專利名稱：采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)耐藥基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐藥基因芯片的制備以及其檢測(cè)標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于通過(guò)使用基因芯片檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因，指導(dǎo)抗生素的合理使用。
1.抗生素的使用現(xiàn)狀正確選用抗生素是抗生素治療中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。所謂正確選用，包括是否應(yīng)該使用抗生素、需要選用哪種抗生素及通過(guò)什么途徑給藥等問(wèn)題。不恰當(dāng)?shù)慕o藥不僅達(dá)不到預(yù)期的療效，而且還會(huì)適得其反。
為加強(qiáng)抗生素使用的宏觀管理、減少醫(yī)院感染的發(fā)生、阻止或延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，各醫(yī)院都制訂了合理使用抗生素的條例。其中合理選用抗生素的原則是在診斷或高度疑似細(xì)菌性感染、決定使用抗生素前，應(yīng)留取標(biāo)本做細(xì)菌學(xué)涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、分離病原體并做常規(guī)藥敏試驗(yàn)，作為抗生素選藥依據(jù)，并根據(jù)抗生素的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，結(jié)合感染部位及藥物濃度分布情況選擇抗生素，并參考以下程序 在實(shí)際工作中，絕大多數(shù)抗生素是按途徑①給藥的，在新的抗生素和細(xì)菌對(duì)各種抗生素的新的耐藥性層出不窮的今天，經(jīng)驗(yàn)用藥的可行性和科學(xué)性正在逐漸降低；途徑②可以將抗生素粗分為β-內(nèi)酰胺類和非β-內(nèi)酰胺類給藥，但對(duì)病原菌的耐藥性無(wú)法判斷，而且不適用于混合感染或有多種細(xì)菌定植部位的感染；途徑③是目前所能采取的最好方式，但由于所需時(shí)間長(zhǎng)(最快3天)、難于篩選條件致病菌、藥敏試驗(yàn)受實(shí)驗(yàn)用抗生素的限制等原因，使其不能在首次診斷時(shí)及時(shí)提供合理使用抗生素的方案，而是作為對(duì)已用抗生素的正誤作追溯性評(píng)估，同時(shí)為調(diào)整抗菌藥提供方案。若經(jīng)驗(yàn)用藥不對(duì)，等到基于途徑③的正確給藥方案提出時(shí)，往往病情已經(jīng)加重、感染已經(jīng)蔓延，為增加了下一步治療的難度。
正是這種傳統(tǒng)的抗生素用藥方式導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，使人類面臨傳染病卷土重來(lái)的危險(xiǎn)。
另外，不合理用藥也使全國(guó)每年不必要的藥費(fèi)支出高達(dá)上百億元。
因此，迫切需要新的措施，為臨床使用抗生素提供及時(shí)、準(zhǔn)確、合理的指導(dǎo)。2.細(xì)菌耐藥性研究現(xiàn)狀人類進(jìn)入抗生素時(shí)代已有近半個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間，在這期間，各種新型抗生素的不斷問(wèn)世，極大地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。但與此同時(shí)，在抗生素的巨大進(jìn)化選擇壓力下，許多病原菌演化出了對(duì)抗生素的耐藥性。細(xì)菌的耐藥，使人類面臨巨大挑戰(zhàn)。從1937年首次觀察到淋球菌對(duì)磺胺的耐藥現(xiàn)象開(kāi)始，科學(xué)家們一直在研究不斷出現(xiàn)的細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥性，從細(xì)胞和分子水平研究細(xì)菌的耐藥機(jī)理?，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，細(xì)菌對(duì)每一類抗生素都已產(chǎn)生了耐藥性，細(xì)菌耐藥性從機(jī)理上可分為固有性耐藥(細(xì)菌本身的生理特性，如不滲透性和溢出機(jī)制)、獲得性耐藥(細(xì)菌基因型不變，但耐藥性隨生長(zhǎng)環(huán)境而變)和遺傳性耐藥(通過(guò)基因突變或通過(guò)獲得抗藥質(zhì)粒，細(xì)菌獲得了新的穩(wěn)定的耐藥特性)。雖然這些耐藥性涉及上百種結(jié)構(gòu)和活性各不相同的蛋白質(zhì)，但近年來(lái)已完成對(duì)這些蛋白基因序列的測(cè)定。固有性耐藥親脂性抗生素對(duì)G-菌的MIC要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于G+菌，這主要是由于G-菌帶有的多種藥物溢出泵。
表1.藥物溢出泵類型、分布及功能溢出泵類型細(xì)菌基因 抗生素EmrB 大腸桿菌 emrB萘啶酸、thiolactomycinArcB 大腸桿菌 arcAB Tet、CP、FQ、β-內(nèi)酰胺類、Nov、Em、FuA、RifMexB 銅綠假單胞菌 mexAB Tet、CP、FQ、β-內(nèi)酰胺類(除羧芐青霉素外)、Nov、Em、FuA、Rif、TMP、SMZ
MexD 銅綠假單胞菌 mexCD Tet、CP、FQ、TMP、第四代頭孢菌素(除羧芐青霉素外)MexF 銅綠假單胞菌 mexEF CP、TMP、FQMtrD 淋病奈瑟氏球菌 mtrCD Tet、CP、β-內(nèi)酰胺類、Em、FuA、Rif注CP(chloramphenicol)氯霉素，Em(erythromycin)紅霉素，F(xiàn)Q(fluoroquinolones)氟喹諾酮，F(xiàn)uA(fusidic acid)褐霉素，Nov(novobiocin)新生霉素，Rif(rifampicin)利福平，SMZ(sulfamethoxazole)新諾明，Tet(tetracycline)四環(huán)素，TMP(trimethoprim)甲氧芐啶。獲得性耐藥細(xì)菌由于所處的環(huán)境不同而出現(xiàn)耐藥性的差異。表現(xiàn)在銅綠假單胞菌時(shí)，細(xì)菌在體外藥敏試驗(yàn)中表現(xiàn)為對(duì)氨基糖甙類(妥布霉素)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星)敏感，但在體內(nèi)時(shí)MIC卻提高了6-8倍。這與細(xì)菌所處的體內(nèi)環(huán)境和體外實(shí)驗(yàn)條件的差異有關(guān)。遺傳性耐藥絕大多數(shù)的細(xì)菌耐藥性都是通過(guò)遺傳途徑而獲得的并成為穩(wěn)定性狀的。耐藥性最初都是由于細(xì)菌染色體的基因突變而產(chǎn)生，耐藥基因通過(guò)同源重組轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒上，即可實(shí)現(xiàn)在種屬內(nèi)和種屬間的縱向和橫向傳播。
現(xiàn)在已經(jīng)知道，大多數(shù)的耐藥基因都已被整合到了質(zhì)粒上，因而很容易引起耐藥性的擴(kuò)散。
細(xì)菌對(duì)各類抗生素的遺傳性耐藥分述如下①β-內(nèi)酰胺類抗生素細(xì)菌對(duì)青霉素類和頭孢菌素類抗生素的抗性主要是通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而實(shí)現(xiàn)的。目前已經(jīng)鑒定出超過(guò)200種β-內(nèi)酰胺酶，其中超過(guò)80％的酶的基因序列已經(jīng)測(cè)出，它們中的絕大多數(shù)都有相同的酶活性功能部位，有絕對(duì)和相對(duì)保守區(qū)，因而易于檢測(cè)。青霉素結(jié)合蛋白也是抗性產(chǎn)生的原因之一，但不是主要因素。
表2.β-內(nèi)酰胺酶的分類及其所對(duì)應(yīng)的抗生素耐藥譜組別有關(guān)酶類的基因抗生素1組 超過(guò)33種，包括A1、 主要水解LOR和LOT，對(duì)克拉維酸不敏感AsbAls、AmpCs、TypeA、 部分水解PEN的水解頭孢菌素的P99、BIL-1、FOX-1、LAT-1、β-內(nèi)酰胺 MIR-1、MOX-1s、CEP-1s、S&A、S2等酶2a組 超過(guò)20種，來(lái)自G+菌，包主要水解PEN、AMP，部可被克拉維酸抑制括I、IIIs、MJ-2s、LEN-1s、 分水解CARB、LOR、LOR的水解青霉素的β- NPS-1s、PCl(A)P，B，C，D、 和NCF內(nèi)酰胺酶Exo等2b組 超過(guò)15種，包括CEP-2、 主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制Forml、OHIO-1、SHV-1、 LOR和LOT，其中一些的廣譜β-內(nèi)酰胺酶 TLE-1、ROB-l、LXA-1、 酶還有更寬的耐藥譜TLE-2、HMS-1、TEM-1、TEM-2等2be組 超過(guò)38種，包括TEM-3至 主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制TEM-12、TEM-16、TEM-20 CARB、LOR、LOT、TAX、的超廣譜β-內(nèi)酰胺 至TEM-26、SHV-2至 TAZ和ATM等，個(gè)別酶酶 SHV-6、B1、B2、MJ-2、 還有更寬的耐藥譜MEN-1、CTX-ase-M-1、K1、MJ-1、PER-1、CTX-ase-M-2等2br組 超過(guò)9種，包括TEM31至 主要水解PEN、AMP和對(duì)克拉維酸不敏感TEM36、TRC-1等 LOR，個(gè)別酶有更寬的耐的廣譜β-內(nèi)酰胺酶 藥譜2c組 超過(guò)15種，包括CARB-5、 主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制AER-1、TypeBs、BRO-1、 CARB，部分水解LOR，的水解羧芐青霉素BRO-2、PSE-1、PSE-3、 個(gè)別酶有更寬的耐藥譜的β-內(nèi)酰胺酶 PSE-4、CARB-3、CARB-4、SAR-1等2d組 超過(guò)19種，包括OXA-1至 主要水解PEN、AMP、水解氯唑西林的β- OXA-12、OXA-A、LCR-1、 CARB、CLOX、OXA、內(nèi)酰胺酶M-OXA等MET、LOR、LOT、TAX等，個(gè)別酶有更寬的耐藥譜2e組 超過(guò)19種，包括CepA、 主要水解LOR和LOT，可被克拉維酸抑制CblA、CfsA、FormII、FEC-1、部分水解PEN和TAX等的頭孢菌素酶FUR、FPM-1、L2、BlaI等2f組 超過(guò)3種，包括IMI-1、 主要水解PEN、AMP、水解羧芐青霉素的NMC-A、Sme-1等 LOR、LOT、TAX、ATM、非METβ-內(nèi)酰胺酶 IMP等3組 超過(guò)15種，包括CphA/A2、主要水解PEN、AMP、不被克拉維酸抑制A2h、II、CcrA、PCM-1、 CARB、CLOX、LOR、的METβ-內(nèi)酰胺酶IMP-1、L-1等 LOT、FOX、NCF、TAX、IMP等。4組可被克拉維酸 超過(guò)7種，主要為SAR-20 主要水解PEN、AMP、部分抑制的青霉素 CARB、CLOX、OXA，酶 部分水解LOR注PEN，benzylpenicillin青霉素G；AMP，ampicillin氨芐青霉素；CARB，carbenicillin羧芐青霉素；OXA，oxacillin苯唑青霉素；CLOX，cloxacillin氯唑青霉素；LOR，cephaloridine頭孢噻啶；LOT，cephalothin頭孢噻吩；FOX，cefoxitin頭孢西??；NCF，nitrocefin頭孢硝噻吩；TAX，ceftazidime復(fù)達(dá)欣；ATM，aztreonam氨曲南；IMP，imipenem亞胺培南。②氨基糖甙類抗生素細(xì)菌對(duì)氨基糖甙類的抗性包括核糖體結(jié)構(gòu)改變和膜滲透性降低等，但最主要的是借助于酶對(duì)抗生素的滅活，如乙酰轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶。這些酶的基因分布在轉(zhuǎn)座子上，很容易導(dǎo)致對(duì)氨基糖甙的耐藥性在不同種類的細(xì)菌間快速傳播。
表3.氨基糖甙乙?；揎椉?xì)菌 基因分布抗生素大腸桿菌acc(1)染色體 Apr，Lvdm，Prm，Rsm，(But)，(Neo)大腸桿菌acc(3)-Ia 質(zhì)粒Gm，Astm，Siso銅綠假單胞菌acc(3)-Ib粘質(zhì)沙雷氏菌acc(3)-II 質(zhì)粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Siso大腸桿菌銅綠假單胞菌acc(3)-III染色體 Gm，Tob，Dbk，5-epi，Siso，Km，Neo，Prm，Lvdm沙門氏菌屬 acc(3)-IV 質(zhì)粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Apr，Siso陰溝腸桿菌 acc(3)-VI 質(zhì)粒Gm，6’Ntl，Siso，(Tob)，(Ntl)，(Km)，(5’-epi).
差異檸檬酸桿菌 aac(6’)-I質(zhì)粒Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，Siso，(Isp)，粘質(zhì)沙雷氏菌 染色體 5-epi肺炎克雷伯氏菌轉(zhuǎn)座子G+陰溝腸桿菌/檸檬酸桿菌溶血不動(dòng)桿菌不動(dòng)桿菌屬腸球菌屬銅綠假單胞菌aac(6’)-II染色體 Gm，Tob，Dbk，Ntl，2’Ntl，5-epi，Siso糞鏈球菌aac(6’)-α 質(zhì)粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，金黃色葡萄球菌 (2”) 轉(zhuǎn)座子 6’Ntl，5-epi，Astm斯氏普羅威登斯菌 acc(2’-1)acc(2’-1) Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl表4.氨基糖甙腺苷?；揎椉?xì)菌基因 分布 抗生素腸桿菌科 ant(2”)-I 質(zhì)粒 Gm，Tob，Dbk，Siso，Km陰溝腸桿菌腸桿菌科 ant(3”)-I 質(zhì)粒 Sm，Spcm金黃色葡萄球菌 ant(4”)-I 染色體 Tob，Amk，Isp，Dbk銅綠假單胞菌 ant(4”)-II 質(zhì)粒 Tob，Amk，Isp糞鏈球菌 ant(6)-I 質(zhì)粒 Sm金黃色葡萄球菌 ant(9)-I 轉(zhuǎn)座子 Spcm表5.氨基糖甙磷酸化修飾細(xì)菌基因分布 抗生素糞鏈球菌 aph(2”)-I 染色體 Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，6’Ntl，5-epi，Astm肺炎克雷伯氏菌 aph(3’)-I 轉(zhuǎn)座子 Km，Neo，Prm，Rsm，Lvdm，GmB質(zhì)粒大腸桿菌 aph(3’)-II 轉(zhuǎn)座子 Km，Neo，Prm，Rsm，But，Gmb(Amk)金黃色葡萄球菌 aph(3)-III 質(zhì)粒 Km，Neo，Prm，Lvdm，Rsm，But，糞鏈球菌 Gmb，AmK，Isp環(huán)狀芽孢桿菌 aph(3’)-IV 染色體 Km，Neo，Prm，Rsm，But弗氏鏈霉菌 aph(3’)-V 染色體 Neo，Prm，RsmS.ribosidificus青銅小單孢菌鮑氏不動(dòng)桿菌 aph(3’)-VI 質(zhì)粒 Km，Neo，Prm，Rsm，But，GmB，肺炎克雷伯氏菌 Amk，Isp空腸彎曲桿菌 Aph(3’)-V 質(zhì)粒 Km，Neo(Amk)II銅綠假單胞菌 aph(3”)-I 染色體 Sm灰色鏈霉菌 aph(6’)-I 轉(zhuǎn)座子 Sm淡青鏈霉菌染色體大腸桿菌 aph(4)-I 質(zhì)粒 HygBS.hygroscopicus注Amk，amikacin阿米卡星；Apr，apramycin阿布拉霉素；Astm，Astromicin(fortimicin)阿司米星；But，Butirosin丁胺菌素；Dbk，dibekacin地貝卡星；5-epi，5-episisomicin 5-表紫蘇霉素；Gm，gentamicin慶大霉素；GmB，gentamicinB；HygB，hygromycin潮霉素；Isp，isepamicin；Km，kanamycin卡拉霉素；Lvdm，lividomycin里杜霉素；Neo，neomycin；Ntl，netilmicin乙基紫蘇霉素；2’Ntl，2’-N-ethylnetilmicin；6’Ntl，6’-N-ethylnetilmicin；Sm，streptomycin；Prm，paromomycin巴龍霉素；Rsm，ribostamycin核糖霉素；Siso，sisomicin紫蘇霉素；Spcm，spectinomycin奇霉素；Tob，tobramycin妥布霉素；③酰胺醇類抗生素細(xì)菌對(duì)酰胺醇類抗生素的耐藥性主要表現(xiàn)在氯霉素上。
很多G+和G-菌都帶有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cml-acetyltransferases，CAT)，CAT有很多種類，但在它們的基因中，對(duì)應(yīng)于酶活性部位的區(qū)域都含有23bp的絕對(duì)保守序列，因而易于測(cè)出。
還有很多細(xì)菌帶有異抗生素乙酰轉(zhuǎn)移酶(xemobiotic acetyltransferases，XAT)，其帶有相對(duì)保守的序列，分布在Mmorganii，S.mancescens，E.aerogenes，E.coli，P.aeruginsa，A.tumefaciens，E.faecium，S.sureus，B.sphaericus等細(xì)菌中。XAT導(dǎo)致了對(duì)氯霉素的低水平耐藥性。④大環(huán)內(nèi)酯類抗生素ermC基因存在于Bacillus subtilis中，與對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽(yáng)性菌素B(macrolide-lincomycin-streptograminB)的耐藥性有關(guān)。而對(duì)紅霉素的耐藥基因ermBP和ermQ則存在于質(zhì)粒和染色體上，易于造成對(duì)紅霉素耐藥性的傳播。⑤糖肽類抗生素細(xì)菌對(duì)糖肽類抗生素的耐藥性表現(xiàn)為對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性，三個(gè)耐藥基因vanH，vanA和vanX都有保守序列，其中以vanA為主，vanA可以整和到質(zhì)粒上。⑥四環(huán)素類抗生素四環(huán)素類抗生素的耐藥基因tet廣泛分布很廣，目前常見(jiàn)的病原菌幾乎都帶有tet基因。⑦喹諾酮類抗生素細(xì)菌主要通過(guò)將喹諾酮類抗生素泵出而表現(xiàn)出耐藥性。溢出性泵如前所述。⑧甲氧芐啶類抗生素在G-菌中發(fā)現(xiàn)了17種質(zhì)粒編碼的二氫葉酸還原酶的基因dhfr，它們導(dǎo)致對(duì)甲氧芐氨嘧啶的耐藥性。在dhfr出現(xiàn)在腸道球菌中10年后，現(xiàn)在在G+菌中也發(fā)現(xiàn)了dhfr。
綜上所述，目前細(xì)菌幾乎已經(jīng)對(duì)每種抗生素都產(chǎn)生了耐藥性，而且很多單個(gè)的耐藥基因能抗多種不同的抗生素，多數(shù)的耐藥基因分布于轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒上，因而造成了耐藥性的快速傳播。研究發(fā)現(xiàn)，在每一種新的抗生素投入臨床使用后不久(最短僅數(shù)月時(shí)間)，細(xì)菌就會(huì)演化出對(duì)這種抗生素的耐藥性。
面對(duì)如此復(fù)雜并不斷增加的細(xì)菌耐藥性，如何才能及時(shí)、準(zhǔn)確地使用抗生素？傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)已經(jīng)難以回答這一長(zhǎng)久困擾醫(yī)學(xué)界的難題。
隨著基因工程和生物傳感器技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的基因芯片技術(shù)，為人們及時(shí)準(zhǔn)確地查找稀少基因提供了簡(jiǎn)潔途徑。采用基因芯片技術(shù)，我們有可能快速準(zhǔn)確地直接從標(biāo)本中檢測(cè)病原菌的耐藥基因，從而準(zhǔn)確指導(dǎo)抗生素的正確使用。
本發(fā)明的耐藥基因芯片是通過(guò)將特異性針對(duì)細(xì)菌耐藥基因的核酸分子固定于固相載體表面而制成的。
本發(fā)明的基因芯片所采用的固相載體選自任何可用于制備基因芯片的材料，其包括，但不限于，玻璃片、硅片和塑料片。所述的固相載體經(jīng)不同的化學(xué)修飾后，在其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團(tuán)。這些基團(tuán)包括，但不限于，氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巰基(-SH)。
本發(fā)明的耐藥基因芯片是在所述的固相載體上連接有針對(duì)細(xì)菌耐藥基因的特異性核酸探針，所述的探針可以為單鏈或雙鏈DNA分子，其核苷酸序列選自耐藥基因雙鏈中的任一條鏈，而且在適當(dāng)?shù)臈l件下可以與耐藥基因特異性雜交。所述的探針可以通過(guò)DNA自動(dòng)合成或PCR擴(kuò)增而獲得，其長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少為20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少為30個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選至少為40個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選至少為50個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少為60個(gè)核苷酸，還最優(yōu)選至少為70個(gè)核苷酸。所述的核酸探針，在其與載體連接的一端可以選擇性地添加一個(gè)目的在于增加探針的空間活動(dòng)性以利于雜交的連接臂，所述的連接臂可以由多聚胸腺嘧啶核苷poly(dT)n(n≥10)、多聚尿嘧啶核苷poly(dU)n(n≥10)或多聚腺嘌呤核苷poly(dA)n(n≥10)構(gòu)成。
在本發(fā)明的耐藥基因芯片中，所述的核酸探針或用于制備探針的PCR引物在DNA自動(dòng)合成時(shí)末端(5’端或3’端)被修飾(連接)有活性基團(tuán)。這些活性基團(tuán)包括，但不限于，羧基(-COOH)、氨基(-NH2)和巰基(-SH)。如核酸探針末端被羧基修飾，則羧基與載體表面的氨基反應(yīng)，形成酰氨鍵而將該核酸分子以共價(jià)鍵連接到載體上。如核酸探針末端被氨基修飾，則氨基與載體表面的醛基或羧基反應(yīng)，形成酰氨鍵而將該核酸分子以共價(jià)鍵連接到載體上。如核酸探針末端被巰基修飾，則巰基與載體表面的巰基反應(yīng)形成二硫鍵而將該核酸分子以共價(jià)鍵連接到載體上。
本發(fā)明的耐藥基因芯片的制備，是利用微排序法按照設(shè)計(jì)將所述的核酸探針有序地點(diǎn)樣到載體上，通過(guò)核酸探針末端修飾的活性基團(tuán)與載體表面相應(yīng)的活性基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)連接，將探針固定于載體上，從而制成基因芯片。同時(shí)，在所制備的基因芯片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交后，通過(guò)對(duì)所捕獲陽(yáng)性信號(hào)的尋址即可明確其對(duì)應(yīng)的特定核酸探針，從而確定與其對(duì)應(yīng)的耐藥基因。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的耐藥基因芯片對(duì)標(biāo)本中細(xì)菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，其過(guò)程包括樣品的標(biāo)記、與基因芯片的雜交以及雜交信號(hào)的檢測(cè)。
在所述的樣品標(biāo)記過(guò)程中，可以利用本領(lǐng)域已知各種核酸標(biāo)記方法使標(biāo)本中的目的基因標(biāo)記上信標(biāo)分子，所述的方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉(zhuǎn)錄、隨機(jī)引物標(biāo)記、缺口平移以及末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記等方法。所述的信標(biāo)分子可以為熒光素或同位素；所述的熒光素包括，但不限于，Cy3、Cy3.5、Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述的同位素包括，但不限于，32P、。在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子強(qiáng)度的條件下，將所述的標(biāo)記產(chǎn)物與本發(fā)明的耐藥基因芯片進(jìn)行雜交。雜交條件和方法是本領(lǐng)域已知的。雜交后，根據(jù)所選用的信標(biāo)分子采用相應(yīng)的檢測(cè)方法對(duì)基因芯片進(jìn)行掃描分析，根據(jù)所捕獲陽(yáng)性信號(hào)的位置尋址，判斷所述標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因的種類。在信號(hào)采集和分析過(guò)程中所需的設(shè)備均已經(jīng)商品化。
本發(fā)明的基因芯片采用耐藥基因特異性寡核苷酸作為探針，而在細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)過(guò)程中利用基因特異性引物通過(guò)對(duì)目的基因的線性PCR擴(kuò)增進(jìn)行樣品的標(biāo)記。本發(fā)明的基因芯片上連接的寡核苷酸探針和在PCR過(guò)程中所用擴(kuò)增引物以及對(duì)應(yīng)的耐藥基因均列于表6中。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中所采用的寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物也可以用于對(duì)目的基因進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增，而擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物同樣可以作為探針用于按照上述方法制備耐藥基因芯片，因此利用所述的PCR產(chǎn)物作為探針?biāo)苽涞哪退幓蛐酒苍诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。
表6。用于耐藥基因檢測(cè)的探針和引物序列及對(duì)應(yīng)的耐藥基因
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的基因芯片的制備、檢測(cè)方法及其應(yīng)用進(jìn)行描述。需說(shuō)明的是，下述實(shí)施例只是用來(lái)說(shuō)明而非限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他用于通過(guò)基因芯片對(duì)細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1耐藥基因特異性寡核苷酸和擴(kuò)增引物的合成利用DNA自動(dòng)合成儀(PE)按照表6中所列的寡核苷酸序列合成相應(yīng)的寡核苷酸探針和擴(kuò)增引物。在合成耐藥基因特異性寡核苷酸探針過(guò)程中，于每條探針序列的5’端均添加20個(gè)額外的胸腺嘧啶核苷(poly(dT)20)，并對(duì)所合成寡核苷酸探針的5’端進(jìn)行氨基修飾。
通過(guò)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳對(duì)合成的所有寡核苷酸進(jìn)行純化。所述的純化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
實(shí)施例2細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)基因芯片的制備將合成的耐藥基因特異性寡核苷酸探針?lè)謩e溶于適當(dāng)體積的無(wú)菌去離子水中，使各探針的終濃度均為60μM。從所有寡核苷酸探針溶液中各吸取5μl分別置于不同的微量離心管內(nèi)，并向每個(gè)微量離心管中分別加入5μl的二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國(guó))。將兩種溶液充分混勻后，各取5μl置于386孔板的相應(yīng)孔中。以醛基修飾的玻片(CSS-100 Silylated Slides，CEL Associates，Inc.，休斯敦，美國(guó))作為固相載體，制備細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)基因芯片。
利用GSI Flexys基因芯片點(diǎn)樣儀(Genomic Solution，美國(guó))將各寡核苷酸探針樣品均按照3×3的矩形點(diǎn)陣點(diǎn)到玻片上相應(yīng)的位置處，這樣不同位置上的寡核苷酸探針矩陣便對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的耐藥基因。室溫下將點(diǎn)制的基因芯片避光放置至少24小時(shí)。
實(shí)施例3標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因的PCR線性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光素標(biāo)記利用耐藥基因特異性引物通過(guò)線性PCR擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本中細(xì)菌的耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，并在擴(kuò)增過(guò)程中向擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入熒光素，以便隨后通過(guò)激光共聚焦掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。
將所有的耐藥基因特異性引物溶于適當(dāng)體積的無(wú)菌去離子水中，調(diào)整體積，使全部引物合并后各引物的終濃度均為10μM。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的線性擴(kuò)增方法，以標(biāo)本DNA為模板利用該引物混合物對(duì)標(biāo)本中相應(yīng)的細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增。簡(jiǎn)言之，在50μl PCR反應(yīng)體系中的成分如下1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、2.0mM MgCl2、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP、2μM引物、2μg模板DNA。將所述的PCR混合物在95℃變性5分鐘后加入Taq酶1u，隨后以94℃30秒，50℃30秒，72℃120秒的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，最后于72℃反應(yīng)5分鐘。利用Microcon 30(MilliporeCorporation，美國(guó))按照制造商的使用說(shuō)明對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作如下將PCR產(chǎn)物加入到Microcon 30樣品池中，并用去離子水補(bǔ)足體積至500μl；將其置于一微量離心管中，室溫下以12,000×g離心10分鐘；將樣品池取出，加入10μl去離子水，并將其倒置放于一微量離心管中，室溫下以12,000×g離心2分鐘。將純化的PCR產(chǎn)物用于進(jìn)行與基因芯片的雜交。
實(shí)施例4隨機(jī)引物6聚體對(duì)標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因熒光素標(biāo)記利用隨機(jī)引物6聚體和大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段(TaKaRa公司，大連，中國(guó))按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行熒光素標(biāo)記。具體如下配置反應(yīng)體系，使得在50μl終體積中含有1×大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段反應(yīng)緩沖液、15μg的隨機(jī)引物6聚體、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及2μg模板DNA。將上述混合物在99℃變性2分鐘后立即置于冰浴上，隨后加入50個(gè)單位的大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，并于37℃溫育2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，利用Microcon 30(Millipore Corporation，美國(guó))按照前面所述的方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
實(shí)施例5耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片的雜交和檢測(cè)按照本領(lǐng)域已知的方法對(duì)耐藥基因芯片進(jìn)行雜交前的預(yù)處理，具體操作如下將基因芯片經(jīng)60mJ的紫外線交聯(lián)后，用0.2％SDS室溫洗滌2次，各2分鐘；隨后用H2O室溫洗滌2次，各2分鐘；將基因芯片置于Na2BH4(1.3gNa2BH4溶于375ml PBS中，并加入125ml無(wú)水乙醇)溶液中室溫洗滌10分鐘；用0.2％SDS室溫洗滌2次，各1分鐘；用H2O分別于室溫和95℃各洗滌1分鐘后干燥待用。將純化的PCR產(chǎn)物或隨機(jī)引物標(biāo)記產(chǎn)物與雜交緩沖液(12×SSC，0.2％SDS)等體積混合，99℃變性5分鐘后立即置于冰浴中冷卻。將所述的雜交液滴加在基因芯片一側(cè)的邊緣，小心蓋上蓋玻片，使雜交液均勻分布在基因芯片和蓋玻片之間，隨后將其置于濕盒中，于70℃雜交1小時(shí)。雜交后，取出基因芯片，并立即投入到2×SSC+0.2％SDS溶液中，輕輕移去蓋玻片，洗滌5分鐘，隨后用1×SSC+0.1％SDS液繼續(xù)洗滌5分鐘，繼而在0.05×SSC中洗滌5分鐘，取出后自然涼干。利用GeneTAC 2000基因芯片掃描儀(Genomic Solution Inc.，美國(guó))，在532nm的激發(fā)光波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描并自動(dòng)曝光。分析掃描結(jié)果，并對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行尋址，并與特異性寡核苷酸探針相對(duì)應(yīng)，確定標(biāo)本中細(xì)菌耐藥基因的表達(dá)狀況。
權(quán)利要求
1.耐藥基因芯片，其用于對(duì)標(biāo)本中細(xì)菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，是通過(guò)將針對(duì)細(xì)菌各種耐藥基因的特異性寡核苷酸固定于固相載體上制成的。
2.權(quán)利要求1的基因芯片，其以玻璃片、硅片、塑料片或者其它可以用于制備基因芯片的材料作為固相載體，所述的固相載體表面經(jīng)化學(xué)修飾而帶有活性基團(tuán)。
3.權(quán)利要求2的活性基團(tuán)，其可以選自氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巰基(-SH)。
4.具有表6中所列核苷酸序列的寡核苷酸，其用于耐藥基因芯片的制備和細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)，所述的核苷酸序列中探針序列和引物序列分別屬于所述耐藥基因的互補(bǔ)鏈之一。
5.權(quán)利要求4的寡核苷酸，其中探針序列可直接用于制備基因芯片，在所述探針末端(5’端或3’端)修飾(連接)有活性基團(tuán)，所述的活性基團(tuán)選自羧基(-COOH)、氨基(-NH2)和巰基(-SH)。
6.權(quán)利要求4的寡核苷酸，其中探針序列可與引物序列聯(lián)合用于相關(guān)耐藥基因DNA序列的PCR擴(kuò)增，所獲的PCR產(chǎn)物也可用于制備基因芯片。
7.權(quán)利要求4的寡核苷酸，其中引物序列通過(guò)對(duì)目的基因的線性PCR擴(kuò)增而將信標(biāo)分子標(biāo)記到擴(kuò)增產(chǎn)物上，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)與基因芯片上的探針雜交而被檢測(cè)。
全文摘要
本專利涉及檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的基因芯片技術(shù)，包括固定于基因芯片載體上的寡核苷酸探針的DNA序列、將目標(biāo)耐藥基因進(jìn)行PCR線性擴(kuò)增的延伸引物的DNA序列、PCR線性擴(kuò)增的條件、將PCR產(chǎn)物于芯片上探針雜交的條件。PCR線性擴(kuò)增的目的是增加目標(biāo)耐藥基因的拷貝數(shù)同時(shí)將其標(biāo)記上熒光素等信標(biāo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1396271SQ0112044
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者劉元, 王鶴堯, 李梁, 石朝輝 申請(qǐng)人:北京三雄高新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司