專利名稱：基于四氮唑化合物的診斷的制作方法
技術領域：
本發明是1999年3月30日申請的共同待審的美國申請序號09/282083的繼續申請，該共同待審的申請是美國申請序號為09/161876(申請日1998年9月28日)的繼續申請，是現在的美國專利US5902731。
本發明涉及允許在含血紅蛋白的生物流體中測量分析物濃度的診斷組合物。該組合物基于四氮唑染料前體并涉及抑制血紅蛋白誘導的它們的還原。
脂肪組織是人體中能量貯存最豐富的形式之一。它釋放貯存的脂肪酸進入主要由肝代謝的循環系統。在該過程中，脂肪被消耗，能量被釋放，被人體加以利用。通常，消耗很少的脂肪，脂肪酸完全代謝為二氧化碳和水，該轉化不會打亂身體的敏感的pH平衡。然而，如果身體中的碳水化合物的量不充足，例如由于飲食，那么脂肪消耗和脂肪酸的產生可增加至潛在危害的水平。除了飲食外，依賴胰島素的病人由于它們的碳水化合物的代謝不足而易受到傷害。當使用過量的脂肪酸以提供身體的能量需求時，會產生大量的乙酰乙酸鹽、丙酮和β-羥丁酸鹽。這些中間產物稱為酮體，疾病是已知的酮酸中毒。
酮體通常由身體再循環為其它形式，只要它不是令人無法忍受的。因此，健康的人積聚了可忽略量的這些分析物。當大量的脂肪在相對短的時間被代謝或當大部分的能量來自脂肪時，產生大量的酮體。如果不立刻校正的話，這些脂肪代謝物的過量產生導致一定的神經性紊亂。
酮體存在于血中，并且如果超過閾值，則通過尿排泄。通過先進的臨床分析儀器可容易地檢測它們。β-羥丁酸鹽、乙酰乙酸鹽和丙酮的百分率分別平均為78％、20％和2％。由于其相對低的濃度和高揮發性，所以丙酮很少被檢測到。但是，通過硝普鹽反應可定量確定乙酰乙酸鹽，用酶法定量β-羥丁酸鹽。利用乙酰乙酸鹽試驗條已經數十年。它們基于硝普鹽離子和醛以及酮的偶合反應。讓堿性尿樣或血清樣品和硝普鹽反應幾分鐘，形成紫色。顏色的強度表明乙酰乙酸鹽濃度。但是，丙酮干擾該試驗，導致較高的讀數。另外，當病人從酮酸中毒恢復時，尿中和血中的乙酰乙酸鹽含量增加，因此使診斷困難。
β-羥丁酸鹽試驗對于控制酮體濃度更有用。它基于β-羥丁酸鹽和相應的脫氫酶在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)輔因子存在下的氧化反應。(嚴格地說，僅D-β-羥丁酸鹽天然存在和被氧化，但為了簡潔，在整個說明書和所附的權利要求書中，我們省略了“D”。)氧化時，產生NADH，用UV分光光度計直接測量其濃度。因此，在光譜中相應的信號改變和分析物的濃度成比例。不幸的是，在UV區域中發生NADH激發；因此該檢測方式僅適合于實驗室儀器。另一個控制β-羥丁酸鹽的方法是用四氮唑化合物氧化NADH。
四氮唑化合物一般對強堿和光很敏感。因此，需特別注意保證這些化合物的完整性。然而，四氮唑化合物在研究組織代謝中起著重要的作用。例如，該類化合物已用于探測細胞中不需氧氧化和還原反應。另外，它們一般用于臨床診斷。該類化合物典型地是在還原劑存在下進行還原反應以得到高度著色的甲的淺顏色或無色化合物。還原劑例如抗壞血酸鹽、巰基化合物或NADH、NADPH、PQQH2(還原的PQQ-吡咯并喹啉醌)、FMNH2(還原的FMN-黃素單核苷酸)和EADH2(還原的FAD-黃素腺嘌呤二核苷酸)的變體能夠形成染料。
在臨床診斷中，已發現這些染料在厭氧反應中對監測由它們的母化合物NAD(P)+形成NAD(P)H是非常有價值的。(參見，例如US5360595,1994年11月1日授予D.Bell等人。)氧化還原反應很快，對氧不敏感。得到的染料顏色很強烈，具有低的水溶性。
一般來說，可使用四氮唑染料前體測量全血中的酮體和葡萄糖。但是，如果血紅蛋白不含在血的紅細胞中，則可通過血紅蛋白(Fe(Ⅱ))非酶還原四氮唑形成有色的甲。因此，游離的血紅蛋白會嚴重干擾檢測。事實上，由于溶血和產生相對于目的分析物大量的游離血紅蛋白，因此，在典型的酮體測量中，來自血紅蛋白的干擾信號會超過目的信號。相反，葡萄糖的測量，特別是在正常濃度或超過正常濃度時，則不受影響。當在高血細胞比容樣品中或在較高溫度下進行該反應時，血紅蛋白氧化反應較快，同樣嚴重干擾葡萄糖的測量。既然不易避免造成游離血紅蛋白存在的紅細胞的溶血，所以，如果用四氮唑分析，則必須在試驗前從樣品中除去紅細胞。
通過用膜和過濾器過濾、化學試劑捕集或這兩種方法的結合，從樣品中除去紅細胞。從全血中分離紅細胞的過濾方法昂貴，需要相當大的樣品容積。使用過濾以從全血樣品除去紅細胞的血酮(β-羥丁酸鹽)試驗的實例是從GDSDiagnostics,Elkhart,IN得到的KetoSite試驗。(參見由C.Burtis等人編輯的TietzTextbook of Clinical Chemistry,2ndEd.,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,PA,1994，第974頁)用在那個試驗中的“試驗卡”具有兩個過濾層，使得卡相當昂貴和需要大量的(25μL)的血樣品。另外，該血必須沒有發生溶血。
過濾和化學捕集的結合用于得自Miles的AmesGlucometer EncoreTM血糖條中。該條利用過濾材料層和凝集助劑(土豆凝集素)以從紅細胞中除去干擾。(參見Chu等人的歐洲專利申請0638805A2,1995年2月15日公開)系統中引進氧化劑以氧化血紅蛋白形成高鐵血紅蛋白是降低血紅蛋白干擾的另一種方式。盡管已知高鐵氰化物將血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白，但它們也破壞所需產品即NADH。
Palmer等人的EPO0330517B2(公開于1989年8月30日)公開了一種測量生物化學分析物的方法，包括分析物和能夠具有電子轉移酶活性的氧化酶反應以產生還原的酶。比色法分析該酶以確定分析物濃度。該酶反應是不依賴氧的。
Freitag等人的WO94/01544(公開于1994年1月20日)公開了一種用于分析物分析的穩定的試劑。該試劑包括酶、吩嗪衍生物、四氮唑鹽和二價金屬鹽以穩定該試劑。
Storhoff等人的WO94/01578(公開于1994年1月20日)也公開了一種用于分析物分析的穩定的試劑。該試劑包括酶、介質、四氮唑鹽和穩定該試劑的氧化劑。
本發明提供一種在含血紅蛋白的生物流體中測量分析物濃度的試劑。該試劑包括a)具有與之結合的黃素和對分析物具有特異性的依賴黃素的酶，b)四氮唑染料前體，c)電子轉移劑，和d)亞硝酸鹽。
在本發明的另一個實施方案中，該試劑包括a)對分析物具有特異性的和沒有與之相結合的黃素的依賴黃素的酶，b)黃素單核苷酸(FMN)或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，
c)四氮唑染料前體，d)電子轉移劑，和e)亞硝酸鹽。
該試劑特別適合于在一個或多個底物上涂敷以形成干的試劑條，用于測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度。特別優選的試劑條包括a)載體層，b)在載體層上的具有涂層的墊片，包括ⅰ)具有與之結合的黃素和對分析物具有特異性的依賴黃素的酶，ⅱ)四氮唑染料前體，和ⅲ)電子轉移劑，和c)在試驗墊片上的用亞硝酸鹽涂敷的吸濕頂層。
本發明的另一種條包括a)載體層，b)在載體層上的具有涂層的墊片，包括ⅰ)對分析物具有特異性的和沒有與之相結合的黃素的依賴黃素的酶，ⅱ)FMN或FAD，ⅲ)四氮唑染料前體，ⅳ)電子轉移劑，和c)在試驗墊片上的用亞硝酸鹽涂敷的吸濕頂層。
圖1是本發明的試驗條的透視圖。
圖2是本發明另一種試驗條的分解圖。
圖3是本發明再一種試驗條的分解圖。
圖4是本發明的葡萄糖分析的化學圖示。
圖5是顯示亞硝酸鹽作為血紅蛋白抑制劑在雙層分析上的效果圖。
圖6是顯示亞硝酸鹽作為血紅蛋白抑制劑在單層葡萄糖分析上的效果圖。
本發明通過產生還原形式的輔因子如NADH、NAD(P)H、PQQH2、FMNH2或EADH2，提供了一種測量含血紅蛋白的生物流體(如全血)中的分析物濃度的試劑，所述輔因子是分析物濃度的量度。試劑中包含的亞硝酸鹽克服了血紅蛋白對測量還原輔因子濃度的干擾。對測量但不限于酮體和葡萄糖特別有用。
圖1描述了本發明的典型試驗條10，它由附著在載體14上的試驗墊片12組成。載體是塑料的，例如聚苯乙烯、尼龍或聚酯或金屬片或任何其它本領域公知的適合材料。用試劑涂敷該試驗墊片，該試劑和分析物反應產生顏色變化該試驗墊片優選包括吸濕材料，例如濾紙或聚合物膜，但是，由于反應不需要氧氣，所以該試驗墊片可以是非吸濕材料例如塑料膜。試劑包括對分析物有特異性的酶，氫陰離子轉移劑，四氮唑染料前體，適當的酶輔因子和血紅蛋白抑制劑。為了較高的穩定性，任選還包括緩沖劑和穩定劑。
如圖2所示，試驗條也可以是多層結構，上層16覆蓋在試驗墊片12上。在該結構中，試劑被分為2層。例如，血紅蛋白抑制劑可以涂敷在任選的上層16上，剩余的試劑涂敷在試驗墊片12上。優選上層16是吸濕性的，并用作擴散層和吸附層以吸附過量的樣品。樣品被涂敷在上層16，它通過而達到試驗墊片12。通過測量整個載體層14上的顏色改變，或如果層14鄰接反應區處是不透明的，通過任選的窗口或通過孔18，確定分析物濃度。
在圖3所示的另一個實施方案中，間隔20分開了上層16和試驗墊片12。間隔20優選是非吸濕的塑料膜，在其兩面具有黏附層(未示出)。間隔20中的通道22給樣品提供了毛細路徑以從開口24流至測量區26。流動取決于試驗墊片12的表面和鄰接層之間的排氣口，或者選擇性的孔18。通過選擇性的孔/窗口18監測測量區域26中的顏色改變。試劑可以都在試驗墊片12上，或在試驗墊片和非吸濕層14和16之一或兩者之間分配。因此，試劑的第一部分在試驗墊片上，試劑的第二部分在非吸濕層之一上或兩層都有。當我們稱試劑為“涂層”和“在”層上時，我們意在包括試劑將被吸附進層內的可能性，特別是如果該層是吸濕性的。
所有依賴黃素的酶適合于本發明的分析。適合的氧化酶和它們相應的分析物包括醇的醇氧化酶，葡萄糖的葡萄糖氧化酶，半乳糖的半乳糖氧化酶，膽固醇的膽固醇氧化酶，L-乳酸鹽的L-乳酸鹽氧化酶，尿酸的尿酸鹽氧化酶，膽紅素的膽紅素氧化酶，膽堿的膽堿氧化酶。適合的脫氫酶和相應的分析物包括丙酮酸鹽的丙酮酸脫氫酶，D-乳酸的D-乳酸脫氫酶和琥珀酸的琥珀酸脫氫酶。
當不和酶結合時，必須添加輔因子以活化該酶。可以添加到依賴黃素的酶中的輔因子包括黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(EAD)。在酶的存在下，分析物還原了輔因子。
染料形成方法中的下一步是通過電子轉移劑從還原的輔因子吸取氫陰離子(hydride)。適合的電子轉移劑包括黃遞酶例如硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP-還原酶和脂酰胺脫氫酶。當使用黃素輔因子時，更優選是非酶電子轉移劑，例如吩嗪硫酸甲酯(PMS)、吩嗪硫酸乙酯(PES)、1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯或Meldola Blue。反應動力學和穩定性是選擇電子轉移劑或“氫陰離子吸取劑(hydride abstractor)”的主要因素。例如PMS是通用的氫陰離子吸取劑，因為它和下列的大多數四氮唑化合物具有相對快的反應動力學。因此，當輔因子是PQQ時，優選PMS。但是PMS比酶基的氫陰離子吸取劑對光更敏感。為此，當輔因子是NAD時，黃遞酶更穩定，且是優選的。
被捕獲的氫陰離子轉移至四氮唑化合物(染料前體)，形成有色的甲。最適合該裝置的四氮唑化合物是2-(2＇-苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4′-鄰苯二甲酰肼基)四氮唑(BSPT)、2-苯并噻唑基-(2)-3,5-二苯基四氮唑(BTDP)、2,3-二(4-硝基苯基)四氮唑(DNP)、2,5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四氮唑(DPSP)、二苯乙烯基氮藍四唑(DSNBT)、3,3＇-[3,3′-二甲氧基-(1,1′-聯苯基)-4,4＇-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基(-2H)四氮唑(NBT)、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H四氮唑(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基四氮唑(PCPM)、四氮唑藍(TB)、硫代氨基甲酰氮藍四唑(TCNBT)、四氮藍四唑(TNBT)、四氮唑紫(TV)、2-苯并噻唑噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四氮唑(WST-4)和2,2′-二苯并噻唑基-5,5′-雙[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3＇-(3,3′-二甲氧基-4,4′-亞聯苯基)二四氮唑二鈉鹽(WST-5)。優選使用水溶性染料前體，更優選WST-5，以便和生物樣品相容。另外，當使用WST-5時，得到的甲化合物在紫-藍區域顯示出強的光譜吸收，因此降低了對來自血紅蛋白的背景信號的校正的需求。
最后，血紅蛋白抑制劑存在于試劑中以消減血紅蛋白和四氮唑化合物之間的不希望的染料形成反應。血紅蛋白抑制劑的作用是氧化血紅蛋白為不與四氮唑或甲反應的高鐵血紅蛋白。令人驚奇地是，亞硝酸鹽，例如亞硝酸鈉、亞硝酸鉀和它們的衍生物在抑制血紅蛋白方面是非常有效的，而不會破壞還原的輔因子(例如NADH、PQQH2、FMNH2或FADH2)。亞硝酸鹽在高溫和血細胞比容樣品下同樣是有效的。優選亞硝酸鈉，因為它具有高的水溶性，無毒和相對便宜。
選擇性地，該試劑還包括穩定劑，例如二價金屬鹽。
盡管本發明的試劑以濕的化學模式使用，例如在優選的實施方案中在比色杯中，但本發明提供了在全血中分析β-羥丁酸鹽或葡萄糖的干條。該條可以是單層的或兩層的。兩層條由膜試驗墊片組成，該墊片優選是尼龍制成的，放在載體和上層之間。載體優選是由聚酯構成。上層可以是網眼的或任何本領域公知的吸收材料。優選的材料是用甲基油酰基牛磺酸鈉處理的多孔聚乙烯(購自Fairburn,GA的Porex公司)。我們稱該材料為“Porex”。優選該試驗墊片具有正電荷表面。更優選，該試驗墊片是聚酰胺。試驗墊片含有包含葡萄糖氧化酶(包括黃素輔因子)、PMS(或其同系物的一種)和WST-5的試劑(下面的表1)。Porex上層含有亞硝酸鹽試劑(表2)。
在單層條中，省略了Porex層，包括亞硝酸鹽的整個試劑(表3)涂在試驗墊片上。注意到在兩層條和單層條中，可以使用黃素與之結合的依賴黃素的酶或沒有黃素與之結合的依賴黃素的酶。在后一情況下，添加黃素輔因子(例如FMN或FAD)。
在操作中，使用者將一滴全血涂在Porex上層的上表面。當全血或溶解的血和Porex接觸時，亞硝酸鈉被復制并和可利用的游離血紅蛋白反應，因此使得血紅蛋白對分析無害。得到的基本上無血紅蛋白的樣品通過毛細力或重力被轉移至下面的試驗墊片上。在試驗墊片上，樣品引發級聯反應，產生有色的染料，其濃度和樣品中的分析物濃度成比例，用光度計可直接確定。圖4描述了使用葡萄糖氧化酶和PMS的葡萄糖的反應。
圖5描述了有和沒有亞硝酸鹽的血樣品在時間范圍內的光密度的變化，都具有60％血細胞比容并且都含有0-100mg/dL的葡萄糖。上圖顯示了在35℃下的結果。下圖顯示了在室溫(RT)下的結果。在每個情況下，亞硝酸鹽的濃度是5g/dL。在沒有亞硝酸鹽的情況下，血紅蛋白減少了四氮唑以形成連續增加的染料濃度并相應增加了光密度。通過除去血紅蛋白(通過氧化)，亞硝酸鹽限制了顏色的形成以致結果僅由樣品中的葡萄糖得到。制備用于產生圖中所描述的數據的兩層條在下面的實施例1中有述。
圖6顯示了亞硝酸鹽對單層條的葡萄糖/葡萄糖氧化酶系統中的顏色形成反應的影響。都具有60％血細胞比容的血樣品含有0或200mg/dL葡萄糖和0或200mg/dL的亞硝酸鹽。在室溫下操作樣品。圖顯示了本系統在室溫下是有效的，血細胞比容高達60％。制備使用的單層條在下面的實施例2中有述。
下面的實施例說明了本發明的優選實施方案。在實施例1中，使用兩層條，分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖酶。在實施例2中，使用單層條。如前所述，分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖酶。可容易地改進該組合物以應用于以前所列的其它分析物-酶的組合。(參見，例如Tietz Texbook of Clinical Chemistry，第二版，由C.Burtis等人編輯，W.B.Saunders公司，Philadelphia,PA，第976-978和1174-1175頁。)實施例不意在對本發明有任何限制。
實施例1將得自Pall公司(EaSt Hills,NY)的0.8μm尼龍膜浸在表1的試劑中直至飽和。用玻璃棒輕輕地刮掉過量的試劑。將得到的膜懸掛在56℃的烘箱中干燥10分鐘。將Porex(0.6mm厚)浸泡在表2的亞硝酸鹽溶液中，然后懸掛在100℃的烘箱中干燥10小時。最后，膜在聚酯料(0.4mm Melenex聚酯，得自ICIAmerica,Wilmington,DE)和浸滿亞硝酸鹽的Porex之間層壓。
實施例2重復實施例1的步驟，除了第一次浸泡是在表3的試劑中，沒有第二次浸泡，因為不需要Porex。
表1葡萄糖試驗墊片的試劑
表2亞硝酸鹽試劑
表3葡萄糖試驗墊片的試劑
*Gantrez AN-139(聚甲基乙烯基醚-alt-馬來酸酐，MW1080000,Cat#41632-0,Aldrich Chemicals,Milwaukee,WI,USA)使6％Gantrez在水中，加熱至95℃，少于45分鐘，得到易于使用的Gantrez6％。
權利要求
1．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的試劑，包含a)具有與之結合的黃素和對分析物具有特異性的依賴黃素的酶，b)四氮唑染料前體，c)電子轉移劑，和d)亞硝酸鹽。
2．權利要求1的試劑，其中分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖氧化酶。
3．權利要求1的試劑，其中染料前體是水溶性的。
4．權利要求1的試劑，其中電子轉移劑包含吩嗪硫酸甲酯(PMS)或其同系物。
5．權利要求1的試劑，進一步包含二價金屬穩定劑。
6．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的試劑，包含a)對分析物具有特異性的和沒有與之相結合的黃素的依賴黃素的酶，b)黃素單核苷酸(FMN)或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，c)四氮唑染料前體，d)電子轉移劑，和e)亞硝酸鹽。
7．權利要求6的試劑，其中染料前體是水溶性的。
8．權利要求6的試劑，其中電子轉移劑包含(PMS)或其同系物。
9．權利要求6的試劑，進一步包含二價金屬穩定劑。
10．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的干試劑條，包括一載體層，其上是具有權利要求1的試劑的涂層的試驗墊片。
11．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的干試劑條，包括一載體層，其上是具有權利要求6的試劑的涂層的試驗墊片。
12．權利要求10的條，其中試驗墊片具有帶正電荷的表面。
13．權利要求10的條，其中試驗墊片含有聚酰胺。
14．權利要求10的條，進一步含有覆蓋在試驗墊片上的吸濕的上層。
15．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的干試劑條，包括一載體層，其上是試驗墊片，一上層覆蓋在試驗墊片上，其中權利要求1的試劑的第一部分在試驗墊片上，第二部分試劑在載體和/或上層上。
16．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的分析物濃度的干試劑條，包括一載體層，其上是試驗墊片，一上層覆蓋在試驗墊片上，其中權利要求6的試劑的第一部分在試驗墊片上，第二部分試劑在載體和/或上層上。
17．權利要求15的條其中上層是吸濕性的。
18．權利要求15的條，進一步包括上層與試驗墊片之間的間隔和通道，提供上層和墊片之間的毛細路徑。
19．權利要求15的條，其中分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖氧化酶。
20．權利要求15的條，其中四氮唑染料前體是2,2＇-二苯并噻唑基-5,5′-雙[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3′-(3,3′-二甲氧基-4,4′-亞聯苯基)二四氮唑二鈉鹽(WST-5)。
21．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的葡萄糖濃度的干試劑試驗條，包括a)一載體層，b)在載體層上有一含有涂層的試驗墊片，該涂層含有ⅰ)具有與之結合的黃素的葡萄糖氧酶，ⅱ)四氮唑染料前體和ⅲ)PMS或其同系物，和c)在試驗墊片上，有一吸濕性的上層，用亞硝酸鹽涂敷該層。
22．一種測量含血紅蛋白的生物流體中的葡萄糖濃度的干試劑試驗條，包括a)一載體層，b)在載體層上有一含有涂層的試驗墊片，該涂層含有ⅰ)沒有與之相結合的黃素的依賴黃素的酶，ⅱ)FMN或FAD，ⅲ)四氮唑染料前體，和ⅳ) PMS或其同系物，和c)在試驗墊片上的用亞硝酸鹽涂敷的吸濕頂層。
全文摘要
適合于測量含血紅蛋白的生物流體例如全血中的分析物濃度的試劑。該試劑含有對分析物有特異性的依賴黃素的酶，黃素輔因子，條件是且僅是黃素不和酶結合，四氮唑染料前體，電子轉移劑和亞硝酸鹽。該試劑形成染料，據此可測定分析物濃度。亞硝酸鹽抑制由血紅蛋白非酶造成的對染料形成的干擾。優選，試劑用于干條中以測量全血中的葡萄糖。
文檔編號C12Q1/32GK1317575SQ0111625
公開日2001年10月17日 申請日期2001年2月24日 優先權日2000年2月25日
發明者T·歐陽, Y·S·于 申請人:生命掃描有限公司