一種腺相關病毒載體及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：一種腺相關病毒載體及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腺相關病毒載體。具體地說，涉及一種包含質粒pSub201的末端反轉重復序列和質粒pRc/CMV的CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因的腺相關病毒載體。本發明還涉及用DNA重組技術制備腺相關病毒載體的方法和所述載體在介導基因轉移和建立體外細胞模型中的用途。
人類基因組核苷酸草圖繪制的完成，標志著以功能研究為主的后基因組時代的到來。研究基因的功能通常需要建立相應的細胞模型，以便將基因轉移到正常細胞內，以觀察細胞功能的變化；或者將基因轉移到缺陷型或帶有異常拷貝的細胞內，以恢復細胞的正常功能。
B淋巴細胞是一類重要的免疫細胞，研究基因在B細胞中的生物學功能對免疫學研究和臨床治療具有重要意義。B細胞在體外不能被長期培養，而EB病毒(Epstein-Barr Virus，簡稱EBV)轉化的B細胞(B-LCL)可以在體外長期生存(Miller G.,Epstein-Barr virus.In field BN,Knipe DM,ChanockRM et al.,ed.Virology,Vol Ⅱ,2ndedition,New York:Raven Press,1990,1921-1958)，因而是研究特定基因在B細胞中功能的良好模型。然而，進行此類研究的前提是獲得合適的轉移系統，使目的基因能夠高效轉入宿主細胞并能夠穩定表達。
目前的基因轉移系統主要分為非病毒類和病毒類。非病毒類轉移系統，如裸DNA和質粒DNA介導的基因轉移效率很低，外源基因只能在宿主細胞瞬時表達(Levy M.Y.,et al.,Characterization of plasmid DNA transfer into mouseskeletal muscle: evaluation of uptake mechanism, expression andsecretion of gene products into blood.Gene.Ther.,1996,3:201-211)。病毒類轉移系統主要包括逆轉錄病毒、腺病毒等。逆轉錄病毒系統能夠實現基因的高效轉移和整合，但不能轉導入非分裂細胞，且具有致病性(Jolly D.,Viral vector systems for gene therapy.Cancer Gen.Ther.,1994,1:55-64)。腺病毒系統能夠介導分裂和非分裂細胞的基因的高效轉移，但不能將其整合入宿主細胞基因組，只能實現基因的瞬時轉導和表達；而且宿主對腺病毒的免疫反應亦使該系統的安全性和有效性受到質疑(Peng L.,et al.Construction of recombinant adeno-associated virus vector containingthe rat preproinsulinⅡgene.J.Surgical Res.,1997,69:193-198)。
就B-LCL的基因轉移而言，逆轉錄病毒系統和腺病毒系統不適用于B-LCL,因為B-LCL對其介導的基因轉移具有抵抗性(Hanazono Y.,et al.In vivomarking of rhesus monkey lymphocytes by adeno-associated viral vectors:Direct compari son with retroviral vectors.Blood,1999,94:2263-2270)。某些轉移系統能使轉入的外源基因在B-LCL中短期表達。例如，根據oriP(EBV的順式作用元件)允許質粒在感染EBV的細胞中持續存在的特點，人們構建了帶有oriP的質粒并將其用于體外基因治療(Saeki Y.,et al.Sustained transgene expression in vitro and in viro using Epstein-Barrvirus replicon vector system combined with liposomes.Gene.Ther.,1998,5:1031-7)，盡管轉導后基因的表達期限可能足以殺傷靶細胞(如腫瘤細胞)，但遠不足以進行基因功能的研究。根據EBV對B細胞的親合性，人們構建了對輔助病毒有依賴性、能復制及包裝的非轉化性微小EBV載體，用于將基因轉入淋巴母細胞。然而EBV的DNA也不能整合入宿主染色體，經這類載體轉入的基因仍然不能持續表達。Suzuki等人報導用復制缺陷型皰疹病毒-1作載體，轉導的LacZ基因在EB病毒轉化的B細胞SWEIG中僅表達1周(Suzuki T.,et al.Efficient gene delivery into Epstein-Barr virus(EBV)-transformedhuman B cells mediated by replication-defective herps simplex virus-1(HSV-1):a gene therapy model for EBV-related B cell malignancy.Biochem.Biophys.Res.Commun.1998,253:686-90)。綜上所述，現有的轉移系統都不能使轉移的基因在B-LCL中長期穩定表達，因此無法滿足研究基因功能的需要。
本發明的一個目的是提供一種腺相關病毒載體，所述載體為7146bp的閉環質粒，其包含質粒pRc/CMV的CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因和質粒pSub201的末端反轉重復序列。
本發明的再一個目的是提供用DNA體外重組技術制備腺相關病毒載體的方法。
本發明的又一個目的是提供腺相關病毒載體在介導目的基因轉入真核動物細胞中的用途，尤其是轉入B-LCL中的用途。經本發明的腺相關病毒載體轉入的基因可以在宿主細胞(包括B-LCL)中長期表達。
本發明的又一個目的是提供腺相關病毒載體在建立體外細胞模型中的用途。
本發明的構思如下發明人基于腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)不僅能夠轉導入分裂和非分裂細胞，并且能夠定點整合入宿主染色體組，而且沒有致病性的特點，用DNA體外重組技術改造現有的AAV病毒質粒，構建一種能夠使基因高效轉移并在真核細胞中穩定表達的新型載體。
根據本發明的一個方面，本發明提供了一種腺相關病毒載體。所述載體為7146bp的閉環質粒，其包含質粒pRc/CMV的CMV啟動子(PCMV)、多克隆位點(MCS)、新霉素抗性基因(Neor)和質粒pSub201的末端反轉重復序列(ITR)。
本發明的腺相關病毒載體是以HindⅢ和XbaⅠ酶切質粒pSub201后，含有ITR的部分作為骨架(pEMBL)，以NruⅠ和SalⅠ酶切質粒pRc/CMV9后，含有PCMV、MCS及Neor的片段作為插入元件，通過DNA體外重組技術獲得的。根據PCMV-MCS-Neor插入方向的不同，本發明的腺相關病毒載體pAGX有兩類。PCMV-MCS-Neor正向插入的腺相關病毒載體是pAGX(+)，用ClaⅠ和SpeⅠ酶切后，產生5273bp、1207bp和666bp的片段；PCMV-MCS-Neor反向插入的腺相關病毒載體是pAGX(-)，用ClaⅠ和SpeⅠ酶切后，產生3479bp、3001bp和666bp的片段。
本發明的腺相關病毒載體具有5’-反向末端重復序列、CMV啟動子、T7啟動子、多克隆位點、Sp6啟動子、BGH加尾信號、M13復制原點、SV40早期啟動子、新霉素抗性基因、SV40加尾信號、3’-反轉末端重復序列等遺傳元件。
本發明的腺相關病毒載體上有多個限制性內切酶切位點，pAGX(+)上的部分酶切位點及其起始位點列舉如下ApaⅠ(979),BamHⅠ(897,1272,3241),BstⅪ(913,943),BglⅠ(322,444,515,2008,4632,7086),ClaⅠ(6176),EcoRⅠ(928,1732),HindⅢ(879),MscⅠ(121,2353,3327),NotⅠ(954),PstⅠ(933,2320),PvuⅡ(1254,2375,3448,7146),SalⅠ(3248),SmaⅠ(68,79,2082,3369,3380),SpeⅠ(237,903),XbaⅠ(973)。其中適用于克隆的酶切位點包括HindⅢ、BstⅪ、NotⅠ、XbaⅠ和ApaⅠ。
根據本發明的再一個方面，本發明提供了腺相關病毒載體的制備方法。方法包括A．用HindⅢ和XbaⅠ酶切質粒pSub201，回收含有末端反轉重復序列的片段；B．用NruⅠ和SalⅠ酶切質粒pRc/CMV，回收含有CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因的片段；C．用Klenow酶補平回收的片段，用DNA連接酶進行連接；D．重組載體轉化大腸桿菌后篩選陽性克隆。
腺相關病毒質粒pSub201含有AAV反向末端重復序列(inverted terminalrepeat,ITR)，復制基因(rep)與包裝基因(cap)基因，其中ITR基因是腺相關病毒包裝、整合和復制必須的，它還可以調節基因的轉錄。質粒pRc/CMV9含有在真核動物細胞中表達所需要的CMV啟動子(PCMW)，可作為篩選標志的新霉素抗性基因，可用于外源基因插入的多克隆位點。
HndⅢ和XbaⅠ酶切pSub201后，回收3448bp含ITR的片段作為本發明腺相關病毒載體的骨架pEMBL。NruⅠ和SalⅠ酶切真核表達質粒pRc/CMV9，回收3698bp含有CMV啟動子(PCMV)、多克隆位點及新霉素抗性基因(Neor)的片段作為重組載體的插入元件。為了提高實驗的效率，用于連接的回收片段優選純化過的。可以用本領域已知的任何方法純化回收的片段，一種較簡便的方法是用凝膠純化并回收所需片段。帶有不匹配粘末端的酶切片段需要用Klenow酶補平，再用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線性DNA上的5’磷酸基團。在DNA連接酶的作用下，pSub201的骨架與pRc/CMV中含PCMV、MCS及Neor的片段連接，產生重組的腺相關病毒載體pAGX。經轉化大腸桿菌DH5α后，藉對氨芐青霉素和新霉素的抗性篩選陽性克隆。
根據本發明的又一個方面，本發明提供了腺相關病毒載體在介導目的基因轉移到真核細胞中的用途。具體的使用方法包括A．將目的基因插入腺相關病毒載體的多克隆位點；B．在宿主細胞內包裝并拯救帶有目的基因的重組腺相關病毒載體；C．用包裝后的重組腺相關病毒載體轉導真核動物細胞。
外源基因片段(如正義的cDNA片段或反義的cDNA片段)插入腺相關病毒載體pAGX的多克隆位點后，需要經過包裝和拯救才能成為有感染毒力的顆粒。這是因為pAGX沒有病毒復制基因(rep)與包裝基因(cap)，它需要借助輔助質粒或輔助噬菌體的rep與cap，方能整合入宿主細胞基因組。同時，腺相關病毒載體是一種有缺陷的病毒載體，整合入宿主細胞基因組的DNA通常情況下只發生潛伏性感染，其rep基因的轉錄處于抑制狀態。只有在宿主細胞同時感染腺病毒的情況下，腺病毒基因編碼的某些蛋白可以解除rep的轉錄抑制狀態，啟動DNA的復制，整合入宿主細胞染色體的pAGX DNA才能被拯救。即pAGX的正鏈和負鏈能夠被單獨包裝成具有毒力的粒子，產生子代病毒載體。能夠被包裝后的重組腺相關病毒載體感染的真核細胞優選哺乳動物細胞，更優選EB病毒轉化的B細胞。
在本發明的優選實施例中，pAGX(+)的包裝是采用磷酸鈣沉淀共轉染法，通過用輔助質粒pAAV/Ad和pAGX(+)共同轉染293細胞實現的。拯救是通過在轉染過程中加入野生型腺病毒Ad5完成的。
為鑒定pAGX轉移外源基因的能力和效率，本發明的一個實施例以黃色熒光素蛋白(EYFP)作為報告基因進行檢測。攜帶EYFP基因的重組腺相關病毒載體pAEYFP經包裝后，pAEYFP儲存液的感染滴度達1.39×107t.u./ml，復制滴度達1.94×1011顆粒/ml。Southern雜交表明EYFP基因獲得成功拯救。pAEYFP顆粒轉導哺乳動物細胞COS 7后，EYFP基因整合入COS 7細胞的基因組，并能夠長期穩定表達。pAEYFP轉導EB病毒轉化的B細胞SKW6和3D5細胞后，EYFP亦獲得穩定表達。這說明pAGX作為基因轉移載體的有效性和實用性。
根據本發明的又一個方面，本發明提供了腺相關病毒載體在建立體外細胞模型中的用途。在本發明的一個實施例中，用pAGX(+)分別將6A8α-甘露糖苷酶基因的正義cDNA片段和反義cDNA片段轉入EB病毒轉化的B細胞株(B-LCL)SKW6和3D5。細胞培養24個月之后，α-甘露糖苷酶活性檢測和RT-PCR檢測均顯示6A8反義cDNA片段的轉入使細胞內的6A8α-甘露糖苷酶表達持續抑制，Con-A結合實驗顯示細胞內蛋白質的糖基化受到干擾。因此，發明人通過使用腺相關病毒載體，建立起可以研究6A8α-甘露糖苷酶對B-LCL功能影響的細胞模型。通過這種細胞模型，發明人發現6A8α-甘露糖苷酶的表達抑制使SKW6細胞對Fas抗體誘導的凋亡發生抵抗。在本發明的另一個實施例中，發明人通過腺相關病毒載體pAGX(+)，建立起人淋巴細胞膜相關抗原5D4反義cDNA片段轉入的B-LCL細胞模型，用以研究反義5D4 cDNA片段的轉入對細胞的影響。因此，利用本發明的腺相關病毒載體可以建立起多種細胞模型，用以研究基因的長期表達或抑制對細胞功能的影響。細胞模型優選在哺乳動物細胞中建立，更優選在EB病毒轉化的B細胞中建立。此外，由于許多B細胞的惡化與EB病毒感染有關，本發明的腺相關病毒載體還可以在基因治療(例如治療惡化的B細胞)等方面發揮作用。
為了更清楚地理解本發明，對本發明使用的部分術語和操作方法作如下說明。
“基因”是指與產生多肽有關的DNA片段，包括編碼區(外顯子)之前和之后的區域，以及在各個編碼區之間的間插序列(內含子)。
“質粒”以小寫字母p和后續的大寫字母或數字命名。本文的起始質粒是公眾可以通過市售途徑無限制獲得的，或者是可以按照已經公開的制備的方法獲得的。
“酶切”或“消化”是指用限制性核酸內切酶催化切割DNA的反應。正如本領域的普通技術人員所知的，特定的限制性內切酶僅識別并作用于特定的DNA序列，酶切的反應條件、輔助因子及其它要求應當視具體的酶而定。本發明使用的限制性核酸內切酶都是市售的。對于市售的酶而言，可以參照生產商推薦的條件，選擇合適的緩沖液和加入底物的量。為了分析的目的，一般可以在約20微升緩沖液中使用1-2個單位的酶消化1微克質粒或DNA片段，37℃作用1-2小時的反應條件可以滿足大多數酶切反應的要求。酶切后的產物可以直接在聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠上電泳，以達到分離的目的。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。
“pEMBL骨架”是指pSub201經HindⅢ和XbaⅠ酶切后，構建重組腺相關病毒載體pAGX所需要的含有末端反轉重復序列的片段。
“包裝”是指病毒的核酸復制后，cap基因編碼的包裝蛋白與病毒的核酸組裝在一起，形成完整病毒顆粒的過程。
“拯救”是指將整合到宿主染色體組上、處于隱性感染狀態(不復制，不包裝)的腺相關病毒載體激活的過程。即在某些基因的活動下，腺相關病毒載體復制并包裝成病毒顆粒的過程。
“復制滴度”是指有毒力的病毒感染細胞后，一定數量的細胞裂解物中含有的病毒顆粒。復制滴度的單位是“病毒顆粒數/ml”，病毒顆粒數越多，復制滴度越高。
“感染滴度”是指一定數量的病毒能夠感染的細胞數。感染滴度的單位為轉導單位(transducing unit,t.u)，在本發明中,3×106t.u./ml表示1ml的病毒儲存液能夠感染3×106個細胞。
“感染效率”是指以合適感染復數(MOI)的病毒感染細胞，被感染的細胞占被檢測的全部細胞的比例。
除另有說明的外，本發明的實驗操作均參照《分子克隆實驗指南(第二版)》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，1996，科學出版社出版)進行。
為了更清楚地理解本發明的實質，現參照附圖和實施例對其進行解釋。附圖和實施例是為了說明而不以任何方式限制本發明。


圖1顯示了腺相關病毒載體的構建過程。
圖2顯示了重組腺相關病毒的包裝程序。
圖3反映了用基因組PCR法檢測新霉素抗性基因在宿主細胞染色體組整合的情況。圖3A是在SKW6細胞的檢測結果，圖3B是在3D5細胞的檢測結果。
圖4反映了用RT-PCR法分析轉導的6A8 cDNA片段在細胞內的轉錄情況。
圖5是6A8 cDNA片段轉導后，Con A結合實驗的結果。
圖6顯示了Fas抗體誘導SKW6細胞凋亡的梯形DNA檢測結果。
實施例一、pAGX(+)和pAGX(-)的構建腺相關病毒質粒pSub201含有反向末端重復序列(inverted terminalrepeat，簡稱ITR)，復制基因(rep)與包裝基因(cap)基因(Samulski R.J.,etal.,Recombinant plasmid from which an infectious adeno-associated virusgenome can be excised in vitro and its use to study viral replication,J.Virol.,1987,61:3096-3101)。真核表達質粒pRc/CMV9(Introgen公司)含有CMV啟動子(PCMV)、多克隆位點(MCS)及新霉素抗性基因(Neor)。
質粒pSub201用HindⅢ和XbaⅠ酶切。質粒pRc/CMV用NruⅠ和SalⅠ酶切。凝膠回收純化所需片段，切端均用Klenow酶補平。3448bp的pSub201骨架中含ITR和氨芐青霉素抗性基因，經牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化后，與pRc/CMV中含CMV啟動子(PCMV)、多克隆位點(MCS)及新霉素抗性基因(Neor)的3698bp片段藉T4 DNA連接酶連接，構建重組pAGX載體。經轉化大腸桿菌DH5α后，藉對氨芐青霉素和新霉素的抗性篩選陽性克隆。擴增并提取重組質粒，經SalⅠ、ClaⅠ-HindⅢ、ClaⅠ-SpeⅠ、ClaⅠ-XbaⅠ酶切確定含PCMV、MCS,Neor片段的插入方向。
結果稱PCMV-MCS-Neor正向插入的重組AAV載體為pAGX(+)，稱相反方向者為pAGX(-)。
pAGX(+)全長7146bp，框架區3448bp。多克隆位點內可用于克隆的限制性內切酶位點為HindⅢ,BstXⅪ,NotⅠ,XbaⅠ和ApaⅠ。pAGX(+)構建過程見圖1，pAGX(+)上的部分元件見表1。
表1腺相關病毒載體pAGX(+)的部分元件pAGX(+)的部分元件起始位點終止位點5’-反向末端重復序列 1194CMV啟動子198 852T7啟動子 853 876多克隆位點 879 979Sp6啟動子981 1007BGH加尾信號 1009M13復制原點 1273SV40早期啟動子 1732新霉素抗性基因 2108SV40加尾信號 29663’-反轉末端重復序列 3254 3448pEMBL骨架3449 7146實施例二、pAGX(+)轉導黃色熒光素蛋白基因1．pAEYFP和pEYFPCMV的構建為構建包含黃色熒光素蛋白(EYFP)的重組載體pAGX(+)，用HindⅢ和NotⅠ酶切pEYFP-1(Clontech公司)，將EYFP片段插入pAGX(+)的HindⅢ和NotⅠ位點。用HindⅢ-NotⅠ酶切鑒定EYFP片段插入情況，用PstⅠ酶切鑒定插入方向。
構建報告質粒pEYFPCMV作為對照。用SalⅠ和BamHⅠ酶切質粒pRc/CMV，回收CMV啟動子片段，插入經SalⅠ和BamHⅠ酶切的pEYFP-1質粒，構建重組質粒pEYFPCMV。
結果用HindⅢ-NotⅠ酶切鑒定EYFP基因插入情況，出現779bp EYFP片段的克隆為陽性克隆。用PsfⅠ酶切鑒定插入方向，將酶切后出現249bp、1880bp和5721bp的質粒作為EYFP基因正向插入的質粒，將其命名為pAEYFP。
質粒pEYFP-1重組質粒pEYFPCMV經SalⅠ-BamHⅠ酶切獲得877bp的CMV啟動子序列片段，用PstⅠ酶切獲得1131bp和3925bp片段，用PstⅠ-SpeⅠ酶切獲得223bp、887bp和3946bp片段。上述結果證明pEYFPCMV構建正確。由于pEYFPCMV是一個普通的重組質粒，不能被包裝成病毒，因此可以作為pAEYFP包裝的陰性對照。2．pAEYFP的包裝和拯救磷酸鈣共沉淀法轉染試劑盒購自GIBCO/BRL公司，輔助質粒pAAV/Ad(Samulski R.J.,et al.,Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses normal integration does not require viral geneexpression,J.Virol.,1989,63:3822-3828)和野生型腺病毒Ad5為本室保存。293細胞(ATCC CRL 1537)是用截斷的腺病毒Ad5 DNA轉化的人胚胎腎細胞株。
當293細胞生長到60-80％匯片時，換液為10ml含10％NBS但無抗生素的新鮮DMEM液。3小時后，加入1ml pAEYFP與pAAV/Ad(各12.5μg)的磷酸鈣共沉淀混合液。以質粒pEYFPCMV作為包裝的陰性對照組，進行同步實驗。12小時后，用新鮮的DMEM完全液置換原有的培養液，同時加入野生型腺病毒Ad5(感染復數MOI:2)以拯救pAEYFP。48-72小時后，輕輕刮下細胞，懸細胞于1mlTBS(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl)中，經反復凍融四次后，除去細胞碎片。上清部分于56℃30分鐘以滅活腺病毒Ad5，此即為pAEYFP儲存液，于-20℃保存備用。3．pAEYFP中EYFP基因的拯救情況鑒定參照Hirt等人的方法(Hirt B.,Selective extraction of polyoma DNAfrom infected mouse cell culture.J.Mol.Biol.,1967,26:365-9)從pAEYFP儲存液中分離出低分子量DNA。簡言之，取100μl pAEYFP儲存液，加入以下試劑并使其終濃度為Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,EDTA(pH8.0)20mmol/L,SDS0.5％，蛋白酶K50μg/ml。37℃溫浴1小時后，加入1/5體積5mol/L NaCl。冰浴1小時后，12,000rpm離心30分鐘，上清經抽提后，用等體積的異丙醇沉淀低分子量DNA。TE(pH8.0)溶解DNA。用DpnⅠ和HindⅢ-NotⅠ完全酶切后，Southern轉移此DNA于帶正電荷的尼龍膜上。以[α-32P]-dCTP標記的EYFP DNA作探針。
結果從尼龍膜上DNA中探測到單聚體和二聚體兩種形式的EYFP基因，表明EYFP基因獲得成功拯救。4．pAEYFP感染滴度和復制滴度的測定用不同稀釋度pAEYFP與腺病毒Ad5(MOI:1)共感染293細胞24小時后，計數黃色熒光細胞以計算pAEYFP的感染滴度。
從25μl pAEYFP儲存液或500μl上清中分離所得的低分子量DNA經DpnⅠ酶切，以兩倍梯度連續稀釋，藉Slot Blot裝置(BioRad公司)將此DNA負載于帶正電荷的尼龍膜上。以兩倍連續稀釋的pAEYFP作定量標準品，標準品濃度梯度為100ng、50ng、25ng和12.5ng。用[α-32P]-dCTP標記的EYFP DNA作探針雜交，對照標準品雜交反應的強度，計算兩次包裝中pAEYFP的復制滴度。
結果見表2。
表2 pAEYFP的感染滴度和復制滴度感染滴度(t.u./ml)復制滴度(顆粒/ml)第一次包裝3.06×1065.5×1010第一次包裝2.47×1073.32×1011平均值1.39×1071.94×10115．PAEYFP轉導哺乳動物細胞-COS 7細胞(1)．Southern雜交探測EYFP基因的整合當COS 7細胞于6孔細胞培養板中生長至約50-80％匯片時，用100μlpAEYFP儲存液轉導COS 7細胞。同時，以pEYFPCMV儲存液作陰性對照組，脂質體法轉染pEYFPCMV(轉染試劑盒購自GIBCO/BRL公司)的細胞作陽性對照組。48-72小時后，1∶6-1∶10稀釋細胞培養，并加入G418(新霉素類抗生素)400μg/ml，篩選至陰性對照組細胞全部死亡后1周，生存細胞即為轉導和轉染成功的細胞。
當細胞在50cm2細胞培養瓶中生長至90-100％匯片時，裂解細胞，按常規提取基因組DNA。用PstⅠ完全酶切基因組DNA后，按Southern法轉移至帶正電荷的尼龍膜上，以[α-32P]-dCTP標記的EYFP/HindⅢ-NotⅠ片段DNA作雜交探針，以野生型、轉導空載rAAV和脂質體法轉染pEYFPCMV的細胞作對照。
結果Southern雜交表明EYFP基因經pAEYFP轉導整合入了COS 7細胞基因組，而經質粒pEYFPCMV介導的EYFP基因轉移未能整合入COS-7細胞基因組。(2)．EYFP在COS 7細胞的表達分別在轉導或轉染后48小時以及G418篩選后，用激光共聚焦顯微鏡(Meridian公司，型號Ultima212)觀察COS 7細胞黃色熒光發光情況，以判斷EYFP基因在COS 7細胞的表達。
結果在轉導EYFP基因48小時后，部分COS 7細胞呈現黃色熒光，表明EYFP基因成功轉導并獲得表達。經G418篩選后，COS 7細胞均呈黃色熒光，陽性率為100％。用作陽性對照的、經脂質體轉染的pEYFPCMV中的EYFP基因在COS 7細胞也獲得表達。6．pAEYFP感染B細胞的頻率
SKW6(ATCC TIB 215)和3D5細胞(參見朱立平等，一個對B細胞生長因子(BCGF)有特異反應的人B細胞株(3D5)的建立，中華微生物學和免疫學雜志，1989,9:284)是EB病毒轉化的B細胞。包裝后的pAEYFP分別感染SKW6細胞和3D5細胞1小時，繼續培養48小時。以野生型細胞作為陰性對照，用流式細胞儀(Coulter公司，型號ETICS ELITE ESP)檢查表達黃熒光的細胞。
結果SKW6細胞的感染率為64±3.5％(個細胞)，3D5細胞的感染率為58±6.2(個細胞)。實施例三、pAGX(+)轉導6A8-甘露糖苷酶基因1．含正義6A8 DNA片段和反義6A8 DNA片段的pAGX(+)的構建含6A8 cDNA 3’端1 358 bp的正義6A8 DNA或反義6A8 DNA片段的重組質粒pRc/CMV的構建過程參見Li B.,et al.Cloning,expression andcharacterization of a cDNA(6A8)encoding a new human α-mannosidase.Europ.J.Biochem.2000,276:7176-7182。用限制性內切酶HindⅢ/XbaⅠ分別從含正義6A8 DNA和反義6A8 DNA的重組質粒pRc/CMV中酶切，并行膠回收含1358bp的正義和反義6A8 DNA片段，插入pAGX(+)載體的HindⅢ-XbaⅠ位點。獲得的含正義6A8 DNA或反義6A8 DNA的重組AAV載體pAGX(+)，分別命名為pAGX(+)-正義6A8 DNA及pAGX(+)-反義6A8 DNA。用EcoRⅠ和HindⅢ/XbaⅠ酶切鑒定正義或反義6A8 DNA片段是否插入。用PstⅠ和ApaⅠ酶切鑒定6A8 DNA片段在AAV載體pAGX(+)中的插入方向。
結果用EcoRⅠ酶切后，pAGX(+)-正義6A8 DNA和pAGX(+)-反義6A8 DNA均產生804bp、1358bp和6284bp的片段；用HindⅢ/XbaⅠ酶切后，二者均產生1394bp和7052bp的片段。該結果說明目的片段后插入了重組載體，因為未插入目的基因的pAGX(+)經EcoRⅠ酶切應產生804bp和6342bp的片段，經HindⅢ/XbaⅠ酶切則應產生94bp和7052bp的片段。
將PstⅠ酶切后產生595bp、756bp、1347bp和5748bp的重組載體作為pAGX(+)-正義6A8 DNA,ApaⅠ酶切后其產生616bp、733bp和7097bp的片段；將PstⅠ酶切后產生130bp、595bp、1347bp和6374bp的重組載體作為pAGX(+)-反義6A8 DNA,ApaⅠ酶切后，其產生89bp、616bp和7741bp的片段。2．pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA的包裝和拯救12.5μg的pAGX(+)、pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA分別與12.5μg的輔助質粒pAAV/Ad用磷酸鈣共沉淀法共轉染293細胞，并在野生型腺病毒Ad5輔助下拯救重組載體(rAAV)，以pRc/CMV-正義6A8 DNA替代rAAV作包裝的陰性對照組。分別從293細胞沉淀中得到空載、含正義6A8DNA、含反義6A8 DNA的rAAV顆粒(rAAV儲存液)，于-20℃儲存備用。分別從100μl rAAV儲存液和2ml細胞培養上清中分離到低分子量DNA，用限制性內切酶DpnⅠ和EcoRⅠ完全酶切后，進行Southern雜交，用[α-32P]-dCTP標記的6A8 DNA作探針。
結果從pAGX(+)-正義6A8 DNA和pAGX(+)-反義6A8 DNA儲存液中探測到單體和雙體兩種形式的DNA雜交帶。而陰性對照組的細胞裂解液中未見雜交帶。上述結果證明pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA拯救成功。3．pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA復制滴度的測定從25μl rAAV儲存液和1ml細胞培養上清中分離得到的DNA，經限制性內切酶DpnⅠ完全酶切后，以兩倍梯度連續稀釋行狹縫點膜，并用50ng、25ng、12.5ng和6.25ng的pAGX(+)-正義6A8 DNA作標準品，用[α-32P]-dCTP標記的6A8 DNA探針雜交，對照標準品的雜交強度計算rAAV的復制滴度。
結果狹縫雜交(圖片未顯示)從陰性對照組(pRc/CMV-正義6A8 DNA包裝組)細胞沉淀裂解液中未探測到6A8 DNA雜交信號，說明其中不存在rAAV顆粒。從pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA細胞沉淀的裂解液中可探測到6A8 DNA雜交信號。而從正義和反義6A8 DNA包裝組培養上清中分離的DNA經DpnⅠ酶切后，雜交信號很弱，表明重組AAV未釋放。對照標準品計算復制滴度的結果見表3。
表3 pAGX(+)-正義6A8 DNA和pAGX(+)-反義6A8 DNA的復制滴度實驗分組復制滴度(×1011病毒顆粒/ml)實驗1實驗2平均值陰性對照組---pAGX(+)空載體 ---pAGX(+)-正義6A8 DNA2.04 3.86 2.95pAGX(+)-反義6A8 DNA4.8010.02 7.414．pAGX(+)-正義6A8 DNA、pAGX(+)-反義6A8 DNA轉導淋巴細胞SKW 6細胞、3D5細胞是EB病毒轉化的B細胞，BJAB是Burkitt淋巴瘤細胞株，其表面標志為CD19+CD3-CD4-CD8-。
用100μl rAAV儲存液重懸1×106的細胞(MOI約10)，并用等體積包裝陰性對照組的細胞裂解液作對照。于37℃作用1小時，再加入含10％的FCS和抗生素的RPMI 1640完全培養液，24小時后，更換為新鮮的RPMI 1640完全培養液，繼續培養24至48小時，然后加入G418進行篩選，G418終濃度分別為SKW 6和3D5細胞600μg/ml,BJAB細胞800μg/ml。篩選至陰性對照組細胞全部死亡后7至10天為止，存活細胞即為轉導成功的細胞。采用有限稀釋法進行轉導細胞的克隆。即將細胞稀釋為5個/ml，于96孔細胞培養板中每孔加入200μl稀釋的細胞懸液進行克隆，視細胞生長情況更換部分完全培養液。5．Northern雜交檢測轉導的正義和反義6A8 DNA片段的表達收獲生長良好的細胞(5×106細胞/ml)，按照TRIZOL試劑盒(GIBCO公司)說明書提取細胞總RNA，并行電泳檢查RNA質量。按常規轉移RNA于尼龍膜上，用[α-32P]-dCTP標記的6A8 DNA探針探測6A8 DNA的表達。并以[α-32P]-dCTP標記的β-actin DNA為探針雜交作對照。
結果在轉導了正義和反義6A8 DNA的SKW6細胞、3D5細胞克隆株中檢測到長度約1.5kb的轉導基因的轉錄本，但在不同的克隆株中表達水平不同。BJAB細胞在轉導了反義6A8 DNA后于克隆中死亡，但從轉導了正義6A8 DNA的BJAB細胞和未經克隆的、轉導了反義6A8 DNA的BJAB細胞中亦檢測到到長約1.5kb的轉導基因的轉錄本。6．基因組PCR檢測新霉素抗性基因(neoR)在宿主細胞的整合按照《分子克隆實驗指南(第二版)》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，1996，科學出版社出版)描述的方法從細胞內提取基因組DNA作為PCR反應的模板。
neoR的上游引物為5’TTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGG 3’；neoR的下游引物為5’AAAGCGGCCATTTTCCACCAT 3’。
反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃,45秒→58℃,45秒→72℃90秒，30個循環；循環結束后72℃延伸5分鐘。
結果如圖3所示，在轉導了空載、正義、或反義6A8 DNA的細胞中都檢測到明顯的neoRmRNA表達，而在野生型細胞則未見neoRmRNA表達。7．RT-PCR檢測轉導的6A8 cDNA片段在細胞內的轉錄以5×105細胞(已傳代培養24個月)來源的細胞總RNA作模板，用無RNA酶H的SuperScriptTMⅡ逆轉錄酶逆轉錄合成cDNA第一鏈，然后加RNA酶H去除RNA。在50μl反應體系中，分別用1μl經不同稀釋度稀釋的逆轉錄產物作模板，行PCR反應。為檢測6A8 cDNA 3’端mRNA(1358bp)的表達，以甘油醛3磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA的表達作為內參照。
6A8 3’端上游引物5’CCCTGGAAGCGGATCGAAGTGATG 3’；6A8 3’端下游引物5’GGTCGCTCCAAGAGAGATCGCAGAGG 3’。
GAPDH cDNA的上游引物為5’CCATGGAG從GGCTGGG 3’；GAPDH cDNA的下游引物為5’C從AGTTGTCATGGATGACC 3’。
反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃,45秒→58℃,60℃,45秒→72℃90秒，30個循環；循環結束后72℃延伸5分鐘。
結果如圖4所示，轉導正義6A8 DNA的4個克隆株和轉導反義6A8 DNA的5個克隆株中6A8基因的表達量明顯增加。8．正義和反義6A8 cDNA片段的轉導對EB病毒轉化的細胞中6A8α-甘露糖苷酶的影響(1)．6A8α-甘露糖苷酶活性的檢測細胞研磨成勻漿，用α-甘露糖苷酶底物對-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙(pnitro-phenyl-α-D-mannopyranoside)測定細胞勻漿上清中的酶活性。α-甘露糖苷酶降解對-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙后產生對-硝基酚，測定細胞勻漿在410nm的光吸收。設野生型細胞勻漿上清中α-甘露糖苷酶的活性為1。
結果見表4，轉導了反義6A8 cDNA片段的B-LCL中，6A8α-甘露糖苷酶的活性明顯降低。表4 B-LCL細胞中6A8α-甘露糖苷酶的活性測定底物(對-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙)細胞 SKW6胞 3D5胞野生型 1.0 1.0轉導空載體1.0±0.08 1.10±0.07轉導rAAV-正義6A8 cDNA片段 1.14±0.2 0.92±0.14轉導rAAV-正義6A8 cDNA片段 0.56±0.17 0.67±0.21(2)．Con A結合試驗-6A8α-甘露糖苷酶基因表達的檢測細胞(已傳代培養24個月)經PBS洗滌三次后，鋪于載玻片上，晾干，用4％多聚甲醛于室溫固定15mim,PBS沖洗三遍，晾干，加0.1％Triton X-100/0.1％枸櫞酸鈉溶液于4℃作用2mim，用PBS淋洗三遍后晾干。滴加用0.5％BSA-PBS溶液稀釋的終濃度為20μg/ml的FITC-Con A(異硫氰酸熒光素標記的刀豆蛋白A,Sigma公司)20μl，于37℃溫育30mim,PBS淋洗三遍后，用50％甘油封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色強度。
結果如圖5所示，轉導空載pAGX(+)的SKW 6和3D5細胞的FITC-Con A染色強度與野生型細胞無明顯差異；轉導pAGX(+)-正義6A8 DNA的SKW 6和BJAB細胞的FITC-Con A染色強度的變化不大；轉導pAGX(+)-反義6A8 DNA的SKW 6和BJAB細胞的FITC-Con A染色強度明顯升高。
由于α-甘露糖苷酶的作用是修剪糖蛋白中的甘露糖，而糖蛋白中高甘露糖型聚糖上的甘露糖是Con A的受體。Con A結合實驗可以檢測正義和反義6A8DNA的轉導對6A8α-甘露糖苷酶基因的影響。實驗結果說明反義6A8 DNA的轉錄產物能與6A8α-甘露糖苷酶mRNA互補形成雙鏈，因而阻斷6A8基因的翻譯，并引起糖蛋白上甘露糖修剪減少，導致Con A結合升高。7．pAGX(+)-反義6A8 DNA片段對細胞凋亡的影響(1)．Giemsa染色細胞用PBS洗滌3次后鋪于載玻片上，晾干，用醋酸-甲醇(1∶3)固定30分鐘，PBS淋洗3次,晾干后用1∶10稀釋的Giemsa染液于室溫染色20min,PBS淋洗3次，然后用樹脂封片，于光學顯微鏡下觀察。(2)．Annexin-V熒光染色取20μL Annexin-V試劑(德國羅氏公司)和20μL碘化丙啶(PI)儲存液，用1ml Hepes緩沖液稀釋，制成為染色工作液。1×106個細胞經PBS離心洗滌一次后，用100μL染色工作液重懸，于室溫染色15min，然后用流式細胞儀分析細胞染色情況。(3)．梯形DNA的提取和電泳取1×106的細胞，用TBS(pH7.4)洗滌2次后，用400μL裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA(pH8.0)、0.5％SDS、50μg/ml蛋白酶K)裂解細胞，于37℃溫浴2小時。樣品于室溫14000轉/分離心10分鐘，棄沉淀，上清用酚-氯仿(1∶1)-酚-氯仿-異丙醇(25∶24∶1)-氯仿抽提。上清中加入1/5體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和兩倍體積的無水乙醇，混勻后置-20℃過夜。于-4℃12,000轉/分離心15分鐘，棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀，然后于-4℃12,000轉/分離心15分鐘，棄乙醇，晾干，用22μL TE(pH8.0)溶解DNA沉淀物，再加入2μl的RNA酶A，于37℃溫浴1小時，加6μl加樣緩沖液后，加樣于2％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察梯形DNA的有無。100bp梯形DNA分子量標準為鼎國生物技術公司產品。
結果Giemsa染色經抗Fas抗體誘導24小時的細胞，觀察細胞形態以確定凋亡情況。轉導了pAGX(+)-反義6A8 cDNA的5個克隆細胞株中的凋亡細胞數與未經抗Fas抗體誘導的細胞株無明顯差異，而野生型細胞和轉導了空載pAGX(+)的3個克隆細胞株凋亡細胞數明顯增多。
經Annexin-V熒光染色，測得未經抗Fas抗體誘導的SKW 6野生型細胞的陽性染色陽性率為4.8％；經抗Fas抗體誘導24小時的SKW 6野生型細胞染色陽性率為72.6％。誘導后，轉導了空載pAGX(+)的3個克隆細胞株之間染色陽性率無明顯差異(80.1％、75％和78.4％)，相對于野生型細胞亦無明顯差異；而在轉導了pAGX(+)-反義6A8 cDNA的5個克隆細胞株中，有4個克隆的染色陽性率(48.9％、44.6％、52.8％和41.5％)明顯降低，僅1個克隆的染色陽性率降低較少(70.3％)。
從圖6可見，轉導了空載rAAV的克隆細胞株(圖5:2-4)產生梯形DNA的情況與野生型細胞(圖5:1)基本無差異，而轉導了rAAV-反義6A8 DNA的5個克隆細胞株中(圖5:5-9)，除克隆7在誘導36h時出現微弱的梯形DNA外，均未出現明顯梯形DNA。實施例四、pAGX(+)轉導人淋巴細胞膜相關抗原5D4基因1．含反義5D4 cDNA片段的pAGX(+)的構建5D4 cDNA(馬鳳蓉等，編碼人分化抗原5D4的全長cDNA克隆及其編碼蛋白質的二級結構分析，中國科學(C輯)，1999年，29卷，第6期，615-620)是人淋巴細胞膜相關抗原(GenBank注冊號AF043290)。PCR擴增得到413bp的5D4 cDNA的反義片段(包含5D4 cDNA的第88-484位核苷酸)。上游引物(5’-CGGGGCCCATGAAGCAGAACCTCCCAGAA-3’)帶有ApaⅠ酶切位點，下游引物(5’-CGAAGCTTCCAGCATAAGAAGCAAACCAT-3’)帶有HindⅢ酶切位點。擴增后的5D4cDNA反義片段經限制性內切酶ApaⅠ和HindⅢ酶切，插入pAGX(+)的ApaⅠ-HindⅢ位點。獲得pAGX(+)-反義5D4 DNA。
同時，用BamHⅠ和SalⅠ酶切5D4 cDNA，插入pRc/CMV的BamHⅠ-SalⅠ的位點構建pRc/CMV-5D4 DNA，作為pAGX(+)-反義5D4 DNA的陰性對照。2．pAGX(+)-反義5D4 DNA的包裝和拯救分別用12.5μg的pAGX(+)、pAGX(+)-反義5D4 DNA與12.5μg的輔助質粒pAAV/Ad用磷酸鈣共沉淀法共轉染293細胞，并在野生型腺病毒Ad5輔助下拯救rAAV，以pRc/CMV-5D4 DNA作包裝的陰性對照組。分別從293細胞沉淀中得到空載、含反義5D4 DNA片段的rAAV顆粒(rAAV儲存液)，于-20℃儲存備用。分別從100μl rAAV儲存液和2ml細胞培養上清中分離到低分子量DNA，用限制性內切酶DpnⅠ和EcoRⅠ完全酶切后，進行Southern雜交，用[α-32P]-dCTP標記的5D4 DNA作探針。結果從pAGX(+)-反義5D4 DNA儲存液中探測到單體和雙體兩種形式的DNA雜交帶，而陰性對照組的細胞裂解液中未見雜交帶。該結果說明pAGX(+)-反義5D4 DNA拯救成功。3．pAGX(+)-反義5D4 DNA復制滴度的測定從25μl rAAV儲存液和1ml細胞培養上清中分離得到的低分子量DNA，經限制性內切酶DpnⅠ完全酶切后，以兩倍梯度連續稀釋行狹縫點膜，并用50ng、25ng、12.5ng和6.25ng的pAGX(+)-5D4 DNA作標準品，用[α-32P]-dCTP標記的6A8 DNA探針雜交，對照標準品的雜交強度計算rAAV的復制滴度。結果兩次包裝的復制滴度分別為1.82×1011顆粒/ml和0.70×1011顆粒/ml，平均值為1.26×1011顆粒/ml。4．pAGX(+)-反義5D4 DNA轉導B-LCL用100μl rAAV儲存液重懸1×106的SKW 6和3D5細胞(MOI約10)，并用等體積包裝陰性對照組的細胞裂解液作對照。于37℃作用1小時，再加入含10％的FCS和抗生素的RPMI 1640完全培養液，24小時后，更換為新鮮的RPMI 1640完全培養液，繼續培養24至48小時，然后加入終濃度為600μg/ml的G418進行篩選。篩選至陰性對照組細胞全部死亡后7至10天為止，存活細胞即為轉導成功的細胞。采用有限稀釋法進行轉導細胞的克隆。即將細胞稀釋為5個/ml，于96孔細胞培養板中每孔加入200μl稀釋的細胞懸液進行克隆，視細胞生長情況更換部分完全培養液。5．反義5D4 DNA片段的轉導對B-LCL中5D4蛋白的影響從原核表達系統獲得的5D4蛋白經純化后免疫小鼠，制得5D4單克隆抗體。先用5D4單克隆抗體染色細胞(已傳代培養12個月)，再用FITC標記的羊抗鼠免疫球蛋白染色細胞，用流式細胞儀檢測熒光強度。以小鼠IgG1作為陰性對照。
結果相對野生型細胞而言，反義5D4 DNA片段轉導后，SKW6和3D5細胞內的5D4單克隆抗體熒光染色強度明顯降低。說明反義5D4 DNA片段轉導后，抑制了細胞內5D4蛋白的表達。
應當指明的是，本發明并不限于上述具體的實施例，實施例僅是用于更清楚地說明本發明。事實上，根據本文的描述和有關附圖，本領域的技術人員可以作出某些改變。這些改變應視作顯而易見的，功能上等同的方法和物質已經包含在本發明的范圍內。
權利要求
1．一種腺相關病毒載體pAGX，所述載體為7146bp的閉環質粒，其包含質粒pSub201的末端反轉重復序列和質粒pRc/CMV的CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因。
2．權利要求1所述的腺相關病毒載體，其中所述載體為pAGX(+)。
3．權利要求1所述的腺相關病毒載體，其中所述載體為pAGX(-)
4．權利要求1-3任一項所述的腺相關病毒載體，其中載體上可用于克隆的限制性內切酶位點包括HindⅢ、BstⅪ、NotⅠ、XbaⅠ和ApaⅠ。
5．權利要求1所述載體的制備方法，方法包括A．用HindⅢ和XbaⅠ酶切質粒pSub201，回收含有末端反轉重復序列的片段；B．用NruⅠ和SalⅠ酶切質粒pRc/CMV，回收含有CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因的片段；C．回收的片段經Klenow酶補平，藉DNA連接酶進行連接；D．連接后的產物轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆。
6．權利要求5所述的方法，其中酶切后的片段經凝膠純化并回收。
7．權利要求5所述的方法，其中補平的片段經去磷酸化處理，藉T4 DNA連接酶進行連接。
8．權利要求1所述的載體在介導目的基因轉入真核動物細胞中的用途，包括A．將目的基因插入腺相關病毒載體的多克隆位點；B．在宿主細胞內包裝并拯救帶有目的基因的重組腺相關病毒載體；C．包裝后的重組腺相關病毒載體轉導真核動物細胞。
9．權利要求8所述的用途，其中包裝是通過磷酸鈣沉淀法，用輔助質粒pAAV/Ad與帶有目的基因的重組腺相關病毒載體共同轉染293細胞實現的。
10．權利要求8所述的用途，其中拯救是通過在共同轉染過程中加入野生型腺病毒Ad5實現的。
11．權利要求8所述的用途，其中的真核動物細胞是哺乳動物細胞。
12．權利要求11所述的用途，其中的真核動物細胞是EB病毒轉化的B細胞。
13．權利要求1所述的載體在建立體外細胞模型中的用途。
14．權利要求13所述的用途，其中的細胞是哺乳動物細胞。
15．權利要求13所述的用途，其中的細胞是EB病毒轉化的B細胞。
全文摘要
本發明公開了一種腺相關病毒載體,該載體為7146bp的閉環質粒,其包含質粒pSub201的末端反轉重復序列和質粒pRc/CMV的CMV啟動子、多克隆位點、新霉素抗性基因。本發明還公開了用DNA重組技術制備腺相關病毒載體的方法以及這種載體在介導基因轉移、建立體外細胞模型等方面的用途。經本發明的載體轉入的基因可以在宿主細胞內長期穩定表達。
文檔編號C12N7/01GK1322840SQ0111884
公開日2001年11月21日 申請日期2001年6月20日 優先權日2001年6月20日
發明者朱立平, 史耕先, 劉音, 趙方萄 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所