水稻5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶以及編碼該酶的基因的制作方法

專利名稱：水稻5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶以及編碼該酶的基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，編碼該酶的核酸分子，使用這種核酸分子轉化植物的方法和由該方法得到的植株。
本發明另外涉及含有這些核酸分子的載體和細菌，以及被所述核酸分子轉化的植物細胞和植物，產生的轉基因植物在抗除草劑草甘膦的能力上有顯著提高。
芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的合成是通過莽草酸途徑，經由分枝酸的一段多步酶促反應過程。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSPS，以下簡稱EPSP合成酶)是芳香族氨基酸合成途徑中的一個重要的酶，也是其中研究最多的酶之一。它可逆地催化3-磷酸莽草酸(Shikimate-3-phosphate，S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyrurate，PEP)縮合成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸，并釋放無機磷分子(Gollub，E.1967，J.Biol.Chem.242，5323-5328)。
已從細菌(Duncan，1984，FEBS Lett.170，59-63)、真菌(Charles，1986，Nucleic Acids Res.14，2201-2213)和植物(Gasser，1988 J.Bio.Chem.263(9)，4280-4289；Klee，1987，Mol.Gen.Gent.210，437-442)中克隆獲得了相應的EPSP合成酶基因。植物和細菌的EPSP合成酶是一種單體酶，分子量在44,000-48,000之間。而真菌的EPSP合成酶只是arom復合酶的一部分。通過對已克隆的各種植物和微生物的EPSP合成酶的氨基酸序列比較分析發現，它們成熟肽的氨基酸序列非常保守，同源性較高，推測它們起源于同一個基因。
利用化學修飾的方法研究EPSP合成酶，結果表明，賴氨酸、精氨酸和組氨酸對維持酶的活性是必須的。矮牽牛EPSP合成酶中23位的賴氨酸和28位精氨酸是酶的活性中心的重要組成部分。如果23位的賴氨酸突變精氨酸，酶的活性不受影響。但是，如果23位的賴氨酸突變為谷氨酸或丙氨酸，酶的活性將完全喪失。這表明，賴氨酸側鏈帶正電側鏈基團在維持EPSP合成酶的活性具有重要作用。可以這樣推測，23位的賴氨酸和28位的精氨酸的帶正電的側鏈基團可以識別底物的陰離子殘基。對比已獲得的EPSP合成酶的氨基酸序列，在上述兩個氨基酸位點附近的氨基酸序列非常保守。另外，在385位的組氨酸在植物和微生物的EPSP合成酶的氨基酸序列中一致性較高。
植物的EPSP合成酶含有葉綠體導肽，長度約72氨基酸左右，無保守性，不同物種的葉綠體導肽差異較大。
EPSP合成酶一個重要特點是它能被草甘膦特異性抑制。草甘膦是一種內吸傳導的非選擇性除草劑，適用于防治多種一年生、多年生禾本科，以及莎草科及闊葉雜草。草甘膦專一性抑制EPSP合成酶，使EPSP合成酶活性喪失，將直接干擾苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成，使細胞內染色體失常(Steinrücken H.C.，1980，Biochem.Biophys.Res.Commum.94，1207-1212)。把草甘膦施用到植株后，它們在植株內運輸并積累到快速生長的部位，特別是莖和根尖，造成植物的根的莖和根中毒死亡。目前，草甘膦是應用最廣泛的非選擇性除草劑，能有效地控制全世界危害最嚴重的78種雜草中的76種。它具有對動物無毒，土壤殘效期短，易于降解等優點。市售的商品Roundup中的主要成份就是草甘膦。
草甘膦對EPSP合成酶的抑制對PEP而言是競爭性抑制劑，對S3P而言是非競爭性抑制劑。它在結構上類似于PEP，競爭性地與EPSP合成酶相結合，防礙EPSP合成酶與正常底物PEP的結合，從而導致EPSP合成酶活力下降乃至喪失。
草甘膦作為除草劑有一個顯著缺點，它無法區分莊稼和雜草，這使除草劑不能在農田中安全有效地使用。
對于植物抗草甘膦的基因工程，有兩種較為常見的策略一是采用突變的EPSP合成酶基因轉化；二是EPSP合成酶的過量產生。
(1)導入突變的EPSP合成酶Stalker等研究人員1985年從鼠傷寒沙門氏菌及E.coli中分離到對草甘膦表現抗性的菌株，研究表明這種抗性發生在AroA基因上。DNA序列分析表明，AroA基因發生了兩種類型的突變一類為AroA基因的啟動子區突變，導致基因表達水平的提高，但這種突變對草甘膦的耐性提高不大；另一類為AroA的結構基因發生點突變，導致酶第101位的脯氨酸為絲氨酸所取代，由此所產生的EPSP合成酶降低了與草甘膦除草劑的親和性，從而提高了對草甘膦的抗性。將此突變的AroA基因轉入E.coli，后者在2000ug/ml草甘膦存在的情況下生長，而野生型的E.coli在加有100ug/ml對生長抑制即達40％。Comai等(Comai，L.，1985，Nature317，741-744)構建了由aroA與ocs轉錄信號的融合基因。然后，將這兩種基因分別克隆到植物表達載體上，轉入發根農桿菌。應用Ri質粒媒介的T-DNA轉移技術，將上述基因結構導入煙草、矮牽牛、番茄中。在轉基因植株中能檢測到外源基因表達的mRNA以及有活性的酶蛋白。轉基因植株對草甘膦的抗性比對照提高了2到3倍。特別是E.coli分離的突變的EPSP合成酶對草甘膦的敏感性比正常酶低99.98％。不過，在生長狀態方面，轉基因植株較對照生產緩慢。從細菌來源的aroA基因編碼的EPSP合成酶，不含葉綠體導肽，轉化植物后，外源的EPSP合成酶存在于植物細胞的胞質中。
(2)導入過量的EPSP合成酶，減低草甘膦的作用影響提高EPSP合成酶的活性是目前抗除草劑基因工程中另一種較為常用的方法。這個方法的提出基于如下的發現。Amrhein等人通過逐漸增加草甘膦的濃度，加大草甘膦的選擇壓力，分離獲得一個耐草甘膦的矮牽牛細胞系(Amrhein N，et al.，1983，FEBS Lett.，157191-196)。分析這個細胞系中的EPSP合成酶，結果表明該細胞系的核中的EPSP合成酶基因的拷貝數擴增了20倍，使酶大量產生。研究人員利用上述細胞系分離出了矮牽牛的EPSP合成酶的cDNA克隆。矮牽牛EPSP合成酶基因是一個約9Kb的核基因，有7個內含子，酶蛋白分子量為48KD。利用來源于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的啟動子和矮牽牛的EPSP合成酶基因cDNA構建了嵌合的EPSP合成酶基因。花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的啟動子可使一些編碼序列在所有植物組織中顯示高水平的組成性表達。在轉基因植株中EPSP合成酶的活性增加了20倍，轉基因植株對草甘膦施用量的耐受程度為殺死非轉基因植株用量的4倍以上(Shah，D.M.，1986，Science 233，478-481)。
本文所披露的內容中，使用了很多術語。在本文中，“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區前面(5’非編碼區)和后面(3’非編碼區)的調控序列。“外源基因”是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉移導入的基因；也可是指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導致一種內源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現。“嵌合基因”是指包括異源調控序列和編碼序列的基因。
“啟動子”是指一段可與RNA聚合酶及其他一些影響轉錄的反式因子結合而準確有效地起始轉錄的DNA序列。“組成型啟動子”是能驅動目的基因在生物體各發育階段和不同部位表達，且表達水平沒有明顯差異的一類啟動子。“組織特異性啟動子”是指驅動目的基因在生物體特定組織中表達的一類啟動子。“器官特異性啟動子”是指驅動目的基因在生物體特定器官中表達的一類啟動子。“誘導型啟動子”是指在一定的外界條件下(如光、溫、化學物質等)誘導下驅動目的基因表達的一類啟動子。
“復合啟動子”是不同啟動子之間或啟動子和調控序列共同構成的。調控元件包括能增強外源基因表達或調控基因在植物中表達部位的各種來源的DNA序列。旨在增強外源基因表達的序列是水稻Actin1內含子1、玉米Ubiquitin內含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1內含子1、玉米乙醇脫氫酶1-S基因內含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外顯子以及水稻EPSP合成酶基因第一內含子。
“增強子”是能夠增強啟動子轉錄活性的一段順式調控序列。“內含子”是一段不轉錄的DNA序列，某些基因的個別內含子能增強啟動子的轉錄活性。
“植物表達載體”是指能驅動目的基因在植物體內表達的載體。“整體水平的轉化”是指以生物體為轉化受體的轉化方法，它包括花粉管通道法介導的基因轉化、生殖細胞浸泡法、胚囊或子房注射法等。
“基因組文庫”是一套包含基因組DNA片段的細胞載體。常用的載體有λ噬菌體，cos質粒、BAC(Bacteria Artificial Chromosome)載體，YAC(Yeast Artificial Chromosome)以及TAC(Transformation-competentArtificial Chromosome)載體。“cDNA文庫”是從mRNA逆轉錄成cDNA單鏈，經DNA聚合酶的作用轉變成雙鏈cDNA分子，然后插入到適當的載體中并克隆化而形成的集合。
“簡并性”是由于遺傳密碼子第3位的可搖擺性而導致的多個密碼子對應一種編碼氨基酸的現象。
在本描述中，“植物”意味著任何能夠進行光合作用的分化的多細胞有機體，“植物細胞”意味著來源于植物并能夠形成未分化組織例如愈傷組織或分化的組織例如胚或植物部分或種子的任何細胞。
在現有已克隆的植物EPSP合成酶基因中，主要是針對雙子葉植物的；而對于單子葉植物，研究較少，僅有高粱和玉米的EPSP合成酶蛋白的分離(Forlanni，G.，1994.Plant Physiol.105，1107-1114；Ream，J.E，1988 Plant Physiol.87，232-238)，目前尚沒有來源于單子葉植物EPSP合成酶基因的核苷酸序列在文獻中的報道。
本發明的一個目的是提供水稻的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列或具有該酶活性的片段或功能衍生物。其中，功能衍生物是指通過一個或多個氨基酸的替換、缺失、增加或修飾得到的而同時具有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶活性的衍生物。
本發明的另一個目的是提供一種編碼的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶或具有該酶活性的片段或功能衍生物的核酸分子。該分子可以是(1)含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的核酸分子；(2)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質的核酸序列；(3)含有SEQ IDNO3所示的核苷酸序列的核酸分子；(4)因遺傳密碼的簡并性引起的核苷酸序列與(1)、(2)或(3)所述的核酸分子的序列有所不同但仍編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質的核酸分子。所述的核酸分子可以是DNA分子。所述的DNA分子可以是cDNA分子或基因組DNA分子。所述的核酸分子編碼的氨基酸序列可以與SEQ ID NO2具有85％以上的同源性。
本發明的再一個目的是提供一種利用水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因生產抗除草劑的細胞和植株的方法，該方法包括以下步驟(1)將水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的上游端沿有義方向上連接于啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上，進而構建植物表達載體；(2)將構建好的植物表達載體導入植物細胞；(3)在適宜的培養條件下將轉化后的植物細胞再生，得到表達目的基因的植株。
在上述方法中，所述啟動子包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子以及由啟動子和調控元件組成的復合啟動子。所用的轉化方法包括農桿菌介導的轉化方法、基因槍法、原生質體介導的轉化方法、電擊法以及整體水平的轉化方法。其中，所述的除草劑是N-(膦羥甲基)甘氨酸異丙胺鹽〔N-(phosphonomethyl)glycine，草甘膦〕。或者，所述的除草劑包括草甘膦前體、草甘膦衍生物以及以草甘膦為主要成分的混合物。
本發明的由一個目的是提供由上述方法得到的植株及其子代。這種植株可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。例如水稻、玉米、小麥、大麥，高粱；或者煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍或青椒。
本發明的方法中使用一種除草劑草甘膦抗性的嵌合基因，在該嵌合基因的轉錄方向上包括一個啟動子區，葉綠體導肽，編碼草甘膦耐受性的酶基因和3’末端非翻譯的聚腺苷酸信號區的序列。
本發明中對水稻EPSP合成酶的獲得是通過對水稻基因組文庫的雜交篩選。獲得陽性克隆后，然后進行亞克隆，并最終獲得水稻EPSP合成酶的基因組全序列。這些對本領域中的研究人員是熟知的，可參見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)。
水稻EPSP合成酶基因全長cDNA序列的克隆是采用RT-PCR方法，以水稻明恢63葉片總RNA的反轉錄cDNA一鏈為模板，進行PCR擴增。這些都是本領域中的研究人員所熟知的，可參見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
含有水稻EPSP合成酶基因的質粒，一般含有合適的啟動子、增強子等調控元件，以及合適的選擇抗性基因(如氨芐青霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因等)，質粒的重組過程包括質粒的提取、質粒的酶切、目的片段的回收以及目的片段和相關載體的連接。這些都是本領域中的研究人員所熟知的，可參見Sambrook等人，分子克降實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
對于本領域的技術人員而言，有多種將一個DNA序列導入高等植物的真核細胞的方法。這些方法包括基因槍法(參見Klein等(1987)Nature32770-73)；農桿菌的Ti和Ri質粒介導的轉化方法(參見Pacciotti等(1985)Bio/Technology 3241；Potrykus等(1985)Mol.Gen.Genet.199183-188；Hiei等(1994)The Plant J，6271-282)。另外還有其它轉化方法，如外源DNA直接導入法和電擊法等。細胞一旦轉化后，即可由本領域技術人員再生。獲得了用上述方法之一轉化的轉基因單株后，在本發明中，可以通過卡那霉素來篩選抗性植株，并結合分子檢測的方法，鑒定轉基因的整合情況，用除草劑草甘膦鑒定獲得的轉化植株，獲得了抗草甘膦的轉基因植物。
附圖簡要說明

圖1質粒pBEF酶切圖譜。含有水稻EPSP合成酶基因cDNA全序列，質粒骨架來自pBlueSK。
圖2質粒pSPROK酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子。
圖3質粒pSPEF酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子，水稻EPSP合成酶基因連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pSPROK。
圖4質粒pNPT-II酶切圖譜。該質粒可用來轉化雙子葉植物，含有左右邊界序列，植物選擇標記基因是新霉素磷酸轉譯酶基因。細菌選擇標記是卡那霉素。
圖5質粒pCSPEF-NptII酶切圖譜。該質粒可用來轉化雙子葉植物。P-35S是CaMV的35S啟動子調控水稻EPSP合成酶基因。NptII是新霉素磷酸轉移酶基因作為篩選標記。質粒骨架來自pC2300。
下面結合實施例進一步闡明本發明。在本申請中，所用的術語和縮寫是本領域中技術人員通用的術語和縮寫。實施例1水稻EPSP合成酶基因部分cDNA片段的獲得根據GeneBank序列號AB016765提供的水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶部分mRNA序列信息，合成一對特異性的引物，利用RT-PCR方法獲取部分的EPSP的cDNA序列。PCR中所用引物為上游引物EP1ggctctctgtggaagcag下游引物EP2gtgatcatcgtaggtgtcPCR擴增得到一條特異性帶，長約1000bp，命名為EPSP(p)，將這個片段克隆到pBluescript KS(+)的EcoRV位點，獲得重組質粒，并進行測序。測序的結果表明，克隆獲得的1000bp片段與GeneBank中AB016765提供的部分水稻EPSP合成酶基因序列一致性為100％，沒有產生堿基的突變。實施例2水稻品種明恢63基因組文庫的篩選基因組文庫由劉耀光研究員提供的明恢63的TAC文庫，保存于8個96孔板中，每孔含約100個克隆，每個克隆的插入片段的平均長度為40Kb。用EPSP(p)為探針對文庫進行篩選。用隨機引物法標記探針，采用如下標記反應取20ng EPSP(p)DNA片段作為標記模板，加入2μl(0.5μg/μl)隨機引物并加入TE至10μl后，95℃變性5分鐘，取出立即冰浴5分鐘，然后加入11μl標記緩沖液(含dATP，dGTP，dTTP)、2U的DNA聚合酶I大片段和10-20μCi a-32P-dCTP，37℃反應2-3小時。將尼龍膜放入雜交袋，加入適量(4-6ml/100cm2)雜交液(5×SSC；0.1％，SDS；0.1％，Sarkosyl；0.6％，Blocking Reagent；5％，Dextran Sulfate)，65℃預雜交1小時。然后加入變性后的探針，在65℃下雜交過液(16-20小時)。取出尼龍膜，在65℃下用洗液(0.2×SSC，0.1×SDS)洗2-3次，每次約60分鐘。洗完膜后，用保鮮膜包好壓片。-70℃下放射自顯影。
第一輪篩選獲得了兩個陽性，5-10C和5-11C。吸取少量陽性孔中的菌液，在一定稀釋度涂板，以獲得分散較開的單個菌落。挑取單個菌落，分別置于384孔板的每孔(每孔含250μl LB；IPTG10 mg/L；Km 50mg/L)。384孔板在37℃培養16小時后，轉膜，用于雜交。第二輪雜交共獲得了20個陽性克隆，分別取名為E5-E25。提取陽性克隆的質粒，用HindIII酶切，電泳后轉膜。雜交結果顯示，確定的陽性克隆有16個，分別為E5，E7，E8，E9，E11，E12，E13，E15，E16，E17，E18，E20，E21，E23，E24，E25。分析陽性克隆的Hind III酶切圖譜可以看出，這16個克隆插入片段大小相同，約40kb，帶型一致，我們判斷它們為同一種克隆。實施例3陽性克隆的亞克隆任意選取陽性克隆E11和E20，選用BglII，DraI，SalI，ScaI，XbaI酶切質粒，轉膜。用EPSP(p)作為探針進行雜交。雜交結果顯示，DraI酶切泳道，雜交為一條帶。對應回收這條帶，并插入到克隆載體pBluescriptKS(+)的EcoRV位點，按照BIO-RAD公司電激儀的操作程序，采用電激法轉化E.coli DH5α，在含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素選擇培養基上挑選白色菌落，得到重組質粒pBlueE7。按照Applied Biosystem公司Sequenase Dye-Primer Sequencing Kit方法進行測序，交與上海皓嘉生物技術公司測序。測序結果表明，亞克隆E7全長3,370bp，包括7個外顯子和6個內含子。具有完整的5′端序列，但3′端不全。根據E7序列以及GeneBank序列號AB016765提供的水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶部分mRNA序列信息，設計兩條引物，以陽性克隆E11的質粒為模板，依次加入10×Taq DNA酶緩沖液5μl，dNTPs(2.5umol/L)5μl，TaqDNA聚合酶1U，最后加水補至總體積50μl，再加50μl石蠟油覆蓋于表面。按以下條件進行PCR反應94℃預變性5min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共進行35個循環；最后于72℃延伸10min。擴增產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離。測序擴增片段的3′端，結合E7序列，以獲得了全長的EPSP合成酶基因的全序列。實施例4EPSP合成酶cDNA全序列的獲得根據EPSP合成酶基因的全序列，利用DNA Star軟件分析基因組序列中的ORF(Open Reading Fragment)，依次ORF為依據合成以下引物，EP35’gct cta gag cat ggc ggc gac cat gg 3’EP45’ggg gta ccc caa cag aaccta gac 3’取秈優63根的反轉錄產物2μl作為上述模板，依次加入10×TaqDNA酶緩沖液5μl，dNTPs(2.5umol/L)5μl，EP5引物10pmol，EP6引物10pmol，Taq DNA聚合酶1U，最后加水補至總體積50μl，再加50μl石蠟油覆蓋于表面。按以下條件進行PCR反應94℃預變性5min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共進行35個循環；最后于72℃延伸10min。擴增產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離。為了敘述方便，這一步的RT-PCR產物命名為EPSP(h)。PCR產物經XbaI和KpnI酶切后，用低熔點瓊脂糖電泳回收擴增片段，并插入到克隆載體pBluescriptKS(+)的XbaI和KpnI位點。按照BIO-RAD公司電激儀的操作程序，采用電激法轉化E.coli DH5α，在含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素選擇培養基上挑選白色菌落，經詳細的酶解分析，得到重組質粒pBEPSP(h)。按照Applied Biosystem公司Sequenase Dye-Primer Sequencing Kit方法進行測序，交與上海皓嘉生物技術公司測序。實施例5雙子葉植物轉化載體pCSPEF-NptII的構建選擇pSPROK作為水稻EPSP合成酶基因的植物表達中間載體，其上帶有CaMV35S啟動子和nos終止子；選擇pCNPT-II作為水稻EPSP合成酶基因的植物表達載體，其上帶有來源于Ti質粒的T-DNA邊界序列RB和LB，在邊界序列之間帶有植物選擇標記NptII及MCS序列。pSPEF為植物表達中間質粒，pCSPEF-NptII為最終植物表達載體。
根農桿菌LBA4404的轉化使用BIO-RAD公司的電激儀，感受態的制備和電激方法參照產品說明書進行，在YEB(Rif25，Km50)平板上28℃暗培養2天后即有轉化菌落長出，進一步從轉化菌中提取質粒予以鑒定。實施例6煙草轉化苗的獲得將含植物表達載體的根農桿菌LBA4404接種20ml YEB培養基(Km50mg/L，Ref 50mg/L)28℃培養過夜，按2％轉接至無抗生素的YEB培養基(乙酰丁香酮0.2％)中繼續培養3小時，菌液用MS培養基適當稀釋用于植物轉化。
采用葉盤法(Horsch，1985，Methods in Enzymology，118627-641)轉化煙草，將含有質粒pCSPEF-NptII和pCNPT-II的根農桿菌LBA4404分別轉化煙草，其中pCNPT-II為不含水稻EPSP合成酶基因的植物表達載體，以作為對照。轉化兩周后，在含75mg/L卡那霉素篩選培養基上進行篩選。未轉化對照逐漸變黃、變白，而轉化的葉片周緣則長出了小芽。繼續在含抗草甘膦(有效成份為N-(膦羥甲基)甘氨酸異丙胺鹽〕篩選培養基上進行篩選，轉質粒pCNPT-II煙草葉片，逐漸變白。而轉pCSPEF-NptII質粒煙草葉片，能正常生長，并分化出小芽。切下小芽，轉入生根培養基中，待小苗根系發達，植株較壯后，用除草劑草甘膦進行噴灑篩選，獲得了抗除草劑草甘膦的轉基因煙草植株。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A) 姓名(B) 街道大屯路甲3號(C) 城市北京(D) 國家中國(E) 郵編(ZIP).100101(ii) 發明題目編碼水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的核酸分子(iii) 序列數4(iv) 計算機可讀形式(A) 介質類型軟盤(B) 計算機IBM PC可兼容機(C) 操作系統(D) 軟件(2)SEQ ID NO1的信息(i) 序列特征(A) 長度3661個堿基對(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓撲結構線性(ii) 分子類型基因組DNA序列(iii)原始來源(A) 生物明恢63基因組文庫(B) 品系秈稻(C) 組織類型葉片(iv)直接來源(A) 陽性克隆亞克隆片段和PCR產物拼接的結果(B) 克隆pBlueE7(v)序列描述SEQ ID NO1 (2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度515個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ii) 序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Leu Asp Gln Ala Val5 10 15 20Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly25 30 35 40Met Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser45 50 55 60Ser Ser Val Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile65 70 75 80Ser Gly Ala Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ser Ala85 90 95 100 105Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu110 115 120 125Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val130135140145Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu150155160165Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala170175180185Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly190 195200205210Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val215220225230Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr235 240 245250Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp255260265270Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys275280285290Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro295 300305310315Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile320 325 330335Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe340345350355Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val Thr Val Thr360365370375Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys380385390395Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile400 405410415420Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu425430435440Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys445450455460Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala465 470475480Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn485490495500Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn505510 515(3)SEQ ID NO3的信息(iii) 序列特征(D)長度1,604個堿基對(E)類型核酸(F)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA序列(iii)序列描述SEQ ID NO31 GCAATGGCGGCGACC ATG GCG TCC AAC GCC GCG GCT GCG GCG GCG GTG TCC CTG GAC CAG GCC GTG GCG GCG TCG GCG78M A S N A A A A A A V r S L D Q A V A A S A79 GCG TTC TCG TCG CGG AAG CAG CTG CGG CTG CCC GCC GCG GCG CGC GGG GGG ATG CGG GTG CGG GTG CGG GCG CGG153A F S S R K Q L R L P A A A R G G M R V R V R A R154GGG CGG CGG GAG GCG GTG GTG GTG GCG TCC GCG TCG TCG TCG TCG GTG GCA GCG CCG GCG GCG AAG GCG GAG GAG228G R R E A V V V A S A S S S S V A A P A A K A E E229ATC GTG CTC CAG CCC ATC AGG GAG ATC TCC GGG GCG GTT CAG CTG CCA GGG TCC AAG TCG CTC TCC AAC AGG ATC303I V L Q P I R E I S G A V Q L P G S K S L S N R I304CTC CTC CTC TCC GCC CTC TCC GAG GGC ACA ACA GTG GTG GAC AAC TTG CTG AAC AGT GAG GAT GTT CAC TAC ATG378L L L S A L S E G T T V V D N L L N S E D V H Y M379CTT GAG GCC CTG AAA GCC CTC GGG CTC TCT GTG GAA GCA GAT AAA GTT GCA AAA AGA GCT GTA GTC GTT GGC TGT453L E A L K A L G L S V E A D K V A K R A V V V G C454GGT GGC AAG TTT CCT GTT GAG AAG GAT GCG AAA GAG GAA GTG CAA CTC TTC TTG GGG AAC GCT GGA ACT GCA ATG528G G K F P V E K D A K E E V Q L F L G N A G T A M529CGA CCA TTG ACA GCA GCC GTG ACT GCT GCT GGT GGA AAT 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G T V T V Q G C G T T S1054 TTG CAG GGT GAT GTC AAA TTT GCT GAG GTA CTT GAG ATG ATG GGA GCA AAG GTT ACA TGG ACT GAC ACC AGT GTA1128L Q G D V K F A E V L E M M G A K V T W T D T S V1129 ACC GTA ACT GGT CCA CCA CGT GAG CCT TAT GGG AAG AAA CAC CTG AAA GCT GTT GAT GTC AAC ATG AAC AAA ATG1203T V T G P P R E P Y G K K H L K A V D V N M N K M1204 CCT GAT GTT GCC ATG ACC CTT GCC GTT GTT GCA CTC TTC GCT GAT GGT CCA ACT GCT ATC AGA GAT GTG GCT TCC1278P D V A M T L A V V A L F A D G P T A I R D V A S1279 TGG AGA GTA AAG GAA ACC GAA AGG ATG GTT GCA ATT CGG ACC GAG CTA ACA AAG CTG GGA GCA TCG GTT GAA GAA1353W R V K E T E R M V A I R T E L T K L G A S V E E1354 GGT CCT GAC TAC TGC ATC ATC ACC CCA CCG GAG AAG CTG AAC ATC ACG GCA ATC GAC ACC TAC GAT GAT CAC AGG1428G P D Y C I I T P P E K L N I T A I D T Y D D H R1429 ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTC GCT GCC TGC GCC GAC GTG CCC GTG ACG ATC AGG GAC CCT GGT TGC ACC CGC AAG1503M A M A F S L A A C A D V P V T I R D P G C T R K1504 ACC TTC CCC AAC TAC TTC GAC GTT CTA AGC ACT TTC GTC AGG AAC TGA ACTGAGCTTTTAAAAGAGTGAGTCTAGGTTCTGTTG 1588T F P N Y F D V L S T F V R N ***
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶或具有該酶活性的片段或功能衍生物。
2.一種編碼權利要求1所述的酶或具有該酶活性的片段或功能衍生物的核酸分子。
3.按權利要求2所述的核酸分子，該分子選自(a)含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的核酸分子；(b)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質的核酸序列；(c)含有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的核酸分子；(d)因遺傳密碼的簡并性引起的核苷酸序列與(a)、(b)或(c)所述的核酸分子的序列有所不同但仍編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質的核酸分子。
4.按權利要求3所述的核酸分子，它為DNA分子。
5.按權利要求4所述的核酸分子，其中，所述的DNA分子是cDNA分子或基因組DNA分子。
6.按權利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有85％以上的同源性。
7.一種利用水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因生產抗除草劑的細胞和植株的方法，該方法包括以下步驟(a)將水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的上游端沿有義方向上連接于啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上，進而構建植物表達載體；(b)將構建好的植物表達載體導入植物細胞；(c)在適宜的培養條件下將轉化后的植物細胞再生，得到表達目的基因的植株。
8.按權利要求7所述的方法，其特征在于，所述啟動子包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子以及由啟動子和調控元件組成的復合啟動子。
9.按權利要求7所述的方法，其特征在于，所用的轉化方法包括農桿菌介導的轉化方法、基因槍法、原生質體介導的轉化方法、電擊法以及整體水平的轉化方法。
10.按權利要求7所述的方法，其中，所述的除草劑是N-(膦羥甲基)甘氨酸異丙胺鹽〔N-(phosphonomethyl)glycine，草甘膦〕。
11.按權利要求10所述的方法，其中，所述的除草劑包括草甘膦前體、草甘膦衍生物以及以草甘膦為主要成分的混合物。
12.由權利要求7所述的方法得到的植株及其子代。
13.權利要求10的植株，其特征在于，該植株是單子葉植物。
14.權利要求12所述的植株，它是水稻、玉米、小麥、大麥或高粱。
15.權利要求10的植株，其特征在于，該植株是雙子葉植物。
16.權利要求13所述的植株，它是煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍或青椒。
全文摘要
本發明涉及編碼水稻5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶的核酸分子。本發明還涉及經過轉化的植物細胞和由這些細胞再生的植物,它們表現出抗除草劑草甘膦的特性。
文檔編號C12N15/82GK1384192SQ0111582
公開日2002年12月11日 申請日期2001年5月8日 優先權日2001年5月8日
發明者朱禎, 徐軍望 申請人:中國科學院遺傳研究所