專利名稱：乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學體外診斷技術，具體地講是一種基因芯片。
目前在臨床上已開展的實驗室診斷方法主要有三大類，即組織培養法、免疫學方法(酶聯免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因診斷技術(斑點雜交和聚合酶鏈反應PCR)。這些方法對病毒性肝炎的診斷起到了非常積極的作用，但也有不足之處(1)組織培養法對實驗室條件要求高，一般醫院難以開展，并且周期長，只能區分病毒的種。(2)ELISA和RIA檢測往往只能間接推測病毒在體內的感染狀況，不能直接判斷是否存在以及病毒數量。(3)PCR和斑點雜交雖可直接檢測病毒基因組本身，甚至可以用來分析基因型和變異株，但由于對儀器、試劑及場地等要求條件較高，以及方法學上尚有欠妥之處，難以滿足臨床的大量篩查。并且從目前已獲得的結果看，各實驗室之間利用基因診斷技術檢測肝炎病毒的結果很難取得一致，也缺乏統一的標準。(4)上述方法共同的缺點是要檢查多個肝炎病毒標志物時，只能一項項去做，耗時費力，并且抽取患者的血量也較大。上述不足提示我們，多種檢測項目用一種儀器一次性檢測，并實現程序化和自動化是診斷病毒性肝炎的研究方向之一。近年新興的生物芯片技術對解決此問題給我們帶來極大的希望。
我國是乙型肝炎的高發區，全國乙型肝炎病毒攜帶者至少有1.3億以上，每年的發病率在6000萬人次，乙肝病毒持續感染最終轉化為慢性肝炎、肝硬化或肝癌；總數約占世界感染者的40％。因此，我國自“六五”以來，一直將研究和開發肝炎病毒的新診斷技術和診斷試劑作為醫學攻關項目，并取得了一定的進展。但隨著研究的深入，人們對肝炎病毒的認識也不斷加深，乙肝病毒基因的變異、不同位點的突變可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒治療逃避，在臨床表現為漏診、盲目用藥和延誤治療，最終導致患者多花錢而使病情加重。最新研究結果表明，乙肝病毒的基因型與病情的輕重相關，抗病毒藥物引起乙肝病毒特定位點的變異而耐藥等。但是目前臨床常規的檢測方法越來越不適應臨床診治的需要，這就需要研究更新的、更能反映肝炎病毒實際狀況的試劑或儀器、方法等，對肝炎病毒感染狀況進行準確判斷，并指導臨床治療方案的制定。
本發明的目的是提供一種乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，該基因芯片具有診斷準確、特異性強、信息量高的特點，是目前乙肝病毒感染診斷最好的手段，給數千萬乙肝患者帶來福音。此芯片成功應用于臨床，其潛在市場巨大，并能帶來極大的經濟效益和社會效益。
本發明是在基質尼龍膜上設置探針，探針在膜上的步陣，與核苷酸類似物等抗病毒藥物的耐藥相關探針.；與免疫逃亡，臨床漏檢有關的探針；與干擾素應答，免疫逃避，臨床狀況有關的探針；與病毒復制和原發性肝癌相關的缺失突變等特異性探針100-1000個左右，在特異探針末端加一段特異引物。
本發明實施的具體步驟是1.設計乙肝病毒特異性探針100-1003個。
乙肝病毒基因組大小為3.2kb，P區從2357核苷酸開始-1621個核苷酸位置終止，在這段基因組中設計探針117-381個，S區分為三段，S12848-3172，S23173-155，S156-833核苷酸，設計探針52-137個，C區分為前C區和C區，從1814-1901-2450個核苷酸，設計探針177-380個，X區1374-1818個核苷酸之間，設計探針37-115個。探針的大小8-25個堿基。
2.合成探針使用上海生物工程有限公司DNA合成儀合成。
3.探針處理由于設計的探針比較短，很難固化在膜上，因此我們在3’末端加了一個尾巴，使它能夠固化在尼龍膜上。
4.基因芯片的制備使用羅氏公司生產的帶有正點荷的尼龍膜，使用南開大學設計的NKG-Microarray III點樣儀(如
圖1所示)按預先設定好的順序進行點樣(見表2，表2是乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片合成的引物序列)。
圖1是基因芯片微點陣操作平臺示意圖。
如圖所示，1為點樣臂，為有機玻璃制作，可以是一個以上；2為精密平移臺，為一維精密操縱器；3為點樣頭架，有機玻璃制作，用于裝載針架；4針架；5為精密電控平移臺Z軸；6為精密電控平移臺Y軸；7為精密電控平移臺X軸；8為光學平臺；9為電控箱；10為計算機；利用計算機控制軟件通過電控箱操作機械手自動化點樣。
尼龍膜大小1.0-2.5cm×5cm，點數，按照不同的要求從幾十點到千點，依針管徑粗細點的大小為100-1000微米，點間的距離為200-1500微米，每點上樣量為0.05-0.1微升。
5.將點好的膜放在長波紫外燈下進行交聯5-10分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
6.處理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混勻，然后100℃煮沸10分鐘，離心。
7.PCR擴增采用套式PCR使用引物見表3(表3套式PCR引物)。第一次PCR反應在PCR反應管中加入PCR mix、處理好的標本和引物1，按下列程序進行PCR擴增。
94℃ 1min，1個循環 第二次擴增在PCR反應管中加入PCR mix、處理好的標本和引物2，按下列程序進行擴增 8.探針的回收采用硅膠樹脂的方法進行所需DNA片段的回收。
9.探針標記使用羅氏公司生產的地高辛標記試劑盒，方法參照試劑盒的說明。
10.雜交預雜交為0.5小時-1小時，雜交為3-12小時，在雜交箱中進行。
11.顯色參照DAB檢測方法試劑盒說明書進行。
12.檢測將作好的芯片掃描進入計算機，然后用自設的計算機分析軟件自動進行結果分析，將結果輸出。
本發明經在天津市第三中心醫院120例臨床應用，實驗證明NKG-450s乙肝病毒基因分型和基因變異診斷芯片具有診斷準確、特異性強、操作簡單、信息量大等特點，臨床實驗深受大夫們的歡迎。
實例1
設計乙肝病毒特異性探針429個。P區117個，S區52個，C區177個，X區37個。探針的大小為18-24堿基。由上海生物工程有限公司使用DNA合成儀合成探針，末端轉移酶催化下在3’末端加T尾巴15個以上。
基因芯片的制備使用羅氏公司塵產的帶有正點荷的尼龍膜(20×30cm)，和南開大學設計的NKG-Microarray III點樣儀按上述預先設定好的順序進行點樣。針管徑粗為170微米，點間的距離為1400微米，每點上樣量為0.1微升。將點好的膜放在長波紫外燈下進行交聯5分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
芯片使用方法如下處理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混勻，然后100℃煮沸10分鐘，離心。
PCR擴增采用套式PCR方法。第一次PCR反應在PCR反應管中加入PCR mix、處理好的標本和引物1，按下列程序進行PCR擴增。
94℃1min，1個循環 第二次擴增在PCR反應管中加入PCR mix、處理好的標本和引物2，按下列程序進行擴增 用硅膠樹脂過濾，進行所需DNA片段的回收。使用羅氏公司生產的地高辛標記試劑盒，方法參照試劑盒的說明。雜交預雜交為1小時，雜交為12小時，在雜交箱中進行。參照DAB檢測方法試劑盒說明書進行顯色，雜交信號呈棕黃色。
將作好的芯片掃描輸入計算機，按照表1 NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣，將結果輸出。
表1是NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣，該乙肝芯片型號為NKG-450/s，其中，1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450號為質控探針，3-36號為乙型肝炎基因分型探針、37-54號為血清分型探針，55-171號為核苷酸類似物等抗病毒藥物的耐藥相關探針；172-224號為免疫逃亡探針，225-404號為臨床漏檢；干擾素應答，免疫逃避，臨床狀況有關的探針；405-448號為病毒復制和原發性肝癌相關的缺失突變等特異性探針。
本發明臨床應用實例按照表1所說的NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣進行檢測病例1XXX，男，患乙肝多年，服用賀普丁一年，開始半年病情好轉，HBV DNA含量下降，轉氨酶也趨于正常；但隨后沒有徹底緩解開始反彈。2001年1月使用乙肝病毒基因診斷芯片檢測后，發現該病人在P區552aa的甲硫氨酸(M)變異為纈氨酸(V)，因此對病人進行換藥治療三個月，經檢查各項指標開始恢復正常。
病例2該發明用于血站獻血員的檢測，從血站所取自愿獻血者血液20份，經該乙肝病毒基因芯片檢測有2例乙肝病毒攜帶者。
病例3該患者患乙型肝炎多年，經治療痊愈，后又去醫院復診，經乙肝病毒基因芯片檢測，乙型肝炎復發。
乙型肝炎除做上述檢測外，還可以進行藥物篩選和藥物治療效果跟蹤。
表1NKG-450/s乙肝病毒基因診斷芯片布陣
表2乙肝病毒基因檢測芯片合成寡核苷酸引物序列
表3套式PCR引物序列
權利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，其特征在于在基質尼龍膜上設置探針，探針在膜上的步陣，乙肝病毒特異性探針100-1003個，包括P區從2357核苷酸開始至1621個核苷酸位置終止，與核苷酸類似物和抗病毒藥物的耐藥相關探針117-381個；S變異區S12848-3172，S23173-155，S156-833個核苷酸，與免疫逃亡，臨床漏檢有關的探針52-137個；C變異區從1814-1901-2450個核苷酸，與干擾素應答，免疫逃避，臨床狀況有關的探針177-380個；X變異區1374-1818個核苷酸之間，與病毒復制和原發性肝癌相關的缺失突變探針37-115個；探針的大小8-25個堿基；探針的3’末端加尾巴10個以上。
2.按照權利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，其特征在于所說的探針在膜上的步陣1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450號為質控探針；3-36號為乙型肝炎基因分型探針；37-54號為血清分型探針；55-171號為核苷酸類似物和抗病毒藥物的耐藥相關探針；172-224號為免疫逃亡探針；225-404號為臨床漏檢，干擾素應答，免疫逃避，臨床狀況有關的探針；405-448號為病毒復制和原發性肝癌相關的缺失突變特異性探針。
3.權利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的制備方法，其特征在于它包括下述步驟(1)設計乙肝病毒特異性探針，包括P區、S區、C區、X區；(2)使用DNA合成儀合成探針；(3)在3’末端加尾巴進行探針處理，使它能夠固化在尼龍膜上；(4)使用帶有正點荷的尼龍膜，用芯片點樣機上按預先設定好的順序進行點樣；(5)將點好的膜放在長波紫外燈(365nm)下進行交聯5-10分鐘，使DNA牢固固定在膜上。
4.權利要求1所說的乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片的使用方法，其特征在于它包括下述步驟(1)將待檢血清加入Lysis Buffer處理血清，然后100℃煮沸10分鐘，離心備用；(2)PCR擴增采用套式PCR方法，第一次PCR反應在PCR反應管中加入PCRmix、處理好的標本和引物1，按下列程序進行PCR擴增94℃ 1min，1個循環 第二次擴增在PCR反應管中加入PCR mix、處理好的標本和引物2，按下列程序進行擴增 (3)采用硅膠樹脂的方法進行所需DNA片段的回收探針；(4)隨機引物標記探針；(5)在雜交箱中進行雜交預雜交為0.5小時-1小時，雜交為3-12小時；(6)顯色；(7)將作好的芯片掃描輸入計算機檢測，輸出結果。
全文摘要
本發明涉及醫學體外診斷技術,具體地講是一種基因芯片。乙肝病毒基因分型和變異診斷芯片是100－1003個乙肝病毒特異性探針和20個質控探針構成的基因診斷體外檢測芯片,該基因芯片具有診斷準確、特異性強、信息量高的特點,是目前乙肝病毒感染診斷最好的手段,對我國數千萬乙肝患者帶來福音。
文檔編號C12Q1/68GK1339608SQ01116078
公開日2002年3月13日 申請日期2001年5月15日 優先權日2001年5月15日
發明者陳瑞陽, 高英堂, 陳力, 宋文芹 申請人:天津南開基因工程有限公司, 南開大學