專利名稱：有機磷農藥降解菌及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術，具體涉及一株可高效降解有機磷農藥的細菌菌株(Pseudomonas sp.WBC-3)，還涉及一種有機磷農藥降解菌的制備方法。
我國是高毒農藥生產大國，其中有機磷農藥約占整個農藥的57％。對硫磷一類的有機磷農藥被大量用于農業生產與害蟲防治，但其殘毒會造成環境與食品的嚴重污染，并產生大量的殺蟲劑廢物，嚴重影響了人們的身體健康及農產品的出口創匯，引起越來越多的社會的廣泛關注。一方面，國家石化局和農業部制訂出中國農藥工業“十五”發展規劃，要求在“十五”期間，削減生產高毒有機磷殺蟲劑，同時大力開發新型高效低毒替代產品；另一方面，針對目前該類農藥的大量使用對人類造成的影響，如何有效地處理，避免殘藥對環境及人類的損害，成為人們亟待解決的問題。國外文獻報道，傳統的處理有機磷農藥殘留主要采取化學法(40℃時以0.1N的NaOH處理)或焚燒、掩埋的方法，這些方法的副作用大，往往造成環境的二次污染，并且作用很慢。
曾有文獻報道了微生物處理有機磷農藥殘留的方法。多株微生物可以共代謝的方式礦化對硫磷，即一株菌將對硫磷降解成對硝基苯酚后再由其他菌株進行徹底的分解。但至今尚未有一株菌進行對硫磷有機磷農藥徹底降解的報道。
本發明的目的是提供一種有機磷農藥降解菌，利用該菌能完全降解對硫磷和甲基對硫磷，并能降解其他多種農藥，可用于治理有機磷類農藥及部分芳烴類化合物引起的環境污染與食品污染。
本發明另一目的是提供一種方法易行、操作方便的有機磷農藥降解菌的制備方法。
為達到上述目的，本發明敘述如下本發明所提供的典型微生物是假單胞菌屬的一株命名為WBC-3的菌株(Pseudomonas sp.WBC-3，CCTCC No.M201027)。該菌種的主要特征為菌體呈短桿狀，極生單鞭毛，革蘭氏染色陰性，氧化葡萄糖產酸、硝酸鹽還原及V.P.反應陰性，過氧化氫酶和氧化酶測定陽性。豐富培養基上菌落白色，光滑，邊緣整齊。能以對硝基苯酚(PNP)或對硫磷做唯一碳氮源生長，在無機鹽培養基(外加PNP濃度為100ppm-500ppm或外加MPAR濃度為100ppm-800ppm)中、28-32℃搖床培養時生長很快。在pH6-8、溫度20-40℃范圍內均生長良好；該菌的16S rDNA序列的GenBank編號為AY040872。
本發明采用先富集后篩選的方法獲得該菌。其步驟如下1)將含有機磷農藥污染土樣配制成10-30％的菌懸液，菌懸液按5％計接種于外加甲基對硫磷0.005％的無機鹽培養基，培養至穩定生長期。培養基為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.05-0.1％；培養條件為28-32℃.搖床培養時生長很快，PH6-8.溫度20-40℃范圍內均生長良好。
2)將上述培養菌懸液接入與步驟1)同樣的培養基中，培養至對數生長期，以后傳代過程中外加甲基對硫磷濃度為0.01-0.08％，逐漸升高，自0.01％逐漸升高至0.08％；3)將上述最終培養菌液用平板稀釋法進行分離純化，獲得在上述培養基中生長快、菌落規則、性狀穩定的單菌落；4)經生理生化鑒定，確定上述菌株是假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，保存于LB斜面，使用前以外加甲基對硫磷(0.01％-0.08％)的上述培養基進行馴化。
本發明用于農業生產中可有效地去除有機磷農藥殘留，與已報道的降解菌株相比，優點在于具有野生菌株的生長優勢，篩選菌株降解性能穩定，降解酶系豐富，降解底物范圍廣，可徹底降解對硫磷等有機磷類農藥。對于保護環境，減少農產品中農藥殘留，保護人們的健康具有重要的意義，適合在果蔬去農藥毒、環境污染整治中進行推廣應用。
實施例1將斜面菌種接種于含0.06％對硝基苯酚的無機鹽培養基中，活化至對數期，培養基成分為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％。將所得菌液按4％計接于含0.005％-0.1％甲基對硫磷的無機鹽培養基中，30℃培養28小時左右測其OD600值。同樣以活化好的菌液接種到含0.02％-0.3％的甲基對硫磷的葡萄糖(濃度為0.1％)無機鹽培養基中，培養至穩定期測其OD600值。結果是該菌對甲基對硫磷的耐受濃度很高，在單純無機鹽培養基中可達到0.08％，在含有葡萄糖的培養基中可達到0.2％。該菌對高濃底物的耐受是降解性能得以實現的基礎。
實施例2同實施例1的方法，將0.04％對硝基苯酚中培養20小時，活化至對數期的菌液，按5％計接于含0.03％甲基對硫磷的無機鹽培養基中，每隔一定時間取樣一次，經萃取提純后進行氣相色譜分析，測定培養基中甲基對硫磷的殘留量。中間產物對硝基苯酚的濃度則以其在405nm的特征光吸收值來測定。結果是該菌能夠以甲基對硫磷作為唯一碳源、氮源，將其水解成對硝基苯酚后再徹底降解作為生長基質。生長到對數期時對底物的消耗最為旺盛，對于0.03％的甲基對硫磷在22小時即可降解完全。
實施例3將斜面菌種首先接種于含0.004％的2，3-二氯酚、鄰苯二酚或馬拉硫磷的富集培養基中，培養基成分為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％，酵母提取物0.02％。24小時培養至菌體的OD600分別達到1.5、1.5和0.5時，取出OD值為0.75的菌量做測定用的菌膜，以0.001％標準GGA溶液(成分為150ppm葡萄糖和150ppm谷氨酸)加0.001％的二氯酚或馬拉硫磷活化所做菌膜，用活化好的菌膜進行呼吸耗氧實驗，實驗裝置為文獻(環境科學學報，1986，6184-192)所述。某些對細胞呼吸代謝有較大毒性的化合物，試驗過程同時開展了以鄰苯二酚、二氯酚、亞胺硫磷、二嗪農、殺螟松、馬拉硫磷為唯一碳源的培養試驗在0.04％的對硝基苯酚中活化的菌種以4％接種于5mL無機鹽培養基(含0.004％底物)中，于30℃振蕩培養，48小時后測其OD600的變化。結果見表1。表1可見該菌對于某些芳烴衍生物，如2，3-二氯酚、鄰苯二酚、鄰苯二胺、對苯二酚、馬拉硫磷等有較強的代謝活性；另外，對于3，4-二氯酚、PNP、二嗪農、殺螟松、喹硫磷、辛硫磷、樂果等也有一定代謝活性。用2，3-二氯酚、鄰苯二酚、馬拉硫磷、二嗪農、殺螟松、二嗪農、亞胺硫磷等物質分別培養WBC-3菌時也顯示了同樣的結果，表明該菌是一株可降解多種底物的高效菌株。
表1培養結果底物BODm 可生化性*(以OD600表示)甲胺磷 0.390.37+亞胺硫磷0 0.0299 -殺螟松 0.260.0730 +二嗪農 0.250.0494 +喹硫磷 0.18 —+辛硫磷 0.15 —+樂果0.220.15+馬拉硫磷0.510.4906 +2，4，5-T 0 0 -五氯酚鈉0 0 -3，4-二氯酚 0.21 —+2，3-二氯酚 1.521.519 +++對硝基苯酚(PNP) 0.220.1529 +對苯二酚0.68 —++鄰苯二酚1.591.492 +++鄰苯二胺0.70 —++*+，表示可生化；++，表示生化性較強；+++，表示生化性很強；-，表示無生化性
權利要求
1.一種有機磷農藥降解菌，其特征在于該微生物是假單胞菌屬Pseudomonas sp.WBC-3菌株，CCTCC NO.M201027；該菌的16S rDNA序列為GenBank Accession No.AY040872。
2.一種實現權利要求1所述的有機磷農藥降解菌的制備方法，其步驟是A)將含有有機磷農藥污染土樣配制成菌懸液，懸液按5％計接種于外加甲基對硫磷0.005％的無機鹽培養基，培養基為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，NH4)2SO40.05-0.1％，培養條件為28-32℃搖床培養，PH6-8，溫度20-40℃；B)將上述培養菌懸液接入步驟A)同樣的培養基中，培養至對數生長期，以后傳代過程中外加甲基對硫磷濃度為0.01％-0.08％C)將上述培養菌液用平板稀釋法進行分離純化；D)經生理生化鑒定，確定上述菌株是假單胞菌屬Pseudomonassp.，保存于LB斜面，使用前外加甲基對硫磷的上述培養基進行馴化。
全文摘要
本發明公開了一種有機磷農藥降解菌及其制備方法。該微生物是假單胞菌WBC－3菌株,CCTCCNO.M201027,該菌的16SrDNA序列號為GenBank AccessionNo.AY040872。制備該菌株的步驟是首先將含有有機磷農藥污染土樣配制成菌懸液,懸液接種含甲基對硫磷的無機鹽培養基;其次是將上述菌懸液接入培養基中,培養至對數生長期;第三是上述培養菌液用平板稀釋法進行分離純化;第四是經生理生化鑒定,確定上述菌株是假單胞菌,保存于LB斜面,使用前外加甲基對硫磷的培養基進行馴化。本發明篩選的菌株降解性能穩定,降解酶系豐富,降解底物范圍廣,能完全降解對硫磷等有機磷農藥,適合在果蔬農藥去毒。
文檔編號C12N1/20GK1329138SQ01128319
公開日2002年1月2日 申請日期2001年8月7日 優先權日2001年8月7日
發明者張先恩, 陳亞麗, 劉虹, 夏祥明, 王銀善 申請人:中國科學院武漢病毒研究所