專利名稱：肝癌細胞特異的基因工程腺病毒的構建及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種肝癌細胞特異的基因工程腺病毒的構建及應用。
腺病毒是一種雙鏈DNA病毒。除了引起呼吸道疾病及象感冒癥狀之外，至今未發現腺病毒引起其它嚴重疾病。腺病毒的基因組有36000左右堿基對。編碼的基因分為早期基因和晚期基因。早期基因當中除了基因組3之外，其它基因都是病毒復制繁殖所必需的。象基因組E1，E2和E4缺失的病毒變種在一般細胞中是不會復制繁殖的(Shenk T.，Fundamantal Virology，Third Edition，979-1005，1996)。現在常用的腺病毒載體，都是復制缺陷型(Replication-deficient)。由于腺病毒基因組的基因表達調控已研究得較清楚，同時腺病毒可以感染各種類型的細胞，不會引起嚴重疾病，不會整合到染色體中去，腺病毒很穩定且易生產。因此腺病毒被認為可發展成具有巨大應用潛力的基因治療的載體。
早在上世紀50年代，腺病毒就被科學家用來嘗試治療腫瘤。美國國家衛生研究院的Smith博士等人嘗試利用野生型的腺病毒治療子宮癌(Smith et.al.，Cancer 91211-1218，1956)。他們把腺病毒直接注射到原位子宮腫瘤中，發現65％的病人表現出療效。同時沒有一位病人出現任何副作用(Smith et.al.，Cancer 91211-1218，1956)。可惜的是由于當時病毒純化技術的落后和子宮腫瘤注射操作的困難，使得這項試驗沒有進展下去。
直到1996年，美國的ONYX制藥公司，采用基因工程技術，將早期基因EIB當中的p55K編碼區切除而改造成一種傾向于在p53腫瘤細胞缺陷的腫瘤細胞中復制的腺病毒變種dl1520(Barker and Berk，Virology 156107-121，1987)。這種病毒在p53缺陷的細胞中復制效率比在p53正常的細胞中要高100倍(Bischoff et.al.，Science 274373-376，1996)。但由于p55K蛋白的功能除了與p53結合而使p53失去活性的功能之外，還參與病毒信使RNA在細胞核和細胞質之間的運輸。由于p55蛋白的缺失而嚴重影響到病毒mRNA的轉運，以致dl1520的復制能力比野生型腺病毒要低成千上萬倍(Babiss et.al.，Mol.Cell.Biol.52551-2558，1985)。這嚴重影響到它殺死腫瘤細胞的能力。
1997，美國另一家生物制藥公司—Calydon提出利用組織特異基因激活子去控制腺病毒的復制。他們成功地將人體前列腺細胞專一的抗原基因(PSA)的激活子和增強子放到腺病毒的早期基因EIA的激活子和編碼區之間，產生的基因工程病毒CN706在PSΛ+細胞中的復制水平比PSΛ-細胞中要高100倍(Rodrigucz et.al.，Cancer Research 572559-2563，1997)。隨后，另一家生物公司利用類似技術生產出傾向于在甲胎球蛋白質表達的細胞中復制的腺病毒變種(Avela041).他們將甲胎球蛋白(AFP)的激活子和增強子放到腺病毒早期基因IA的編碼區上面，取代EIA基因的激活子。早期基因EIB仍然由野生的EIB自己的激活子控制。這種變種在AFP+細胞中比在AFP-細胞中復制水平要高100至1000倍。動物試驗表明，這種變種能使AFP+腫瘤生長放緩(Halleubeck et.al.，Human Gene Therapy101721-1733，1999)。但上述的幾種基因工程在肝臟腫瘤細胞中的復制特異性不高，殺死腫瘤細胞的能力還有待進一步提高。
本發明的目的是制備一種在肝臟腫瘤細胞中復制特異性更高，殺死腫瘤細胞能力更強的基因工程腺病毒。本發明的實施方案如下將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強子和靜止子被組裝成一個只在肝癌細胞中表達調控的激活開關，取代腺病毒的早期表達基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，這樣基因EIA和EIB在轉錄水平上同時受肝癌細胞專一的激活開關控制。同時在病毒的基因組中，將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除，以增加病毒殺死細胞的能力。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長的基因(ENDOSTATIN)。經過上述基因改造后成為本發明的SF-1人類腺病毒血清型5(保藏號CGMCC NO.0589，保藏日期2001年6月14日)。本發明的優點及其原因1)利用一個腫瘤細胞專一基因激活開關同時控制病毒的兩個早期基因。在我們構建的基因工程病毒SF-1中，病毒的兩個早期基因同時被一個腫瘤細胞專一的基因啟動子所控制。這樣使SF-1中EIA和EIB的表達，同時受到肝臟腫瘤細胞的專一轉錄因子(HCCSS)在轉錄水平上的控制。而在翻譯水平上，基因EIB是通過翻譯中介因子來完成的。
以上介紹的幾種病毒變種都是只有一個基因被腫瘤基因開關控制，所以用本發明的SF-1的腺病毒的腫瘤細胞的特異性更高(要比以上介紹的幾種病毒變種在肝臟腫瘤細胞中復制的特異性高出100倍)。同時，利用一個腫瘤專一基因的激活開關同時控制兩個病毒基因而構建只在腫瘤中復制的技術，在世界上還未見有報導。2)在我們構建的肝癌專一的基因工程病毒變種中，早期基因EIB當中的p19K蛋白編碼區以被切除。基因EIB編碼至少兩個蛋白，P55和P19。P19蛋白被認為是抑制細胞雕亡的抑制蛋白，有了它，病毒感染之后死亡得較慢，而切除p19K蛋白的變種比野生型腺病毒的殺傷腫瘤的能力更強。這在我們的實驗中以得到驗證。因此，本發明制備的腺病毒變種比已發表的變種可能會有更好的治療腫瘤的效果。在腫瘤細胞專一的腺病毒中缺失P19K蛋白的工作，作者還未見報道。3)本發明制備的腺病毒變種中同時攜帶有腫瘤生長所需血管的抑制基因。這樣制備的產品可以在體內腫瘤細胞中隨著病毒的復制而不斷轉錄翻譯生產出抑制腫瘤血管生產的抑制劑，以進一步達到殺死腫瘤細胞的效果。這與發表的腺病毒變種也是不一樣的。利用腺病毒做載體，去表達血管生長抑制因子，已有前例。但是，利用只感染腫瘤細胞的基因工程病毒去表達血管生長因子，是本發明特征之一。4)本發明的基因工程病毒，不但表現出比所有已發表的癌細胞專一的病毒更好的特異性，而且能在靜脈給藥的情況下，6個星期內治愈動物身上的腫瘤，藥效特別好。本發明用于制備肝臟腫瘤細胞特異復制腺病毒的DNA組件組成有1)pXC 1，本質粒購于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人類腺病毒血清型5的左手6Kb左右的DNA序列，編碼早期基因EIA和EIB。2)pBHG11，本質粒購于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人類腺病毒血清型5的全長基因，但是其中從矸基對188至1339(包含病毒的包裝序列)和矸基對從27865至30995兩段DNA以被切除。3)甲胎球蛋白基因的調控開關(HCCSS)從人類基因組中分離出來，其中包括從矸基對-163至+34的激活子，從矸基對-3856至-3267的增強子和從矸基對-1800至-953的靜止子。克隆到pGEM-T載體(Promaga)之中。4)Endostatin基因來自于InvivoGen，Inc.它是抑制血管生長的基因。
以下實施例對本發明的用于建造肝臟腫瘤細胞特異性，并表達心血管形成生長抑制劑基因工程腺病毒的制備和用途作了詳細說明，但不意味著限制本發明的內容。實施例1SF-1人類腺病毒血清型5的制備兩個新的限制性脢切位點SpeI和SalI被通過定點突變方法加到pXC.1之中，然后將甲胎球蛋白的調控組件HCCSS兩端加上SpeI和SalI切口，然后用限制性內切脢切割HCCSS將切割好的HCCSS片段克隆到通過SpEI和SalI切割的PXC.1之中。與此同時，在EIA和EIB基因之間加入一種翻譯中介因子，從而使EIB的翻譯受中介因子控制而產生中間質粒WP-1，接著將進行下一步驟。
質粒pBHG11之中有Pac I單一限制脢切口，腺病毒早期基因E3之中的致死基因(ADP)被克隆到Pac I切口之中，然后再克隆ENDOSTATIN基因到此之中而產生中間質粒WP-2，接著將進行下一步驟。
中間質粒WP-1和WP-2分別用NruI和ClaI內切脢切割，并用phenol和chloroform純化溶在重蒸水之中(1μg/ml)。轉化有腺病毒左手區域大約6Kb片段DNA的293細胞種在玻璃皿之中，48小時之后達到80％左右的細胞密度。然后用Transfectin(Gibco，Lifescience)同DNA混合并轉化293細胞。8天之后細胞被括下來收集于15ml試驗之中，然后注-80℃和+37℃凍融三次，細胞液用來轉染293細胞并挑選單個分離的病毒斑點，6個病毒斑點被挑選并感染已生長好的293細胞。5天左右時間，細胞裂變，收集細胞液于試管之中，并分裝到小試管之中，保存在負80℃的冰箱之中，用于以下實驗。首先200微升的細胞液被用來提取DNA。然后用聚合鏈式反映(PCR)重新驗證得到病毒的結構，實驗證實，得到的病毒正如設計的那樣如
圖1病毒結構示意圖。HCCSS被正確地放在早期基因EIA之上，早期基因EIB被用轉譯切入信號(TS)連于早期基因EIB之后。在早期基因區域E3，包含著ADP基因和ENDOSTATIN基因。經上述分析，基因插入的位置和方向都正確。命名這個病毒為SF-1。實驗比較1病毒在各種細胞中的復制8種人體細胞其中包括人體正常細胞內體細胞(Human MicrovescularEndothelium Cells)微小通氣道細胞(Small airway cell)，人體肝臟細胞(humanhepatocytes)和人體成纖維細胞(fibroblast)。這些細胞和人體胸腺細胞(HBL-100)都不生產甲胎球蛋白，而肝臟腫瘤細胞Hep3B SW620和H1299都生產高水平的甲胎球蛋白。
將細胞長在培養皿中，24小時之后，三種病毒(WT-Ad(由PXC.1提供)，SF-1和dl1520(由加州大學提供)被用來感染上述細胞(2PFU/cell)。四小時之后，培養基被取出，并用PBS洗一次細胞然后將新的培養基加入，在37℃含5％CO2的培養廂中培養72小時，然后細胞和培養基被一起收入到試管中。然后經凍融三次，樣品用于分析有多少新的病毒復制繁殖起來。
圖2病毒在不同細胞中的復制效率結果表明，SF-1同野生型腺病毒(WT-Ad)相似，能有效地在甲胎球蛋白表達的細胞中復制繁殖，每個細胞產生超過10000病毒感染顆粒。但是在甲胎球蛋白不生產的細胞中，野生型WT-Ad能有效地復制繁殖每個細胞產生的病毒從1000至50000感染顆粒不等。有趣的是SF-1在這些非甲胎球蛋白生產的細胞中基本上不復制。每個細胞生產的感染病毒顆粒從0.05至5個不等。這樣的復制水平比起它在甲胎球蛋白生產的肝臟腫瘤細胞中要低5000至50,000倍。說明SF-1傾向于在肝臟腫瘤細胞中復制。
同樣dl1520在不同細胞中的復制繁殖效率也被檢測分析，發現dl1520在肝臟腫瘤中的復制比野生腺病毒要低10至5000倍不等。而在非肝癌細胞中比SF-1復制又要好50至500倍。說明SF-1的腫瘤選擇性好，而dl1520沒有腫瘤細胞的選擇性。實驗比較2病毒在人體正常微泡內皮細胞中的生長曲線將人體微泡內皮細胞種在培養皿中，48小時之后之三種病毒去感染一個培養皿細胞，4小時之后吸去培養皿中的培養基，再用PBS洗一遍，然后加新的培養基。然后在不同時間(6，12，24，36，48，72和108小時)之后將細胞和培養基一起收集到試管中，凍融三次之后，在293細胞上檢測有多少新的病毒產生。
圖3病毒在人體微血管內及細胞中的生長的曲線表明了3種病毒在開始的24小時內生長比較相近，但24小時之后，野生型腺病毒和dl1520在人體微泡內細胞中生長的很好，每個細胞產生20000和2000感染顆粒不等，而SF-1在這種細胞中基本上沒有什幺復制，表明SF-1的復制已被嚴格地限制至腫瘤細胞而不會在人體正常細胞中繁殖。實驗比較3病毒殺死細胞的效率臟腫瘤細胞Hep3B種在96孔的培養皿中，24小時之后，用三種病毒(0.1PFU/Cell)各感染一個培養皿。然后分別在2天、4天、6天和8天之后測定細胞的線粒體活性而計算細胞存活率。
圖4病毒殺死肝癌細胞的動力學曲線表明SF-1殺死Hep3B的效率要顯著高于dl1520，同時也高于野生型腺病毒，例如感染8天之后，SF-1殺死95％的細胞，野生型腺病毒殺死60％的細胞，而dl1520只殺死32％的細胞。這表明SF-1不但有顯著特異性殺死腫瘤細胞的活性，而且殺死肝癌細胞的效率很高。實驗比較4病毒在動物模型上殺死腫瘤細胞的試驗首先在裸鼠上建立肝臟腫瘤模型。1×106個Hep3B細胞被注射到裸鼠的皮下，四周之后，腫瘤塊長大到300mm3左右，然后往這些鼠的尾巴血管中注射9？1010顆粒的SF-1.每個星期測量腫塊的大小，并按以下公式計算腫塊的體積V＝長X(寬)2/2。以注射前測量的體積為100％而得圖5肝癌動物模型上的HEP3B腫瘤大小在接受SF-1靜脈注射之后的變化。表明腫瘤相對體積結果。
圖標結果表明Hep3B在裸鼠上生長很快。6個星期之后體積增加超過9倍。但是經靜脈注射SF-1的老鼠背上的腫塊體積則沒有增加，反而降低，例如注射一針的老鼠腫瘤體積下降到原來注射前的87％，而注射二針的老鼠背上的腫瘤體積則下降到0。則表明SF-1有顯著的殺死腫瘤的能力，注射二針可以殺滅肝臟腫瘤。實驗比較5病毒對肝癌腫瘤血管生長的抑制作用實驗方法同上述例六一樣，只是腫塊在SF-1注射之后一周和二周的時候被收割下來做成切片而用來檢測腫瘤血管的生長情況。腫塊切片用CD31單克隆抗體去染色，這樣新生血管中內皮細胞上表達CD31蛋白的細胞都會被染成蘭色。圖6SE-1在肝癌動物模型上的抗血管生長的效應。表明，沒有注射病毒的動物背上腫塊中的血管被CD31抗體染成蘭色的當做100％，而被注射SF-1的動物背上的腫瘤塊能染成蘭色的在注射一個星期之后減少為對照動物的42％，二個星期之后減少為對照動物的18％。而注射dl1520的動物，能被CD31抗體染色的血管內皮細胞數與對照相比變化不大，第一個星期為對照的98％，第二個星期為對照的80％。這組數據表明SF-1是一個具有顯著殺死心血管的，腫瘤細胞專一的基因工程病毒，具有抗血管增生的功效。
(A OAP上述例六一樣，只是腫塊在WV-A注射之后一周和二周的時候被收割下來做成切片而用來檢測腫瘤血管的生長情況。腫塊切片用CD31單克隆抗體去染色，這樣新生血管中內皮細胞上表達CD31蛋白的細胞都會被染成蘭色。圖6表示，沒有注射病毒的動物背上腫塊中的血管被CD31抗體染成蘭色的當做100％，而被注射WV-A的動物背上的腫瘤塊能染成蘭色的在注射一個星期之后減少為對照動物的42％，二個星期之后減少為對照動物的18％。而注射dl1520的動物，能被CD31抗體染色的血管內皮細胞數與對照相比變化不大，第一個星期為對照的98％，第二個星期為對照的80％。這組數據表明WV-A是一個具有顯著殺死心血管的，腫瘤細胞專一的基因工程病毒，具有抗血管增生的功能。
圖1為病毒結構示意2為病毒在不同細胞中的復制效率圖3為病毒在人體微血管內及細胞中的生長曲線圖4為病毒殺死肝癌細胞的動力學曲線圖5為肝癌動物模型上的HEP3B腫瘤大小在接受SF-1靜脈注射之后的變化圖6為SF-1在肝癌動物模型上的抗血管生效應。
權利要求
1.一種肝癌細胞特異的基因工程腺病毒的構建，其特征在于將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強子和靜止子被組裝成一個只在肝癌細胞中表達調控的激活開關，取代腺病毒的早期表達基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，并將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長的基因(ENDOSTATIN)而改造而成。
2.根據權利要求1的腺病毒其特征在于應用于殺死肝癌細胞。
全文摘要
將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強子和靜止子被組裝成一個只在肝癌細胞中表達調控的激活開關，取代腺病毒的早期表達基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，并將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長的基因(ENDOSTATIN)而改造而成。主要用于殺死肝癌細胞的能力比現有技術強得多，實驗表明，注射本發明的針劑，注射二針劑可殺死肝癌腫瘤。
文檔編號C12N15/11GK1393559SQ0111990
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月29日 優先權日2001年6月29日
發明者鄭嚴光 申請人:上海韋池生物技術有限公司