多孔菌屬漆酶的應用的制作方法

專利名稱：多孔菌屬漆酶的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼一種真菌氧化還原酶的分離核酸片段，以及由該片段所產生的純化酶。更具體地講，本發明涉及編碼一種酚氧化酶，特別是擔子菌-多孔菌屬地漆酶的核酸片斷。還涉及多孔菌屬漆酶的應用。
漆酶(苯二醇氧氧化還原酶)是含多個銅的酶，它能催化酚類物質的氧化。漆酶對合適酚類底物的氧化作用，會導致芳氧基中間體的產生，所產生的中間體通過最終聚合，形成由二聚、低聚和多聚反應產物組成的混合物。這種反應在導致黑素、生物堿、毒素、木素和腐殖酸形成的生物合途徑中實際上起著重要作用。漆酶可由很多種真菌產生，包括子囊菌，如曲霉屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)和柄孢殼菌屬(Podospora)，半知菌綱的葡萄孢屬(Botrytis)，和擔子菌，如金錢屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、香菇屬(Lentinus)、側耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、多孔菌屬(Polyporus)和完全絲核菌屬(Rhizoctonia)。漆酶具有很大范圍的底物專一性，而且，各種不同真菌的漆酶在其氧化酚類底物的能力方面通常僅有量的差別。由于其底物的多樣性，漆酶一般具有很多潛在的工業應用前景。其中包括木素改性、紙張強化、洗滌劑中染料轉移的抑制、苯酚聚合作用、果汁生產、酚醛樹脂的生產、及廢水處理。
由不同真菌菌種制成的漆酶，雖然催化能力相似，但具有不同的溫度和pH最佳值，而且，溫度和pH最佳值也會根據具體的底物而有所不同。已經分離得到多種上述真菌漆酶，而且，編碼其中幾種酶的基因也已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5119-128，1992)披露了編碼粟樹枯萎真菌Cryphonectria parasitica的漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol.Chem.26515224-15230，1990；JP2-238885)披露了白腐擔子菌Coriolus hirsutus漆酶的兩種等位形式。Germann和Lerch(Experientia 41801，1985；PNAS USA 838854-8858，1986)報道了對粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)漆酶基因的克隆和部分序列分析結果。Saloheimo等(J.Gen.Microbiol.1371537-1544，1985；WO92/01046)披露了對來自真菌Phlebia radiata的漆酶基因的結構分析結果。
所做的在異源真菌系統中表達漆酶基因的嘗試，通常獲得極低的產率(Kojima等，Supra；Saloheimo等，Bio/Technol.9987-990，1991)。例如，在實驗室規模的發酵中，Phlebia radiata漆酶在Trichoderma reesei中進行的異源表達，在每升發酵液中僅有20mg活性酶(Saloheimo，1991，supra)。盡管漆酶具有巨大的商業潛力，但是，能否大量表達這種酶是決定其商業應用前景的關鍵。以前所做的在重組宿主中表達擔子菌漆酶的嘗試中，只得到極低的產率。本發明要提供在曲霉屬中表達良好的新的擔子菌漆酶。
本發明涉及一種DNA結構，該結構帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的核酸序列。本發明還涉及分離到的由上述核酸序列編碼的漆酶。這種漆酶最好基本上是純的。“基本上是純的”是指一種漆酶中基本上(即≥90％)不含其它非漆酶蛋白。
為促進上述新漆酶的生產，本發明還提供了帶有要求保護的核酸序列的載體和宿主細胞，這種載體和宿主細胞可用于所述漆酶的重組生產。所述核酸序列與轉錄和翻譯信號可操縱地連接，這些信號可指導所述漆酶蛋白在所選擇的宿主細胞中表達。優選的宿主細胞是真菌細胞，曲霉屬的細胞為最佳宿主細胞。本發明漆酶的重組生產是這樣實現的在適合漆酶蛋白表達的條件下培養用本發明的結構轉化或轉染的宿主細胞，并從培養物中回收所述漆酶蛋白。
本發明的漆酶可用于很多需要對酚類物質進行氧化的工業方法中。所述方法包括木素加工、果汁生產、苯酚聚合和酚醛樹酯生產。


圖1表示帶有LCC1(SEQ ID No.1)的基因組克隆21GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖2表示帶有LCC2(SEQ ID No.3)的基因組克隆23GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖3表示帶有LCC3(SEQ ID No.5)的基因組克隆24GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖4表示帶有LCC4(SEQ ID No.7)的基因組克隆31GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖5表示帶有LCC5(SEQ ID No.9)的基因組克隆41GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖6表示載體pMWR1的結構。
圖7表示載體pDSY1的結構。
圖8表示載體pDSY10的結構。
圖9表示由pDSY2所產生的漆酶的pH曲線；(A)丁香醛連氮氧化作用；(B)ABTS氧化作用。
圖10表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發的染料前體的比較，測量DL*。
圖11表示用漆酶和H2O2分另處理各種用于染發的染料前體的比較，測量Da*。
圖12表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發的各種染料前體和改性劑的比較，測量DL*。
圖13表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發的洗滌穩定性的比較。
圖14表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發的耐曬性。
Polyporus pinsitus是一種擔子菌，又被稱為絨毛樣栓菌(Trametesvillosa)。多孔菌早先就已被確認為漆酶生產菌(Fahraeus和Lindeberg，Physiol.Plant.6150-158，1953)。不過，尚未見從Polyporus pinsitus中提純漆酶的報道。業已證實Polyporus pinsitus能產生至少兩種不同的漆酶，而且可將編碼這兩種酶的基因用于在簡便的宿主系統，如曲霉屬中以較高的產率生產這種酶。另外，還分離到能編碼漆酶的3個其它基因。
通過對各種真菌菌株的初步篩選表明，P.pinsitus是一種漆酶產生菌，P.pinsitus產生漆酶是由2，5-二甲代苯胺誘導的。首先，從誘導的菌株的上清液中分離漆酶。陰離子交換層析證實，一種約為65 kD(在SDS-PAGE上測得)的蛋白質具有漆酶活性。對該酶進行充分純化，以便得到幾種內肽序列，和N-末端序列。初步的序列資料表明，這種漆酶與Coriolus hirsutus的漆酶以及一種未鑒定的擔子菌漆酶有明顯的同源性(Coll等，Appl.Environ.Microbiol.594129-4135，1993)。根據上述序列信息設計出PCR引物，并對從P.pinsitus中分離的cDNA進行PCR。通過PCR獲得了一條預計大小的帶，而且，分離得到的與纖維素酶信號序列連接的片段被證實可在米曲霉(A.Oryzae)中表達一種活性漆酶，但表達水平很低。上述PCR片段之一還被用作篩選P.pinsitus cDNA文庫的探針。以這種方式鑒定得到100個以上的陽性克隆。對這些陽性克隆進行特征分析，并對最長克隆的末端測序；在這些克隆中，沒有發現一個具有完整長度。
還進行了分離完整長度克隆的進一步努力。用按上述方法分離到的最完整的cDNA片段檢測一個5-6kb BamHI大小選擇的P.pinsitus基因組文庫。初步篩選證實，克隆24GEN(LCC3)與該cDNA有同源性，但它不是該cDNA編碼的漆酶，而且也不是完整長度。隨后篩選一個7-8kb BamHI/EcoRI大小選擇的文庫表明，至少有兩種漆酶；部分序列分析表明，一種被稱為21GEN(LCC1)的克隆與所分離的原始部分cDNA克隆相同，而另一種被稱為31GEN(LCC4)的克隆是一種新的，以前未鑒定過的漆酶。用LCC1作為探針再次篩選一個EMBL4基因組文庫，鑒定了一類含有完整的LCC1插入片段及其5′和3′側翼區的克隆。用LCC3篩選EMBL文庫鑒定了另外兩個編碼漆酶的克隆，這兩個克隆是以前未被鑒定過的，被稱為41GEN(LCC5)和23GEN(LCC2)，它們在結構上也與另外3個克隆LCC1、LCC3和LCC4不同。上述每種漆酶的核酸序列和預測的氨基酸序列分別在圖1-5和序列號SEQ ID No.1-10中給出。在表2中對每種漆酶的結構組織進行了比較。這些漆酶通常在約4-5.5的酸性pH條件下具有最佳活性。
將LCC1用于產生表達載體，再將所產生的載體用于轉化曲霉屬的各種菌種。在所有試驗過的菌種中轉化都取得了成功，但表達水平在黑曲霉(Aspergillus niger)中最高。在搖瓶培養中，能產生濃度為15mg/l或15mg/l以上的漆酶，而在實驗室規模的發酵罐中，獲得了超過300mg/l的產率。與先前用其它漆酶和其它真菌宿主細胞獲得的漆酶水平相比，上述產率代表了一種重大改進。
根據本發明，通過上述方法或本領域中任何其它已知方法，利用本發明所提供的信息，可獲得編碼一種漆酶的多孔菌屬基因。該基因可利用一種表達載體以活性形式表達。適用的表達載體，帶有一個能使該載體穩定整合到宿主細胞基因組上或能使該載體在宿主細胞中獨立于該宿主細胞的基因組之外進行自主復制的因子，而且最好還帶有一個或一個以上便于選擇轉化宿主細胞的表型標記。該表達載體還可以包括編碼啟動子、核糖體結合位點、翻譯起始信號的各種操縱序列，并可有選擇地帶有一個阻抑基因或各種激活基因。為了讓表達的蛋白能夠分泌，可將編碼一種信號序列的核苷酸插在基因編碼序列之前。為了在操縱序列指導下進行表達，將有待按照本發明使用的漆酶基因與所述操縱序列在正確的閱讀框架中進行可操縱連接。可結合到質粒載體上、并可指導漆酶基因轉錄的啟動子序列，包括但不限于原核β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)和tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。還可從“Useful Proteins from recombinant bacteria”(Scientific American，1980，24274-94)一文和SamDrook等所著的Molecular Cloning(1989)一書中找到其它可供參考的信息。
攜帶本發明DNA結構的表達載體，可以是有利于進行重組DNA方法的任何載體，載體的選擇通常取決于將被導入所選載體的宿主細胞。因此，所述載體可以是一種自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，如質粒或染色體外因子，微型染色體或人工染色體。另外，所述載體可以是這樣的當它被導入宿主細胞后能整合到宿主細胞基因組上，并與其所整合的染色體共同復制。
在該載體上，漆酶DNA序列與一個合適的啟動子序列可操縱地連接。該啟動子可以是任何在所選擇的宿主細胞中具有轉錄活性的DNA序列，并可由編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因衍生而來。用于指導本發明的DNA結構轉錄，特別是在細菌宿主中轉錄的合適的啟動子的例子有大腸桿菌(E.coli)lac操縱子的啟動子、StreptomgcesCoelicolor瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣型芽胞桿菌(BacillusLicheniformis)α-淀粉酶基因(amgL)啟動子、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥淀粉酶基因(amgM)啟動子、淀粉液化桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)啟動子或枯草桿菌(Bacillus Subtilis)xylA和xylB基因啟動子。在酵母宿主中，一種有用的啟動子是eno-1啟動子。為了在真菌宿主中轉錄，可以使用的啟動子的例子有由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生而來的啟動子。優選TAKA-淀粉酶和glaA啟動子。
本發明的表達載體還可包括一個合適的轉錄終止子，而且，在真核生物中，與編碼本發明漆酶的DNA序列可操縱地連接的聚腺苷酸化序列。終止序列和聚腺苷酸化序列可以源自與上述啟動子相同的來源。所述載體還可以包括一個使該載體能夠在上述宿主細胞中復制的DNA序列。這種序列的例子包括質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復制起點。
所述載體還可以包括一個選擇標記，例如一個基因，該基因的產物能夠彌補宿主細胞的某種缺陷，如來自枯草桿菌或地衣型芽胞桿菌的dal基因；或是一種能賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的基因。曲霉屬選擇標記的例子包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB，一種能產生潮霉素抗性的標記。用于曲霉屬宿主細胞的優選選擇標記是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標記。常用的哺乳動物標記是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。另外，還可以通過共轉化實現選擇，例如在WO91/17243中所披露的。
一般，希望表達能夠產生一種胞外產物。因此，本發明的漆酶可以包括一個前導區，它使得表達的蛋白質能分泌到培養基里。如果需要，該前導區可以是本發明漆酶的天然前導區，或是被其它前導區或信號序列所取代，通過取代編碼相應前導區的DNA序列可很容易地實現上述目的。例如，所述前導區可來源于獲自曲霉菌的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、獲自芽胞桿菌的淀粉酶基因、獲自Rhizomucer miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、獲自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子編碼基因或小牛前凝乳酶原基因。特別理想的是，當宿主是真菌細胞時，所述前導區為米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶的信號序列，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信號，Rhizomucor miehei脂肪酶信號，芽包桿菌NCIB11837生麥淀粉酶、嗜熱芽胞桿菌α-淀粉酶、或地衣型芽胞桿菌枯草溶菌素的信號序列。
用于把本發明的DNA結構分別與啟動子、終止子和其它因子連接的方法，以及將連接后的DNA序列插入帶有復制所需的信息的合適載體的方法，是本領域技術人員所熟知的(例如，Sambrook等，MolecularCloning，1989)。
帶有上述本發明的DNA結構或表達載體的本發明的細胞，能很好地用作重組生產本發明的酶的宿主細胞。該細胞可用本發明的DNA結構進行轉化，通過將DNA結構整合到宿主染色體上而順利地進行。這種整合被一般視為一種優點，因為該DNA序列更傾向于穩定地維持在細胞中。所述DNA結構與宿主染色體的整合可通過常規方法實現，例如，通過同源或異源重組。另外，還可用上文中與不同類型宿主細胞一起論及的表達載體轉化所述細胞。
所述宿主細胞可選自原核細胞，如細菌細胞。合適的細菌的例子包括革蘭氏陽性細菌，如枯草桿菌、地衣型芽胞桿菌、Bacillus lentus、短桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilus)、淀粉液化芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、環狀芽胞桿菌(Bacillus Circulans)、Bacillus lantus、巨大芽胞桿菌(B.megaterium)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)或鉛色鏈霉菌(Streptomyces lividans)或灰色鏈霉菌(Streptomyces murinus)，或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。細菌的轉化可通過已知方法來實現，例如通過原生質體轉化或通過使用感受態細胞。
所述宿主細胞也可以是真核細胞，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或最好是真菌細胞，真菌細胞包括酵母和絲狀真菌。例如，可選用的哺乳動物細胞包括CHO或COS細胞。酵母宿主細胞可選自酵母屬或裂殖酵母屬的一個種，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。能采用的絲狀真菌，可選自曲霉屬的一個種，如米曲霉或黑曲霉。另外，還可以把鐮孢菌(Fusarium sp.)，如尖鐮孢(F.oxysporum)用作宿主細胞。真菌細胞可以通過一種包括原生質體形成和原生質體轉化的方法轉化，在原生質體轉化之后，以一種已知方式再生細胞壁。在歐洲專利EP238023中披露了一種轉化曲霉屬宿主細胞的適宜方法。Malardier等(1989)披露了一種轉化鐮孢菌的合適方法。
因此，本發明提供了一種生產本發明的重組漆酶的方法，該方法包括在有利于所述漆酶產生的條件下培養上述宿主細胞，從該細胞和/或培養基中回收所述漆酶。用于培養上述細胞的培養基可以是任何適于這種宿主細胞生長并能表達本發明的漆酶的常規培養基。合適的培養基可從供應商那里購買或按照公開的配方(例如，可參看American TypeCulture Collection目錄)制備。
在一種優選實施方案中，在有過量銅的條件下，在培養中實現了漆酶的重組生產。盡管加入培養基中的微量元素通常含有少量的銅，但結合本發明所做的實驗表明，補加銅可以使活性酶的產率增加很多倍。理想的是，以可溶形式把銅加進培養基中，最好是以可溶性銅鹽形式加入，如氯化銅、硫酸銅或乙酸銅。培養基中銅的最終濃度應在0.2～2mM范圍內，最好在0.05～0.5mM范圍內。這方法可用于提高任何重組生產的真菌漆酶，以及其它含銅酶，特別是氧化還原酶的產率。
可通過常規方法從培養基中回收所產生的酶，該方法包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞；用鹽，如硫酸氨沉淀上清液或濾液中的蛋白質成分；隨后用各種層析方法進行提純，如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。理想的是，通過SDS-PAGE測得所提取的蛋白質的純度約為90％，在食品、果汁或洗滌劑方面的應用中，純度最為重要。
在一種特別優選實施方案中，在真菌宿主細胞，如曲霉屬細胞里實現了漆酶的表達。正如將要在下面的實施例中詳細講述的，把漆酶基因連接在一種帶有米曲霉TAKA α-淀粉酶啟動子和構巢曲霉amdS選擇標記的質粒上。另外，admS也可以在另一種質粒上，將這種質粒用于共轉化。按照Yelton等(PNAS USA811470-1474，1984)的方法，用上述質粒轉化曲霉菌宿主細胞，如米曲霉或黑曲霉宿主細胞。
特別值得一提的是，在本發明中以曲霉菌為宿主細胞所得到的多孔菌屬漆酶的產率出乎意料地明顯高于先前報道過的在其它宿主細胞中表達其它漆酶的產率。預計，在生產來自其它擔子菌，如草蓋菌屬(Coriolus)或栓菌屬(Trametes)的漆酶時，將曲霉菌屬用作宿主細胞，也能產生比以前所能達到的量更大的酶。因此，本發明還包括在曲霉屬重組宿主細胞中生產上述類多孔菌屬漆酶。
本領域技術人員可以理解，本發明并不局限于使用本文所披露的核酸片段，例如在圖1-5中披露的核酸片段。很明顯，本發明還包括編碼與圖1-5所示相同的氨基酸序列的核苷酸序列，但這種序列由于遺傳密碼的簡并而與圖中所示的核苷酸序列有所不同。此外，在說明書和權利要求書中對圖1-5的說明應當被理解為既包括所示出的基因組序列，又包括相應的cDNA和RNA序列，而本文所采用的“DNA結構”和“核酸序列”應當被理解成包括所有這類變形。“DNA結構”一般被理解成單鏈或雙鏈DNA分子，這種DNA結構可以從天然存在的基因中分離出它的一部分，或對其進行修飾，以使其含有以天然狀態下沒有的方式結合和并列的DNA片段。
另外，本發明還包括其它多孔菌屬漆酶，如存在于Polyporuspinsitus中的其它形式的漆酶，以及由Fries所定義的多孔菌屬的定義范圍內的其它真菌中所存在的漆酶，或Long等(1994，ATCC Names ofIndustrial Fungi，ATCC，Rockville，Maryland)所定義的多孔菌屬的同物異名真菌中所存在的漆酶。通過采用在本發明實施例中所述的方法，可以從本文所列舉的來源之外的、公開銷售的多孔菌屬菌株鑒定和分離漆酶基因。另外，這里所披露的序列可用于設計引物和/或探針，將其用于通過標準PCR或Southern雜交技術分離漆酶基因。其它名稱的多孔菌包括，但不局限于P.zonatus、P.alveolaris、P.arcularius、P.australiensis、P.badius、P.biformis、P.brumalis、P.ciliatus、P.colensoi、P.eucalyptorum、P.meridionalis、P.varius、P.palustris、P.rhizophilus、P.rugulosus、P.squamosus、P.tuberaster和P.tumulosus。還包括同物異名的漆酶，例如，多孔菌屬的種或株的變形或完整形式。公眾可很容易地從很多培養物保藏中心得到多孔菌屬菌株，例如，可從ATCC獲得ATCC26721、9385、11088、22084；可從DSM獲得DSM1021、1023和1182；可從CBS獲得CBS687.70、166.29、101.15，276.31、307.39、334.49和332.49。本發明還包括任何改變形式的核苷酸序列及其所編碼的蛋白質，這種蛋白質與圖2-5中所示的任一氨基酸序列的同源性至少約為80％、至少約為85％較為理想，至少約為90-95％最為理想，而且在實質上它具有本文所示序列的漆酶活性。上述類型中可以使用的變體包括，例如，已進行過保守氨基酸取代的蛋白質，這種取代不會明顯影響該蛋白質的活性。保守取代是指同一類型的氨基酸可被這一類型的其它氨基酸所取代。例如，非極性脂族殘基Ala、Val、Leu和Ile之間可以互相替換，堿性殘基Lys和Arg之間或酸性殘基Asp和Glu之間也可以相互替換。類似地，Ser和Thr互為保守取代基，Asn和Gln互為取代基。本領域技術人員可以理解，可以在對該分子的功能起關鍵作用的區域之外進行這種取代，并且仍能得到有活性的酶。例如用本發明實施例中所述的標準ABTS氧化方法，能夠很方便地測定所保留的需要的活性。
所述蛋白質可用在許多不同的工業方法中。這些方法包括在溶液中的木素聚合，所述木素包括硫酸鹽紙漿和木素硫酸鹽，通過聚合產生具有較高分子量的木素。這種方法披露于下列文獻中Holzforschung(Jin等，45(6)，467-468，1991)；US-4，432，921；EP0275 544；PCT/DK93/00217(1992)。
本發明的漆酶還可用于牛皮紙槳中木素的原位解聚，從而產生一種木素含量較低的紙漿。漆酶的這種用途，是對現行用氯解聚木素的一種改進，現行方法會產生氯化芳族化合物，這種化合物是由造紙廠生產的對環境有害的付產品。這類用途披露于下列文獻中，例如，CurrentOpinion in Biotechnology 3261-266，1992；J.Biotechnol.25333-339，1992；Hiroi等，Svensk papperstidning 5162-166，1976。
對染料或染料前體及其它有色化合物的氧化作用，會導致該化合物脫色。可將漆酶用于這種目的，在不希望染料在織物間轉移的情況下，使用漆酶特別有利，例如在紡織業和洗滌劑業中。用于染料轉移抑制和染料氧化的方法披露在以下文件中WO92/01406、WO92/18683、EP0495836和Calvo，Mededelingen Van de Faculteit Landbouw-Wetenschappen/Rijiksuniversitet Gent.561565-1567，1991；Tsujino等，J.Soc.Chem.42273-282，1991。
所述漆酶特別適用于染發。在這一用途中，漆酶與染料前體(最好在毛發上)接觸，從而實現對染料前體的有控制的氧化，將所述前體轉化成染料或色素產生化合物，如醌類化合物。所述染料前體最好是屬于下列三大化合物家族之一的一種芳族化合物二胺、氨基苯酚(或氨基萘酚)和苯酚。上述染料前體可單獨使用或組合使用。共聚作用的中間體，至少有一種必須是鄰-或對-二胺或氨基苯酚(主要中間體)。其例子見下文的第V部分，而且還披露在US-3,251,742中，該專利的內容被用作本文的參考。在一種實施方案中，原料不僅包括所述酶和主要中間體，而且還包括一種改性劑(成色劑)(或多種成色劑的組合物)，所述改性劑通常是間-二胺、間-氨基苯酚、或多酚。在所述漆酶的存在下，所述改性劑再與主要中間體反應，將其轉化成有色化合物。在另一種實施方案中，所述漆酶可直接用于所述主要中間體，將中間體氧化成有色化合物。在任何情況下，所述染色方法都可用一種或一種以上主要中間體單獨進行或與一種或一種以上改性劑一起進行。各種成分的用量與類似成分的常見商業用量一致，而各種成分的比例可相應變化。
所述漆酶的應用，是對傳統的H2O2的使用的一各種改進，在使用H2O2時會損傷毛發，而且使用它還需要高pH，這樣也會損傷毛發。相反，與漆酶的反應可在堿性、中性或者甚至在酸性pH條件下進行，而且氧化所需的氧氣來自空氣，而不是進行苛刻的化學氧化作用。使用所述多孔菌屬漆酶所產生的結果，不論在顯色方面，還是在耐洗性和耐曬性方面，都可與使用H2O2所產生的效果媲美。另一種商業優勢是，可用一個容器包裝在沒有氧氣的條件下同時盛放漆酶及其前體，這種安排不可能用于H2O2的包裝。
本發明的漆酶還可用于存在于液體中的酚類或苯胺類化合物的聚合作用。這種用途的一個例子是，用它處理果汁，如蘋果汁，這樣，所述漆酶可加快果汁中的酚類化合物的沉淀，從而產生一種更為穩定的果汁。這類應用披露了下列文獻中Stutz，Fruit Processing 7/93，248～252，1993；Maier等，Dt.Lebensmittel-rindschau 86(5)137-142，1990；Dietrich等，Fluss.Obst 57(2)67-73，1990。
漆酶，如多孔菌屬漆酶還可用于土壤解毒(Nannipieri等，J.Environ.Qual.20510-517，1991；Dec和Bollag，Arch.Environ.Contam.Toxicol.19543-550，1990)。
通過下面的非限定實施例對本發明作進一步說明。
實施例
I.分離Polyporus pinsitus漆酶
材料和方法
1.酶促試驗
除非另有說明，在本申請的所有實施例中，漆酶活性是按下述方法用丁香醛連氮和2，2′-雙連氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)測定的。使用19μM底物，在530nm波長處監測丁香醛連氮的氧化。在30℃溫度下，在25mM乙酸鈉、40μM硫酸銅、pH5.5的溶液中，其活性用LACU(μmole/分鐘)表示。采用Britton和Robison(B&R)緩沖液進行pH特征研究，這種緩沖液是按照披露于Quelle，Biochemisches Taschenbuch，H.M.Raven，II.Teil，s.93u.102，1964中的方法制備的。ABTS氧化作用，是使用0.1mM ABTS，在0.1MNaAc(pH5.0)中，在室溫下進行的，通過在96孔滴定板(Costar)上監測ΔAbs405或在石英比色杯中監測ΔAbs418。重疊ABTS氧化酶活性試驗是這樣進行的將冷卻的ABTS-瓊脂糖(0.03～0.1gABTS，1g瓊脂糖、50ml H2O、加熱溶化瓊脂糖)傾注在天然IEF凝膠或PAGE上，并在室溫下保溫。
2.漆酶的初步分離
為了提取所述漆酶，在一個超濾器(緩慢過濾)上用HFSC過濾800ml培養液。在一個帶有GR81PP膜的Amicon cell上，將所得到的澄清濾液濃縮并洗滌至72ml的體積。
將1ml漆酶試樣同用0.1M磷酸鹽(pH7)平衡過的Q-SepharoseHP(Pharmacia，Sweden)柱結合，并用NaCl梯度液洗脫結合上去的漆酶。總共對10×1ml的樣品進行提純，收集，濃縮并通過超濾洗滌，超濾時使用分子量截斷值為6kD的膜。
3.二次提純
在二次提純時，通過超濾對發酵液進行過濾和濃縮。原料中含187LACU/ml。所得濃縮液在一個Propex23濾器(P&S Filtration)上，用3％Hyflo Cuper-Cel(HSC；Celite Corporation)進行快速過濾，隨后在一個Filtron濾器上進行兩次超濾，使用兩個膜，每個膜的分子量截斷值為3kD。把所得到的樣品(2.5mS/cm，pH7.0，4℃)加到一個130mlQ-Sepharose柱上，該柱用磷酸鈉(1.1mS/cm，pH7.0)平衡過。在這種條件下，漆酶不與上述柱結合，但在加入并用平衡緩沖液洗滌時緩慢地從柱上洗脫，以致只能與其它棕色材料部分分離。
將這種部分提純的1.0mS的制劑(在20℃下pH7.0)加到Q-Sepharose柱上。該柱用20mM磷酸鈉(2.2mS，pH7.0)平衡。在這種條件下，漆酶與柱結合，并可由0-1MNaCl梯度以20倍的柱體積洗脫。
3、序列分析
為了進行內肽序列分析，用胰蛋白酶消化純化的蛋白質，然后用HPLC提純肽。在一臺Applied Biosystem473A序列測定儀上分析純化的肽的序列。
B、結果和討論
1、初步特征分析
初步提純的總產率大約為50mg(在A280nm處測得)。純化的酶為濃藍色，而且在SDS-PAGE上大約65kd的位置僅有兩條極為接近的帶。用含有底物的天然PAGE進行的疊層試驗表明，兩條帶對ABTS都有漆酶活性。吸收光譜表明，除了在A280nm處有吸收外，純化的漆酶在約600nm處也有吸收。
2、序列分析
對初步純化的蛋白質進行N-末端測定表明，有一個單一序列
Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Pro-Asp-Gly-Phe-Pro…
由于該N-末端序列并非可用于構建探針的理想序列，又進行了胰蛋白酶消化的其它試驗，隨后再對所得片段進行進一步提純(按上述方法)和測序。
2、二次提純和特征分析
在二次提純時，由另一個Q-Sepharose層析步驟產生以下洗脫庫(pools)。
Q-Sepharose-2-庫-1 40ml 112LACU 47LACU/A280
Q-Sepharose-2-庫-3 80ml 385LACU 65LACU/A280
洗脫產率大于加樣量的80％。高度純化的制劑Q-Sepharose-2-庫-3的A280＝5.9，而A280/A260＝1.4。以蛋白質計算，原料中漆酶的純度極高，但原料為非常深的棕色。在SDS-PAGE上可見到兩條帶，一條65kD的主帶，和一條較小的62kD的帶。采用陰離子層析，在第一個峰(Q-Sepharose-2-庫-1)中，僅能看到主帶，而在第二個峰(Q-Sepharose-2-庫-3)中，兩條帶都可以看到。
3、序列
測定了若干內肽序列，并與Coriolus hirsutus(Ch)漆酶序列進行比較。鑒定的片段如下Tryp 13Ser-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Asp-LeuTryp 14Ser-Ala-Gly-Ser-Thr-Val-Tyr-Asn-Tyr-Asp-Asn-Pro-Ile-Phe ArgTryp 16
序列1Ser-Thr-Ser-Ile-His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-Gln-Lys
序列2Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-ValTryp 18Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-AsnTryp 19
序列1Leu-Gly-Pro-Ala-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Leu-Ile-
序列2Phe-Gln-Leu-Asn-Val-Ile-Asp-Asn-Asn-Thr-Thr-His-Thr-MetTryp 25Tyr-Ser-Phe-Val-Leu-Glu--Ala-Asn-Gln-Ala-Val-Asp-Asn-Tyr-Trp-Ile-ArgTryp 27Gly-Thr-Asn-Trp-Ala-Asp-G1y-Pro-Ala-The
II.Polyporus pinsitus漆酶cDNA克隆的分離
A、材料和方法
1、RNA制備
用鈲鹽/CsCl緩沖法，從10g在有二甲代苯胺誘導的條件下生長6.5小時的P.pinsitus菌絲體中提取RNA。在一個寡脫氧胸苷酸柱上對所得RNA進行聚腺苷酸(Poly-A)選擇，采用標準條件。得到120μgmRNA，并以5μg的試樣在-80℃下呈冷凍顆粒形式保存。
2、單鏈cDNA
按照生產商的說明，用反轉錄酶“Super Script”(BRL)合成單鏈cDNA。
3、cDNA文庫的構建
用庫存的IV cDNA試劑盒(Invitrogen)構建一個cDNA文庫。得到50個cDNA庫，每庫含有大約5000個轉化體。
4、PCR
在下列標準條件下進行PCR100pmol各種引物，10μl10×PCR緩沖液(Perkin-Elmer)，40μldNTP 0.5mM，2μl單鏈cDNA(或約100ng染色體DNA或100ngPCR片段)，用H2O把體積調至100μl，2.5UTaq聚合酶。進行3次。(40℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環，接著再進行30次(60℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環。
B、結果和討論
1、克隆P.pinsitus漆酶
用引物#3331ACCAGNCTAGACACGGGNTC/AGATACTG/ACGNGAGAGCGGAC/TTGCTGGTCACTATCTTCGAAGATCTCG
和引物#3332CGCGGCCGCTAGGATCCTCACAATGGCCAA/CTCTCTG/CCTCG/ACCTTC進行PCR。獲得一條清晰的約1500bp的帶。用NotI/HindIII消化這種DNA，并在瓊脂糖凝膠上進行分離。對上帶(片段#42)進行提純，并將其克隆到曲霉屬載體pHD423上。未得到轉化體。為了克隆該片段，進行了幾種試驗，包括用限制酶進行再消化，末端磷酸化，補充克列諾(Klenow)片段，和在SmaaI裂解的puC18上進行平端克隆，但均未成功。用根據Coll等披露的漆酶制備的漆酶探針雜交，結果表明，上述PCR產物可能是P.pinsitus漆酶。在試圖克隆該PCR片酸的新的努力中，進行一種新的PCR反應，采用與片段#42相同的條件。結果又得到約為1500bp的片段(片段#43)。這一次是用HindIII/BamHI裂解該片斷，并將其同HindIII/BamHI裂解的pUC18連接。發現3個克隆#43-/A，-B、-G中帶有1500bp的片段。部分序列分析結果表明，這些片段與漆酶有關。
2、P.pinsitus漆酶的表達
為了表達所述漆酶，將片段#43與來自一種43KD纖維素酶的信號序列連接，將引物pHD433(TAGCGGATCCCACAATGCGTTCCTCCCCCCTCCTCCCGTCCGCCGTTGTGGCCGCCCTGCCGGTGTTGGCCCTTGCCGGCATTGGGCCCGTCGCGGACC)
用于進行標準的PCR反應，采用一種pUC正向引物(NewEngland Biolabs)。為了減少用到有錯誤的DNA的危險，將3個克隆都用作模板。
在PCR反應中產生的DNA帶有引物pHD433和模板43-A和43-G，用HindIII/BamHI對所得DNA進行裂解，并將其克隆到曲霉屬表達載體pHD414(在下文詳細講述)上。得到了幾個轉化子。
將克隆pHD433/43A-1，2，pHD433/43G-2，-3轉入米曲霉中。對每種轉化的轉化體(3-10個)的漆酶產生進行分析。僅在pHD433/43G-3的轉化體上測得活力。在amdS平皿上對陽性轉化體(編號1，4，6)進行再次分離，并再次試驗。在另一輪轉化中，又得到10個pHD433/43G-3的轉化體。克隆#20、23、26、28和29為陽性。對這些克隆進行再次分離，并通過在ABTS分析(pH4.5)中的顯色反應，對兩個分離克隆的漆酶表達進行半定量分析。有幾個克隆以+-+++的規模表現出中到強的漆酶表達力。
進行進一步克隆，以鑒定完整長度的克隆。以片段#42-4為探針，對由大約350,000個轉化體組成的二甲苯胺誘導的cDNA文庫進行篩選。檢測到100個以上陽性克隆。對這些克隆進行純化、再篩選，并用Southern印跡進行分析。通過DNA序列測定對最長的兩個克隆作進一步分析。發現最長的兩個克隆相同，而且，在其3′末端有一個聚腺苷酸片段，并且是在氨基酸末端的第4個氨基酸開始。由不同的克隆測定部分DNA序列。
然后，將pHD433/43G-3用于進一步的克隆研究，如在下面的第IV部分將要講到的。
III.其它P.pinsitus漆酶野生型酶的純化和特征分析
A、材料和方法
1、培養條件
用幾個取自一周齡P.pinsitus的PDA培養皿的瓊脂塊接種搖瓶(250ml培養基/2.8升體積的擋板式搖瓶)。每升培養基中含有10g葡萄糖、2.5gL-天冬酰胺、0.2gL-苯丙氨酸、2.0g酵母提取物、2.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、2.0mlAMG微量金屬元素、0.002g CuSO4·7H2O、1.0g檸檬酸，用自來水配制，高壓滅菌之前pH5.0。培養物在18～22℃溫度下在一臺旋轉搖床上以較低的速度(～100rpm)振蕩。7天以后，通過加入0.25ml5N NaOH把每只搖瓶里的pH調至6.0左右，并通過向每只搖瓶中添加0.5ml 2，5-二甲代苯胺儲液(以1∶10的比例把二甲代苯胺稀釋在乙醇中)誘導所述培養物。將搖瓶再培養24小時，這時，回收每只搖瓶里的培養上清液。
2、材料
用作緩沖液的化學試劑起碼是試劑級的商業化產品。Endo/N-葡糖苷酶F購自Boehringer-Mannheim公司。在PharmaciaFPLC上進行層析。光譜分析是在一臺分光光度計(ShimadzuPC160)上進行，或是在一臺微量板閱讀儀(Molecular Device)上進行。
3、純化
先用紗布過濾培養液，并以1000×g的速度離心，以除去膠凝狀粉紅色二甲代苯胺聚合物。隨后用Whatman#2濾紙過渡上清液，并在4℃溫度下，在S1Y100(Amicon，Spiral concentrater)上由1500ml濃縮至250ml體積。用水稀釋濃縮液，直到0.8mS(從2.5mS開始)，然后在S1Y100上濃縮至250ml。將在-20℃下冷凍過夜的洗滌液解凍，并用Whatman#濾紙過濾，以除去殘余的粉紅色材料，然后用NaOH把pH值從6.1調整到7.7。得到275ml、0.8mS的黃色液體，將其加到Q-Sepharose XK-26柱(約有64ml凝膠)，該柱用10mM Tris-HCL，pH7.7，0.7mS平衡過。通過用平衡緩沖液加注和洗滌，得到第一份流經該柱的活性漆酶部分。用由平衡緩沖液配成的0-0.5M的線性梯度NaCl溶液，以8.8倍的床體積進行洗脫。第二和第二份活性部分分別被0.15M和0.35M的NaCl洗脫。隨后在用2M NaCl和1mM NaOH依次洗脫時，未再檢測到活性部分。收集活性部分，調至約10mS，在Centricon-10(Amicon)上濃縮，然后上Superdex75(HR10/30，24ml，Pharmacia)柱，該柱用10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、pH8，14mS平衡過。在用加樣緩沖液洗脫時，所有3個Q-Sepharose洗脫的漆酶部分都被以相同的洗脫體積洗脫，表明它們具有極為相似的天然分子量。在SDS-PAGE上測定所得漆酶的純度。
4、蛋白質分析
在一個Mini ProteanII和一個Model 111 Mini IEFCell(Bio-Rad)上進行PAGE和天然IEF。在一個Mini trans-blotCell(Bio-Rad)上，用堿性磷酸酶分析試劑盒(Bio-Rad)進行Western吸印。在吸印期間，把一級抗體稀釋1000倍。在一臺Applied Biosystems(ABT)476A蛋白質測序儀上進行N-末端測序，采用液相TFA輸送進行裂解，并用聯機HPLC鑒定PTH-氨基酸。按照生產商的說明使用Standard Fast Cycle和Pre-MixBuffer System。按下述方法用糖苷酶進行脫糖基化將3μg蛋白質和3.6單位的糖苷酶在含0.25M NaAc，pH5，20mM EDTA，0.05％2-巰基乙醇的溶液中在37℃下保溫18小時，分別將卵清蛋白和牛血清白蛋白用作正、負對照，并通過SDS-PAGE測遷移率。
用購自Hewlett Packand的Amino Quant 1090 HPLC系統進行氨基酸分析，以測定消光系數。用MDS-2000 hydrolysis-station(CEM，Matthews，NC)對凍干的樣品進行由微波促進的蒸汽相水解。以含有1％苯酚的6N HCl作為清除劑，將其用于產生酸蒸汽。在70psi(約148℃)壓力下，水解時間為20分鐘。將水解過的樣品凍干，并再溶解于20μl 500pmol/μl肌氨酸和正纈氨酸溶液中，并把這兩種氨基酸作為內標。按照生產商的說明注射1μl樣品，并進行分析。
B、結果和討論
1、純化
前面進行過特征分析的P.pinsitus漆酶的PI值大約為3.5。不過，在以pH7.7預平衡過的Q-Sepharose的流通部分中，檢測到顯著的漆酶活性。在進行梯度洗脫時，在原先預計的活性部分之前，一個更有活性的部分被從柱上洗脫。UV-可見光譜和SDS-PAGE分析表明，3個部分都是主要含有漆酶。經凝膠過濾進一步提純之后，在天然未變性條件下檢測兩個新部分的不同pI值，發現與洗脫順序一致。
2、特征分析
從Q-Sepharose洗脫液中產生的純漆酶制劑，在SDS-PAGE上，在大約63kDa處有一條相當完美的帶。根據在SDS-PAGE上遷移率的變化，脫糖基化檢測到約14％(w/w)的碳水化合物。在進行天然-IEF分析時，上述漆酶制劑具有pI6～6.5、5～6.5和3.5的幾條帶。ABTS-瓊脂糖重疊試驗表明，所有的帶都有活性。在IEF條件下，每一種形式又表現出多種同工型。
中性和酸性形式在605和275nm處有典型的UV-可見光譜。A275/A605之比為30～40。酸-中性型在276am處有一個峰，而在600nm左右有一個峰肩。
N-末端序列分析表明，中性型中-酸性型的前29個殘基相同(表1)。酸型的N-末端與先前分析過的特征型100％的相符。三種型都能與用先前的特征型制備出的抗體進行相當好的交叉反應性。
表1P.pinsitus漆酶的結構和酶解特性型N-末端 LACU ΔA405min-1(ABTs)酸性GIGPVA D LTITNAAVSPDGFSRQAVVVNG92 4000酸性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****75 4000中性中性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****32 1000*與酸性型比較為相同殘基 ()弱信號
3、漆酶活性
通過ABTS和丁香醛連氮氧化作用試驗3種型的比活性(每A275)。3種型的pH活性曲線的形狀和最佳值非常相近在進行ABTS和丁香醛連氮氧化時，均分別在pH≤4和pH5～5.5處最佳。
IV.多拷貝P.pinsitus漆酶和基因的分離
A、材料和方法
1、菌株
將下列菌株用在以下所述方法中E.coli K 802(el4-(mrcaa)，mcrB，hsdR2，galK2，galT22，supE44，metB1；Clonetech)；E.coli XL-1 Blue(recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Lac〔F′proAB，lacIqZDM15，Tn10(tetr)〕；Stratagene)和P.pinsitus CBS 678.70。
2.基因組DNA分離
讓P.pinsitus培養物在500mlYG(0.5％酵母提取物，2％葡萄糖)中，在室溫下生長3-4天。通過米拉布(miracloth)收集菌絲體，用TE洗兩遍，并在液氮中快速冷凍。將冷凍的菌絲體放在-80℃下保存。為了分離DNA，用電動咖啡磨把菌絲體磨成細末。將粉末狀菌絲體再懸浮于TE中，使終體積為22ml。加入4ml 20％SDS，并通過倒位混合，然后在室溫下保溫10分鐘。用苯酚/氯仿溫和提取所得樣品，并離心分離水相和有機相。收集水相，加入400μl蛋白酶A(10mg/ml儲液)。將樣品在37℃下保溫30分鐘，然后用苯酚/氯仿抽提。往水相里加入0.1體積3MNaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，并在-20℃下冷凍1小時。離心沉淀DNA后，將沉淀物再懸浮于6mlTE中，加入200μl煮沸的RNase A(10mg/ml儲液)。在37℃下保溫之后，加入100μl蛋白酶A(10mg/ml儲液)，隨后在37℃下保溫30分鐘。用苯酚/氯仿將該樣品抽提2次。向水相中加入0.1體積的3M NaAc和2.5體積95％的乙醇，并將樣品在-20℃下冷凍1小時。離心以后，將沉淀輕輕地懸浮在400μlTE中，并加入40μl NaAc和1ml 95％乙醇。離心使DNA沉淀，并用70％乙醇洗滌沉淀。將最終的沉淀再懸浮于250μl TE中。
3、RNA制備
從菌絲體中提取RNA，菌絲體是從P.pinsitus培養物中獲得，培養物通過加入2，5-二甲代苯胺的方式誘導過漆酶的表達，或未誘導過。洗滌菌絲體，并在液氮中快速冷凍。用一臺電動咖啡磨把冷凍的菌絲體磨成細末。馬上把菌絲體末懸浮于20ml抽提緩沖液(0.2M Tris-HCl，0.25M NaCl，50mM EGTA，0.8％萘磺酸三-異丙酯，4.8％對-氨基水楊酸pH8.5)中。所有用于提取RNA的溶液都是用由焦碳酸二乙酯(DEP)處理過的水配制的。將樣品放置在冰上，并加入0.5體積TE飽和的苯酚/氯仿。倒位2分鐘充分混合樣品，并通過離心進行相分離。保留水相，用2ml抽提緩沖液抽提有機相兩次，并在68℃下保溫5分鐘。離心進行相分離，爾后收集水相，并用苯酚/氯仿抽提幾次，直至界面上不再有任何蛋白質。向水相中加入0.1體積的3M NaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，使RNA沉淀，并把樣品放在-20℃下冷凍2小時。沉淀RNA，并再懸浮于含有RNase抑制劑的DEP水中。
4、DNA序列分析
核苷酸序列是這樣測定的利用TAQ聚合酶循環測序法，用熒光標記的核苷酸進行測序，而且，反應是在一臺AppliedBiosystems自動DNA測序儀(Model 363A，Version 1.2.0)上電泳進行。
5、制備基因組文庫
構建2個大小選擇的P.pinsitus基因組文庫。一個5～6kbBamHI片段的文庫建在pBluescript+上。用BamHI消化基因組DNA，并在制備瓊脂糖(IBI)凝膠上對消化產物進行電泳。將帶有5-6BamHI片段的部分從電泳凝膠上切下來。用Geneclean試劑盒(BIO 101)從凝膠中分離DNA。將得到的DNA連接到預先用Bam HI消化過的pBluescript質粒上，并用BAP(GIBCOBRL)脫磷酸化，用連接的產物轉化E.coli XL-1 Blue感受態細胞(Stratagene)，得到12,000個白色菌落。
一個7-8kb的BamHI/EcoRI片段的文庫建在pUC118上。用BamHI和EcoRI消化10μg基因組DNA，并用BAP(GIBCOBRL)進行處理。用連接產物轉化感受態E.coli XL-1 Blue細胞(Stratagene)，所得文庫中含有大約8000個轉化體。
為了在λEMBL4上構建總基因組文庫，用Sau 3A對P.pinsitus基因組DNA進行部分消化。消化以后，在制備低熔點瓊脂糖凝膠上對DNA進行電泳，并把含有9～23kb大小的DNA的帶從凝膠上切下來。用瓊脂糖(New England Biolabs)從凝膠中提取DNA。按照供應商的說明分離EMBL4臂(Clonetech)。用GigapackII試劑盒(Stratagene)在體外包裝連接產物。用E.coliK802細胞滴定所建的文庫。估計未擴增的文庫中具有35,000個獨立的重組體。用E.coli K802細胞擴增該文庫。
6、Southern和Northern吸印
在瓊脂糖凝膠上，在TAE緩沖液中使用標準方法對DNA樣品進行電泳。RNA樣在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳。通過在堿性條件下的毛細作用或一個真空印跡裝置把DNA和RNA凝膠轉移到Zeta-Probe膜(BIO-RAD)上。轉移之后，對DNA凝膠進行UV交聯。在65℃下對轉移的印跡進行預雜交，預雜交在1.5×SSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉和200μg/ml鮭精DNA的溶液中進行1小時。將放射性探針直接加入預雜交溶液里，在65℃下繼續進行雜交過夜。在65℃下用2×SSC洗滌印跡5分鐘，再在65℃下用0.2×SSC，1％SDS，0.1％焦磷酸鈉洗滌30分鐘，兩次。
放射性標記的探針是用α-32P-dCTD和一種切口平移試劑盒(GIBCO-BRL)制備的。
7、文庫篩選
為了篩選大小選擇的5-6kb BamHI和7-8kb BamHI/EcoRI文庫，將LB carb平皿上的大約500個菌落轉移到Hybond N+濾膜(Amersham)上，采用的是標準方法。在中和以后，對上述濾膜進行UV交聯。在65℃下對該濾膜進行預雜交，預雜交在1.5×SSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉，200μg/ml鮭精DNA中進行1小時。將切口平移探針直接加進預雜交溶液時，在65℃下進行雜交過夜。
為了篩選EMBL里的基因組文庫，將擴增文庫的適當稀釋液與E.coli K802細胞一起在100mM NZY頂層瓊脂糖上進行平皿培養。用標準方法把菌斑轉移到Hybond N+膜(Amersham)上。用標準的UV交聯法把DNA交聯在上述膜上。用與上文相同的條件對該膜進行預雜交和雜交。結果和討論
1、多拷貝漆酶基因的分離
為了進行Southern分析，用幾種不同的限制酶消化P.pinsitus基因組DNA。用由α-32P-dCTP標記過的cDNA插入片段(從PYES載體上分離的Bam HI/SphI片段)檢測印跡。按上文所述方法對印跡進行雜交和洗滌。cDNA能與大多數酶的幾種限制片段雜交，這意味著在該基因組中有多個漆酶基因。因為cDNA可與一個約5.5kb的BamHI片段雜交，所以構建了一個來自P.pinsitus的5-6kb BamHI片段的文庫。
2、基因組文庫的篩選
篩選基因組文庫的結果歸納在表2中。用由32P標記過的原始cDNA克隆篩選5-6kb的BamHI大小選擇文庫。通過在65℃下雜交篩選到大約30,000個克隆。從兩個陽性克隆中分離質粒DNA，并用BamHI消化，以檢測插入片段的大小。這兩個克隆都帶有大約5.5kb的BamHI插入片段。從兩端對克隆的插入片段(LCC3)進行測序；該序列與所述cDNA有同源性，但很顯然不是該cDNA所編碼的漆酶。LCC3的部分序列還表明，LCC3pUC118克隆不具有完整的基因。
通過對BamHI/EcoRI雙消化的DNA進行的Southern印跡分析表明，該cDNA能同一個大約7.7kb的片段雜交。在pUC118上構建的一個大小選擇的文庫帶有7-8的Bam HI/EcoRI片段。總共獲得大約8000個獨立的克隆，并用由32P標記的插入片段進行雜交。從陽性菌落中分離質粒DNA，并用BamHI和EcoRI進行消化。對質粒進行的限制分析表明，可將其分成兩類。一類(LCC4)帶有四個相同的克隆，并有一個能與所述cDNA雜交的約7.7kb的Bam HI/EcoRI插入片段。另一類(LCC1)帶有兩個相同的克隆，并有一個能與所述cDNA雜交的約7.2kb的插入片段。對克隆LCC1和LCC4進行的部分DNA序列分析表明，克隆21是原始cDNA的基因組克隆，而LCC4編碼另一種漆酶。LCC1的部分DNA序列顯示，pUC118克隆不具有完整的基因，而且，需要在EcoRI位點上游的一個片段。
同時，構建了大小選擇的7-8kb BamHI/EcoRI文庫，在EMBL4上構建的P.pinisitus基因組文庫帶有大約35,000個獨立的重組噬菌體。挑選陽性噬菌斑，并進行純化。從純化的噬菌體裂解物中提取DNA。對EMBL DNAs的限制消化證實，有三類克隆。第一類(11GEN)由兩個同胞構成，其插入片段帶有大小與LCC1相同的BamHI/EcoRI片段，它能與LCCI插入片段雜交。另一類(12GEN)帶有一個克隆，它具有不同于11GEN類型的限制圖譜，而且，其插入片段帶有一個約5.7kb的BamHI/EcoRI片段。第三類由一個單一克隆形成，其插入片段帶有一個大約3.2kb的Bam HI/EcoRI片段，它能與LCC1插入片段雜交。DNA序列分析證實，克隆11GEN帶有LCC1 BamHI/EcoRI片段和5′與3′側翼區。還證實克隆12GEN帶有一部分LCC1插入片段。
為了克隆完整基因，還用LCC3 BamHI插入片段篩選P.pinisitus EMBL基因組文庫。平皿培養大約30,000個噬菌斑并轉移用于進行雜交。鑒定并提純5個能與LCC3(BamHI/EcoRI)插入片段雜交的噬菌斑。從純化的噬菌體儲液中提取DNA。對P.pinisitus基因組DNA所做的Southern分析表明，LCC3 BamHI插入片段能與一個大約7kb的EcoRI片段雜交。限制消化和Sotuthern分析表明，上述克隆中有4個帶有能與EcoRI/BamHI(1.6kb)片段雜交的片段，而且，這些克隆分成3種類型。第一類由一個單一的克隆(LCC5)構成，其插入片段帶有一個能與LCC3 BamHI/EcoRI片段雜交的3kb的EcoRI片段。另一類是由克隆(LCC2)構成，其插入片段帶有一個能與LCC3BamHI/EcoRI插入片段雜交的大約11kb的EcoRI片段。第三類由兩個克隆構成，這兩個克隆不同，但帶有很多相同的限制片段，這兩個克隆都帶有能與LCC3插入片段雜交的大約7.5kb的EcoRI片段。對第三種類型進行進一步分析還表明，它們與克隆LCC4相同。對LCC5和LCC2所進行的部分DNA序列分析證實，這兩個克隆都編碼漆酶；但它們都不與上面提到的任何漆酶基因(LCC1、LCC3或LCC4)相同。就此而言，克隆了5個不同的漆酶基因；不過，由LCC5和LCC2亞克隆的片段上不具有完整基因。
通過對來自克隆LCC5的3kb EcoRI片段進行的DNA序列分析證實，N-末端的大約200bp的片段在E.coRI位點的上游。將一個來自LCC5的380bp的EcoRI/MluI片段用于鑒定一個Mlu1片段的亞克隆，該片段來自LCC5 EMBL克隆。對來自LCC5 EMBL克隆的一個約4.5kb的MluI片段進行亞克隆，以便進行序列分析，證實其帶有N-末端序列。
為了克隆半個LCC3漆酶基因的N-末端，用一個來自LCC3pUC118克隆的約750bp的BamHI/StuI限制片段檢測P.pinsitusEMBL基因組文庫。對大約25,000個噬菌斑進行篩選，有5個能與上述探針雜交。在進行進一步的提純時，這些克隆中僅有3個仍為陽性。其中，有兩個克隆產生極強的信號，而對從這些噬菌體中分離出的DNA所做的限制消化表明，在這兩個克隆的插入片段上都有一個約750bp的BamHI/StuI片段，而且，這兩個克隆不相同，但重疊。根據Southern分析的結果，對來自這些克隆的一個約8.5kb的片段進行亞克隆，以便作序列分析。證實EcoRI片段帶有完整的基因。
為了克隆半個LCC2漆酶基因的N-末端，用一個來自EMBLLCC2克隆的約680bp的EcoRI/PvuI片段檢測建在EMBL4上的P.pinsitus基因組文庫。通過在65℃下雜交對30,000個噬菌斑進行篩選，有15個噬菌斑能與上述探針雜交。對所有15個噬菌斑進行純化，并提取DNA。根據限制圖譜，可將這些克隆分成4種類型，這些克隆中的7個均為同胞，并且與LCC2的原始EMBL克隆相同。第二種類型由3個同胞克隆構成。對來自這一類型的一個約4kb的HindIII片段進行亞克隆，以便進行序列分析，證實其帶有半個LCC2的N-末端。第三種類型由一個單一的克隆構成，不再對其作進一步特征分析。
3、DNA序列分析
按照在材料和方法部分所述的方法，測定5個基因組克隆的全DNA序列。對克隆LCC2的序列分析表明，它可能編碼從培養液中提取的第二種形式的漆酶(中性pI)，所述培養液來自按上述方法誘導過的P.pinsitus培養物。對所述中性pI漆酶的N-末端蛋白質序列和預測的由LCC2編碼的蛋白質的N-末端進行比較，發現它們相同。由克隆LCC2所編碼的蛋白質的預測pI為5.95，它與測定的所述第二種形式的漆酶的實驗pI(5.0～6.5)恰好吻合。圖1-5(SEQ ID NOS.1-5)表示DNA序列和基因組克隆的預測翻譯產物。對于LCC1來說，其成熟蛋白質的N-末端通過蛋白質測序和根據Von Hei jne規則預測在位置22上是Gly。所述N-末端為Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。對于LCC2來說，通過蛋白質測序測定在其成熟蛋白質的N-末端氨基酸的位置21上是Ala。所述N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。對于LCC3來說，預計其成熟蛋白質的N-末端氨基酸在位置22上是Ser，其N-末端為Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Glu-Leu-。對于LCC4來說，預計其N-末端氨基酸在位置23上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-。對于LCC5來說，預計其N-末端氨基酸在位置24上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp。將所述基因的結構組織和預測的由這些基因編碼的蛋白質在表1中列出進行比較。可以看出，所列出的5個基因具有不同的結構，并編碼大小稍有差別的蛋白質。還對預測的基因組克隆的蛋白質和其它真菌漆酶進行了比較。在表2中列表對預測的漆酶相互進行了比較，并與其它真菌漆酶進行了比較。克隆LCC1(最先作過特征分析的誘導漆酶)與Coriolus hirsutus漆酶和PM1擔子菌漆酶(Coll等，Supra)之間的同一性最大(90％)。其它四種漆酶與C.hirsutus漆酶之間的同一性在64～80％之間。由LCC3編碼的漆酶與LCC1漆酶和表2中其它真菌漆酶的同一性最低。LCC2是按上述方法分離的另一種野生型漆酶；根據所分離克隆的N-末端序列還可以看出，“中性”和“酸中性”野生型漆酶是由LCC2序列編碼的同一種酶。表1P.pinsitus基因組克隆的結構組織與預測的蛋白質的比較基因 #內含子 預計蛋白前體的大小 預計成熟蛋白的大小 預計的等電點21GEN8 520499 4.4923GEN10 519498 5.9524GEN12 516495 5.2331GEN11 510488 4.0641GEN11 527504 4.07表2P.pinsitus漆酶與其它真菌漆酶的氨基酸同一性比較
21GEN 23GEN24GEN 31GEN 41GEN CRIPHA CRIPHE PBILAC PM121GEN——79％64％70％72％90％91％64％80％23GEN79％——65％66％69％80％81％62％74％24GEN64％65％——61％65％64％65％61％63％31GEN70％66％61％——75％69％70％64％69％41GEN72％69％65％75％——71％72％64％71％CRIPHA 90％80％64％69％71％——99％64％80％CRIPHE 91％81％65％70％72％99％——65％81％PBILAC 64％62％61％64％64％64％65％——65％PM1 80％74％63％69％71％80％81％65％——21GEN，23GEN，24GEN，31GEN和41GEN＝P.pinsitis漆酶克隆CRIPHA＝Coriolus hirsutis漆酶ACRIPHE＝C.hirsutis漆酶BPBILAC＝Phlebia radiata漆酶PM1＝擔子菌 PM1漆酶(CECT2971)
5、Northern印跡分析
從菌絲體中提取RNA，菌絲體來自二甲代苯胺誘導過的培養物和未誘導過的培養物。電泳以后把RNA吸印到膜上，并用所述cDNA插入片段或一個帶有約100bp的23GEN啟動子和其編碼區的前100個bp的小片段檢測所得印跡。一個大約1.8kb的轉錄物能同時與誘導的和非誘導的RNA樣品雜交；不過，該信息的轉錄，明顯會被向培養物中添加二甲代苯胺所誘導。
III.P.pinsitus漆酶在曲霉屬中的表達
材料和方法
1、菌株
米曲霉A1560、米曲霉How B104(fungamyl缺陷型，pyrg)、米曲霉How B101 pyrg、黑曲霉Bo-1、黑曲霉B0-80、黑曲霉ATCC1040、黑曲霉NRRL337、黑曲霉NRRL326、黑曲霉NRRL2295、黑曲霉ATCC11358、黑曲霉NRRL322、黑曲霉AT10864、日本曲霉(A.japonicus)A1438、紅曲霉(A.phoenicis)、臭曲霉(A.foetidus)N953。
2、培養基
用MY50培養基(每1升中含50g麥芽糖糊精，2gMgSO4·H2O、10gKH2PO4、2gK2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)對黑曲霉、臭曲霉和紅曲霉進行搖瓶培養。用MY51(每1升中含30g麥芽糖糊精、2mgMgSO4、10gKH2PO4、2gK2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、1g尿素、2g(NH4)2SO4、pH6.0)對米曲霉A1560和HowB101菌株進行搖瓶培養。為了對米曲霉HowB104菌株進行搖瓶分析，使用MY51麥芽糖培養基(與MY51相同，但含有50g麥芽糖而不是麥芽糖糊精)。為了對日本曲霉菌株進行搖瓶分析，使用M400培養基(每1升中含50g麥芽糖糊精、2gMgSO4、2gK H2PO4、4g檸檬酸、8g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)。
將用于形成原生質體和接下來的轉化的生長過夜的培養物生長在YEG(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖)上。對于pyrg菌株來說，補充尿苷，使其終濃度為10mM。
3、篩選漆酶產生
首先，在基本培養基平皿上篩選一級轉化體，培養基中含有1％葡萄糖，作為碳源，并含有1mMABTS，用于檢驗漆酶的產生。挑出能在平皿上產生綠色部分的轉化體，并在進行搖瓶分析之前進行孢子純化。
對搖瓶培養樣品進行離心，以澄清培養液。用ABTS對稀釋或未稀釋過的培養液樣品進行分析。
結果和討論
1、在搖瓶中表達
構建的第一個表達載體是pDSY1，它帶有TAKA啟動子、TAKA信號序列、P.pinsitus漆酶cDNA，在成熟N-末端的起始部分和AMG終止子。TAKA信號序列漆酶插入片段是分兩步構建的。首先通過定點誘變，改變一個堿基，在漆酶成熟編碼區的bp107處開始產生一個AgeI位點，并在該漆酶終止子下游約120bp處產生一個NsiI位點(改變分另為ACG GGT→ACC GGT和TTC GCT→ATG CAT)。對漆酶上從SfiI位點開始并在107bp處的AgeI位點結束的一個小PCR片段進行PCR擴增。該片段帶有一段TAKA信號序列，以及成熟漆酶cDNA的前面的約107bp。對該片段進行的進一步DNA序列分析表明，它發生了單一的堿基改變，這種堿基變化導致在成熟漆酶的位置9上Asn取代Thr。這種取代產生出一個潛在的N-連接糖基化位點。將該PCR片段和AgeI/NsiI片段克隆到用SfiI/NsiI消化過的pMWR1(圖6)上。載體pMR1帶有TAKA啟動子，一部分TAKA信號序列(它在一個SfiI位點結束)，以及TAKA終止子，一個NsiI位點直接插在該終止子的5′末端。將所得到的表達載體(圖7)用于共轉化幾個宿主。用于曲霉屬菌株共轉化的方法如Christensen等(Supra)所述。
在第二個漆酶表達載體上，在DSY1上所發生的導致氨基酸位置9上Asn取代Thr的堿基變化，在PCR反應中又恢復到野生型。除了上述單一堿基變化之外，第二個表達載體pDSY2與pDSY1相同。用pDSY2和帶有構巢曲霉amdS基因的pTO90(WO91/17243)或帶有米曲霉pyrG基因的pSO2一起對3種不同的米曲霉菌株和幾個黑曲霉菌株進行共轉化。
在用DSY1和DSY2試驗過的所有宿主中都觀察到漆酶的表達。產率范圍為0.1～12.0Δabs/分鐘/ml，在黑曲霉菌株中觀察到最高產率。
構建一個pDSY10結構，該結構帶有TAKA啟動子，漆酶全長cDNA，包括其信號序列及AMG終止子。以lac1為模板對一個200bp的BamHI/AgeI片段進行擴增，該片段在緊鄰起始密碼子ATG的5′末端處有一個BamHI位點，而在與pDSY1上相同的位置上有一個AgeI位點。以pDSY2為模板對一個MluI/HindIII片段進行PCR擴增，從在cDNA上的MluI位點開始，至漆酶終止密碼子3′末端處的一個HindII位點處結束。將上述兩個片段與來自pDSY2的AgeI/MluI片段連接在pHD414上，得到pDSY10(圖8)。
用于漆酶表達的載體pHD414是質粒p775(EP238023)的衍生物。與所述質粒相反，pHD414在TAKA啟動子和AMG終止子之間有一串相同的限制位點。該質粒是這樣構建的在終止子的3′末端去掉一段大約200bp長的片段(帶有不需要的RE位點)，隨后再除去啟動子5′末端的一個大約250bp長的片段(也帶有不需要的位點)。所述200bp的片段是通過用NarI(作用位點在pUC載體部分)和XbaI(就在終止子的3′末端)裂解而被除去的，隨后用克列諾(Klenow)DNA聚合酶＋dNTP補充所產生的末端，在凝膠上純化該載體片段，并重新連接該載體片段。所得質粒被稱為pHD413。用StuI(作用位點在啟動子的5′末端)和PvuII(作用位點在pUC載體上)裂解pHD413，在凝膠上分級分離，并進行重新連接，得到pHD414。以pToC90為選擇質粒，對米曲霉HoW B104和黑曲霉B0-1進行共轉化。在搖瓶培養中的產率與用pDSY2轉化時的產率相當。
2、在發酵罐中表達
將1ml黑曲霉轉化體Bo-1-pDSY10-4孢子懸浮液試樣(大約109個孢子/ml)在無菌條件下加入盛有100ml無菌搖瓶培養基(葡萄糖，75g/l；大豆粉，20g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，10g/l；K2SO4，2g/l；CaCl2·2H2O，0.5g/l；檸檬酸，2g/l；酵母提取物，10g/l；微量金屬元素〔ZnSO4·7H2O，14.3g/l；CuSO4·5H2O，2.5g/l；NiCl2·6H2O，0.5g/l；FeSO4·7H2O，13.8g/l；MnSO4·H2O，8.5g/l；檸檬酸3.0g/l〕，0.5ml/l；尿素，2g/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調至6.0)的500ml搖瓶中，并在37℃溫度下，在一臺以200rpm的速度轉動的旋轉搖床上培養18小時。在無菌條件下把50ml上述培養液轉移到一個盛有1.8升發酵培養基(麥芽糖糊精MD01300g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，2g/l；檸檬酸，2g/l；K2SO4，2.7g/l；CaCl2·2H2O，2g/l；微量金屬元素，0.5ml/l；pluronic消泡劑，1ml/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調至6.0)的體積為3升的發酵罐中。通過使冷卻水在發酵罐夾套中循環，把發酵罐溫度維持在34℃。以1.8升/分鐘(1v/v/m)的速度將無菌空氣通入發酵罐中。在接種后的前24小時把攪拌速度維持在800rpm，而在其后的發酵時間里以1300rpm的速度攪拌。通過自動添加5N NaOH或H3PO4把發酵的pH維持在4.0。用一臺蠕動泵把消毒的進料(尿素50g/l；pluronic消泡劑1.5ml/l；用蒸餾水配制并高壓滅菌)加入發酵罐中。發酵期間的供料速度設計如下在接種之前先加入40g進料；接種之后，以2.5g/升小時的恒速供料。
用水或合適的緩沖液把銅配制成400X儲液，過濾消毒并在無菌條件下加入罐中，使最終濃度為0.5mM。取出用于進行酶活性測定的樣品，并通過米拉布(Miracloth)過濾，以除去菌絲體。通過LACU試驗分析這些樣品的漆酶活性。結果發現，隨著發酵過程的進行，漆酶活性連續升高，190小時之后獲得大約55LACU/ml的活性值。這相當于有大約350mg/l的重組漆酶表達。
IV.重組漆酶的提純
材料和方法
1、材料
用作緩沖液和底物的化合物，是起碼為試劑級別的商品化產品。Endo/N-糖苷酶G購自Boehringer-Mannheim公司。層析是在一個Pharmacia′s FPLC或一個常規的開放柱低壓系統上進行。在一臺Shimadzu PC160分光光度計上進行分光分析。
2、提純
(a)DSY2
按照上述方法用紗布過濾米曲霉pDSY2轉化體，得到2.8升濾液(pH7，19mS)。所得濾液在0.45μ的Corning濾器上過濾，并在使用S1Y30膜的Spiral Concentrator(Amicon)上濃縮至200ml體積。將濃縮液調至pH7.5，用4.8升水稀釋至1.2mS，并在S1Y30上濃縮至200ml體積。將50ml的上述溶液加注到一個Q-Sepharose柱(XK16，34ml凝膠)上，該柱用10mM Tris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預平衡過。在用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A＋0.5M NaCl)洗脫加樣期間緩慢地移動的藍色的漆酶帶。將24ml所收集的漆酶部分在Centricon-100(Amicon)上濃縮至4.5ml，并上一個Superdex 200柱(Hiload 16/10，120ml凝膠)。在用緩沖液C(緩沖液A＋0.15M NaCl，14.4mS)洗脫時，在藍色漆酶洗脫物部分之后為棕色混雜部分。只有洗脫帶的前半部(通過Abs600檢測)表現出較高的漆酶與混雜物之比，收集這部分洗脫液。將所收集的部分在10mM Bis-Tris(pH6.8，0.6mS)(緩沖液D)中透析，上一個用緩沖液D平衡過的Mono-Q柱(Mono-Q5/5，1ml)，并用一種線性梯度的緩沖液E(緩沖液D＋0.5M NaCl)進行洗脫。通過SDS-PAGE判斷得知，由27％左右的緩沖液E洗脫的漆酶部分是純的。在每一步都對漆酶部分進行常規ABTS氧化作用、SDS-PAGE和Western印跡檢測。
(b)DSY10
用紗布過濾HowB104-pDSY10，得到2.8升濾液(pH7.3，24mS)。用Whatman#2濾紙過濾上述濾液，并在帶有S1Y100膜的Spiral Concentrator(Amicon)上濃縮至210ml。用水稀釋上述濃縮液，使其達到1.2mS，在SlY100上濃縮至328ml。將所得液體上Q-Sepharose柱(XK26，120ml凝膠)，該柱用10mMTris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預平衡過。用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A＋2M NaCl)洗脫加樣期間緩慢移動的藍色漆酶帶。用水稀釋所收集的120ml漆酶部分，使其達到1.1mS，并在SIY100上濃縮至294ml，再上一個用緩沖液A預平衡過的Mono-Q柱(Hiload 16/10，40ml凝膠)。在上樣和用緩沖液A液脫期間，漆酶緩慢地從柱中通過。將所收集的pH讀數為5.6的部分上一個用緩沖液C(10mM MES，pH5.5，0.1mS)預平衡過的Mono-Q柱。漆酶部分被一種梯度很小的緩沖液D(緩沖液C＋1M NaCl)所洗脫。按上述方法進行酶促試驗。
3、蛋白質分析
按上述方法進行全氨基酸分析、N-末端序列分析、脫糖基化分析、SDS-PAGE、IEF和Western印跡分析。
B、結果和討論
1、提純和特征分析
對于DSY10來說，獲得了256倍的純化液和37％的產率，而對于DSY2來說，獲得了246倍的純化液和14％的產率。就電泳特征、光譜特征和活性而言，純化的DSY2和DSY10沒有區別。在凝膠過濾時，純化的重組漆酶表現為一種雙體，而且，其亞單位分子量稍大于野生型漆酶的分子量，這表明在米曲霉中發生的翻譯后加工導致在重組體上發生額外的糖基化作用。脫糖基化作用已證實了由額外糖所產生的質量差異(表3)。表3重組和野生型漆酶的分子量和光譜特征
MW，KDa碳水化合物pI λmax，nm(ε，l/g*cm)
天然分子 亞單位w/w％野生型 ～130～63 ～7 3.5275(1.8)615(0.12)重組型 ～130～67 ～13 3.5275(1.7)615(0.11)
提純的酶的光譜在615nm和275nm處有最大光吸收值，275nm的光吸收值與615nm的光吸收值之比為16，這表明，每個亞單位上有一個I型Cu。330nm的光吸收值與615nm的吸光值之比為1.0，接近Rhus vernicefera漆酶的0.75的比值，暗示每個亞單位上存在一個II型和兩個III型銅離子。通過氨基酸分析測得的消光系數為1.71/(g*cm)。
3、活性
通過丁香醛連氮和ABTS氧化作用測定漆酶活性。每一A275單位表示漆酶的LACU值為83。每一mg單位表示其LACU值為141。圖9中示出了所述漆酶的pH曲線。
V、將多孔菌屬漆酶用于染發
在多種染料前體(在下面列出)上試驗Polyporus pinsitus漆酶的染色效果，并與3％H2O2的染色效果進行比較。并進一步試驗其在0.1％對苯二胺上的染色效果，與多種改性劑進行比較。
材料
染料前體
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-苯二胺，pH7.0(pPD)。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-甲代苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氯-對-苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-氨基苯酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰-氨基苯酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％3，4-二氨基甲苯，pH7.0。
改性劑
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％間苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％2，4-二氨基茴香醚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％α-萘酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氫醌，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％間苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％4-氯代間苯二酚，pH7.0。
當使用改性劑時，將染料前體對苯二胺與上述改性劑中的一種混合使用，使染液中前體的濃度為0.1％，改性劑的濃度也為0.1％。所用的酶是濃度為10LACU/ml的來自P.pinisitus的重組漆酶。
用于該方法中的其它溶液有3％H2O(在最終染液中的濃度)，以及一種市售香波。
在一臺Datacoler Textflash 2000(CIE-Lab)上，采用CIE-Lab參數L*(“0”＝黑，“100”＝白)和a*(“-”＝綠，“+”＝紅)測定發束的定量化顏色。DL*和Da*分別表示一種樣品與未處理過毛發的L*和a*進行比較時的L*和a*的Δ值。在日光燈(D65)下以1000LUX的強度測定耐曬性。
使用一束金黃色歐洲人的頭發(1g)。在一臺Whirley攪拌器上將4ml染料前體溶液(包括改性劑)與1ml漆酶或1ml H2O2混合，將其涂在上述發束上，并在30℃下保持60分鐘。然后用流動水漂洗染過的發束，梳理并風干。
染色作用試驗的結果在下面的表4-6以及圖10-12中列出。
表4L*0＝黑100＝白a*-＝綠+＝紅
表5L*0＝黑100＝白a*-＝綠+＝紅
表6L*=黑100=白a*-=綠+=紅
按上述方法進行氧化染發，所不同的是，使用50LACU/ml的P.pinsitus漆酶。
為了試驗耐洗性，將所染過的發束弄濕，并用50μl市售香波洗15秒鐘，再用水漂洗1分鐘。將該發束洗20遍。
洗發試驗的結果如圖13所示。由圖13可以看出，當使用P.pinsitus漆酶進行氧化染色時，洗滌多達20遍后的頭發的耐洗性仍然良好。
為了試驗耐曬性，使用歐洲人的金黃色頭發作試驗材料，對用P.pinsitus漆酶染過的頭發與用H2O2染過的頭發進行比較。將對苯二胺用作染料前體。按上述方法進行染發。將一個發束放置在黑暗中，而另一個發束放置在目光下(即在日光燈(D65)下，光照強度大約為1000LUX)長達275小時。在染發后馬上測定CIE-Lab值，并在暴露于日光期間進一步測定。
試驗結果在圖14中給出。圖14顯示，以對苯二胺為染料前體用P.pinsitus漆酶染過的頭發與用H2O2染過的頭發的耐曬性相同。生物材料的保藏
已按照布達佩斯條約規定，于1994年5月25將下列生物材料交由Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center(1815 University Street，Peoria，Illinois，61604)保藏，并被賦予下列入藏號。
保藏物 入藏號帶有pDSY22(41GEN；約3.0kb的NRRL B-21263EcoRI插入片段)的E.coli DH5α帶有pDSY23(41GEN；約4.5kb的NRRL B-21268MluI插入片段；插入片段帶有pDSY22 EcoRI片段的一小部分和EcoRI片段5′端的序列)的E.coli DH5a帶有pDSY21(31GEN；約7.7kb的NRRL B-21264EcoRI/BamHI插入片段)的E.coliXL-1 Blue帶有p DSY18(21GEN；約8.0kb的 NRRL B-21265BamHI插入片段)的E.coli XL-1Blue帶有pDSY19(23GEN；約4kb的HindNRRL B-21266III插入片段)的E.coli DH5a帶有pDSY20(24GEN；約8.5kb的 NRRL B-21267EcoRI插入片段)的E.coli DH5a
序列表(1)一般信息
(i)申請人
(A)名稱Novo Nordisk生物技術公司
(B)街道1445 Drew大街
(C)城市Davis，California
(D)國家美國
(E)郵編(ZIP)95616-4880
(F)電話(916)757-8100
(G)傳真(916)758-0317
(i)申請人
(A)名稱Novo Nordisk A/S
(B)街道Novo Alle
(C)城市Bagsv rd
(D)國家丹麥
(E)郵編(ZIP)DK-2880
(F)電話+45 4444 8888
(G)傳真+45 4449 3256
(F)電傳37304
(ii)發明名稱純化的多孔屬漆酶及編碼該酶的核酸
(iii)序列數10
(iv)相關地址
(A)收件人Novo Nordisk of North America，Inc.
(B)街道405 Lexington Avenue，Suite 6400
(C)城市和州New York，New York
(D)國家U.S.A.
(E)ZIP10174-6401
(v)計算機可讀形式
(A)介質類型軟盤
(B)計算機IBM PC兼容機
(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件Patent In Release #1.0，Version#1.25(EPO)
(vi)本申請數據
(A)申請號待定
(B)申請日1995年6月15日
(vii)在先申請數據
(A)申請號08/265，534
(B)申請日1994年6月24日
(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Lowney，Karen A.
(B)登記號31，274
(C)文件/檔案號4185.204-WO
(ix)電信信息
(A)電話2128670123
(B)傳真2128789655(2)序列1的信息
(i)序列特征
(A)長度2418bp
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(vi)起源
(A)生物Polyporus pinsitus
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置414..464
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置534..589
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置710..764
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置879..934
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1001..1050
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1147..1197
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1354..1410
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1609..1662
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置join(413..465，533..590，709..765，878..935，
1000..1051，1146..1198，1353..1411，
1608..1663)
(xi)序列表述序列1AGATTTCTGA CACCGGTGCA ATCTTGACAC TGTACCAACC GGGCAAGTCT CGTCCTTGGT60TCTCGGGGACT GGCGCCGGT CGCTACCCCT TGGTCATTCA CTCTACCAGA GCGCTGGCTT 120CGCCGAGGTA TAAAGGATGT TGCGCGACAC CCTCAACACC CCAACTCAAG CCCCACTTGA 180GCTTTTGCGA GATCCTCCAC ATACCACTCA CTACTTTCAA GTTCTTCAAC ATG TCG AGG 239
Met Ser Arg
1TTT CAC TCT CTT CTC GCT TTC GTC GTT GCT TCC CTT ACG GCT GTG GCC 287Phe His Ser Leu Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Leu Thr Ala Val Ala
5 10 15CAC GCT GGT ATC GGT CCC GTC GCC GAC CTA ACC ATC ACC AAC GCA GCG 335His Ala Gly Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Thr Asn Ala Ala20 25 30 35GTC AGC CCC GAC GGG TTT TCT CGC CAG GCC GTC GTC GTG AAC GGC GGC 383Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Gln Ala Val Val Val Ash Gly Gly
35 40 45ACC CCT GGC CCT CTC ATC ACG GGT AAC ATG GTTCGTCTCG GCTCGCACTA433Thr Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Met
50 55GGGGGTTGTA TCGTTCCTGA CGTTGTTGGA G GGG GAT CGC TTC CAG CTC AAT GTC ATC 491
Gly Asp Arg Phe Gln Leu Asn Val Ile
60 65GAC AAC CTT ACC AAC CAC ACG ATG GTG AAG AGC ACG AGT ATT GTGAGCTGCT 543Asp Asn Leu Thr Asn His Thr Met Val Lys Ser Thr Ser Ile
70 75ATTTCTCCGG ACGGGGCTTC ATTGTGCTAA TAATCGTCGT GTGCAG CAC TGG CAC GGT 601
His Trp His Gly
80TTC TTC CAG AAG GGT ACC AAC TGG GCC GAC GGT CCC GCC TTC ATC AAC 649Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn
85 90 95CAG TGC CCG ATC TCA TCT GGT CAC TCG TTC CTG TAC GAC TTC CAG GTT 697Gln Cys Pro Ile Ser Ser Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val100 105 110 115CCT GAC CAG GCT GTAAGTACGG TCGTTATGGA GTATACTGCG CATTGCTAAA 749Pro Asp Gln AlaCCACATGGTG AACAG GGT ACC TTC TGG TAT CAC AGT CAC TTG TCT ACG CAG800
Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln
120 125 130TAC TGT GAT GGT TTG AGG GGT CCG TTC GTT GTT TAC GAC CCG AAT GAC 848Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp
135 140 145CCG GCC GCC GAC CTG TAC GAC GTC GAC AAC GTAAGGACGA ATTCGAACCG 898Pro Ala Ala Asp Leu Tyr Asp Val Asp Asn
150 155TAAATACTTG CTTACTGATA CTTCTCGATG AATTAG GAC GAC ACT GTC ATT 949
Asp Asp Thr Val Ile
160ACC CTT GTG GAT TGG TAC CAC GTC GCC GCG AAG CTG GGC CCC GCA TTC 997Thr Leu Val Asp Trp Tyr His Val Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe
165 170 175CCT GTAAGTCCAT GAGTATTCTG CTGTTGAATC TGTCTTAACT GTGCATATCA CTC 1053ProLeu
180GGC GCC GAC GCC ACC CTC ATC AAC GGT AAG GGA CGC TCC CCC AGC ACG1101Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile Asn Gly Lys Gly Arg Ser Pro Ser Thr
185 190 195ACC ACC GCG GAC CTC TCA GTT ATC AGC GTC ACC CCG GGT AAA CGC1146Thr Thr Ala Asp Leu Ser Val Ile Ser Val Thr Pro Gly Lys Arg
200 205 210GTATGCTATA TCTTATCTTA TCTGATGGCA TTTCTCTGAG ACATTCTCCA G 1197TAC CGT TTC CGC CTG GTG TCC CTG TCG TGC GAC CCC AAC TAC ACG TTC1245Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe
215 220 225AGC ATC GAT GGT CAC AAC ATG ACG ATC ATC GAG ACC GAC TCA ATC AAC1293Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr Ile Ile Glu Thr Asp Ser Ile Asn
230 235 240ACG GCG CCC CTC GTC GTC GAC TCC ATT CAG ATC TTC GCC GCC CAG CGT1341Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg
245 250 255TAC TCC TTC GTG GTAAGTTCGA TTCATCCTCT AACGTTGGTC GCTGTTAGTG1393Tyr Ser Phe Val260ATCGTATGGT CATGTAG CTC GAG GCC AAC CAG GCC GTC GAC AAC TAC TGG 1443
Leu Glu Ala Asn Gln Ala Val Asp Asn Tyr Trp
265 270ATT CGC GCC AAC CCG AAC TTC GGT AAC GTC GGG TTC ACC GGC GGC ATT 1491Ile Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Asn Val Gly Phe Thr Gly Gly Ile275 280 285 290AAC TCG GCT ATC CTC CGC TAC GAT GGT GCC GCT GCC GTG GAG CCC ACC 1539Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly Ala Ala Ala Val Glu Pro Thr
295 300 305ACA ACG CAA ACC ACG TCG ACT GCG CCG CTC AAC GAG GTC AAC CTG CAC 1587Thr Thr Gln Thr Thr Ser Thr Ala Pro Leu Asn Glu Val Asn Leu His
310 315 320CCG CTG GTT ACC ACC GCT GTG GTATGTAATA TTGTCGGTAA TGTAATACAT1638Pro Leu Val Thr Thr Ala Val
325TGTTGCTGAC CTCGACCCCC ACAG CCT GGC TCG CCC GTC GCT GGT GGT GTC 1689
Pro Gly Ser Pro Val Ala Gly Gly Val
330 335GAC CTG GCC ATC AAC ATG GCG TTC AAC TTC AAC GGC ACC AAC TTC TTC 1737Asp Leu Ala Ile Asn Met Ala Phe Asn Phe Asn Gly Thr Asn Phe Phe
340 345 350ATC AAC GGC ACG TCT TTC ACG CCC CCG ACC GTG CCT GTC CTG CTC CAG 1785Ile Asn Gly Thr Ser Phe Thr Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln355 360 365 370ATC ATC AGC GGC GCG CAG AAC GCG CAG GAC CTC CTG CCC TCC GGT AGC 1833Ile Ile Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser
375 380 385GTC TAC TCG CTT CCC TCG AAC GCC GAC ATC GAG ATC TCC TTC CCC GCC 1881Val Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ala Asp Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ala
390 395 400ACC GCC GCC GCC CCC GGT GCG CCC CAC CCC TTC CAC TTG CAC GGG CAC 1929Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His
405 410 415GCG TTC GCG GTC GTC CGC AGC GCC GGC AGC ACG GTT TAC AAC TAC GAC 1977Ala Phe Ala Val Val ArG Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Asn Tyr Asp
420 425 430AAC CCC ATC TTC CGC GAC GTC GTC AGC ACG GGG ACG CCT GCG GCC GGT 2025Asn Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly435 440 445 450GAC AAC GTC ACC ATC CGC TTC CGC ACC GAC AAC CCC GGC CCG TGG TTC 2073Asp Asn Val Thr Ile ArG Phe Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe
455 460 465CTC CAC TGC CAC ATC GAC TTC CAC CTC GAG GCC GGC TTC GCC GTC GTG 2121Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Val Val
470 475 480TTC GCG GAG GAC ATC CCC GAC GTC GCG TCG GCG AAC CCC GTC CCC CAG 2169Phe Ala Glu Asp Ile Pro Asp Val Ala Ser Ala Asn Pro Val Pro Gln
485 490 495GCG TGG TCC GAC CTC TGT CCG ACC TAC GAC GCG CTC GAC CCG AGC GAC 2217Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asp Ala Leu Asp Pro Ser Asp
500 505 510CAG TAAATGGCTT GCGCCGGTCG ATGATAGGAT ATGGACGGTG AGTTCGCACT2270Gln515TGCAATACGG ACTCTCGCCT CATTATGGTT ACACACTCGC TCTGGATCTC TCGCCTGTCG 2330ACAGAACAAA CTTGTATAAT TCGCTTAATG GTTGAAACAA ATGGAATATT GGGGTACTAT 2390GCACGCATCT CGCTGGGTGA GCTTTCGT2418(2)序列2的信息(i)序列特征
(A)長度520個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)起源
(A)生物Polyporus pinsitus(xi)序列表述序列2Met Ser Arg Phe His Ser Leu Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Leu Thr1 5 10 15Ala Val Ala His Ala Gly Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Thr
20 25 30Asn Ala Ala Val Ser Pro Asp G1y Phe Ser Arg Gln Ala Val Val Val
35 40 45Asn Gly Gly Thr Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Met Gly Asp Arg
50 55 60Phe Gln Leu Asn Val Ile Asp Asn Leu Thr Asn His Thr Met Val Lys65 70 75 80Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp
85 90 95Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn Gln Cys Pro Ile Ser Ser Gly His
100 105 110Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp
115 120 125Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu ArG Gly Pro
130 135 140Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro Ala Ala Asp Leu Tyr Asp Val145 150 155 160Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Val Asp Trp Tyr His Val Ala
165 170 175Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile
180 185 190Asn Gly Lys Gly Arg Ser Pro Ser Thr Thr Thr Ala Asp Leu Ser Val
195 200 205Ile Ser Val Thr Pro Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu
210 215 220Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr225 230 235 240Ile Ile Glu Thr Asp Ser Ile Asn Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Ser
245 250 255Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn
260 265 270Gln Ala Val Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Asn
275 280 285Val Gly Phe Thr Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly
290 295 300Ala Ala Ala Val Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Thr Ser Thr Ala Pro305 310 315 320Leu Asn Glu Val Asn Leu His Pro Leu Val Thr Thr Ala Val Pro Gly
325 330 335Ser Pro Val Ala Gly Gly Val Asp Leu Ala Ile Asn Met Ala Phe Asn
340 345 350Phe Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Gly Thr Ser Phe Thr Pro Pro
355 360 365Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Ile Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln
370 375 380Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ala Asp385 390 395 400Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Pro His
405 410 415Pro Phe His Leu His Gly His Ala Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly
420 425 430Ser Thr Val Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser
435 440 445Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr
450 455 460Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu465 470 475 480Glu Ala Gly Phe Ala Val Val Phe Ala Glu Asp Ile Pro Asp Val Ala
485 490 495Ser Ala Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr
500 505 510Asp Ala Leu Asp Pro Ser Asp Gln
515 520(2)序列3的信息
(i)序列特征
(A)長度2880bp
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置544..592 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置837..899 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1014..1066 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1133..1187 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1284..1342 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1752..1815 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1873..1928 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(A)位置2136..2195 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置join(364..543，593..661，716..835，900..1013，
1067..1132，1188..1283，1343..1498，
1554..1751，1816..1872，1929..2135，
2196..2489) (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置662..715 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1499..1553 (xi)序列表述序列3GCGGCGCACA AACCGTGGGA GCCAACACAC TCCCGTCCAC TCTCACACTG GCCAGATTCG60CGCGACCGCC GCCTTTCAGG CCCAAACAGA TCTGGCAGGT TTCGATGGCG CACGCCGCCG 120TGCCTGCCGG ATTCAATTGT GCGCCAGTCG GGCATCCGGA TGGCTCTACC AGCGCGGTTG 180ACTGGAAGAG AACACCGAGG TCATGCATTC TGGCCAAGTG CGGCCAAAGG ACCGCTCGCT 240GGTGCGGATA CTTAAAGGGC GGCGCGGGGA GGCCTGTCTA CCAAGCTCAA GCTCGCCTTG 300GGTTCCCAGT CTCCGCCACC CTCCTCTTCC CCCACACAGT CGCTCCATAG CACCGTCGGC 360GCC ATG GGT CTG CAG CGA TTC AGC TTC TTC GTC ACC CTC GCG CTC GTC 408
Met Gly Leu Gln Arg Phe Ser Phe Phe Val Thr Leu Ala Leu Val
1 5 10 15GCT CGC TCT CTT GCA GCC ATC GGG CCG GTG GCG AGC CTC GTC GTC GCG 456Ala Arq Ser Leu Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Ser Leu Val Val Ala
20 25 30AAC GCC CCC GTC TCG CCC GAC GGC TTC CTT CGG GAT GCC ATC GTG GTC 504Asn Ala Pro Val Ser Pro Asp Gly Phe Leu Arq Asp Ala Ile Val Val
35 40 45AAC GGC GTG GTC CCT TCC CCG CTC ATC ACC GGG AAG AAG GTCGGCGTGT 553Asn Gly Val Val Pro Ser Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys
50 55 60TCGTCGTCGT CCTACTCCTT TGCTGACAGC GATCTACAG GGA GAC CGC TTC CAG 607
Gly Asp Arq Phe Gln
65CTC AAC GTC GTC GAC ACC TTG ACC AAC CAC AGC ATG CTC AAG TCC ACT 655Leu Asn Val Val Asp Thr Leu Thr Asn His Ser Met Leu Lys Ser Thr
70 75 80AGT ATC GTAAGTGTGA CGATCCGAAT GTGACATCAA TCGGGGCTAA TTAACCGCGC 711Ser IleACAG CAC TGG CAC GGC TTC TTC CAG GCA GGC ACC AAC TGG GCA GAA GGA760
His Trp His Gly Phe Phe Gln Ala Gly Thr Asn Trp Ala Glu Gly
85 90 95CCC GCG TTC GTC AAC CAG TGC CCT ATT GCT TCC GGG CAT TCA TTC CTG 808Pro Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Ser Gly His Ser Phe Leu
100 105 110TAC GAC TTC CAT GTG CCC GAC CAG GCA GTAAGCAGGA TTTTTTCTGGGG 855Tyr Asp Phe His Val Pro Asp Gln Ala115 120TCCCCGTGTG ATGCAATGTT CTCATGCTCC GACGTGATCG ACAG GGG ACG TTC TGG911
Gly Thr Phe Trp
125TAC CAC AGT CAT CTG TCT ACG CAG TAC TGT GAC GGG CTG CGG GGG CCG 959Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu ArG Gly Pro
130 135 140TTC GTC GTG TAC GAC CCC AAG GAC CCG CAC GCC AGC CGT TAC GAT GTT1007Phe Val Val Tyr Asp Pro Lys Asp Pro His Ala Ser ArG Tyr Asp Val
145 150 155GAC AAT GTACGTGCGC CACGGAGTAT ATCACACAGC ATGCGTTGAC GTCGGGCCAA 1063Asp Asn160CAG GAG AGC ACG GTC ATC ACG TTG ACC GAC TGG TAC CAC ACC GCT GCC1111
Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu Thr Asp Trp Tyr His Thr Ala Ala
165 170 175CGG CTC GGT CCC AAG TTC CCA GTAAGCTCGC AATGGCTTAG TGTTCACAGG 1162Arg Leu Gly Pro Lys Phe Pro
180TTCTTTGCTT ATGTTGCTTC GATAG CTC GGC GCG GAC GCC ACG CTC ATC AAC1214
Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile Asn
185 190GGT CTG GGG CGG TCG GCC TCG ACT CCC ACC GCT GCG CTT GCC GTG ATC1262Gly Leu Gly Arg Ser Ala Ser Thr Pro Thr Ala Ala Leu Ala Val Ile
195 200 205AAC GTC CAG CAC GGA AAG CGC GTGAGCATTC TCTTGTATGC CATTTCAATG 1313Asn Val Gln His Gly Lys Arg
210 215CTTTGTGCTG ACCTATCGGA ACCGCGCAG TAC CGC TTC CGT CTC GTT TCG ATC1366
Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile
220TCG TGT GAC CCG AAC TAC ACG TTC AGC ATC GAC GGG CAC AAC CTG ACC1414Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Leu Thr
225 230 235GTC ATC GAG GTC GAC GGC ATC AAT AGC CAG CCT CTC CTT GTC GAC TCT1462Val Ile Glu Val Asp Gly Ile Asn Ser Gln Pro Leu Leu Val Asp Ser240 245 250 255ATC CAG ATC TTC GCC GCA CAG CGC TAC TCC TTC GTG GTAAGTCCTG 1508Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val
260 265GCTTGTCGAT GCTCCAAAGT GGCCTCACTC ATATACTTTC GTTTAG TTG AAT GCG 1562
Leu Asn Ala
270AAT CAA ACG GTG GGC AAC TAC TGG GTT CGT GCG AAC CCG AAC TTC GGA1610Asn Gln Thr Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly
275 280 285ACG GTT GGG TTC GCC GGG GGG ATC AAC TCC GCC ATC TTG CGC TAC CAG1658Thr Val Gly Phe Ala Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu ArG Tyr Gln
290 295 300GGC GCA CCG GTC GCC GAG CCT ACC ACG ACC CAG ACG CCG TCG GTG ATC1706Gly Ala Pro Val Ala Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Pro Ser Val Ile
305 310 315CCG CTC ATC GAG ACG AAC TTG CAC CCG CTC GCG CGC ATG CCA GTG1751Pro Leu Ile Glu Thr Asn Leu His Pro Leu Ala Arg Met Pro Val
320 325 330GTATGTCTCT TTTTCTGATC ATCTGAGTTG CCCGTTGTTG ACCGCATTAT GTGTTACTAT 1811CTAG CCT GGC AGC CCG ACA CCC GGG GGC GTC GAC AAG GCG CTC AAC CTC 1860
Pro Gly Ser Pro Thr Pro Gly Gly Val Asp Lys Ala Leu Asn Leu
335 340 345GCG TTT AAC TTC GTAAGTATCT CTACTACTTA GGCTGGAGGC TCGTCGCTGA1912Ala Phe Asn Phe
350TCATACGGTG CTTCAG AAC GGC ACC AAC TTC TTC ATC AAC AAC GCG ACT 1961
Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Asn Ala Thr
355 360TTC ACG CCG CCG ACC GTC CCG GTA CTC CTC CAG ATT CTG AGC GGT GCG2009Phe Thr Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala
365 370 375CAG ACC GCA CAA GAC CTG CTC CCC GCA GGC TCT GTC TAC CCG CTC CCG 2057Gln Thr Ala Gln Asp Leu Leu Pro Ala Gly Ser Val Tyr Pro Leu Pro380 385 390 395GCC CAC TCC ACC ATC GAG ATC ACG CTG CCC GCG ACC GCC TTG GCC CCG 2105Ala His Ser Thr Ile Glu Ile Thr Leu Pro Ala Thr Ala Leu Ala Pro
400 405 410GGT GCA CCG CAC CCC TTC CAC CTG CAC GGT GTATGTTCCC CTGCCTTCCC 2155Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly
415 420TTCTTATCCC CGAACCAGTG CTCACGTCCG TCCCATCTAG CAC GCC TTC GCG GTC 2210
His Ala Phe Ala Val
425GTT CGC AGC GCG GGG AGC ACC ACG TAT AAC TAC AAC GAC CCG ATC TTC 2258Val Arq Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Phe
430 435 440CGC GAC GTC GTG AGC ACG GGC ACG CCC GCC GCG GGC GAC AAC GTC ACG 2306Arg Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr
445 450 455ATC CGC TTC CAG ACG GAC AAC CCC GGG CCG TGG TTC CTC CAC TGC CAC 2354Ile Arg Phe Gln Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His
460 465 470ATC GAC TTC CAC CTC GAC GCA GGC TTC GCG ATC GTG TTC GCA GAG GAC 2402Ile Asp Phe His Leu Asp Ala Gly Phe Ala Ile Val Phe Ala Glu Asp475 480 485 490GTT GCG GAC GTG AAG GCG GCG AAC CCG GTT CCG AAG GCG TGG TCG GAC 2450Val Ala Asp Val Lys Ala Ala Asn Pro Val Pro Lys Ala Trp Ser Asp
495 500 505CTG TGC CCG ATC TAC GAC GGG CTG AGC GAG GCT AAC CAG TGAGCGGAGG2499Leu Cys Pro Ile Tyr Asp Gly Leu Ser Glu Ala Asn Gln
510 515GCGTGGTGTT GAGCGTAAAG CTCGGGCGTC GACCTGGGGG GTTGAAGGTG TTCTGATTGA 2559AATGGTCTTT GGGTTTATTT GTTGTTATTC TAACTCGGTT CTCTACGCAA GGACCGAGGA 2619TTGTATAGGA TGAAGTAACT TCCCTAATGT ATTATGATAT CAATTGACGG AGGCATGGAC 2679TGCGAAGTGT GTACAATGTG GTAGTGGTCT AGGCCTTGGA GACAAGCTGT GGATTTTTCT 2739TGGGGGATGA AGAGGCGTGA AGGCTGAGAG CTATGCTATG CCTAGTGACG TGGTTATAGT 2799AAATGTCCAT TACATTGACC AAGAACGACA AGAACCATAA GCTTGCTGAG GATAGATGGG 2859GGCGCGTCCG CGAACGACTT G 2880(2)序列4的信息 (i)序列特征
(A)長度519個氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓撲結構線性 (ii)分子類型蛋白質 (xi)序列表述序列4Met Gly Leu Gln Arg Phe Ser Phe Phe Val Thr Leu Ala Leu Val Ala 1 5 10 15Arg Ser Leu Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Ser Leu Val Val Ala Asn
20 25 30Ala Pro Val Ser Pro Asp Gly Phe Leu Arg Asp Ala Ile Val Val Asn
35 40 45Gly Val Val Pro Ser Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys Gly Asp Arg Phe
50 55 60Gln Leu Asn Val Val Asp Thr Leu Thr Asn His Ser Met Leu Lys Ser 65 70 75 80Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Ala Gly Thr Asn Trp Ala
85 90 95Glu Gly Pro Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Ser Gly His Ser
100 105 110Phe Leu Tyr Asp Phe His Val Pro AsP Gln Ala Gly Thr Phe TrpTyr
115 120 125His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro Phe
130 135 140Val Val Tyr Asp Pro Lys Asp Pro His Ala Ser Arg Tyr Asp Val Asp145 150 155 160Asn Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu Thr Asp Trp Tyr His Thr Ala Ala
165 170 175Arg Leu Gly Pro Lys Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile Asn
180 185 190Gly Leu Gly Arg Ser Ala Ser Thr Pro Thr Ala Ala Leu Ala Val Ile
195 200 205Asn Val Gln His Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile Ser
210 215 220Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His ASn Leu Thr Val225 230 235 240Ile Glu Val Asp Gly Ile Asn Ser Gln Pro Leu Leu Val Asp Ser Ile
245 250 255Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asn Gln
260 265 270Thr Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Thr Val
275 280 285Gly Phe Ala Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Gln Gly Ala
290 295 300Pro Val Ala Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Pro Ser Val Ile Pro Leu305 310 315 320Ile Glu Thr Asn Leu His Pro Leu Ala Arg Met Pro Val Pro Gly Ser
325 330 335Pro Thr Pro Gly Gly Val Asp Lys Ala Leu Asn Leu Ala Phe Asn Phe
340 345 350Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Asn Ala Thr Phe Thr Pro Pro Thr
355 360 365Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Thr Ala Gln Asp
370 375 380Leu Leu Pro Ala Gly Ser Val Tyr Pro Leu Pro Ala His Ser Thr Ile385 390 395 400Glu Ile Thr Leu Pro Ala Thr Ala Leu Ala Pro Gly Ala Pro His Pro
405 410 415Phe His Leu His Gly His Ala Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly Ser
420 425 430Thr Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser Thr
435 440 445Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Gln Thr Asp
450 455 460Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu Asp465 470 475 480Ala Gly Phe Ala Ile Val Phe Ala Glu Asp Val Ala Asp Val Lys Ala
485 490 495Ala Asn Pro Val Pro Lys Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Asp
500 505 510Gly Leu Ser Glu Ala Asn Gln
515(2)序列5的信息
(i)序列特征
(A)長度3102bp
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(vi)起源
(A)生物Polyporus pinsitus
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置666..720
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置790..845
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1125..1182
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1390..1450
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1607..1661
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1863..1918
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1976..2025 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2227..2285(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2403..2458(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置2576..2627(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置join(665..721，789..846，1124..1183，
1389..1451，1606..1662，1862..1919，
1975..2026，2226..2286，2402..2459，
2575..2628).(xi)序列表述序列5TTTCCCGACT AAACCAATCT CAGNCCGCTT CCTCCTAGGG AACCGAGCGA TGTGGCGGCC 60CTCTCTATCC AAGCTGTCCA TAAGAAGACG TTCAAATGCC GCAGCAAGCG AGGAAATAAG120CATCTAACAG TGTTTTTCCC ATAGTCGCAT TTGCGCCGCC TGTCGGACCG ACGCCCCTAG180AGCGCTTTGG GAAACGTCGC AAGTGGCGGG TGTTATTCGT GTAGACGAGA CGGTATTTGT240CTCATCATTC CCGTGCTTCA GGTTGACACA GCCCAAAGGT CTATGTACGG CCCTTCACAT300TCCCTGACAC ATTGACGCAA CCCTCGGTGC GCCTCCGACA GTGCCTCGGT TGTAGTATCG360GGACGCCCTA GGATGCAAGA TTGGAAGTCA CCAAGGCCCG AAGGGTATAA AATACCGAGA420GGTCCTACCA CTTCTGCATC TCCAGTCGCA GAGTTCCTCT CCCTTGCCAG CCACAGCTCG480AG ATG TCC TTC TCT AGC CTT CGC CGT GCC TTG GTC TTC CTG GGT GCT 527 Met Ser Phe Ser Ser Leu ArG ArG Ala Leu Val Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15TGC AGC AGT GCG CTG GCC TCC ATC GGC CCA GTC ACT GAG CTC GAC ATC 575Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Ile Gly Pro Val Thr Glu Leu Asp Ile
20 25 30GTT AAC AAG GTC ATC GCC CCG GAT GGC GTC GCT CGT GAT ACA GTC CTC 623Val Asn Lys Val Ile Ala Pro Asp Gly Val Ala Arg Asp Thr Val Leu
35 40 45GCC GGG GGC ACG TTC CCG GGC CCA CTC ATC ACA GGA AAG AAG 665Ala Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys
50 55 60GTATGCTAAG TAGTCCCGCC CCCATCATCC TGTGGCTGAC GTTCGACGCC GCCAG 720GGT GAC AAC TTC CGC ATC AAC GTC GTC GAC AAG TTG GTT AAC CAG ACT 768Gly Asp Asn Phe Arq Ile Asn Val Val Asp Lys Leu Val Asn Gln Thr
65 70 75ATG CTG ACA TCC ACC ACC ATT GTATGTCACT AGCTCTCGCT ATCTCGAGAC 819Met Leu Thr Ser Thr Thr Ile
80CCGCTGACCG ACAACATTTG CCGTAG CAC TGG CAC GGG ATG TTC CAG CAT 859
His Trp His Gly Met Phe Gln His
85 90ACG ACG AAC TGG GCG GAT GGT CCC GCC TTT GTG ACT CAA TGC CCT ATC 917Thr Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile
95 100 105ACC ACT GGT GAT GAT TTC CTG TAC AAC TTC CGC GTG CCC GAC CAG ACA 965Thr Thr Gly Asp Asp Phe Leu Tyr Asn Phe Arg Val Pro Asp Gln Thr
110 115 120GTACGCAAAG GGCAGCATGC GTACTCAAAG ACATCTCTAA GCATTTCCTA CCTAG1020GGA ACG TAC TGG TAC CAT AGC CAT CTG GCC TTG CAG TAC TGT GAT GGG 1068Gly Thr Tyr Trp Tyr His Ser His Leu Ala Leu Gln Tyr Cys Asp Gly125 130 135 140CTT CGC GGC CCC CTG GTG ATT TAC GAT CCC CAT GAT CCG CAG GCA TAC 1116Leu Arg Gly Pro Leu Val Ile Tyr Asp Pro His Asp Pro Gln Ala Tyr
145 150 155CTG TAT GAC GTC GAT GAC GTACGCAGCA CAGTTTCCCT AAAACGGTTA1164Leu Tyr Asp Val Asp Asp
160ACTTCTAATT CTGTAAATAT CTTCATAG GAG AGC ACC GTT ATC ACT CTG 1213
Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu
165GCA GAC TGG TAC CAT ACC CCG GCG CCT CTG CTG CCG CCT GCC GCG1258Ala Asp Trp Tyr His Thr Pro Ala Pro Leu Leu Pro Pro Ala Ala170 175 180GTACGCCTCC ACACATCTGC ACAGCGTTCC GTATCTCATA CCCTTAAAGT TTATCGGACA 1318ACT TTG ATT AAT GGC CTG GGT CGC TGG CCT GGC AAC CCC ACC GCC GAC1366Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Trp Pro Gly Asn Pro Thr Ala Asp185 190 195 200CTA GCC GTC ATC GAA GTC CAG CAC GGA AAG CGC GTATGTCATA GCTCGGTTAT 1419Leu Ala Val Ile Glu Val Gln His Gly Lys Arq
205 210CTATTCATAC TCGCGGCCTC GAAGCTAAAA CCTTGTTCCA G TAC CGG TTC CGA 1472
Tyr Arg Phe Arg
215CTG GTC AGC ACC TCA TGC GAC CCC AAC TAC AAC TTC ACT ATC GAT GGC1520Leu Val Ser Thr Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Asn Phe Thr Ile Asp Gly
220 225 230CAC ACC ATG ACA ATC ATC GAG GCG GAT GGG CAG AAC ACC CAG CCA CAC1568His Thr Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Gly Gln Asn Thr Gln Pro His
235 240 245CAA GTC GAC GGA CTT CAG ATC TTC GCG GCA CAG CGG TAC TCC TTC GTT1616Gln Val Asp Gly Leu Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arq Tyr Ser Phe Val
250 255 260GTATGTTTTC CGCATTTCGG GAAAAGGAAT TGCGCTGACA GCTCGAGTGT GCGTAG 1672CTT AAC GCT AAC CAA GCG GTC AAC AAC TAC TGG ATC CGT GCG AAC CCT1720Leu Asn Ala Asn Gln Ala Val Asn Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro
265 270 275AAC CGT GCT AAC ACT ACG GGC TTC GCC AAC GGC ATC AAC TCC GCC ATC1768Asn Arg Ala Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asn Gly Ile Asn Ser Ala Ile280 285 290 295CTG CGC TAC AAG GGG GCG CCG ATT AAG GAG CCT ACG ACG AAC CAG ACT1816Leu Arq Tyr Lys Gly Ala Pro Ile Lys Glu Pro Thr Thr Asn Gln Thr
300 305 310ACC ATC CGG AAC TTT TTG TGG GAG ACG GAC TTG CAC CCG CTC ACT GAC1864Thr Ile Arg Asn Phe Leu Trp Glu Thr Asp Leu His Pro Leu Thr Asp
315 320 325CCA CGT GCA GTAAGTTCTA CACAGTCACC AACGGTGAGC TGTTGTCTGA1913Pro Arg Ala
330TTGCACTGTG TTATAG CCT GGC CTT CCT TTC AAG GGG GGC GTT GAC CAC 1962
Pro Gly Leu Pro Phe Lys Gly Gly Val Asp His
335 340GCT TTG AAC CTC AAC CTC ACT TTC GTACGTAGCG CCTCAGATAT CGAGTAGTCT 2016Ala Leu Asn Leu Asn Leu Thr Phe
345ATCTCCTGAC CGATTGACAG AAT GGA TCG GAG TTC TTC ATC AAC GAT GCG 2066
Asn Gly Ser Glu Phe Phe Ile Asn Asp Ala
350 355CCT TTC GTC CCT CCG ACT GTC CCG GTG CTA CTG CAG ATC CTG AAC GGA2114Pro Phe Val Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Asn Gly360 365 370 375ACG CTC GAC GCG AAC GAC CTC CTG CCG CCC GGC AGC GTC TAC AAC CTT 2162Thr Leu Asp Ala Asn Asp Leu Leu Pro Pro Gly Ser Val Tyr Asn Leu
380 385 390CCT CCG GAC TCC ACC ATC GAG CTG TCC ATT CCC GGA GGT GTG ACG GGT 2210Pro Pro Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser Ile Pro Gly Gly Val Thr Gly
395 400 405GGC CCG CAC CCA TTC CAT TTG CAC GGG GTAATAATCT CTCTTATAC2257Gly Pro His Pro Phe His Leu His Gly
410 415TTTGGTCTCC CGATGCTGAC TTTCACTGCT CATCTTCAG CAC GCT TTC TCC GTC 2311
His Ala Phe Ser Val
420GTG CGT AGC GCC GGC AGC ACC GAA TAC AAC TAC GCG AAC CCG GTG AAG 2359Val Arg Ser Ala Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Tyr Ala Asn Pro Val Lys
425 430 435CGC GAC ACG GTC AGC ATT GGT CTT GCG GGC GAC AAC GTC ACC GTG CGC 2407Arg Asp Thr Val Ser Ile Gly Leu Ala Gly Asp Asn Val Thr Val Arg
440 445 450TTC GTG GTATGTTTTA CAGCCTCTCT ATCTCCGTGG GCGTTCGGAA GTTGACTGGG 2463Phe Val
455GCGTAG ACC GAC AAC CCC GGC CCG TGG TTC CTC CAC TGT CAC ATC GAC 2511
Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp
460 465TTC CAT TTG CAA GCA GGC CTC GCC ATC GTG TTC GCG GAG GAC GCG CAG 2559Phe His Leu Gln Ala Gly Leu Ala Ile Val Phe Ala Glu Asp Ala Gln470 475 480 485GAC ACG AAG CTT GTG AAC CCC GTC CCT GTACGTCTTC TGGATGCATG 2606Asp Thr Lys Leu Val Asn Pro Val Pro
490CGCTCCGCAC AGTGACTCAT CTTTTGCAAC AG GAG GAC TGG AAC AAG CTG TGC 2659
Glu Asp Trp Asn Lys Leu Cys
495 500CCC ACC TTC GAT AAG GCG ATG AAC ATC ACG GTT TGAGCGATGC 2702Pro Thr Phe Asp Lys Ala Met Asn Ile Thr Val
505 510GTGGCGCTCA TGGTCATTTT CTTGGAATCT TTGCATAGGG CTGCAGCACG CTGGATACTC 2762TTTCCCTTAG CAGGATATTA TTTAATGACC CCTGCGTTTA GTGCTTAGTT AGCTTTACTA 2822CTGGTTGTAA TGTACGCAGC ATGCGTAATT CGGATAATGC TATCAATGTG TATATTATGA 2882CACGCGTCAT GCGCGATGCT TGAGTTGCAA GGTCGGTTTC CGATGCTCGA CATAAACGTT 2942TCACTTACAT ACACATTGGG TCTAGAACTG GATCTATCCA TGTATACAAA AACTCCTCAT 3002ACAGCTGACT GGGGCGCTCT AGAGCATGGG TCCGATTGAT CAGATGTCGC GAACACGAGC 3062CTCCTGAGCT CGAGGACTCT GAGAAGCGGC GGTGCGTTCT 3102(2)序列6的信息(i)序列特征 (A)長度512個氨基酸 (B)類型氨基酸 (C)鏈型單鏈 (D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)起源 (A)生物Polyporus pinsitus(xi)序列表述序列6Met Ser Phe Ser Ser Leu Arg Arg Aia Leu Val Phe Leu Gly Ala Cys1 5 10 15Ser Ser Ala Leu Ala Ser Ile Gly Pro Val Thr Glu Leu Asp Ile Val
20 25 30Asn Lys Val Ile Ala Pro Asp Gly Val Ala Arg Asp Thr Val Leu Ala
35 40 45Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys Gly Asp Asn
50 55 60Phe Arg Ile Asn Val Val Asp Lys Leu Val Asn Gln Thr Met Leu Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Ile His Trp His Gly Met Phe Gln His Thr Thr Asn Trp
85 90 95Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile Thr Thr Gly Asp
100 105 110Asp Phe Leu Tyr Asn Phe Arg Val Pro Asp Gln Thr Gly Thr Tyr Trp
115 120 125Tyr His Ser His Leu Ala Leu Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro
130 135 140Leu Val Ile Tyr Asp Pro His Asp Pro Gln Ala Tyr Leu Tyr Asp Val145 150 155 160Asp Asp Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Thr Pro
165 170 175Ala Pro Leu Leu Pro Pro Ala Ala Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg
180 185 190Trp Pro Gly Asn Pro Thr Ala Asp Leu Ala Val Ile Glu Val Gln His
195 200 205Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Thr Ser Cys Asp Pro Asn
210 215 220Tyr Asn Phe Thr Ile Asp Gly His Thr Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp225 230 235 240Gly Gln Asn Thr Gln Pro His Gln Val Asp Gly Leu Gln Ile Phe Ala
245 250 255Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asn Gln Ala Val Asn Asn
260 265 270Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro Asn Arg Ala Asn Thr Thr Gly Phe Ala
275 280 285Asn Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Gly Ala Pro Ile Lys
290 295 300Glu Pro Thr Thr Asn Gln Thr Thr Ile Arg Asn Phe Leu Trp Glu Thr305 310 315 320Asp Leu His Pro Leu Thr Asp Pro Arg Ala Pro Gly Leu Pro Phe Lys
325 330 335Gly Gly Val Asp His Ala Leu Asn Leu Asn Leu Thr Phe Asn Gly Ser
340 345 350Glu Phe Phe Ile Asn Asp Ala Pro Phe Val Pro Pro Thr Val Pro Val
355 360 365Leu Leu Gln Ile Leu Asn Gly Thr Leu Asp Ala Asn Asp Leu Leu Pro
370 375 380Pro Gly Ser Val Tyr Asn Leu Pro Pro Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser385 390 395 400Ile Pro Gly Gly Val Thr Gly Gly Pro His Pro Phe His Leu His Gly
405 410 415His Ala Phe Ser Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Tyr
420 425 430Ala Asn Pro Val Lys Arg Asp Thr Val Ser Ile Gly Leu Ala Gly Asp
435 440 445Asn Val Thr Val Arg Phe Val Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu
450 455 460His Cys His Ile Asp Phe His Leu Gln Ala Gly Leu Ala Ile Val Phe465 470 475 480Ala Glu Asp Ala Gln Asp Thr Lys Leu Val Asn Pro Val Pro Glu Asp
485 490 495Trp Asn Lys Leu Cys Pro Thr Phe Asp Lys Ala Met Asn Ile Thr Val
500 505 510(2)序列7的信息
(i)序列特征
(A)長度2860bp
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置851..905
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1266..1320
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1351..1376
(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1416..1468 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1625..1683 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1882..1934 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2202..2252 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2370..2425 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2543..2599 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置join(540..725，782..850，906..1025，1086..1265，
1321..1350，1377..1415，1469..1624，
1684..1881，1935..2201，2253..2369，
2426..2542，2600..2653)(xi)序列表述序列7GGGGGGCGCG TCAATGGTCC GTTTGCGAAC ACATATGCAG GATAAACAGT GCGAAATATC 60AATGTGGCGG CGACACAACC TCGCCGGCCG ACACTCGACG CTGTTGATCA TGATCATGTC 120TTGTGAGCAT TCTATACGCA GCCTTGGAAA TCTCAGGCGA ATTTGTCTGA ATTGCGCTGG 180GAGGCTGGCA GCGCAGATCG GTGTGTCGGT GCAGTAGCCG ACGCAGCACC TGGCGGAAGC 240CGACATCTCG GGTACGACTT GATCTCCGCC AGATCACTGC GGTTCCGCCA TCGGCCGCGG 300GGCCCATTCT GTGTGTGCGC TGTAGCACTC TGCATTCAGG CTCAACGTAT CCATGCTAGA 360GGACCGTCCA GCTGTTGGCG CACGATTCGC GCAGAAAGCT GTACAGGCAG ATATAAGGAT 420GTCCGTCCGT CAGAGACTCG TCACTCACAA GCCTCTTTTC CTCTTCGCCT TTCCAGCCTC 480TTCCAACGCC TGCCATCGTC CTCTTAGTTC GCTCGTCCAT TCTTTCTGCG TAGTTAATC539ATG GGC AGG TTC TCA TCT CTC TGC GCG CTC ACC GCC GTC ATC CAC TCT 587Met Gly Arg Phe Ser Ser Leu Cys Ala Leu Thr Ala Val Ile His Ser 1 5 10 15TTT GGT CGT GTC TCC GCC GCT ATC GGG CCT GTG ACC GAC CTC ACC ATC 635Phe Gly Arg Val Ser Ala Ala Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu Thr Ile
20 25 30TCC AAT GGG GAC GTT TCT CCC GAC GGC TTC ACT CGT GCC GCA GTG CTT 683Ser Asn Gly Asp Val Ser Pro Asp Gly Phe Thr Arg Ala Ala Val Leu
35 40 45GCA AAC GGC GTC TTC CCG GGT CCT CTT ATC ACG GGA AAC AAG 725Ala Asn Gly Val Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys
50 55 60GTACGTGGCA TGCGTTCAGT CTACACCCTA CAAGCCTTCT AACTCTTTTA CCACAG 781GGC GAC AAC TTC CAG ATC AAT GTT ATC GAC AAC CTC TCT AAC GAG ACG 829Gly Asp Asn Phe Gln Ile Asn Val Ile Asp Asn Leu Ser Asn Glu Thr
65 70 75ATG TTG AAG TCG ACC TCC ATC GTATGTGCTT CTACTGCTTC TTAGTCTTGG880Met Leu Lys Ser Thr Ser Ile
80 85CAATGGCTCA AGGTCTCCTC CGCAG CAT TGG CAC GGC TTC TTC CAG AAG GGT 932
His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly
90ACT AAC TGG GCT GAT GGA GCT GCC TTC GTC AAC CAG TGC CCT ATC GCG 980Thr Asn Trp Ala Asp Gly Ala Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala 95 100 105 110ACG GGG AAC TCT TTC CTT TAC GAC TTC ACC GCG ACG GAC CAA GCA1025Thr Gly Asn Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Thr Ala Thr Asp Gln Ala
115 120 125GTCAGTGCCT GTGGCGCTTA TGTTTTCCCG TAATCAGCAG CTAACACTCC GCACCCACAG 1085GGC ACC TTC TGG TAC CAC AGT CAC TTG TCT ACG CAG TAC TGC GAT GGT1133Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly
130 135 140TTG CGG GGC CCG ATG GTC GTA TAC GAC CCG AGT GAC CCG CAT GCG GAC1181Leu Arg Gly Pro Met Val Val Tyr Asp Pro Ser Asp Pro His Ala Asp
145 150 155CTT TAC GAC GTC GAC GAC GAG ACC ACG ATC ATC ACG CTC TCT GAT TGG1229Leu Tyr Asp Val Asp Asp Glu Thr Thr Ile Ile Thr Leu Ser Asp Trp
160 165 170TAT CAC ACC GCT GCT TCG CTC GGT GCT GCC TTC CCG GTAAGTTTAC 1275Tyr His Thr Ala Ala Ser Leu Gly Ala Ala Phe Pro
175 180 185CCCAGCGCAC GGAGTTAAGA CCGGATCTAA CTGTAATACG TTCAG ATT GGC TCG 1329
Ile Gly SerGAC TCT ACC CTG ATT AAC GCC GTTGGCCGCT TCGCGGGTGG TGACAG ACT GAC 1382Asp Ser Thr Leu Ile Ash Gly Thr Asp
190 195CTT GCG GTT ATC ACT GTC GAG CAG GGC AAG CGC GTTAGTGATA CCCTCTACAG 1435Leu Ala Val Ile Thr Val Glu Gln Gly Lys Arg
200 205TTGACACTGT GCCATTGCTG ACAGTACTCT CAG TAC CGT ATG CGT CTT CTC TCG 1489
Tyr Arg Met Arg Leu Leu Ser
210 215CTG TCT TGC GAC CCC AAC TAT GTC TTC TCC ATT GAC GGC CAC AAC ATG1537Leu Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Val Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Met
220 225 230ACC ATC ATC GAG GCC GAC GCC GTC AAC CAC GAG CCC CTC ACG GTT GAC1585Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ala Val Asn His Glu Pro Leu Thr Val Asp
235 240 245TCC ATC CAG ATC TAC GCC GGC CAA CGT TAC TCC TTC GTC GTACGTATTC 1634Ser Ile Gln Ile Tyr Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val
250 255 260CGAACAGCCA TGATCACGCC AAGCCCGATG CTAACGCGCC TACCCTCAG CTT ACC 1689
Leu ThrGCT GAC CAG GAC ATC GAC AAC TAC TTC ATC CGT GCC CTG CCC ACC GCC1737Ala Asp Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Phe Ile Arg Ala Leu Pro Ser Ala
265 270 275GGT ACC ACC TCG TTC GAC GGC GGC ATC AAC TCG GCT ATC CTG CGC TAC1785Gly Thr Thr Ser Phe Asp Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr
280 285 290TCT GGT GCC TCC GAG GTT GAC CCG ACG ACC ACG GAG ACC ACG AGC GTC1833Ser Gly Ala Ser Glu Val Asp Pro Thr Thr Thr Glu Thr Thr Ser Val295 300 305 310CTC CCC CTC GAC GAG GCG AAC CTC GTG CCC CTT GAC AGC CCC GCT GCT1881Leu Pro Leu Asp Glu Ala Asn Leu Val Pro Leu Asp Ser Pro Ala Ala
315 320 325GTACGTCGTA TTCTGCGCTT GCAAGGATCG CACATACTAA CATGCTCTTG TAG CCC 1937
ProGGT GAC CCC AAC ATT GGC GGT GTC GAC TAC GCG CTG AAC TTG GAC TTC1985Gly Asp Pro Asn Ile Gly Gly Val Asp Tyr Ala Leu Asn Leu Asp Phe
330 335 340AAC TTC GAT GGC ACC AAC TTC TTC ATC AAC GAC GTC TCC TTC GTG TCC2033Asn Phe Asp Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Asp Va1 Ser Phe Va1 Ser
345 350 355CCC ACG GTC CCT GTC CTC CTC CAG ATT CTT AGC GGC ACC ACC TCC GCG2081Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Thr Thr Ser Ala360 365 370 375GCC GAC CTT CTC CCC AGC GGT AGT CTC TTC GCG GTC CCG TCC AAC TCG2129Ala Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Ala Val Pro Ser Asn Ser
380 385 390ACG ATC GAG ATC TCG TTC CCC ATC ACC GCG ACG AAC GCT CCC GGC GCG2177Thr Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Ala Thr Asn Ala Pro Gly Ala
395 400 405CCG CAT CCC TTC CAC TTG CAC GGT GTACGTGTCC CATCTCATAT GCTACGGAGC 2231Pro His Pro Phe His Leu His Gly
410 415TCCACGCTGA CCGCCCTATA G CAC ACC TTC TCT ATC GTT CGT ACC GCC GGC2282
His Thr Phe Ser Ile Val Arg Thr Ala Gly
420 425AGC ACG GAT ACG AAC TTC GTC AAC CCC GTC CGC CGC GAC GTC GTG AAC2330Ser Thr Asp Thr Asn Phe Val Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Val Asn
430 435 440ACC GGT ACC GTC GGC GAC AAC GTC ACC ATC CGC TTC ACG GTACGCAGCA 2379Thr Gly Thr Val Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Thr
445 450CTCTCCTAAC ATTCCCACTG CGCGATCACT GACTCCTCGC CCACAG ACT GAC AAC 2434
Thr Asp Asn
455CCC GGC CCC TGG TTC CTC CAC TGC CAC ATC GAC TTC CAC TTG GAG GCC2482Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala
460 465 470GGT TTC GCC ATC GTC TTC AGC GAG GAC ACC GCC GAC GTC TCG AAC ACG2530Gly Phe Ala Ile Val Phe Ser Glu Asp Thr Ala Asp Val Ser Asn Thr
475 480 485ACC ACG CCC TCG GTACGTTGTG CTCCCGTGCC CATCTCCGCG CGCCTGACTA2582Thr Thr Pro Ser490ACGAGCACCC CTTACAG ACT GCT TGG GAA GAT CTG TGC CCC ACG TAC AAC 2632
Thr Ala Trp Glu Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asn
495 500GCT CTT GAC TCA TCC GAC CTC TAATCGGTTC AAAGGGTCGC TCGCTACCTT 2683Ala Leu Asp Ser Ser Asp Leu505 510AGTAGGTAGA CTTATGCACC GGACATTATC TACAATGGAC TTTAATTTGG GTTAACGGCC 2743GTTATACATA CGCGCACGTA GTATAAAGGT TCTCTGGATT GGTCGGACCT ACAGACTGCA 2803ATTTTCGTGA CCTATCAACT GTATATTGAA GCACGACAGT GAATGGAAAT AGAGACA2860(2)序列8的信息
(i)序列特征
(A)長度511個氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型蛋白質
(xi)序列表述序列8Met Gly Arg Phe Ser Ser Leu Cys Ala Leu Thr Ala Val Ile His Ser 1 5 10 15Phe Gly Arg Val Ser Ala Ala Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu Thr Ile
20 25 30Ser Asn Gly Asp Val Ser Pro Asp Gly Phe Thr Arg Ala Ala Val Leu
35 40 45Ala Asn Gly Val Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys Gly Asp
50 55 60Asn Phe Gln Ile Asn Val Ile Asp Asn Leu Ser Asn Glu Thr Met Leu 65 70 75 80Lys Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn
85 90 95Trp Ala Asp Gly Ala Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Thr Gly
100 105 110Asn Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Thr Ala Thr Asp Gln Ala Gly Thr Phe
115 120 125Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly
130 135 140Pro Met Val Val Tyr Asp Pro Ser Asp Pro His Ala Asp Leu Tyr Asp145 150 155 160Val Asp Asp Glu Thr Thr Ile Ile Thr Leu Ser Asp Trp Tyr His Thr
165 170 175Ala Ala Ser Leu Gly Ala Ala Phe Pro Ile Gly Ser Asp Ser Thr Leu
180 185 190Ile Asn Gly Thr Asp Leu Ala Val Ile Thr Val Glu Gln Gly Lys Arg
195 200 205Tyr Arg Met Arg Leu Leu Ser Leu Ser Cys Asp Pro Ash Tyr Val Phe
210 215 220Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ala Val Asn225 230 235 240His Glu Pro Leu Thr Val Asp Ser Ile Gln Ile Tyr Ala Gly Gln Arg
245 250 255Tyr Ser Phe Val Leu Thr Ala Asp Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Phe Ile
260 265 270Arg Ala Leu Pro Ser Ala Gly Thr Thr Ser Phe Asp Gly Gly Ile Asn
275 280 285Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Ser Glu Val Asp Pro Thr Thr
290 295 300Thr Glu Thr Thr Ser Val Leu Pro Leu Asp Glu Ala Asn Leu Val Pro305 310 315 320Leu Asp Ser Pro Ala Ala Pro Gly Asp Pro Asn Ile Gly Gly Val Asp
325 330 335Tyr Ala Leu Asn Leu Asp Phe Asn Phe Asp Gly Thr Asn Phe Phe Ile
340 345 350Asn Asp Val Ser Phe Val Ser Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile
355 360 365Leu Ser Gly Thr Thr Ser Ala Ala Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu
370 375 380Phe Ala Val Pro Ser Asn Ser Thr Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ile Thr385 390 395 400Ala Thr Asn Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His
405 410 415Thr Phe Ser Ile Val Arg Thr Ala Gly Ser Thr Asp Thr Asn Phe Val
420 425 430Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Val Asn Thr Gly Thr Val Gly Asp Asn
435 440 445Val Thr Ile Arg Phe Thr Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His
450 455 460Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Ile Val Phe Ser465 470 475 480Glu Asp Thr Ala Asp Val Ser Asn Thr Thr Thr Pro Ser Thr Ala Trp
485 490 495Glu Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asn Ala Leu Asp Ser Ser Asp Leu
500 505 510(2)序列9的信息(i)序列特征 (A)長度2925bp (B)類型核酸 (C)鏈型雙鏈 (D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)起源 (A)生物Polyporus pinsitus(ix)特征 (A)名稱/關鍵詞內含子 (B)位置734..808(ix)特征 (A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置878..932 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1051..1104 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1219..1270 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置1336..1397 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
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(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2030..2085 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2308..2375 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞內含子
(B)位置2492..2569 (ix)特征
(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置join(733..809，877..933，1050..1105，
1218..1271，1335..1398，1712..1775，
2029..2086，2307..2376，2492..2570)，
2542..2600). (xi)序列表述序列9CTCATAACTC TTCGCTTCTA GCATGGGGGC TGCGCACACC TGACAGACCC TTCGGGAGGC 60GAACTCGAAT GCAGCGTACT CTATCNCACC TCCAGGAAAG GTAGGGATGG ACNCCGTGCA 120CCAACAACTG TCTCTCCACC AGCAACCATC CCTTGGATAT GTCTCCACAC ACCCGGTGTC 180TACAAGCGGG GATCTGTGCT GGTGAAGTGC TGTCTCCGGA GCGGCGGCGG CGAGCGACCA 240GAACCCGAAC CAGTGCTAGT GCCCGACACC CGCGAGACAA TTGTGCAGGG TGAGTTATAT 300TCTTCGTGAG ACGGCGCTGC GCGTCGGCAC TGAAAGCGTC GCAGTTAGGT GATGCAGCGG 360TCCGCGCTAT TTTTGACGTC TGGCAGCTAT CCTAAGCCGC GCCTCCATAC ACCCCAGGCG 420CTCTCGTTTG CTATAGGTAT AAATCCCTCA GCTTCAGAGC GTCGATCCTC ATCCCACACG 480ACACCCGTTT CAGTCTTCTC GTAGCGCATT CCCTAGCCGC CCAGCCTCCG CTTTCGTTTT 540CAAC ATG GGC AAG TAT CAC TCT TTT GTG AAC GTC GTC GCC CTT AGT CTT 589
Met Gly Lys Tyr His Ser Phe Val Asn Val Val Ala Leu Ser Leu
1 5 10 15TCT TTG AGC GGT CGT GTG TTC GGC GCC ATT GGG CCC GTC ACC GAC TTG637Ser Leu Ser Gly Arg Val Phe Gly Ala Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu
20 25 30ACT ATC TCT AAC GCC GAT GTT ACG CCT GAC GGC ATT ACT CGT GCT GCT685Thr Ile Ser Asn Ala Asp Val Thr Pro Asp Gly Ile Thr Arg Ala Ala
35 40 45GTC CTC GCG GGC GGC GTT TTC CCC GGG CCC CTC ATT ACC GGC AAC AAG733Val Leu Ala Gly Gly Val Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys
50 55 60GTGAGCCGCG AAACCTTCTA CTAGCGCGCT CGTACGGTGC ACCGTTACTG AAGCCACACT 793TTGCGCTGTC AACAG GGG GAT GAA TTC CAG ATC AAT GTC ATC GAC AAC CTG 844
Gly Asp Glu Phe Gln Ile Asn Val Ile Asp Asn Leu
65 70 75ACC AAC GAG ACC ATG TTg AAG TCG ACC ACA ATC GTAAGGTGCT TGCTCCCATA 897Thr Asn Glu Thr Met Leu Lys Ser Thr Thr Ile
80 85ATTAAGCCCG TCGCTGACTC GAAGTTTATC TGTAG CAC TGG CAT GGT ATC TTC 950
His Trp His Gly Ile Phe
90CAG GCC GGC ACC AAC TGG GCA GAC GGC GCG GCC TTC GTG AAC CAG TGC998Gln Ala Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Ala Ala Phe Val Asn Gln Cys
95 100 105CCT ATC GCC ACG GGA AAC TCG TTC TTG TAC GAC TTC ACC GTT CCT GAT 1046Pro Ile Ala Thr Gly Asn Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Thr Val Pro Asp
110 115 120CAA GCC GTACGTTTAT ACACTTCCCT TTCTGCGGCA TACTCTGACG CGCCGCTGGA1102Gln Ala125TCAG GGC ACC TTC TGG TAC CAC AGC CAC CTG TCC ACC CAG TAC TGT GAC 1151
Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp
130 135 140GGC CTG CGC GGT CCT CTT GTG GTC TAC GAC CCC GAC GAT CCC AAC GCG 1199Gly Leu Arg Gly Pro Leu Val Val Tyr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ala
145 150 155TCT CTT TAC GAC GTC GAT GAC GTAAGCAGGC TACTTGTGGA CTTGTATGGA 1250Ser Leu Tyr Asp Val Asp AsP
160TGTATCTCAC GCTCCCCTAC AG GAT ACT ACG GTT ATT ACG CTT GCG GAC TGG 1302
Asp Thr Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp
165 170TAC CAC ACT GCG GCG AAG CTG GGC CCT GCC TTC CCC GTGAGTCTAC 1348Tyr His Thr Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro175 180 185TCTTCCTCGT GTGTTAACAT AGGTGACGGC CGCTGATACG AGAGCTACCA G GCG GGT 1405
Ala GlyCCG GAT AGC GTC TTG ATC AAT GGT CTT GGT CGG TTC TCC GGC GAT GGT 1453Pro Asp Ser Val Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Phe Ser Giy Asp Gly
190 195 200GGA GGA GCG ACA AAC CTC ACC GTG ATC ACC GTC ACG CAA GGC AAA CGG 1501Gly Gly Ala Thr Asn Leu Thr Val Ile Thr Va1 Thr Gln Gly Lys Arg205 210 215 220GTGAGTCCGC CCTGAGCTGG CCTCAATAGC GATATTGACG AGTCCATGCC CTCCCAG 1558TAC CGC TTC CGC CTT GTG TCG ATC TCG TGC GAC CCC AAC TTC ACG TTC 1606Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile Ser Cys Asp Pro Asn Phe Thr Phe
225 230 235TCG ATC GAC GGG CAC AAC ATG ACC ATC ATC GAG GTG GAC GGT GTC AAC 1654Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr Ile Ile Glu Val Asp Gly Val Asn
240 245 250CAC GAG GCC TTG GAC GTC GAC TCC ATT CAG ATT TTT GCG GGG CAG CGG 1702His Glu Ala Leu Asp Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg
255 260 265TAC TCC TTC ATC GTACGTTCCC TTGCCCTCGT GCTATATCCG CCCGTCTGCT 1754Tyr Ser Phe Ile
270CACAGAGGCTTCTATATCGC AG CTC AAC GCC AAC CAG TCC ATC GAC AAC 1803
Leu Asn Ala Asn Gln Ser Ile Asp Asn
275 280TAC TGG ATC CGC GCG ATC CCC AAC ACC GGT ACC ACC GAC ACC ACG GGC 1851Tyr Trp Ile Arg Ala Ile Pro Asn Thr Gly Thr Thr Asp Thr Thr Gly
285 290 295GGC GTG AAC TCT GCT ATT CTT CGC TAC GAC ACC GCA GAA GAT ATC GAG 1899Gly Val Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Glu Asp Ile Glu
300 305 310CCT ACG ACC AAC GCG ACC ACC TCC GTC ATC CCT CTC ACC GAG ACG GAT 1947Pro Thr Thr Asn Ala Thr Thr Ser Val Ile Pro Leu Thr Glu Thr Asp
315 320 325CT3 GTG CCG CTC GAC AAC CCT GCG GCT CCC GGT GAC CCC CAG GTC GGC 1995Leu Val Pro Leu Asp Asn Pro Ala Ala Pro Gly Asp Pro Gln Val Gly330 335 340 345GGT GTT GAC CTG GCT ATG AGT CTC GAC TTC TCC TrC GTGAGTCCC2041Gly Val Asp Leu Ala Met Ser Leu Asp Phe Ser Phe
350 355CAGCACTCCG CGCCATTTCG CTTATTTACG CAGGAGTATT GTTCAG AAC GGT TCC 2096
Asn Gly Ser
360AAC TTC TTT ATC AAC AAC GAG ACC TTC GTC CCG CCC ACA GTT CCC GTG 2144Asn Phe Phe Ile Asn Asn Glu Thr Phe Val Pro Pro Thr Val Pro Val
365 370 375CTC CTG CAG ATT TTG AGT GGT GCG CAG GAC GCG GCG AGC CTG CTC CCC 2192Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Asp Ala Ala Ser Leu Leu Pro
380 385 390AAC GGG AGT GTC TAC ACA CTC CCT TCG AAC TCG ACC ATT GAG ATC TCG 2240Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Pro Ser Asn Ser Thr Ile Glu Ile Ser
395 400 405TTC CCC ATC ATC ACC ACC GAC GGT GTT CTG AAC GCG CCC GGT GCT CCG 2288Phe Pro Ile Ile Thr Thr Asp Gly Val Leu Asn Ala Pro Gly Ala Pro
410 415 420CAC CCG TTC CAT CTC CAC GGC GTAAGTCCTT GCTTTCCTCA GTGCCTCGCT 2339His Pro Phe His Leu His Gly425 430TCCACGACGT CCACTGATCC CACACATCCC ATGTGCAG CAC ACC TTC TCG GTG2392
His Thr Phe Ser Val
435GTG CGC AGC GCC GGG AGC TCG ACC TTC AAC TAC GCC AAC CCA GTC CGC 2440Val Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr Phe Asn Tyr Ala Asn Pro Val Arg
440 445 450CGG GAC ACC GTC AGT ACT GGT AAC TCT GGC GAC AAC GTC ACT ATC CGC 2488Arg Asp Thr Val Ser Thr Gly Asn Ser Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg
455 460 465TTC ACG GTACGTCTTC TCCGGAGCCC TCCCACCCGT GTGTCCGCTG AGCGCTGAAC 2544Phe Thr
470ACCGCCCACC GTGCTGCTGC TGCGCAG ACC GAC AAC CCA GGC CCG TGG TTC2595
Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe
475CTC CAC TGC CAC ATC GAC TTT CAC CTG GAG GCC GGC TTC GCC ATC GTC 2643Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Ile Val
480 485 490TGG GGG GAG GAC ACT GCG GAC ACC GCG TCC GCG AAT CCC GTT CCT 2688Trp Gly Glu Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ser Ala Asn Pro Val Pro495 500 505GTACGTCGTG CCTGCTGAGC TCTTTGTGCC CGAACAGGGT GCTGATCGTG CCTTCCTCCG2748TGCAG ACG GCG TGG AGC GAT TTG TGC CCC ACT TAC GAT GCT TTG GAC TCG2798Thr Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asp Ala Leu Asp Ser510 515 520TCC GAC CTC TGATCGACAA GGCATGAAGG CTGAAGCAGC TGCGGTCAAT 2847Ser Asp Leu525TCTCGAACAC ACTTTACTCG AACATTCATT TTTCTTTGGC TCGGGATCGG AACAAATCAT2907GGGGGGGCCG GACCGTCT 2925(2)序列10的信息
(i)序列特征
(A)長度527個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型蛋白質
(vi)起源
(A)生物Polyporus pinsitus
(xi)序列表述序列10Met Gly Lys Tyr His Ser Phe Val Asn Val Val Ala Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Gly Ar9 Val Phe Gly Ala Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu Thr
20 25 30Ile Ser Asn Ala Asp Val Thr Pro Asp Gly Ile Thr Arg Ala Ala Val
35 40 45Leu Ala Gly Gly Val Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys Gly
50 55 60Asp Glu Phe Gln Ile Asn Val Ile Asp Asn Leu Thr Asn Glu Thr Met65 70 75 80Leu Lys Ser Thr Thr Ile Mis Trp His Gly Ile Phe Gln Ala Gly Thr
85 90 95Asn Trpo Ala Asp Gly Ala Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Thr
100 105 110Gly Asn Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Thr Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr
115 120 125Phe Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg
130 135 140Gly Pro Leu Val Val Tyr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ala Ser Leu Tyr145 150 155 160Asp Val Asp Asp Asp Thr Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His
165 170 175Thr Ala Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Ala Gly Pro Asp Ser Val
180 185 190Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Phe Ser Gly Asp Gly Gly Gly Ala Thr
195 200 205Asn Leu Thr Val Ile Thr Val Thr Gln Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg
210 215 220Leu Val Ser Ile Ser Cys Asp Pro Asn Phe Thr Phe Ser Ile Asp Gly225 230 235 240His Asn Met Thr Ile Ile Glu Val Asp Gly Val Asn Mis Glu Ala Leu
245 250 255Asp Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Ile
260 265 270Leu Asn Ala Asn Gln Ser Ile Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Ile Pro
275 280 285Asn Thr Gly Thr Thr Asp Thr Thr Gly Gly Val Asn Ser Ala Ile Leu
290 295 300Arg Tyr Asp Thr Ala Glu Asp Ile Glu Pro Thr Thr Asn Ala Thr Thr305 310 315 320Ser Val Ile Pro Leu Thr Glu Thr Asp Leu Val Pro Leu Asp Asn Pro
325 330 335Ala Ala Pro Gly Asp Pro Gln Val Gly Gly Val Asp Leu Ala Met Ser
340 345 350Leu Asp Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn Phe Phe Ile Asn Asn Glu Thr
355 360 365Phe Val Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala
370 375 380Gln Asp Ala Ala Ser Leu Leu Pro Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Pro385 390 395 400Ser Asn Ser Thr Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ile Ile Thr Thr Asp Gly
405 410 415Val Leu Asn Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His
420 425 430Thr Phe Ser Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr Phe Asn Tyr Ala
435 440 445Asn Pro Val Arg Arg Asp Thr Val Ser Thr Gly Asn Ser Gly Asp Asn
450 455 460Val Thr Ile Arg Phe Thr Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His465 470 475 480Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Ile Val Trp Gly
485 490 495Glu Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ser Ala Asn Pro Val Pro Thr Ala Trp
500 505 510Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asp Leu
515 520 525
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13 bis)
權利要求
1.一種用于在溶液中聚合木素或木素硫酸鹽底物的方法，它包括讓所述底物與一種多孔菌屬漆酶接觸。
2.一種用于在牛皮紙漿中進行原位解聚的方法，它包括讓所述紙漿與一種多孔菌屬漆酶接觸。
3.一種氧化染料或染料前體的方法，它包括讓所述染料或染料前體與一種多孔菌屬漆酶接觸。
4.一種染發的方法，它包括在有或沒有至少一種改性劑的條件下，讓一種多孔菌屬漆酶與至少一種染料前體接觸一段時間，而且是在足以將所述染料前體氧化成染料的條件下進行接觸的。
5.如權利要求4的方法，其中，所述染料前體選自二胺、氨基苯酚和苯酚。
6.如權利要求4的方法，其中，使用改性劑時，它是間二胺、間氨基苯酚或多酚。
7.如權利要求6的方法，其中，所述染料前體是選自鄰-或對-二胺或者氨基苯酚的主要中間體。
8.如權利要求6的方法，其中，使用了一種以上染料前體。
9.如權利要求6的方法，其中，使用了一種以上改性劑。
10.如權利要求6的方法，其中，同時使用了一種主要中間體和一種改性劑。
11.一種染料組合物，包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種染料前體。
12.一種染料組合物，包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種主要中間體和至少一種改性劑。
13.一種盛有染料組合物的容器，包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種染料前體，該容器中沒有氧氣。
14.如權利要求11的容器，它包括至少一種主要中間體染料前體和至少一種改性劑。
15.一種聚合或氧化酚類或苯胺類化合物的方法，包括讓所述酚類或苯胺類化合物與一種多孔菌屬漆酶接觸。
全文摘要
本發明涉及帶有一段編碼多孔菌屬(Plyporus)漆酶序列的分離的核酸,以及所編碼的漆酶蛋白。還涉及多孔菌屬漆酶的應用。
文檔編號C12N15/80GK1328073SQ0112110
公開日2001年12月26日 申請日期1995年6月15日 優先權日1994年6月24日
發明者D·S·亞夫爾, F·許, H·達爾伯吉, P·施耐德, D·A·阿斯林格 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司, 諾沃挪第克公司