專利名稱：產l－谷氨酸棒狀細菌及生產l－谷氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及用于L-谷氨酸和L-賴氨酸發酵生產的棒狀桿菌的培育和利用。特別地，本發明涉及α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)有缺陷的棒狀產L-谷氨酸細菌，一種利用該細菌生產L-谷氨酸的方法，一種編碼具有α-KGDH活性的酶并來源于棒狀產α-谷氨酸細菌的基因(α-KGDH基因)，含有該基因的重組DNA，攜帶該重組DNA的棒狀桿菌以及一種利用攜帶該重組DNA并具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌生產L-賴氨酸的方法。
背景技術：
迄今為止在工業上利用短桿菌或棒狀桿菌屬的棒狀桿菌采用發酵方法生產L-谷氨酸。
最近公開一種大腸桿菌突變株，其中α-KGDH活性缺陷或降低并且谷氨酸分解活性降低，具有高的L-谷氨酸生產能力(日本公開專利5-244970號)。
相反地，據報道一種短桿菌屬的細菌突變株與其母本菌株相比，α-KGDH活性降低，L-谷氨酸生產能力卻近似相等(農業生物化學，44，1897(1980)，農業生物化學，46，493(1982))。因此認為α-KGDH活性水平對棒狀桿菌中L-谷氨酸的生產并不重要。
另一方面，發現一種短桿菌屬的產L-谷氨酸細菌的突變株，其α-KGDH活性降低，將該細菌培養于以過量生物素為碳源且不加入如青霉素及表面活性劑的有抑制生物素效應的物質的培養基中，細菌高效地生產L-谷氨酸(最大產率53％)(日本公開專利6-23779號)。然而，如上述已認為α-KGDH活性水平對棒狀桿菌中L-谷氨酸的生產并不重要，卻沒有已將產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因克隆并分析的例子。并且并未發現α-KGD)H完全缺陷的棒狀桿菌突變株。
發明內容
本發明的一個目的是得到來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因，制備含有該基因的重組DNA，利用該重組DNA轉化的微生物搞清α-KGDH活性對L-谷氨酸發酵生產的影響，并因而提供一種培育產L-谷氨酸棒狀桿菌的新方法。具體地，本發明的一個目的是通過破壞染色體DNA上α-KGDH基因得到α-KGDH活性缺陷的產L-谷氨酸棒狀桿菌，并提供一種用該細菌生產L-谷氨酸的方法。而且，本發明試圖提供一種攜帶含有α-KGDH基因的重組DNA的棒狀桿菌，和一種利用攜帶該重組DNA并具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌生產L-賴氨酸的方法。
本發明人得到一種來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因，闡明其結構，用已引入該基因的質粒轉化一種產L-谷氨酸棒狀桿菌，并研究得到的轉化體的α-KGDH活性水平與L-谷氨酸生產能力。結果發現α-KGDH活性顯著影響L-谷氨酸的生產。而且，本發明人發現一種菌株，其中通過破壞產L-谷氨酸棒狀桿菌染色體上α-KGDH基因消除了α-KGDH活性，該菌株培養于含有過量生物素且不加入如表面活性劑和青霉素的任何抑制生物素作用的物質的培養基中，生產并積累相當量的L-谷氨酸。另外，本發明人將含有α-KGDH基因的重組DNA導入具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌。結果發現，得到轉化體的L-賴氨酸生產能力顯著提高，于是本發明在這些發現的基礎上完成。
換句話說，本發明提供(1)一種產L-谷氨酸棒狀桿菌，它由于染色體上編碼具有α-KGDH活性的酶的基因及其啟動子的核苷酸序列中一個或幾個核苷酸的替換、缺失、插入、加入或倒位而造成α-KGDH活性缺失。
(2)一種生產L-谷氨酸的方法，包括在液體培養液中培養上述(1)款的產L-谷氨酸棒狀桿菌，在培養液中生產并積累L-谷氨酸，再收集。
(3)一種來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因。
(4)通過將來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因與在棒狀桿菌中起作用的載體相連接得到的重組DNA。
(5)攜帶上述(4)款的重組DNA的棒狀桿菌。
(6)一種生產L-賴氨酸的方法，包括在液體培養基中培養攜帶上述(4)款的重組DNA并具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌，在培養液中生產并積累L-賴氨酸，再收集。
本發明進一步如下詳述，
本發明的產L-谷氨酸棒狀桿菌包括以前歸類于短桿菌屬但現在屬于棒狀桿菌屬的細菌(國際系統微生物學雜志，41，255，(1981))，還包括屬于短桿菌屬但與棒狀桿菌屬親緣關系近的細菌。這樣的產L-谷氨酸棒狀細菌舉例如下嗜乙酰酸棒狀桿菌乙酰谷氨酸棒狀桿菌頸棒狀桿菌谷氨酸棒狀桿菌百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)melassecola棒狀桿菌擴展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)immariophilum短桿菌乳發酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)玫瑰色短桿菌糖分解短桿菌生硫短桿菌嗜熱產氨(thermoaminogenes)棒狀桿菌特別地，舉下列菌株為例嗜乙酰酸棒狀桿菌ATCC13870乙酰谷氨酸棒狀桿菌ATCC15806頸棒狀桿菌ATCC15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC15990melassecola棒狀桿菌ATCC17965擴展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14067immariophilum短桿菌ATCC14068乳發酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825糖分解短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240
嗜熱產氨棒狀桿菌AJ12340(FERM BP1539)本發明的α-KGDH基因可以如下述那樣從上述產L-谷氨酸棒狀桿菌野生菌株或其突變株的染色體DNA中獲得。
已知大腸桿菌的α-KGDH復合體由三個亞基E1(α-酮戊二酸脫氫酶EC1.2.4.2)，E2(二氫硫辛胺琥珀酰氨轉移酶EC2.3.161)，和E3(硫辛胺脫氫酶1.6.4.3)組成，E1和E2基因形成操縱子結構，E3與丙酮酸脫氫酶(EC1.2.4.1)共用。大腸桿菌E1與E2基因的核苷酸序列已搞清(歐洲生物化學雜志，141，351(1984)，細菌學雜志，141，361(1984))。
對枯草芽孢桿菌，E1和E2基因的核苷酸序列也已搞清(細菌學雜志，171，3667(1989)，基因，61，217(1987)，等)。
于是通過利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌E1基因核苷酸序列的同源性，本發明人成功地分離并克隆了來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因。并且給出下述步驟。
首先，選擇大腸桿菌和枯草芽孢桿菌α-KGDH的E1亞基基因中有高度同源性的區段，根據其兩端的序列合成引物，只要滿足下列條件具有隨機核苷酸組成，E＋C的含量約50％，不形成特殊的二級結構，相互之間不互補，任何序列均可用作引物。常用20-30個核苷酸長的序列。特別地，序列表中SEQ ID NOS3和4中的序列用作例子。
其次，利用聚合酶鏈式反應法(PCR法)從引物和枯草芽孢桿菌染色體DNA制備含有部分枯草芽孢桿菌α-KGDH基因的探針。任何長度不小于20個核苷酸的探針均可應用，不過，探針長度最好不小于約100個核苷酸。探針最好具有與目的基因序列互補的核苷酸序列，不過，具有高度同源性的探針也可采用。
另一方面，提取產L-谷氨酸棒狀細菌的染色體DNA，用限制性內切酶消化染色體DNA得到的DNA片段與載體相連接，制備重組DNA，重組DNA用來轉化大腸桿菌。可用例如Bam HI，EcoRI，XhoI的限制性內切酶。采用來源于大腸桿菌的載體，如pUC19和pBR322。任何適于載體復制的菌株均可用做重組DNA的受體菌株。例如可用大腸桿菌菌株如HB101，JW109和DH5。
從這樣得到的轉化體中用菌落雜交手段選擇與探針DNA雜交的菌株，從該轉化體中回收重組DNA。分析與載體連接的產L-谷氨酸棒狀桿菌染色體DNA的限制性內切酶片段的結構。
得到的DNA片段并不一定包含編碼目的酶的基因的全長。這種情況下，用另一種限制性內切酶切割產L-谷氨酸棒狀桿菌的染色體DNA，并使之與載體連接。制備重組DNA。重組DNA用來進行轉化。用上面的方法利用菌落雜交選擇并分析限制性內切酶片段。于是可得到含有α-KGDH基因全長的DNA片段。操作過程中，可方便地利用第一次得到的DNA片段作探針進行菌落雜交。
含有α-KGDH基因的DNA片段與另一適當載體重組后導入產L-谷氨酸棒狀桿菌。可用的載體例如在棒狀桿菌屬細菌中自主復制的質粒。特別地，例子有pAM330(日本公開專利58-67699號)，pHM1519(日本公開專利58-77895號)，pAJ655，pAJ611，pAJ1844(日本公開專利58-192900號)，前三者，pCG1(日本公開專利57-134500號)，pCG2(日本公開專利58-35197號)，pCG4，pCG11(日本公開專利57-183799號)，pHK4(日本公開專利5-7491號)等。
為了通過將上述載體與產L-谷氨酸棒狀桿菌α-KGDH基因相連接制備重組DNA，事先用限制性內切酶切割載體。用來切割的限制性內切酶與用來切割染色體DNA的相同。備選地，用可產生與染色體DNA片段切割面互補的切割面的限制性內切酶來切割。通常用例如74DNA連接酶連接。
用迄今見于報道的轉化方法將不同的重組DNA導入受體。例如對大腸桿菌K-12報導有一種方法用氯化鈣處理受體細胞增加DNA通透能力(分子生物學雜志，53，159，(1970))。對枯草芽孢桿菌報導有一種方法用增殖期細胞制備轉化態細胞以導入DNA(C.H.基因，1，153，(1977)。備選地，也可用一種方法將DNA受體細胞轉化成可容易地導入重組DNA的原生質體或原生質狀態后將重組DNA導入DNA受體，已知該法用于枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母(分子基因遺傳學，168，111(1979)，Nature，274，398(1978)美國國家科學院院刊，75，1929(1978))。
用原生質體方法，既使在上述用于枯草芽孢桿菌的方法的情況下也能得到足夠高的頻率，不過，日本公開專利57-183799號公開，也可利用一種方法，其中棒狀桿菌屬細菌細胞的原生質體接觸二價金屬離子和聚乙二醇與聚乙烯醇二者任一種的狀態下導入DNA。不加聚乙二醇和聚乙烯醇而加入羧甲基纖維素、葡聚糖、Ficoll.Bruronic F68(Selva公司制造)等也協助DNA導入。本發明實施例應用的轉化方法是電脈沖法(見日本公開專利2-207791號)。
這樣得到的細菌菌株，其中導入了含有來源于產L-谷氨酸棒狀桿菌α-KGDH基因的重組DNA培養于含有碳源、氮源、無機鹽和可選的有機微量營養的普通培養基。于是可以在細胞中高水平地生產具有α-KGDH活性的酶。
糖類如葡萄糖、蔗糖、糖蜜廢料、淀粉水解物或有機酸如乙酸和檸檬酸，以及醇類如乙醇用作碳源，脲、銨鹽、液氧、氨氣等用作氮源，磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽、錳鹽等用作無機鹽。氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸以及含有它們蛋白胨、酵母提取物、大豆蛋白水解物等用作有機微量營養。
供氧條件下培養10-40小時，溫度5-37℃，pH控制在5-9。
培養完成后，定量確定培養液中生產并積累的L-谷氨酸，并測量細菌細胞中α-KGDH活性水平。用農業生物化學，44，1897(1980)中描述的方法等測量活性通過離心等方法從培養物中回收的細菌細胞用超聲處理(Frech Prees處理等粉碎，然后離心去除細胞殘片，凝膠過濾去除小分子量物質得到測量用樣本。
于是對含有擴增基因的產L-谷氨酸棒狀桿菌和一種不含擴增基因的細菌研究α-KGDH活性水平與L-谷氨酸生產能力的關系。結果表明，在由于基因擴增而α-KGDH活性水平升高的細菌中L-谷氨酸生產能力降低，見下述參考實施例1。
本發明的基因的利用包括通過插入藥物相關基因等制備α-KGDH活性缺陷菌株，通過修飾啟動子等制備表達下降的菌株，從而可能有效地培育一種細菌菌株，其L-谷氨酸生產能力與普通產L-谷氨酸棒狀桿菌相比進一步提高。
用利用化學試劑誘變的方法或基于基因重組的方法得到α-KGDH活性缺陷的菌株。然而在利用化學試劑引入突變的方法中，獲得α-KGDH活性降低的菌株相對容易，獲得該活性完全缺失的菌株難。為得到后一種菌株，由于如上述α-KGDH基因的結構已闡明，通過基因同源重組修飾或破壞染色體上α-KGDH基因，這樣的方法可能是有利的。通過同源重組破壞基因的方法已被建立，可以用利用線性DNA的方法，利用溫度敏感性質的方法等。
特別地，用定點突變生成方法(Kramer，W和Frits.H.J.，酶學方法，154，350(1987))或用化學試劑如次硫酸鈉和羥胺處理(Shortle，D與Nathans，D.，美國國家科學院院刊，75，270，(1978))在α-KGDH基因編碼區或啟動子區域的核苷酸序列中造成一個或多個核苷酸的替換、缺失、插入、增加或倒位。這樣修飾或破壞的基因用來替代染色體上的正常基因。因而可能去除α-KGDH作為基因產物的活性或使α-KGDH基因不能轉錄。
定點突變生成方法利用一段合成寡聚核苷酸。該技術實現在可選的有限堿基對中引入可選的替換、缺失、插入、加入或倒位，用該方法，首先，具有確定的DNA核苷酸序列的目的基因并被克隆的質粒變性，制備單鏈。然后合成一段與將要產生突變的部分互補的合成寡聚核苷酸。不過，合成寡聚核苷酸不該具有完全互補的序列，而且有可選的核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位。單鏈DNA然后與具有可選的核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位的合成寡聚核苷酸退火。用DNA聚合酶1的Klenow片段和T4連接酶合成完整的雙鏈質粒。導入大腸桿菌的轉化態細胞。這樣得到的一些轉化體含有其中可選核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位被固定的基因。一種能將突變引入基因來修飾或破壞的相似方法包括重組PCR方法(PCR技術，Stockton press(1989))。
另一方面，利用化學試劑處理的方法中，含有目的基因的DNA片段直接用次亞硫酸鈉，一羥胺等處理，具有核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位的突變隨機引入DNA片段。
用通過引入突變來修飾或破壞得到的基因替換產L-谷氨酸棒狀桿菌染色體上正常基因的方法包括利用同源重組的方法(分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，微生物學雜志，162，1196(1985))。同源重組中，含有一段與染色體上序列同源的序列的質粒等引入細菌細胞，在有同源性的序列部分以一定頻率發生重組，引入的整個質粒就導入染色體。若后來在染色體上有同源性的序列部分進一步發生重組，質粒又會從染色體上分離脫落。這時，根據重組發生的位置，帶有引入突變的基因有時會固定到染色體上，而原來的正常基因隨質粒從染色體上去掉并脫落。選擇這樣的細菌菌株，可得到細菌菌株，其中染色體上的一個正常基因被一個引入了核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位以修飾或破壞的基因所替代。
這樣得到的α-KGDH活性缺陷的產L-谷氨酸棒狀桿菌特別是含有過量生物素的培養基中比具有部分降低的α-KGDH活性的菌株有明顯優異的L-谷氨酸生產能力。
為了利用α-KGDH活性缺陷的產L-谷氨酸棒狀桿菌生產并積累L-谷氨酸，該細菌培養于含有碳源、氮源、無機離子和其它養分的液體培養基中。常規地，若培養在含有過量生物素的液體培養基中進行，有必要添加抑制生物素作用的物質，即青霉素如青霉素G、F、K、O、V或X，或者富含脂肪酸的表面活性劑如蔗糖單軟脂酰或聚氧乙烯甘梨糖單軟脂酸或其衍生物，到培養基中，以高產率地生產L-谷氨酸。
然而，用本實驗的α-KGDH活性缺陷的產L-谷氨酸棒狀桿菌時，既使培養在含有10-100μg/l的高濃度生物素的液體營養培養基中進行而不加任何上述抑制生物素作用的物質，生產和積累的L-谷氨酸也產率高，積累高。
換句話說，對碳源，亦可用富含生物素的原材料如甜馬鈐薯和甜菜的糖汁或糖蜜廢料，除了(常用的)葡萄糖、果糖、糖化淀粉溶液，乙酸等。用于普通L-谷氨酸發酵的銨鹽，液氨、氨氣、脲等用作氮源。另外，視需要適當添加無機離子如磷酸鹽和鎂鹽。視需要適當加微量養分如硫胺素到培養基中。
優選地在有氧條件下培養。培養過程中培養溫度優選地控制在24-42℃，pH優選地控制在5-9。無機或有機、酸性或堿性物質，以及脲、碳酸鈣、氨氣等用來調節pH。
從培養液中收集L-谷氨酸的方法是適當地綜合已知方法如離子交換樹脂處理與結晶。
為了提高L-谷氨酸生產能力，增強谷氨酸生物合成的基因是有利的。增強谷氨酸生物合成系統基因的例子包括糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶(PFK，日本公開專利63-102692號)，回補途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，日本公開專利60-87788和62-55089號)，TCA循環中的檸檬酸合成酶(CS，日本公開專利62-201585和63-119688號)，順烏頭酸水解酶(ACO，日本公開專利62-294086號)，異檸檬酸脫氫酶(ICDH，日本公開專利62-166890和63-214189號)。胺化反應的谷氨酸脫氫酶(GDH，日本公開專利61-268185號)等。
為得到上述基因，可用下述方法。
(1)對于一突變株，其中一目的基因發生突變并表達特定性狀，得到一突變株，其中由于引入目的基因該性狀消失。從棒狀桿菌染色體得到與突變株性狀互補的基因。
(2)若目的基因已由另一生物體獲得并已闡明其核苷酸序列，利用具有高度同源性的區域的DNA作探針用雜交技術得到目的基因。
(3)若目的基因的一段核苷酸序列在細節上已相當清楚，用PCR方法(聚合酶鏈式反應方法)利用棒狀桿菌染色體做模板得到含有目的基因的基因片段。
上述方法可用于獲得此處應用的染色體。只要適用于上述方法應用的棒狀桿菌，任何宿主-載體系統無可應用。在本發明的實施例中利用上述方法(3)，它當核苷酸序列已闡明時有效。
若用上述方法(2)和(3)得到基因，而目的基因原來沒有啟動子，可以將在棒狀桿菌中具有啟動子活性的DNA片段插入目的基因上游某一位置來表達目的基因。為了增強目的基因的表達可以將目的基因連到強啟動子下游某一位置。在棒狀桿菌中起作用的強啟動子包括大腸桿菌的lac啟動子tac啟動子，trp啟動子等(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，J.Biotech，5，305-312(1987))，此外，棒狀桿菌屬細菌的trp啟動子也是優選的啟動子(日本公開專利，62-195294號)。在本發明的實施例中，棒狀桿菌的trp啟動子用于表達PEPC基因。
本發明的α-KGDH基因的擴增有利于在具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌中提高其生產能力。
迄今有多種人工突變株用做產L-賴氨酸細菌。用它們作宿主以攜帶本發明的重組DNA可提高其L-賴氨酸生產能力，這樣的人工突變株包括對S(2-氨乙基)-半胱氨酸(以后縮寫為“AEC”)有抗性的突變株；生長需要氨基酸如L-高絲氨酸的突變株(日本專利出版物48-28078和56-6499號)；對AEC表現抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸，L-高絲氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變株(美國專利3,708,395和3,825,472號)；對DL-α-氨基-ε-(己內酰胺，α-氨基-ω-十二碳內酰胺，天冬氨酸類似物，磺胺藥物，醌和N-月桂酰亮氨酸表現抗性的產L-賴氨酸突變株；對草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統酶的抑制劑表現抗性的產L-賴氨酸酶(日本公開專利50-53588,5-31093,52-102498,53-9394,53-86089,55-9783,55-9759,56-32995,56-39778號和日本專利出版物53-43591,53-1833號)；需要肌醇或乙酸的產L-賴氨酸突變株(日本公開專利55-9784和56-8692號)；對氟丙酮酸敏感或溫度不能低于34℃的產L-賴氨酸突變株(日本公開專利55-9783和53-86090號)；對乙二醇表現抗性并生產L-賴氨酸的短桿菌或棒狀桿菌的突變株(見美國專利4,411,997號)等。
特別地，舉下列菌株為例。
乳發酵短桿菌AJ12031(FERM-BP277，特開昭60-62994公報)乳發酵短桿菌ATCC39134(特開昭60-62994公報)谷氨酸棒狀桿菌AJ3463(FERM-P1987，特公昭51-34477公報)乳發酵短桿菌AJ12435(FERM-BP-2294美國專利5,304,476)乳發酵短桿菌AJ12592(FERM-BP-3239美國專利5,304,476)谷氨酸棒狀桿菌AJ12596(FERM-BP-3242美國專利5,304,476)可通過與上述適當載體連接將α-KGDH基因導入這樣的產L-賴氨酸細菌。
用于L-賴氨酸生產的培養基是含有碳源、氮源、無機離子和可選的其它有機微量養分的普通培養基。糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物，醇類如乙醇和肌醇，有機酸如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸用作碳源。無機銨鹽如硫酸銨，氯化銨和磷酸氨，有機氮如大豆水解物，氨氣，液氨等用作氮源。小量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等加入用作無機離子。適量的必需物質如維生素B1。酵母提取物等如需要最好也包括在內，用作有機微量養分。
優選地在有氧條件下培養16-72小時，培養過程中培養溫度控制在30-45℃，pH控制在5-8.5，無機或有機、酸性或堿性物質，以及氨氣可用來調整pH。
通常可通過綜合已知方法如離子交換樹脂法、沉淀法等從發酵液中收集L-賴氨酸。
附圖簡述
圖1是含有α-KGDH基因的DNA片段的限制性內切酶圖譜。
優選實施方案描述本發明將在下面參考實施例更清楚地說明。對限制性內切酶，用商業產品(酒寶造公司制造)實施例1α-KGDH基因的分離與結構確定(1)制備探針選擇大腸桿菌和枯草芽孢桿菌α-KGDH的E1亞基基因之間有高度同源性的區域，磷酰胺法用DNA合成儀(Model 394，應用生物系統制造)合成序列表中SEQ ID NOS.3和4給出的寡聚核苷酸。
寡聚核苷酸(0.25μmole)作引物，枯草芽孢桿菌NA64的染色體DNA(0.1μg)用普通方法制備(該菌株得自Bacillus Genetic StockCenter(Ohio大學，美國)作模板，Taq DNA聚合酶(2.5單位)(酒寶造公司制造)加到0.1ml的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)中，緩沖液含有dATP，dCTP，dGTP，dTTp各200μM，50mM氯化鉀，1.5mM氯化鎂和0.0001％明膠。用PCR方法，每輪包括94℃1分鐘，55℃分鐘2分鐘，72℃3分鐘，重復30次。反應溶液走瓊脂糖凝膠電泳，目的DNA片段用玻璃粉(酒寶造公司制造)回收。用Klenow片段(Amersham制造)和[α-32dCTP](Amersham制造)以普通方法標記DNA片段，用作探針。(2)乳酸發酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段的制備乳酸發酵短桿菌ATCC13869接種到500ml含1％細菌培養用胰蛋白胨(Difco制造)，0.5％細菌培養用酵母提取物(Difco制造)和0.5％氯化鈉的F-Y培養基(pH7.2)。31.5℃培養6小時得到培養物。培養物5000 vpm離心10分鐘，得到2g濕細胞沉淀物。
用Saito和Miura的方法(Biochem.BiophvsActa.，72，619(1963))從細胞片狀沉淀物中提取染色體DNA。染色體DNA(2μg)和限制性內切酶EcoRI(200單位)分別與50mM含有10mM氯化鎂，100mM氫化鈉和1mM二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)混合，37℃反應15小時。反應結束后，用普通方法將溶液酚提取處理，并乙醇沉淀處理得到EcoRI消化的乳酸發酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段。(3)乳酸發酵短桿菌ATCC13869 α-KGDH基因的分離質粒載體pUC18(酒寶造公司制造)(1μg)和限制性內切酶EcoRI(20單位)與50mM含有10mM氯化鎂，100mM氯化鈉和1mM二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)混合。用普通方法對溶液酚抽提和乙酸沉淀。然后，為防止來源于質粒載體的DNA片段重新連接，用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實驗室出版社，p1.60(1989)的方法用細菌堿性磷酸酶處理將DNA片段脫磷，接著用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。
用EcoRI消化的pUC18(0.1μg)，第(2)步得到的用EcoRI消化的乳酸發酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段(1μg)和74DNA(1單位)(Takara Shuzo Co.Ltd.制造)加到含有6.6mM氯化錳，10mM二硫蘇糖醇和10mM三磷酸腺苷的66mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，16℃反應8小時連接DNA。然后DNA混合物用來用普通方法轉化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)。將細菌鋪到含100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養基，得到約10,000轉化體。
用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實驗室出版社，p1.90(1989)的方法與第(1)步得到的探針DNA雜交，從得到的轉化體中篩選出一個轉化體。(4)乳酸發酵短桿菌ATCC13869 α-KGDH基因核苷酸序列的確定用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實驗室出版社，p1.25(1989)中堿性細菌水解方法從第(3)步得到的轉化體體制取質粒DNA，質粒DNA含有來源于乳酸發酵短桿菌AT 13869染色體DNA的約6千堿基的DNA片段。在(3)中反應組成用限制性內切酶EcoRI和XhoI消化質粒，然后用普通方法瓊脂糖凝膠電泳。與(3)相同進行Southern雜交確定與探針DNA雜交的片段。結果表明一段用EcoRI和XhoI消化的約3千堿基的切割片段雜交。如(3)那樣，該DNA片段與用EcoRI和XhoI消化的質粒載體pHS397(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)連接并克隆。得到的質粒DNA用來確定DNA片段的核苷酸序列。用Sanger的方法(J，Mol.Biol，143,161(1980)用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒(應用生物系統制造)確定核苷酸序列。
由于得到的DNA片段不含有完整的開放閱讀框架，用XhoI切割乳酸發酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，將它與pHSG397連接，如(3)那樣，得到重組質粒，用重組質粒進行轉化。用(1)的方法將從(2)得到的來源于乳酸發酵短桿菌ATCC13869染色體DNA的約3千堿基EcoRI-XhoI切割片段標記，得到的探針用來篩選雜交轉化體。得到的轉化體所攜帶的質粒含有一段約6千堿基的DNA片段。含有該DNA片段的基因的限制性圖譜由圖1給出。用(3)的反應組分用限制性內切酶SalI和XhoI消化質粒，然后用普通方法瓊脂糖凝膠電泳，用(3)的方法確定雜交片段。結果發現一段約4.4千堿基的片段。用如(3)那樣SalI和XhoI消化的質粒載體pHSG 397與DNA片段連接并克隆。該質粒命名為pHSG-X。用與上述相同的在確定質粒中SalI-XhoI切割片段從SalI切割位點到EcoRI切割位點約1.4千堿基的DNA片段的核苷酸序列。
得到的SalI-XhoI切割基因片段的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO1給出。估計有開放閱讀框架，由該核苷酸序列得到的一種產品的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NOS1和2給出。即，編碼含有序列表中SEQ ID NO1給出的氨基酸序列的蛋白質的基因是乳酸發酵短桿菌ATCC13869的α-KGDH基因。蛋白質N末端的蛋氨酸來源于作為起始密碼子的ATG，因此它與蛋白質原來的功能常無關。眾所周知翻譯后該蛋氨酸殘基被肽酶作用去除。相應地，上述蛋白質也可能以蛋氨酸殘基去除形式出現。
該核苷酸序列和氨基酸序列就同源性分別與已知序列比較。所用數據庫為EMBL和SWISS-PROT。結果表明序列表SEQ ID NO1給出的DNA及其編碼的蛋白質是棒狀桿菌中的新基因和新蛋白質。與已報導的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的E1亞基基因及其編碼蛋白質有同源性。
本發明的基因編碼的蛋白質有1,257個氨基酸N-末端有蛋氨酸殘基，與已報導的α-KGDH特征明顯不同。也就是說，C末端的約900個氨基酸與各種E1亞基有高度同源性。然而，N末端的300個氨基酸不見于其它種的α-KGDH，這表明本發明的蛋白質有特殊的功能。將N-末端300個氨基酸的部分與已知序列進行同源性比較，發現該部分與大腸桿菌和固氮菌屬細菌的E2亞基有同源性。這說明有可能本發明的蛋白質與其它種的α-KGDH不同，兼具E1和E2的活性。
另外，與見于大腸桿菌的普通啟動子序列相似的序列(281-286和307-312)以及與棒狀桿菌核糖體結合序列相似的序列(422-428)在本發明的基因的開放閱讀框架上游找到。與轉錄終止信號相似的基環結構(4243-4281)在本發明的基因的開放閱讀框架下游找到。這些序列表明本發明的基因獨立地轉錄和翻譯并具有與其它種α-KGDH不同的遺傳結構。
實施例2通過來源于乳酸發酵短桿菌ATCC13869的α-KGDH基因的表達增加α-KGDH活性(1)將α-KGDH基因導入乳酸發酵短桿菌ATCC13869和AJ11060實施例(1)得到的pHSGS-X質粒DNA(1μg)和限制性內切酶SalI和XhoI(各20單位)混合于實施例(1)中(3)的緩沖液，37℃反應3小時。另一方面，在短桿菌屬細菌中自主轉錄的質粒pPK4(參考日本公開專利5-7491號)DNA(1μg)和SalI(20單位)混合于實施例1中(3)的緩沖液中，37℃反應3小時。用普通方法對兩種反應溶液進行酚抽提與乙醇沉淀。然后，為防止來源于質粒載體的DNA片段重新連接，用實施例1(3)的方法用細菌堿性磷酸酶處理將DNA片段去磷酸化，接著用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。SalI消化的pPK4(0.1μg)，由上述得到的SalI-知XhoI消化的pHSGS-X pHSGS-X質粒DNA(0.5μg)和T4 DNA連接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)混合于實施例1(3)的緩沖液中，16℃反應8小時以連接DNA。接下來，用普通轉化方法用電脈沖法(日本公開專利2-207791號)將DNA混合物導入乳酸發酵短桿菌AJ11060(日本專利出版物59-10797號)。得到的溶液鋪到含有1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化鈉，0.5％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的瓊脂培養基上得到轉化體AJ11060/pPKS-X。該轉化體命名為乳酸發酵短桿菌AJ12999，于1994年6月3日貯存于通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(1-3，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305，日本)，貯存號FERMP-14349，并根據布達佩斯條約(協定)于1995年6月2日從原貯存處轉到國際貯存處，貯存號FERM BP-5123。
依據實施例1(4)從得到的轉化體提取質粒DNA，用普通方法進行瓊脂糖凝膠電泳。于是選擇到來源于乳酸發酵短桿菌ATCC13869的SalI和XhoI片段與質粒pPK4連接的重組DNA。得到的質粒命名為pPKS-X。
用乳酸發酵短桿菌ATCC13869用同樣方法得到轉化體ATCC13869/pPKS-X。(2)帶有擴增α-KGDH基因的菌株的酶活性(1)中得到的乳酸發酵短桿菌AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X接種到50ml含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氫鉀，0.004％硫酸鎂，3％硫酸銨，0.001％硫酸亞鐵，0.001％硫酸錳，0.05％大豆水解物溶液，200μg/l維生素B1，300μg/l生物素，5％碳酸鈣和25mg/l卡那霉素的培養基(pH8.0)，31.5℃培養18小時。用普通方法離心培養液，收集細胞沉淀物。
將細胞沉淀物懸浮于0.2％氯化鉀溶液，離心，重復操作兩次清洗細胞沉淀物。細胞沉淀物用含有30％甘油的N-Tris(羥甲基)甲基-2-氨基乙酰磺酸(以后稱為TES)的0.1M緩沖液(pH7.7)，超聲處理，然后15,000vpm離心30分鐘得到上清。該細胞裂解物進行SephadexE-15(Pharmara制造)柱層析，去除低分子量物質，制備粗酶溶液。
得到的粗酶溶液的α-KGDH活性利用Aqric.Biol.Chem.，44，1987(1980)描述的反應溶液組分根據365nm 3-乙酰嘌呤腺嘌呤二核苷酸吸收增加來測量。使用Bio-Rad制造的試劑盒以牛血清清蛋白為標準測量粗酶溶液的蛋白質濃度，并計算酶的比活。作為對照，用同樣方法確定用質粒pPK4轉化得到的AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活。結果由表一給出。AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X的比活分別是AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活的兩倍或更多。結果證明得到的基因片段編碼具有α-KGDH活性的酶。
表1細菌菌株 α-KGDH比活(Δ吸收/分鐘/mg蛋白)AJ11060/pPK4 0.029AJ11060/pPKS-X 0.055ATCC13869/pPK4 0.019ATCC13689/pPKS-X 0.060
粗酶溶液的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果觀察到約135千道爾頓的帶的擴增對應于所得基因預計的分子量為139千道爾頓的酶。這表明所得基因確實在轉化菌株內表達。
參者例1α-KGDH活性與L-谷氨酸生產能力的關系乳酸發酵短桿菌AJ11060/pPK4和AJ11060pPKS-X培養于產L-谷氨酸培養基，測量生產并積累于培養液中的L-谷氨酸。如下用加入表面活性劑的方法進行培養。
含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氫鉀，0.004％硫酸鎂，3％硫酸銨，1.5％大豆水解物溶液，200μg/l鹽酸硫胺素，300μg/l生物素，25mg/l卡那霉素和5％CaCO3(分別滅菌)的生產培養基(pH8.0，20ml)配好后倒入容積500ml的坂口燒瓶，加熱滅菌。先前由分別培養于含有1％多聚蛋白胨(日本制藥公司制造)1％細菌培養用酵母提取物(Difco制造)，0.5％氯化鈉，0.5％葡萄糖和25mg/l卡那霉素的平板培養基(pH7.2)的AJ11060/pPK4和AJ11060/pPKS-X得到的細菌細胞接種到該培養基中，31.5℃振蕩培養18小時，得到種培養物。
得到的種培養物按5％量接種到加了3g/l表面活性劑(Tween40Sigma制造)的生產培養基和不加表面活性劑的生產培養基，用同樣方法31.5℃培養20小時。
培養完畢，用旭化成公司制造的Biotech Analyaer As-210測量培養液中積累的L-谷氨酸的量及剩余的葡萄糖濃度。將培養物用0.02N鹽酸稀釋至51倍得到的溶液測620nm吸收，確定細菌細胞的生長量。結果由表2給出。
表2菌株表面生長量殘留的糖積累量產率活性劑(OD) (g/dl) (g/dl)(％)AJ11060/pPK4- 1.72 0.45 00+ 0.78 1.802.4642.4AJ11060/pPKS-X - 1.31 1.89 00+ 0.78 3.690.379.4
在未加表面活性劑的培養基中任何細菌菌株均未發現有L-谷氨酸的生產。只有當加入表面活性劑后培養液中才生產并積累L-谷氨酸。本實驗中，在導入了含有α-KGDH基因的pPKS-X質粒的菌株中，比作為對照的導入pPK4的菌株L-谷氨酸產率顯著降低。該事實表明加入表面活性劑后α-KGDH活性水平強烈影響L-谷氨酸的生產。
參考例2用添加青霉素法比較L-谷氨酸生產能力用添加青霉素法研究α-KGDH基因擴增對L-谷氨酸生產的效應。
用與參考實施例1相同的方法制備種培養物，種培養物分別接種到加了0.4單位/ml青霉素的生產培養基和不加青霉素的生產培養基，使細胞片狀沉淀物干重約為2％，31.5℃振蕩培養25小時。
培養完畢，用跟參考實施例相同的方法測量培養液中積累的L-谷氨酸的量及殘留葡萄糖濃度。結果由表3給出。結果顯示加入青霉素后α-KGDH活性水平強烈影響L-谷氨酸的生產。
表3菌株 青霉素生長量殘留的糖積累量產率(OD) (g/dl) (g/dl) (％)AJ11060/pPK4 - 1.84 0.0 0 0+ 0.72 0.03.90 49.2AJ11060/pPKS-X - 1.87 0.0 0 0+ 1.07 0.02.39 30.1實施例3α-KGDH基因缺陷菌株的制備根據L-谷氨酸的生產被α-KGDH基因擴增抑制這一事實，預期相反地，破壞α-KGDH基因應能提高L-谷氨酸產率。利用日本公開專利5-7491號描述的溫度敏感型質粒用同源重組方法得到基因破壞的菌株。特別地，該α-KGDH基因含有兩個被KpnI在序列表中SEQ IDNO1的第1340和3266位消化的位點。實施例(1)得到的pHSGS-X用KpnI部分消化，然后自連接制備缺陷1926個堿基對的KpnI片段的質粒pHSGS-XΔK。pHSGS-XΔK的α-KGDH基因結構上缺少中間部分。下一步，將一種得自在棒狀桿菌中自主復制并具有溫度敏感型自主復制能力的質粒的突變型復制原點導入pHSGS-XAK的BamHI識別位點制備質粒pBTS-XΔK。特別的，一種得自在棒狀桿菌中自主復制并具有溫度生敏感型自主復制能力的質粒的質粒pHSC4(日本公開專利5-7491號)。用限制性內切酶KpnI消化。用DNA平未端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后與BamHI銜接物連接(酒寶造公司制造)。自連接得到一質粒，用限制性內切酶BamHI消化制備含有具有溫度敏感型自主復制能力的突變型復制原點的基因片段。該基因片段導入pHSGS-XAK的BamHI位點制備質粒pBTS-XΔK。
用電脈沖法(日本公開專利2-207791號)將該質粒導入作為產L-谷氨酸棒狀桿菌的野生菌株的乳酸發酵短桿菌ATCC13869，用日本公開專利5-7491號描述的方法將染色體上α-KGDH基因由缺陷型替代。特別地，導入了質粒的ATCC13869/pBTS-XΔK25℃在CM2G液體培養基(1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl，0.5％葡萄糖，pH7.2)中振蕩培養6小時，然后鋪到含有5μg/ml氯霉素的CM2G瓊脂培養基上，34℃培養形成菌落，得到質粒導入的菌株。用復制板法從眾菌株中得到34℃對氯霉素敏感的菌株。用敏感型菌株研究染色體上α-KGDH基因的核苷酸序列，說明α-KGDH基因已替換成缺陷型。該菌株命名為ΔS菌株。用實施例2描述的方法測量ΔS菌株的α-KGDH活性未檢測到任何活性。
實施例4制備用于擴增gdh，gltA和icd基因的質粒(1)gdh，gltA和icd基因的克隆用PCR方法克隆乳酸發酵短桿菌的gdh.gltA和icd基因。在已報導的谷氨酸棒狀桿菌的gdh基因)分子微生物學，6(3)，317-326(1992))，gltA基因(微生物學，140，1817-1828(1994))。和icd基因(J.Batteriol.，177，774-782(1995))的序列的基礎上合成用于PCR方法的引物。序列表中SEQ ID NOS5(5′段)和6(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴增gdh基因的引物，SEQ ID NOS7(5′段)和8(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴增gltA基因的引物，SEQ ID NOS9(5′段)和10(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴增icd基因的引物，上述引物分別合成并應用。
用實施例1的方法從乳酸發酵短桿菌ATCC13869制備染色體DNA，用作模板用前述寡聚核苷酸作引物進行PCR。得到的擴增產物用商業上可購得的DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)在兩端得到平末端，然后克隆到載體質粒pHSG399(酒寶造公司制造)的SamI位點，分別得到質粒pHSG-gdh，pHSG-gltA，和pHSG-icd。(2)ppc基因的克隆與表達用實施例1的方法制備乳酸發酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，用作模板利用PCR方法得到含有編碼PEPC的ppc基因的約3.4Kbp的DNA片段。在已報導的谷氨酸棒狀桿菌的ppc基因序列的基礎上(基因，77，237-251(1989)合成用于PCR方法的引物，與上述相同程序進行PCR反應。引物序列由SEQ ID NOS11(5′段)和12(3′段)給出。
PCR反應的擴增產物用限制性內切酶SalI(酒寶造公司制造)消化，再插入質粒pHSG399的SalI位點，得到質粒pHSG-ppc′。pHSG-ppc′的PEPC基因插入方法與pHSG399的lac啟動子方向相反。
下一步，將一種能在乳酸發酵短桿菌中起作用的色氨酸操縱子的啟動子(基因，53，191-200(1987)插入pHSG-ppc′上ppc基因的上游位置。已知該啟動子具有序列表中SEQ ID NO13給出的含有51個核苷酸的序列，并表現活性。合成具有SEQ ID NO13給出的序列的核苷酸鏈和具有SEQ ID NO14序列的核苷酸鏈作為其互補鏈，得到具有啟動子活性并且其兩端對應限制性內切酶KpnI和XbaI的切割片段的含有51個堿基對的雙鏈DNA。
兩條合成DNA混合濃度各為10 pmol/μg，100℃加熱10分鐘，靜置室溫冷卻退火。pHSG-ppc′用限制性內切酶KnII和XbaI(酒寶造公司制造)消化，與上述啟動子連接。用酒寶造公司制造的連接試劑盒進行連接反應。于是得到質粒pHSG-ppc，其中一拷貝的色氨酸操縱子啟動子插入到ppc基因的上游位置。(3)通過連接三種基因gdh，gltA和icd構建的質粒的制備連接三種基因gdh，gltA和icd制備一質粒。特別的，質粒pHSG-gdh用限制性內切酶EcoRI消化，購得的DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后與上述兩端平末端化的gltA基因的PCR擴增產物連接得到質粒pHSG-gdh+gltA。接下來，質粒pHSG-gdh+gltA用限制性內切酶KpnI消化。用同樣方法得到平末端，與上述兩端平末端化的icd基因的PCR擴增產物連接得到質粒pHSG-gdh+gltA+icd。(4)通過連接三種基因gdh，gltA和ppc構建的質粒的制備連接三種基因gdh，gltA和ppc制備一質粒。特別的，質粒pHSG－gdh＋gltA用限制性內切酶KpnI消化。質粒pHSG-ppc用限制性內切酶KpnI和SalI消化得到在上游位置具有色氨酸操縱子啟動子的ppc基因片段。得到的片段用DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后用Kpn I銜接物(酒寶造公司制造)將其插入質粒pHSG－ghd＋gltA的KpnI位點，得到質粒pHSG－gdh＋gltA＋ppc。(5)將棒狀桿菌的復制原點導入上述質粒為使pHSG－gdh，pHSG－gltA，pHSG－ppc，pHSG－icd，pHSG－gdh＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc在棒狀桿菌細胞中自主復制，將已得到的來源于在棒狀桿菌中自主復制的質粒pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的復制起點(日本公開專利5-7491號)導入pHSG－gdh，pHSG－gltA，pHSG－ppc，pHSG－icd，pHSG－ghd＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc。特別的具有來源于pHM1519的復制起點的質粒pHK4(日本公開專利5-7491號)用限制性內切酶BamHI和KpnI消化，得到含有復制起點的基因片段。得到的片段用DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后用Kpn I銜接物(酒寶造公司制造)分別插入pHSG－gdh，pHSG－gltA， pHSG－ppc和pHSG－icd的KpnI位點，得到pGDH，pGLTA，pPPC和pICD。接下來，相似地用SalI銜接物(酒寶造公司制造)將來源于pHM1519的復制起點分別插入到 pHSG－gdh＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc的SalI位點，得到pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋ppc。另外，相似地用SalI銜接物(酒寶造公司制造)將來源于pHM1519的復制起點插入不含這些基因的質粒pHSG 399的SalI位點，制備pSAC4作為對照。
實施例7pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH+GLTA+ICD和pGDH＋GLTA＋PPC各基因的表達的確證pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC上各基因在乳酸發酵短桿菌細胞中是否表達，以及這些質粒是否進行基因擴增得到確證。特別地用電脈沖法(日本公開專利2-207791號)將各質粒導入乳酸發酵短桿菌ATCC13869。得到的轉化體用1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂(pH7.2)以及4μg/ml氯霉素的CM2G平板培養基進行選擇。得到的轉化體培養于CM2G瓊脂培養基，然后接種到1升純水含有80g葡萄糖，1gKH2PO4，0.4g MgSO4、30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素和50g CaCO3的培養基(用KOH調pH至8.0)中，31.5℃培養16小時。用普通方法離心培養液，收集細菌細胞。
磨碎細菌細胞得到粗提取物，用來利用分子微生物學，6(3)，317-326(1992)中描述的方法測量ATCC13869/pGDH，ATCC13869/GDH＋GLTA＋ICD和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的GDH活性。結果發現這些轉化體的每一種與ATCC13869/pSAC4對照相比有13倍的GDH活性(表4)。用微生物學，140，1817-1828(1994)的方法測量ATCC 13869/pGLTA，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD，和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的CS活性。用J.Bacteriol，177，774-782(1995)的方法測量ATCC13869/pICD和ATCC13869/GDH＋GLTA＋ICD的ICDH活性。用基因，77，237-251(1989)的方法測量ATCC13869/pPPC和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的PEPC活性。測量結果由表5-7給出。發現任何轉化體與ATCC13869/pSAC4對照相比均有2到20倍的目的酶活性。該事實證明pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC的各基因在乳酸發酵短桿菌中表達并執行功能。
表4細菌菌株 GDH活性ΔAbs/min/mg蛋白)ATCC13869/pGDH 1.36ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD1.28ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC1.33ATCC13869/pSAC4 0.11
表5細菌菌株 CS活性(umole/min/mg蛋白)ATCC13869/pGLTA 5.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD4.8ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC4.8ATCC13869/pSAC4 0.7表6細菌菌株 PEPC活性(units/min/mg蛋白)ATCC13869/pPPC 1.12ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC1.04ATCC13869/pSAC4 0.11表7細菌菌株 ICDH活性(units/min/mg蛋白)ATCC13869/pICD 3.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD 2.8ATCC13869/pSAC4 1.0實施例8ΔS菌株的L谷氨酸生產，以及具有擴增的gdh，gltA，ppc和icd基因的ΔS菌株(1)發酵罐中ΔS菌株L-谷氨酸生產的評價在1升純水中含有60g葡萄糖，1g KH2SO4，0.4MgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素和450μg生物素的培養基(300ml)加入1升容積的發酵罐，加熱滅菌。在CM2G瓊脂培養基上培養得到的ΔS菌株的細菌細胞接種于其中，31.5℃培養30小時，用氨氣調整pH至7.0，7.2或7.5。
培養完畢，測量培養基中細菌細胞濃度和積累的L-谷氨酸的量。用旭化成公司制造的Biotech Analyzer AS-210定量確定L-谷氨酸。將培養液用純水稀釋至51倍，用660nm處吸收(OD660)測量細菌細胞濃度。結果由表8給出。
表8pH 細菌細胞濃度L-谷氨酸(OD) (g/l)7.0 0.84357.2 0.85347.5 1.0732已確證盡管ΔS菌株培養于含過量生物素的培養基中，仍能高產率地生產并積累L-谷氨酸。(2)發酵罐培養的ΔS菌株以及帶有擴增的gdh，gltA，ppc和icd基因的ΔS菌株L-谷氨酸生產的評價將上述制備的pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD或pGDH＋GLTA＋PPC導入ΔS菌株以評價導入各質粒的轉化體的L-谷氨酸生產能力，用電脈沖法(日本公開專利2-207791號)將質粒導入乳酸發酵短桿菌的細胞中。用1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂及含有4μg/ml氯霉素的CM2G平板培養基(pH7.2)選擇得到的轉化體。
如上述(1)款那樣評價ΔS菌株及得到的轉化體的L-谷氨酸生產能力。
用與上述相同的方法測量培養后培養基中細菌細胞濃度和積累的L-谷氨酸的量。結果由表9給出。
表9菌株 細胞濃度L-谷氨酸(OD)(g/l)ΔS0.84 35ΔS/pGDH 1.01 35ΔS/pGLTA 0.83 37ΔS/pICD 0.83 37ΔS/pPPC 0.75 37ΔS/pGDH＋GLTA＋ICD0.95 38ΔS/pGDH＋GLTA＋PPC0.85 40ΔS/pSAC4 0.83 35實施例9具有擴增α-KGDH基因的產L-賴氨酸細菌的L-賴氨酸生產上述制備的pPKS-X和pPK4分別導入乳酸發酵短桿菌AJ 12435(FERM BP-2294)，該菌對S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸表現抗性并具有通過誘變乳酸發酵短桿菌ATCC 13869得到的L-賴氨酸生產能力。評價其L-賴氨酸生產能力，用電脈沖法(日本公開專利2-207791號)導入質粒。用在1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5gNaCl和15g瓊脂并含有25μg/ml卡那霉素的CM2G平板培養基(pH7.2)選擇轉化體。
如下評價L-賴氨酸生產能力。一種在1升純水中含有100g葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，25mg卡那霉素和50g CaCO3(用KOH調pH至7.0)的培養基(各20ml)配好后倒入500ml容積的燒瓶，加熱滅菌。將在含有4mg/l卡那霉素的CM2G平板培養基上培養得到的AJ 12435/pPK4和AJ12435/pPKS-X的細菌細胞接種于其中，37℃培養20小時，培養完畢，測量培養液中生產和積累的L-賴氨酸的量以及細菌細胞濃度。結果由表10給出。
表10菌株L-賴氨酸細胞濃度(g/l) (OD)AJ 12435/pPK4 26 1.15AJ 12435/pPKS-X 31 0.92工業應用性已表明產L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH活性水平影響L-谷氨酸的發酵生產。因而可能通過插入抗藥相關基因等制備α-KGDH基因活性缺陷菌株，通過體外突變制備活性滲漏菌株，通過修飾啟動子制備表達降低的菌株等有效地培育與常規產L-谷氨酸棒狀桿菌相比L-谷氨酸生產能力進一步提高的細菌菌株。
序列表(1)一般資料(i)申請人味之素株式會社(ii)發明名稱α-酮戊二酸脫氫酶基因(iii)序列數目14(iv)通訊地址(A)收信人(B)街道(C)城市(E)國家(F)郵政編碼(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟磁盤(B)計算機IBMPC兼容型(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Fast SEQ 1.5版(vi)當前申請資料(A)申請號(B)提交日(C)分類(vii)律師/代理人資料(A)名稱(B)注冊號(ix)通訊資料(A)電話(B)傳真(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度4394堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲類型線型
(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設無(iv)反義非(vi)來源(A)生物體乳發酵短桿菌(B)菌株ATCC 13869(ix)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置443..4213(C)識別方法E(ix)特征(A)名稱/關鍵-35信號(B)位置281..287(C)識別方法S(ix)特征(A)名稱/關鍵-10信號(B)位置307..312(C)識別方法S(ix)特征(A)名稱/關鍵RBS(B)位置421..428(C)識別方法S(ix)特征(A)名稱/關鍵終止子(B)位置4243..4281(C)識別方法S(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCGACAAGC AAAATCGAAG CGGCAGCACG CCGCGTCGGA GCCTT4AACG CCATCGCCGC60CATCCCTGAT GGTTTCAATC ATCAAGTCGG TGAACGCGGG CGCAACCTGT CATCCGGACA120GCGCCAACTG ATCGCGCTGG CGCGCGCCGA ACTCATCGAG CCTTCCATCA TGCTTCTCGA180CGAAGCCACC TCCACCCTCG ACCCCGCCAC CGAAGCCGTT ATCCTCAACG CCTCCGATCG240AGTCACTAAG GGACGCACCA GCATCATCGT CGCGCACCGC TTGGCAACCG CTAAAAGGGC300CGACCGTATT CTTGTTGTTG AACAAGGACG TATCATTGAG GACGGATCTC ACGACGCGTT360GTTGTCTGCT AACGGCACCT ACGCCCGCAT GTGGCATTTA ATGGCCTGAC ACGTTATTTT420TAGGAGAACT GTCAACAAAT TA ATG CTA CAA CTG GGG CTT AGG CAT AAT CAG 472Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln1 5 10CCA ACG ACC AAC GTT ACA GTG GAT AAA ATA AAG CTC AAT AAA CCC TCA 520Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser15 20 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TAC ACC TTG AAG GTC GGC TCC GAA1912Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu475 480 485 490TAC ACC CAC ATC CTG GAC CGC GAC GAG CGC ACC TGG CTG CAG GAC CGC1960Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg495 500 505CTC GAA GCC GGA ATG CCA AAG CCA ACC CAG GCA GAG CAG AAG TAC ATC2008Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr lle510 515 520CTG CAG AAG CTG AAC GCC GCA GAG GCT TTC GAG AAC TTC CTG CAG ACC2056Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr525 530 535AAG TAC GTC GGC CAG AAG CGC TTC TCC CTC GAA GGT GCA GAA GCT CTC2104Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu540 545 550ATC CCA CTG ATG GAC TCC GCC ATC GAC ACC GCC GCA GGC CAG GGC CTC2152lle Pro Leu Met Asp Ser Ala lle Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu555 560 565 570GAC GAA GTT GTC ATC GGT ATG CCA CAC CGT GGT CGC CTC AAC GTG CTG2200Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu575 580 585TTC AAC ATC GTG GGC AAG CCA CTG GCA TCC ATC TTC AAC GAG TTT GAA2248Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu590 595 600GGC CAA ATG GAG CAG GGC CAG ATC GGT GGC TCC GGT GAC GTG AAG TAC2296Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr605 610 615CAC CTC GGT TCC GAA GGC CAG CAC CTG CAG ATG GGC GAC GAC GGC GAG2344His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu620 625 630ATC AAG GTC TCC ACG ACT GCT AAC CCG TCC CAC GTG GAA GCT GTT AAC2392Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn635 640 645 650CCA GTG ATG GAA GGT ATC GTC CGC GCA AAG CAG GAC TAC CTG GAC AAG2440Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys655 660 665GGC GTA GAC GGC AAG ACT GTT GTG CCA CTG CTG CTC CAC GGT GAC GCT2488Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala670 675 680GCA TTC GCA GGC CTG GGC ATC CTG CCA GAA ACC ATC AAC GTG GCT AAG2536Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys635 690 695CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC ATC CAC 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GAA GAT GCA GAA2920Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu815 820 825GCA GTC GTC CGC GAC TTC CAC GAC CAG ATG GAA TCT GTG TTC AAC GAA2968Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu830 835 840GTC AAG GAA GGC GGC AAG AAG CAG GCT GAG GCA CAG ACC GGC ATC ACC3016Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr845 850 855GGC TCC CAG AAG CTT CCA CAC GGC CTT GAG ACC AAC ATC TCC CGT GAA3064Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu860 865 870GAG CTC CTG GAA CTG GGA CAG GCT TTC GCC AAC ACC CCA GAA GGC TTC3112Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe875 880 885 890AAC TAC CAC CCA CGT GTG GCT CCA GTT GCT AAG AAG CGC GTC TCC TCT3160Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser895 900 905GTC ACC GAA GGT GGC ATC GAC TGG GCA TGG GGC GAG CTC CTC GCC TTC3208Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe910 915 920GGT TCC CTG GCT AAC TCC GGC CGC TTG GTT CGC CTT GCA GGT 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4273AAGGCCCTTT TTGCTGCCGT GGTTGCCTAA GGTGGAAGGC ATGAAACGAA TCTGTGCGGT 4333CACGATCTCT TCAGTACTTT TGCTAAGTGG CTGCTCCTCC AGTTCCACCA CGCAGCTCGA 4393G 4394(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度1257氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲類型線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr1 5 10 15Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg20 25 30Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp35 40 45Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val50 55 60Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala65 70 75 80Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala85 90 95Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val100 105 110Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg130 l35 140Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile145 150 155 160Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu165 170 175Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys180 185 190Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met195 200 205Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asr Val Ile Asp Gly Lys Pro210 215 220Thr Leu Ile Val Pro Glu His lle Asn Leu Gly Leu Ala lle Asp Leu225 230 235 240Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu245 250 255Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile260 265 270Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly275 280 285Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly lle Gly Thr Arg His Ser290 295 300Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser305 310 315 320Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala325 330 335Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His340 345 350Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met370 375 380Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr385 390 395 400Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg405 410 415Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln420 425 430Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His435 440 445Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe450 455 460Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser ARg Leu Arg465 470 475480Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp485 490 495Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro500 505 510Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala515 520 525Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys530 535 540Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser545 550 555 560Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly565 570 575Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys580 585 590Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly610 615 620Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr625 630 635 640Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile645 650 655Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr660 665 670Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala AIa Phe Ala Gly Leu Gly675 680 685Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val690 695 700Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr705 710 715 720Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys725 730 735Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala740 745 750Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly755 760 765Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn770 775 780Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile785 790 795 800Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly805 810 815Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe820 825 830His Asp Gln Met Glu Sar Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys
835 840 845Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro850 855 860His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly865 870 875 880Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val885 890 895Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile900 905 910Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser915 920 925Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe930 935 940Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe945 950 955 960Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe965 970 975Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu980 985 990Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala995 10001005Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr101010l51020Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu1025103010351040Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala104510501055Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val106010651070Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His
107510801085Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser109010951100Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu105111011151120Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asr Val Ala Asp Ala112511301135Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu114011451150Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val115511601165Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala117011751180Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu1185 119011951200Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu120512101215Leu lle Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln122012251230Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys123512401245Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala12501255(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無
(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO3CTGTCTGAAG GATCGGTTCT20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGTGCTCAG GCCCCTGTCC CTCGTAACC 29(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTAGCCTCG GGAGCTCTAG 20(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO6GATCTTTCCC AGACTCTGGC 20(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO7TAATGCCACC GACACCCACC20(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO8TCAACGCCCA CATAGTGGAC20(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO9GAATTCGCTC CCGGTGACGC 20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO10GATGCAGAAT TCCTTGTCGG 20(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無
(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO11GTCGACGGCG GACTTGTCGG 20(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO12GTCGACAAAA CCCAAAAAAA 20(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度51堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸..合成DNA(iii)假設無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO13CTGCGGAAAC TACACAAGAACCCAAAAATG ATTAATAATT GAGACAAGCT T 51(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度59堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線型(ii)分子類型其它核酸，合成DNA(iii)假設無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO14CTAGAAGCTT GTCTCAATTA TTAATCATTT TTGGGTTCTT GTGTAGTTTC CGCAGGTAC 59
權利要求
1.一種產L-谷氨酸棒狀細菌，它由于染色體上編碼具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的酶的基因的啟動子的核苷酸序列中一個或幾個核苷酸的替換、缺失、插入、加入或倒位而造成α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷，所述酶具有包含SEQ ID No2所示氨基酸序列的氨基酸序列，或具有在上述氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基發生替換、缺失或插入但不影響α-酮戊二酸脫氫酶活性的氨基酸序列。
2.權利要求1的細菌，其中所述基因包含SEQ ID No1所示核苷酸序列中堿基443-4213的核苷酸序列。
3.一種生產L-谷氨酸的方法，其包括在含有碳源、氮源、無機離子和其它營養成分的液體培養基中培養權利要求1或2的產L谷氨酸棒狀細菌，在培養液中生產并積累L-谷氨酸，再收集L-谷氨酸。
全文摘要
公開內容為α－酮戊二酸脫氫酶缺陷的產L－谷氨酸棒狀桿菌,一種用該細菌生產L－谷氨酸的方法,編碼來源于產L－谷氨酸棒狀桿菌具有α－KGDH活性的酶的基因,含有該基因的重組DNA,攜帶該重組DNA的棒狀桿菌,以及一種用攜帶該重組DNA并具有L－賴氨酸生產能力的細菌生產L－賴氨酸的方法。
文檔編號C12N15/53GK1327049SQ01120750
公開日2001年12月19日 申請日期1995年6月7日 優先權日1994年6月14日
發明者朝倉陽子, 臼田佳弘, 辻本信晴, 木村英一郎, 阿部知津, 河原義雄, 中松亙, 倉橋修 申請人:味之素株式會社