggcagag aacgtaacta gtcatcaaac tgaggagctg61 tccgtgtgca acaactcaag ataaaattct tgactattga aatgcgaaaa attagattga121 ggctttgcgg ctgaattaga ttggtttttc ttgtggccac atgaggtcgc tgctggttaa181 ctgaatggca ccaaaaggca tattggggtc atttccaaca gctatgaacc tgagtctgga241 aggcaaggtc aaggagacag tgcacaatgc cttttgggac catcttaaag agcaactatc301 agcaactccc cctgacttca gctgtgctct tgaacttctg aaagaaatta aagagatctt361 gctatcactg ctattaccac gccagaaccg cctgagaatt gagattgaag aagctctgga421 catggacttg ctcaagcagg aggcagaaca tggggccctg aaagtcctct atctctctaa481 gtacgttctc aacatgatgg ctttgctgtg tgcaccagtt cgagatgaag cagtgcagaa541 actagaaaac attacggatc ctgtttggct actgagaggg atcttccagg ttctgggccg601 gatgaaaatg gacatggtga actacactat ccagagcctt caaccccacc tgcaggaaca661 ttccattcag tatgaacggg ctaaattcca ggaactcctc aataagcagc ctagtctcct721 taatcacacc accaaatggc tgacccaagc agcaggagac ctcaccatgt cacctccgac781 ttgcccagac acttctgact cctccagtgt ggctggcccc tctcccaatg aggcagccaa841 caacccagag cccctcagcc ccacaatggt gctgtgtcag ggcttcttga acctccttct901 ctgggacctt gaaaatgaag agttccctga gaccctgctg atggacagaa cccggctgca961 ggagctgaag tcccagttgc accagttaac cgtcatggcc tcagtcttgc tggtggccag1021 tagtttctcc ggcagtgttt tgtttggctc accccaattt gtagataaac tgaaacgcat1081 aaccaaatcc ttgttggaag actttcactc caggcctgag gaagctatac tgactgtgag1141 tgaacaggta tctcaggaaa tccatcaaag cctcaagaat atgggccttg ttgctctaag1201 cagtgataat acagcatctc taatgggaca gctccagaac attgccaaga aggagaactg1261 tgtctgcagt gttattgatc agcggatcca tttgtttctc aaatgctgtt tggttcttgg1321 tgtgcagcgg tctctattag accttcctgg aggccttact ctcattgaag cagaactggc1381 agaactgggc caaaagtttg tcaacttgac acatcacaat cagcaggtgt ttggtcccta1441 ctacactgag atcctaaaaa ccctcatttc cccagcccag gcactggaaa caaaagtgga1501 gtctgtttga tagcgtcggc tcagagccct ggtaccttgg acccaagagg aggcccatca1561 tcttcctgga gtaacatcac cagtgaccag cagacagtga gcttctatcc caggccctgc1621 agccagtaca ccaaggctgt agggatcaag catgtaaaca ccaactggtc catacccatt1681 cattaataaa cttcttaagt gcaagaagaa aaaaaaaaaa aa(7)SEQ ID NO 7的信息(i)序列特征A)長度441堿基(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO 7MAPKGILGSFPTAMNLSLEGKVKETVHNAFWDHLKEQLSATPPDFSCALELLKEIKEILLSLLLPRQNRLRIEIEEALDMDLLKQEAEHGALKVLYLSKYVLNMMALLCAPVRDEAVQKLENITDPVWLLRGIFQVLGRMKMDMVNYTIQSLQPHLQEHSIQYERAKFQELLNKQPSLLNHTTKWLTQAAGDLTMSPPTCPDTSDSSSVAGPSPNEAANNPEPLSPTMVLCQGFLNLLLWDLENEEFPETLLMDRTRLQELKSQLHQLTVMASVLLVASSFSGSVLFGSPQFVDKLKRITKSLLEDFHSRPEEAILTVSEQVSQEIHQSLKNMGLVALSSDNTASLMGQLQNIAKKENCVCSVIDQRIHLFLKCCLVLGVQRSLLDLPGGLTLIEAELAELGQKFVNLTHHNQQVFGPYYTEILKTLISPAQALETKVESV
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于它包括編碼具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述的序列編碼—多肽，該多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列。
4.一種分離的TCP11蛋白多肽，其特征在于它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物；更佳的該多肽是具有SEQ IDNO.7序列的多肽。
5.一種載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
6.一種用權(quán)利要求5所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于該細胞包括原核細胞和真核細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述宿主細胞，其特征在于原核細胞有大腸桿菌、枯草桿菌；真核細胞有酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞；較佳的真核細胞有CHO細胞、COS細胞。
9.一種產(chǎn)生具有人TCP11蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人TCP11蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人TCP11蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人TCP11蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人TCP11蛋白活性的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.6中人核苷酸185-1510位。
11.一種能與權(quán)利要求4所述的TCP11蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
12.一種核苷酸分子，其特征在于它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
13.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中5-110個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人受精促進肽受體基因TCP11蛋白。本發(fā)明的蛋白被命名為TCP11蛋白。本發(fā)明提供了該TCP11蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽，以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人TCP11蛋白的方法。本發(fā)明還提供了這種新的人TCP11蛋白的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/02GK1408866SQ0112885
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月17日
發(fā)明者張思仲, 馬用信, 夏慶杰, 肖翠英, 邱為民 申請人:四川大學華西醫(yī)院