一種控制植物貯存淀粉發生改變的方法

專利名稱：一種控制植物貯存淀粉發生改變的方法
技術領域：
本發明提供了一種控制植物貯存淀粉發生改變的方法，和由該方法得到的植株。
淀粉是許多糧食作物(如水稻、玉米等)的種子、馬鈴薯塊莖、多種植物塊根的主要組成成份，是高等植物的重要貯存多糖(參考Visser等，1993 TIBTECH 11，63-68)。在人類生活中，淀粉有著舉足輕重的作用。僅禾谷類籽粒中的淀粉就提供了人類大約80％的能量所需，還有數以百計的食品和飲料與淀粉直接相關。在非食用的領域，淀粉還可作為工業原材料，廣泛用于造紙業、包裝業、紡織業、化工業等工業之中(參考Munro等，1994 Cereal Foods World 39，552-555)。
淀粉根據結構的差異，可分為直鏈淀粉(amylose)和支鏈淀粉(amylopectin)兩種。直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量比例影響著淀粉粒的結構和特征(參考Martin等，1995 The Plant Cell 7，971-985)。直鏈淀粉是由α-1，4-糖苷鍵連接而成的線性多聚糖，在不同物種直鏈淀粉含量可從11％到37％；同一物種的不同品種(如玉米)的直鏈淀粉含量也可從20％到36％(參考Detherage等，1955 Trans.Am.Assoc.Cereal.Chem.13，31-42)；另外，植物的不同器官，不同發育階段，甚至是不同生長條件也可以影響植物直鏈淀粉的含量。直鏈淀粉通常也有低水平的分支，每1000個糖殘基約有一個分支。純化后的直鏈淀粉在溶液中形成分子間的水和物，呈剛性的凝膠狀態。另外，通過加熱和濃縮，隨著聚合程度和溫度的變化，直鏈淀粉也會縮小并結晶。支鏈淀粉是由α-1，4-糖苷鍵和α-1，6-糖苷鍵連接而成的具有分支的多聚糖，它是淀粉主要組成部分，占70％之多。
在高等植物中，淀粉合成的主要場所是淀粉體和葉綠體。在葉綠體中合成的淀粉貯藏時間較短，只是作為臨時的儲備碳源供其它代謝使用，這種淀粉常稱為“臨時淀粉”；在淀粉體中合成的淀粉貯藏時間較長，稱為“貯藏淀粉”，常作為種子發芽時的營養物質(參考Morell等，1995，Aust.J.Plant Physiol.22，647-660)。我們常提到的淀粉如果沒有特指，一般是指后者。
淀粉在葉綠體和淀粉體的合成過程受到一系列酶的調控。在葉綠體中，參與淀粉合成的碳源物質是通過卡爾文循環固定的CO2，而在淀粉體中，由于它自身不能進行光合作用固定CO2，所以它依賴蔗糖作為淀粉合成的碳源。經水解后的蔗糖以磷酸葡萄糖的形式進入淀粉體中參與淀粉的合成。在淀粉合成的最后階段三個關鍵性的酶為ADPG焦磷酸化酶(ADPGlc pyrophosphorylase，AGPP)，淀粉合成酶(Starch synthase，SS)和淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)(參考Smith，1997Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，67-87)。最近發現淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme，DBE)在淀粉生物合成中也起到重要作用(參考Monille等，1996 The plant Cell 8，1353-1366)。

圖1是在淀粉體中淀粉合成的過程示意圖。
淀粉的用途基本可分為兩個主要的領域，一個領域是通過酶解或化學方法得到淀粉的水解產物，如葡萄糖和葡聚糖等組分，把它們作為其它化學修飾和發酵的起始物質。另一個領域是利用淀粉的聚合能力等特性，不經任何修飾的天然淀粉廣泛用于食品和非食品領域。包括如下幾類1.用于糧食。淀粉是多種糧食的典型添加物，其中淀粉的主要目的是結合含水的添加物和/或導致粘度增加或凝膠結構的增加。在這個應用領域主要考慮淀粉的流動和吸附作用、膨脹和糊化溫度、粘度和稠化特性、淀粉的溶解性、透明度、對熱、剪切力和酸的抗性、薄膜形成能力、對冷凍/融化的抗性、可消化能力以及與無機或有機離子形成復合物的能力。這之中，優選領域是面包房的各類面食和面團領域。
2.用于非糧食類。淀粉在非糧食類領域的運用主要是用作多種生產過程中的佐劑或技術產物中的添加物。
2.1造紙和紙板工業。淀粉用作佐劑的主要應用領域首推造紙和紙板工業，在造紙過程中，淀粉有如下四個利用領域，即表面處理、涂層、聚集和噴涂分開。在表面處理方面對淀粉的需求實質上是高水平的亮度、相應的粘度、高穩定性、形成良好的薄膜以及形成較少灰塵。當用于涂層時，固體含量、相應的粘度、高結合能力以及高的顏料親和性起著重要的作用。作為聚集時的添加物，重要的是快速、均一、無耗損的分散、高機械穩定性和完全保留在紙漿中。當使用淀粉噴涂時，固體的相應含量、高粘度以及高結合能力也很重要。
2.2粘合劑工業。淀粉在該領域的應用可分為如下幾個方面用作純粹的淀粉膠；用于特殊化合物制備的淀粉膠；用作合成樹脂和聚合物分散相的添加物，以及將淀粉用作合成添加物的膨脹劑。所有基于淀粉的添加物中有90％被用于生產波面紙板，硬質袋和紙包，紙和鋁的組合材料，紙箱，以及信封、郵票的濕潤膠等。
2.3紡織品和紡織品維護工業。在紡織工業中，可用于如下3個應用領域淀粉用作上漿劑，增強紡織品的磨損抗性；用于紡織品漂白、染色等處理后改良紡織品的試劑；作為染料糊劑生產中的增稠劑以防止染料擴散等。
2.4建筑工業。淀粉在這個領域的應用是作為建筑材料的添加物。如生產灰膠紙柏板，其中用水混合于稀灰漿中的淀粉糊化，淀粉在灰膠柏板的表面進行擴散，從而使紙板與板結合。另一個用途如將淀粉與灰漿和礦物纖維混合。在混合好的凝膠結合物中，可使用淀粉以使上漿的進程減速。
2.5淀粉用于植物保護劑和肥料。淀粉在這個領域主要是用于植物保護劑的修飾賦予這些制品一些特殊特性。如，淀粉可用于改善植物保護劑和肥料的濕度，活性組分的劑量釋放，將液體的、易揮發的和/或有氣味的活性組分轉變為微晶的、穩定的、可變形的物質混合不相容的組合物，以及因破碎減少而導致的作用時期延長。
2.6藥物、藥品和化妝品工業。在制藥工業中，淀粉可用作片劑的結合劑或用于膠囊內的結合劑。另外，淀粉也適用于片劑的崩解劑。淀粉吸收了液體，短時間后，淀粉膨脹以使活性組分被釋放出來。在化妝領域，淀粉可用作例如粉末添加物(香水劑和水樣酸)的載體。常見的應用的領域是牙膏。
2.7淀粉用作煤炭和煤球的添加物。在煤炭和煤球中通過加入淀粉，煤炭可以定量凝聚和/或高質量成球，從而防止煤球在球化之前崩解。在市售的煤碳商品中，燒烤用的煤炭含有4-6％的添加淀粉；加熱用的煤炭含有0.1-0.5％的加入淀粉。另外，淀粉因其良好的結合性能，加入到煤炭和煤球中可以在很大程度上減少有毒物質的散發。
2.8淀粉用作鑄造中的添加物。在鑄造過程中，常常需要結合劑與粗礦石混合以產生核心。目前，最常用的結合劑是與經修飾的淀粉、多半為膨脹淀粉混合的膨潤土。另外，在冷水中的分散能力、重新水合能力、與粗礦石良好的混合能力和高的結合水的能力，使得膨脹淀粉在這個領域得到了更廣泛的運用。
2.9淀粉生產可降解塑料。目前所應用的塑料制品中，大都是傳統的塑料，在自然條件下不能分解，不易回收，年復一年造成了土壤的嚴重污染，給整個地球造成“白色公害”即“白色污染”。近年來，全球性的環境保護組織呼吁“清除白色公害，為民造福”。以淀粉為主要原材料，生產出的生物/光雙降解淀粉塑料，是當今世界為消除白色污染所開創、發明的新型工業綠色原材料。
另外，淀粉還可用于橡膠工業、作為皮革代用品等。
淀粉因其在人類生活中的重要地位，所以對于淀粉合成的研究一直沒有中斷過。80年代以前，多數研究集中于對淀粉合成中各種酶的生物化學的鑒定，包括酶的分離和純化等。自80年代中期以來，研究人員對參與淀粉合成的酶進行了廣泛的分子生物學研究。進入90年代，隨著淀粉合成過程中相關酶的基因克隆以及各種植物遺傳轉化體系的相繼建立，使利用基因工程調控淀粉合成過程，改良淀粉品質成為可能。
植物基因工程是80年代興起的一門頗具吸引力的現代生物學技術，已在抗病、抗蟲、抗逆、品質改良等方面取得了令人矚目的成績。近年來，利用基因工程來改良淀粉品質的研究逐漸增多，一方面，人們期望利用基因工程這個手段進一步澄清目前尚不十分清楚的淀粉合成過程，特別是上述各種酶及其同工酶的功能、特性，以及各種酶之間的協調關系；另一方面，人們希望利用基因工程來調節淀粉合成過程中特定酶的含量或幾種酶之間的比例，從而達到增加淀粉含量或獲得獨特性質、新型的淀粉以用于食品或其他工業之中。從現有的研究看，利用基因工程改良淀粉品質有如下三個途徑1)利用反義RNA技術降低或完全抑制內源特定基因的表達。反義RNA技術是把一段或全長基因編碼系列反向置于一個合適的啟動子下，通過產生反義的mRNA與內源特異基因的mRNA形成一個復合體，阻礙內源基因的mRNA的翻譯，從而達到降低或完全抑制內源特定基因的表達。在減少淀粉含量方面，Muller-Rober等人(1992 EMBO J.11(4)，1229-1238)利用含有不同啟動子和反向連接的AGPP大或小亞基cDNA的融合基因構建表達載體，轉化馬鈴薯。在35S加上反向連接的AGPP大亞基cDNA的融合基因轉化植株中，葉片的AGPP活性僅為野生型的5-30％，塊莖中AGPP活性降得更低，活性僅為野生型的2％。分析轉化植株淀粉含量，結果表明轉化植株塊莖淀粉含量僅為野生型的5-3.5％。伴隨這淀粉含量的下降，轉化植株細胞內可溶性糖顯著升高。蔗糖和葡萄糖分別占塊莖干重的30％和8％。例如，Visser等人(1991Mol.Gen.Gent.225，289-296)利用反義RNA技術，向馬鈴薯中導入反向連接的GBSS基因，導致GBSS基因含量和活性下降，進而導致馬鈴薯塊莖中直鏈淀粉含量銳減(減少70％-100％)。相反，在無直鏈淀粉的馬鈴薯塊莖中導入GBSS基因，成功地彌補了直鏈淀粉的缺乏(參考Van derLeij等，1991 Theor.Appl.Genet.82，289-295)。在轉GBSS基因的植株的根尖、氣孔保衛細胞以及花粉粒中都發現有直鏈淀粉，在塊莖中的直鏈淀粉的含量占總淀粉的20％，基本恢復到了正常水平。同樣地利用反義RNA技術，在木薯(參考Salehuzzman等，1993 Plant Mol.Bio.23，947-962)，水稻等植物中，也獲得了低(或無)直鏈淀粉的轉化體。可以說，對GBSS的操作是控制直鏈淀粉的可靠途徑。尚無通過調控SSS、SBE等基因來改變支鏈淀粉含量的文獻報道，但已有不少的專利報道。國際專利WO9722703A2報道了用玉米的SBEIIb轉化玉米的研究。把SBEIIb的cDNA基因或部分片斷正向或反向置于玉米zein蛋白啟動子(胚乳特異性啟動子)控制下組成一系列植物表達載體，轉化玉米，成功得獲得了轉基因植株。在轉化SBEIIb基因3′部分序列反義結構的轉基因玉米中，內源的SBE基因受到了抑制，轉基因玉米淀粉粒中較長糖鏈增加了近2倍。在5′部分序列反義結構表達載體、以及SBEIIb基因全長cDNA反義結構表達載體中也獲得了類似的結果。
2)過量表達內源基因。這種方法用于淀粉品質的改良有兩種效應。通過高效表達內源的AGPP基因，在理論上將提高淀粉的積累；另一方面，通過高效表達內源的淀粉分支酶基因，在理論上可以增加淀粉的分支水平，影響直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例，進而改進淀粉的品質。
3)表達異源淀粉(或糖元)合成相關基因。異源的基因可來自不同種屬的植物，也可來自微生物、動物等。Stark等人(1992 Science 258，287-292)利用突變的大腸桿菌菌株618來源的AGPP基因glgC16(對變構調節不敏感)加上不同的啟動子，構建植物表達載體。這之中，以CaMV35s為啟動子的表達載體轉化植物，獲得極少的轉基因植株，表明AGPP基因的組成性表達對植物的生長、發育是有害的，它很可能改變了植物不同組織之間源庫與沉積的關系。而利用塊莖特異性表達的patatin基因啟動子的表達載體轉化植物，情況大為好轉。把這個表達載體導入煙草愈傷組織中，獲得了大量轉基因煙草愈傷組織。淀粉含量分析表明，轉基因煙草淀粉平均值占干重的10.7％。有些轉基因煙草淀粉干重高達27％，而對照非轉基因煙草卻僅含3.4％的淀粉。用上述表達載體進一步轉化馬鈴薯，成功地獲得了轉化植株。在轉化植株中，淀粉含量平均提高了35％。在轉化突變型的AGPP基因的同時，Stark等人還轉化了野生型的AGPP基因，轉基因植物淀粉含量沒有明顯的增加，再次印證了AGPP基因的變構調節對淀粉合成效率的重要性。
水稻是中國第一大糧食作物，播種面積在三千萬公頃以上，年總產量達到2億多噸，占世界水稻總產量的34％，全國糧食產量的40％以上。在過去一個時期，稻米生產只注重產量的提高，而忽視品質的改良。因此，盡管我國的水稻產量雄居世界首位，但稻米國際貿易額只占全球的5％以下；而泰國稻米年產量不足我國的五分之一，但由于品質優良，卻占據了世界稻米貿易額的50％以上。而且從歷史的角度看，我國稻米出口量自80年代以來呈現出縮減的趨勢，在國際市場上的競爭力逐年下降。改良稻米品質，增強國際競爭力，挽救日漸萎縮的國際市場勢在必行。
稻米的品質一般包括加工品質、外觀品質、蒸煮和食味品質以及營養品質四個方面。在多數情況下，米質更多的是指米飯的外觀和適口性，它與稻米的直鏈淀粉含量和米粒的形態密切相關。具有高直鏈淀粉含量(＞25％)的秈稻，米飯干燥蓬松，色澤滯暗，冷卻后變硬，食味不佳；在我國南方大面積(8000萬畝)種植的早秈品種大多數屬于上述類型；而直鏈淀粉含量適中的秈米，米飯蓬松有光澤，冷涼后質地仍保持較為松軟濕潤，受到消費者的歡迎。從總體上評價，中國稻米在糙米率、精米率、糊化溫度、蛋白質含量等項指標較好，達標率較高；而堊白率、直鏈淀粉含量等項指標較差，達標率不到30％。大多數品種堊白大，直鏈淀粉含量高。在我國廣泛種植的雜交水稻品種品質較差的主要原因也是由于其親本直鏈淀粉含量過高造成的。減少堊白，降低直鏈淀粉含量，改善直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例，增加米飯的柔軟性，是稻米品質改良的當務之急。
本發明的一個目的是提供一種利用水稻淀粉合成相關酶控制植物貯存淀粉發生改變的方法。
本發明的控制植物貯存淀粉發生改變的方法包括(a)制備嵌合基因，它包括編碼淀粉合成過程中的相關基因，該基因的上游端沿有義或反義方向可連接于一個具有啟動子活性的核酸片段上，其下游連接于一種轉錄終止子。(b)用步驟(a)的嵌合基因轉化，獲取含有步驟(a)嵌合基因的轉化植物。
本發明的方法中，所述的淀粉的改變可以是淀粉含量變化；淀粉中直鏈淀粉含量的上升或下降；淀粉中支鏈淀粉含量的上升或下降；淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例的變化；或者淀粉支鏈淀粉分支度的變化。其中，所述編碼淀粉合成過程中的相關基因可以是水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)、水稻淀粉分支酶3基因(RBE3)、水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、水稻淀粉去分支酶基因(DBE)。所述的啟動子是在植物中能驅動外源基因表達的核苷酸序列，包括組成型表達的啟動子、組織特異性表達的啟動子、器官特異性表達的啟動子、誘導型啟動子以及不同啟動子之間或啟動子和調控序列構成的復合啟動子，其中，所述的組織特異性表達的啟動子可以包括胚乳特異性表達的啟動子、塊根或塊莖特異性表達的啟動子。
在本發明的方法中，所述編碼水稻淀粉合成相關基因的核酸片段的上游端可以沿有義方向上連接于一個編碼一種能在胚乳組織中指導基因特異表達的啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上。或者，所述編碼水稻淀粉合成相關基因的核酸片段的上游端沿反義方向上連接于一個編碼一種能在胚乳組織中指導基因特異表達的啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上。其中，轉有義的水稻淀粉合成酶基因(SSS)、轉反義的水稻淀粉去分支酶基因(DBE)以及反義的水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)可以提高淀粉含量。轉有義的水稻水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)和水稻淀粉分支酶3基因(RBE3)，可以降低直鏈淀粉含量或提高支鏈淀粉含量。其中所述的啟動子最好是水稻谷蛋白A亞類的GluA-1蛋白的啟動子。
本發明的另一個目的是提供一種本發明的方法制備的轉化植物或其任何子代和由上述材料衍生的組織。
所述的植物是貯存淀粉的植物。最好是水稻、玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、甘薯、馬鈴薯及其衍生的細胞、組織。
本發明的方法中所使用的植物表達載體，它含有水稻淀粉分支酶I基因或水稻可溶性淀粉合成酶基因，受控于胚乳特異性表達的啟動子下。載體可以是細菌質粒載體，植物轉化載體及其它不同形式的載體。本領域普通技術人員應該知道，外源基因在植物體內的表達可以由不同的啟動子來驅動，且單子葉、雙子葉中表達外源基因一般采用不同的啟動子。本發明涉及的植物轉化載體可用胚乳特異性表達的啟動子、塊根或塊莖特異性表達的啟動子，以及不同啟動子之間或啟動子和調控序列構成的復合啟動子來驅動基因的表達。
本發明還提供了含有該表達載體的轉化的植物細胞。
本發明涉及的細胞包括但不限于細菌，根癌農桿菌，植物細胞。植物細胞可以是雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞，包括但不限于煙草、馬鈴薯、甘薯、水稻、玉米、小麥、等植物細胞及含有此類細胞的完整的轉基因植株。轉基因植株可由許多對本領域普通技術人員來說非常熟知的轉化技術，包括但不限于基因槍轉化、農桿菌介導轉化等獲得。
在本文中，“淀粉合成相關基因”是指在植物淀粉合成的過程中涉及到的催化每步反應的酶的編碼序列。淀粉合成酶是一個葡萄糖轉移酶，它以寡聚糖為前體，ADP-葡萄糖為底物，通過α(1，4)糖苷鍵不斷增加寡聚糖的葡萄糖單位，最終合成以α(1，4)糖苷鍵連接的聚糖。淀粉分支酶(SBE)具有雙重功能，一方面它能切開以α(1，4)糖苷鍵連接的葡聚糖(包括直鏈淀粉或支鏈淀粉的直鏈區)，另一方面它又能把切下的短鏈通過α(1，6)糖苷鍵連接于受體鏈上。淀粉去分支酶能特異性地水解淀粉中的α(1，6)糖苷鍵，對淀粉精細結構的最終形成具有重要作用。轉有義的水稻淀粉合成酶基因(SSS)、轉反義的水稻淀粉去分支酶基因(DBE)以及反義的水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)可以提高淀粉含量。轉有義的水稻水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)和水稻淀粉分支酶3基因(RBE3)，可以降低直鏈淀粉含量或提高支鏈淀粉含量。
本文所披露的內容中，使用了很多術語。在本文中，“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區前面(5’非編碼區)和后面(3’非編碼區)的調控序列。“嵌合基因”是指包括異源調控序列和編碼序列的基因。“內源基因”是指正常存在于其在基因組中的天然基因座位上的天然基因。“外源基因”是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉移導入的基因；也可是指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導致一種內源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現。
在本文中，合適的“調控序列”是指位于編碼序列上游(5’)、中間、和/或下游(3’)的核苷酸序列，由它控制該編碼序列的轉錄和/或表達。所述調控序列包括啟動子、翻譯前導序列、轉錄終止序列和聚腺苷酸化序列。
“啟動子”是指一段可與RNA聚合酶及其他一些影響轉錄的反式因子結合而準確有效地起始轉錄的DNA序列。“組成型啟動子”是能驅動目的基因在生物體各發育階段和不同部位表達，且表達水平沒有明顯差異的一類啟動子。“組織特異性啟動子”是指驅動目的基因在生物體特定組織中表達的一類啟動子。“器官特異性啟動子”是指驅動目的基因在生物體特定器官中表達的一類啟動子。“誘導型啟動子”是指在一定的外界條件下(如光、溫、化學物質等)誘導下驅動目的基因表達的一類啟動子。
“復合啟動子”是不同啟動子之間或啟動子和調控序列共同構成的。調控元件包括能增強外源基因表達或調控基因在植物中表達部位的各種來源的DNA序列。旨在增強外源基因表達的序列是水稻Actin1內含子1、玉米Ubiquitin內含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1內含子1、玉米乙醇脫氫酶1-S基因內含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外顯子以及水稻EPSP合成酶基因第一內含子。
“增強子”是能夠增強啟動子轉錄活性的一段順式調控序列。“內含子”是一段不轉錄的DNA序列，某些基因的個別內含子能增強啟動子的轉錄活性。
“表達”是指基因在生物體內轉錄和翻譯成有活性的蛋白產物的過程。“反義抑制”是指通過轉錄獲得的反義RNA抑制體內相對應的mRNA的正常翻譯，降低或完全抑制目標蛋白的表達。
“轉化”是指將一種已知功能的基因轉入一種宿主生物的基因組中，導致遺傳學上穩定的遺傳。含有所述核酸片段的宿主生物被稱作“轉基因”生物，或稱為GMO(Genetic Modification Organism)。
本發明涉及轉基因水稻的培育，其中，對編碼參與水稻淀粉分支酶I基因、水稻淀粉分支酶3基因、水稻可溶性淀粉合成酶基因、水稻淀粉去分支酶基因的表達進行調控，以實現淀粉含量以及淀粉質量的改變。水稻淀粉分支酶I基因、水稻淀粉分支酶3基因、水稻可溶性淀粉合成酶基因、水稻淀粉去分支酶基因來源于水稻未成熟種子的cDNA文庫的篩選。文庫的篩選采用本領域技術人員熟悉的PCR篩選文庫的方法，它是利用96孔板和一對特異的引物，逐級從cDNA文庫篩選目標克隆，最終獲得目標DNA片段。獲得上述基因的方法，還包括以水稻第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增或化學合成。
本發明中涉及的啟動子是可以在水稻種子胚乳中進行特異表達的啟動子。這一點是特別有用的，因為種子是貯藏淀粉積累的主要場所。另外，種子特異性表達可以避免分支酶調控可能對非種子器官造成的任何潛在損害作用。目前已有很多用于轉基因植物中進行種子貯存蛋白的種子特異性表達的例子。其中包括來自單子葉植物的基因，如編碼大麥醇溶蛋白、小麥的谷蛋白的基因；也有來子雙子葉植物所謂基因，如擬南芥2S蛋白、豆類云扁豆蛋白基因等。
采用本領域技術人員熟知的DNA重組方法，對表達載體進行重組構建。對于本領域的技術人員而言，有多種將一個DNA序列導入高等植物的真核細胞的方法。這些方法包括基因槍法(參見Klein等(1987)Nature32770-73)；農桿菌的Ti和Ri質粒介導的轉化方法(參見Pacciotti等(1985)Bio/Technology 3241；Potrykus等(1985)Mol.Gen.Genet.199183-188；Hiei等(1994)The Plant J，6271-282)。另外還有其它轉化方法，如外源DNA直接導入法和電擊法等。細胞一旦轉化后，即可由本領域技術人員再生。獲得了用上述方法之一轉化的轉基因單株后，在本發明中，可以通過潮霉素來篩選抗性植株，并結合分子檢測的方法，鑒定轉基因的整合情況，用碘染色法來測定直鏈淀粉含量。
利用淀粉合成相關基因轉化植物，可以獲得大量的淀粉精細結構發生改變的突變型。這些突變相比于自然界中已知的淀粉突變型具有顯著的優點。一是通過轉化產生的突變類型較為豐富；二是轉化產生的突變通常是顯性的，它用于育種中可以簡化并加快育種進程。除了在育種中的運用外，這些突變體產生的新型淀粉可以迎合不同的工業需要，減少利用化學修飾改造淀粉所帶來的昂貴費用。
附圖簡要說明附圖1淀粉合成過程示意圖。其中，Glc-1-P是1-磷酸-葡萄糖；ADP-Glc為ADP-葡萄糖；AGPP為ADPG焦磷酸化酶；GBSS為顆粒凝結型淀粉合成酶；SSS為可溶性淀粉合成酶；SBE為淀粉分支酶；DBE為淀粉去分支酶。
附圖2質粒pBlueRBE1酶切圖譜。RBE1基因cDNA全序列包括5′端41bp非轉譯序列，2463bp編碼序列，3′端265bp非轉譯序列。質粒骨架來自pBlueSK。
附圖3質粒pBlueSSS酶切圖譜。SSS基因cDNA全序列包括5’端非編碼序列139bp；3’端非編碼序列568bp；以及1878bp的編碼序列，共編碼626個氨基酸。質粒骨架來自pBlueSK。
附圖4質粒pSPROK酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子。
附圖5質粒pTO126酶切圖譜。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子，屬胚乳特異性表達。
附圖6質粒pSPRBE1(F)酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子，RBE1基因正向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pSPROK。
附圖7質粒pSPRBE1(R)酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子，RBE1基因反向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pSPROK。
附圖8質粒pGt1RBE1(F)酶切圖譜。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子，屬胚乳特異性表達，RBE1基因正向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pTO126。
附圖9質粒pGt1RBE1(R)酶切圖譜。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子，屬胚乳特異性表達，RBE1基因反向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pTO126。
附圖10質粒pSPSSS(F)酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子，SSS基因正向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pSPROK。
附圖11質粒pSPSSS(R)酶切圖譜。P-35S是CaMV的35S啟動子，屬組成型啟動子，SSS基因反向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pSPROK。
附圖12質粒pGt1SSS(F)酶切圖譜。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子，屬胚乳特異性表達，SSS基因正向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pTO126。
附圖13質粒pGt1SSS(R)酶切圖譜。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子，屬胚乳特異性表達，SSS基因反向連接于啟動子下。質粒骨架來自質粒pTO126。
附圖14質粒pCGR1(F)-Hyg酶切圖譜。該質粒可用來轉化單子葉植物。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子正向調控RBE1基因。Hyg是抗潮霉素篩選標記。質粒骨架來自pC1300。
附圖15質粒pCGR1(R)-Hyg酶切圖譜。該質粒可用來轉化單子葉植物。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子反向調控RBE1基因。Hyg是抗潮霉素篩選標記。質粒骨架來自pC1300。
附圖16質粒pCGS(F)-Hyg酶切圖譜。該質粒可用來轉化單子葉植物。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子正向調控SSS基因。Hyg是抗潮霉素篩選標記。質粒骨架來自pC1300。
附圖17質粒pCGS(R)-Hyg酶切圖譜。該質粒可用來轉化單子葉植物。P-Gt1是水稻谷蛋白1的啟動子反向調控SSS基因。Hyg是抗潮霉素篩選標記。質粒骨架來自pC1300。
附圖18克隆獲得水稻淀粉分支酶I基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列。
附圖19克隆獲得水稻可溶性淀粉合成酶基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列。
附圖20轉正義RBE1基因的轉基因水稻植株PCR檢測。aPCR檢測Hyg片段1～10轉基因水稻；11非轉基因水稻(陰性對照)；12pCGt1RBE1(F)質粒(陽性對照)；MDL2000分子量Marker(2000，1000，750，500，250，100)。bPCR檢測水稻淀粉分支酶I(RBEI)基因1～8轉基因水稻；9非轉基因水稻(陰性對照)；10pCGt1RBE1(F)質粒(陽性對照)；MDL2000分子量Marker(2000，1000，750，500，250，100)。
以下實施例將對本發明作進一步的說明。
水稻淀粉分支酶I基因的克隆根據水稻淀粉分支酶(RBE1)cDNA序列(Nakamura Y等1992，PlantPhysiol，99，1265-1266)，合成一對針對水稻淀粉分支酶序列特異性引物RI-15’ACCAATTTCTCAGTTCCTGCG3’RI-25’TCTGTATGTGCTTACTTCTGG3’擴增片段長644bp(From 183-827)文庫選用水稻品種南粳37未成熟種子cDNA文庫。采用PCR篩選文庫的方法。在每一輪篩選過程中，文庫或陽性孔噬菌體在96孔細胞培養板上擴繁完后，首先作列PCR，以確定陽性列；任選一個陽性列，作孔PCR，以確定陽性的孔。對上一輪陽性孔噬菌體進行滴度測定，確定每微升噬菌體數目，作為下一輪每孔噬菌體數目的參考。對水稻淀粉分支酶I的篩選，共進行了4輪。在第一輪篩選時，取1ul cDNA文庫原液(滴度約為2.0×105pfu/ul)與400ul Y1090宿主菌混合，然后均分為96份，這樣每孔所含噬菌體數目約為2×103pfu。列PCR顯示1，2，4，5，6，7，8，9，11，12列為陽性。選第1列各孔(1A～1H)作孔PCR，結果顯示1F，1D為陽性孔。測定第一輪篩選的陽性孔1D的滴度，其每微升中含噬菌體數為6.0×104。在第二輪篩選時，控制每孔的噬菌體數目為240pfu(陽性孔1D的1/10稀釋度噬菌體液10ul與400ul Y1090宿主菌混合，每孔加入4ul混合液)。列PCR顯示3，6，9，11列為陽性。選第3列各孔(3A～3H)作孔PCR，結果顯示3A孔為陽性孔。測定第二輪篩選的陽性孔3A的滴度，其每微升中含噬菌體數為5.0×104；第三輪篩選時，控制每孔的噬菌體數目為40pfu(陽性孔3A的1/100稀釋度噬菌體液4ul與400ul Y1090宿主菌混合，每孔加入4ul混合液)，列PCR顯示5，7，11列為陽性。選第5列各孔(5A～5H)作孔PCR，結果顯示5B，5H孔為陽性孔。測定第三輪篩選的陽性孔5B的滴度，其每微升中含噬菌體數為1.0×104。第四輪篩選時，控制每孔的噬菌體數目為2pfu(陽性孔5B的1/100稀釋度噬菌體液2ul與400ul Y1090宿主菌混合，每孔加入4ul混合液)，列PCR顯示7列為陽性。選第7列各孔(7A～7H)作孔PCR，結果顯示7G，7H孔為陽性孔。從理論上計算，以這一輪陽性孔7G的噬菌體液鋪平板，在2個噬菌體中便有一個陽性的單噬菌板。
獲得目的基因的陽性單克隆后，鋪平板擴繁陽性噬斑。用WizardLambda Preps DNA purification system試劑盒提取噬菌體DNA。經NotI和EcoRI雙酶解回收插入的cDNA片段，插入到質粒pBluescriptSK(+)的相應位點，得到重組質粒pBlueRBE1。經酶切分析表明，插入片段為全長的水稻淀粉分支酶I(RBE1)基因，含有5’端、3’端非編碼序列RBE1基因的編碼序列。
植物表達載體的構建用NotI和HindIII雙酶切質粒pBlueRBE1回收RBE1基因的cDNA片段，插入到pSPROK的SmaI位點，獲得正向和反向重組質粒pSPRBE1(F)；用HindIII和BglII/Klenow雙酶切pTO126，回收Gt1啟動子片段，再用HindIII和XbaI/Klenow雙酶切pSPRBE1(F)回收去除35S啟動子的載體質粒片段，然后Gt1啟動子片段與去除了35S啟動子的載體質粒片段連接，獲得重組質粒pGt1RBE1(F)，RBE1基因置于啟動子Gt1控制下；用HindIII和BglII酶切下Gt1-RBE1(F)-Tnos結構，插入到pC1300/HindIII+BglII載體中，獲得最終植物表達載體pCGt1RBE1(F)。
下面采用基因槍法或農桿菌介導轉化的方法對水稻進行轉化a)利用基因槍法介導的轉化過程轉化受體的制備取水稻品種明恢86開花后12-15天的幼胚(滅菌處理)或幼胚來源的胚性愈傷組織(1mm)作為基因槍轉化的受體。待幼胚在誘導培養基培養2-3天后，仔細挑選將其轉移到盛有高滲培養基(NMBi+0.5M甘露醇)的平皿(直徑9cm)上，并擺放在平皿中央2-3cm的槍擊范圍內(盾片端朝上)，高滲預培養4小時后進行槍擊，胚性愈傷組織進行同上處理后再進行槍擊。
微彈DNA的制備稱取60mg的金粉(直徑1.0μm)置于1.5ml的Eppendorf管中，加入1ml無水乙醇，在漩渦振蕩器上振蕩1-2分鐘后靜置，重復振蕩三次，10，000rpm離心1分鐘，去上清液；再加入1ml的無菌水，重懸，可儲存于4℃冰箱或室溫保存。
充分振蕩起金粉懸液，取50μl，置滅菌的Eppendorf管中，依次加入5μl供體質粒DNA pCGR1(F)-Hyg(見附圖)(1.0μg/μl)溶液，50μl2.5M氯化鈣溶液，以及20μl 0.1M亞精胺溶液(抽濾滅菌)，充分振蕩約3分鐘，靜置10分鐘后，10,000rpm離心10秒鐘，盡可能去除上清液。加250μl無水乙醇，短暫振蕩后，10,000rpm離心10秒鐘，去上清后加60μl無水乙醇，并重新重懸，可供5槍之用(5-10μl一槍)。
基因槍的轟擊使用Dupond公司生產的PDS-1000/He型氣動式基因槍進行轉化，按產品說明書提供的方法操作。真空度為26-30英寸汞柱，氣壓為1,500或1,750psi，每皿轟擊二槍。
水稻抗性愈傷組織的篩選槍擊后的材料于高滲培養基上過夜后，轉移到不含hpt B的非選擇培養基上培養(即NMBi)5-7天后。將材料轉入含有hpt B的NMBs上選擇培養三次，暗培養，每次3-4周，hygB濃度依次為30mg/l、40mg/l和50mg/l。
b)利用農桿菌介導的方法的轉化過程根癌土壤桿菌的培養從根癌土壤桿菌儲液中(20％甘油-70℃保存)取少量菌液于YEB固體培養基(Km和Rif各50mg/L)28℃暗培養36-72小時，取單菌落轉接于20mlYEB液體培養基中(含Km，Rif各50mg/L，乙酰香酮100uM/L)于28℃避光培養過夜(約20小時)，次日測OD值稀至相應濃度(OD＝0.5)即肉眼見稍渾濁即可，以備轉化之用。
共培養取生長旺盛的胚性愈傷組織于滅菌培養皿中，加入相應濃度的根癌土壤桿菌液浸泡3-5分鐘后將愈傷組織轉接于共培養基上(上附無菌濾紙一張)，28℃暗培養2-3天。
預培養將共培養愈傷組織于無菌培養皿中，用含Cef 400mg/L的無菌水漂洗2-3次，在無菌濾紙上吸干后轉接于預培養基中26℃暗培養5-7天。
愈傷組織篩選培養將預培養的愈傷組織轉接于含HygB和Cef的篩選培養基上繼續培養3-4周，再將抗性愈傷組織(記克隆號)轉接于僅含HygB的篩選培養基上，篩選1-2次。
以下的步驟兩種方法共用。
抗性植株的再生將抗性愈傷組織轉至含hpt B 50mg/l的NMBr上，光照條件同前。待分化出的抗性小芽長至2-3cm時，將其轉至含hpt B 20mg/l的MMBg再生苗繼代培養基上，當長至完整的植株后，將其從固體培養基轉至營養液中開放式培養。待生成新根后，將苗轉入溫室。
上述過程中所使用的培養基見下表。
轉化水稻所用培養基一覽表成分 NMBi NMBS-1 NMBS-2 NMBr-1 NMBr-2 MMBg-1 MMBg-2大量元素N6N6N6 N6 N61/2MS 1/2MS微量元素MSMSMS MS MS1/2MS 1/2MS有機成分B5B5B5 B5 B51/2B5 1/2B5谷氨酰胺 250 250 250 250250 250250脯氨酸 -500 500 500500 - -水解酪蛋 300 300 300 300300 300300白PVP 3,000 3,000 3,000 - - - -2，4-D 2 2 1 - - - -NAA - - 1 - - - 0.2KT - -0.5 2.5 - - -6-BA- - - 0.5 - - 1TDZ - - - - 0.5 - -MET - - - - - - 1.25蔗糖60,000 60,000 60,000 30,000 30,000 20,000 20,000Gelrite 2,200 2,200 2,200 2,400 2,400- -瓊脂粉 - - - - - 6,500 6,500MgCl2500 500 500 500500 - -注N6N6培養基，MSMS培養基，B5B5培養基。i愈傷誘導培養基，s愈傷繼代培養基，r水稻植株再生培養基，g水稻植株繼代培養基。蔗糖、氨基酸、抗生素、激素及磷酸鹽抽濾滅菌，其它成分為高壓滅菌。
轉基因水稻植株的分子檢測提取部分潮霉素抗性植株的DNA進行PCR擴增，以P1、P2引物檢測潮霉素序列是否存在與轉基因植株基因組，在轉pCGt1RBE1(F)-Hyg質粒的水稻植株中(圖10.a)，可以擴增出bp特異帶，大小與陽性質粒擴增出來的帶大小相符；而未轉化轉基因水稻植株中均擴增不出此DNA條帶，說明潮霉素序列整合進轉基因水稻中；在此基礎上，對目的基因也進行了PCR檢測(圖10.b)，利用RI-1，RI-2為引物PCR擴增水稻分支酶I(RBE1)基因的整合情況，在轉基因水稻植株中擴增出2條DNA帶，一條長644bp，另一條長1,221bp，而在未轉化的水稻植株中只有一條長DNA帶1,221bp，這條帶是未轉化植株自身的淀粉分支酶I基因的基因組序列形成的擴增，擴增片段介于第2和第5外顯子之間，內含有3個內含子。
分析轉基因水稻植株中獲取的淀粉從來自轉基因水稻植株上R1代的種子提取淀粉，采用如下方法進行直鏈淀粉含量的測定利用改進簡化法；所用的設備儀器包括可見光分光光度計；分析天平；水浴鍋；1000ml容量瓶5ml移液管。所用的試劑包括a.1.00mol/L的氫氧化鈉(GB629-91；分析純)配制并標定；b.0.09mol/L氫氧化鈉溶液取90ml 1.00mol/L氫氧化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至100ml；c.碘液稱量2.00g碘(GB675-77；分析純)和20.00g碘化鉀(GB1272-77，分析純)混合，用蒸餾水溶解后，定容至1000mL；d.95％乙醇(GB679-80，分析純)；e.1.00mol/L乙酸溶液量取57.8mL冰乙酸(GB676-78，分析純)，用蒸餾水稀釋至1000mL。測定方法。a)用精米樣品制備過0.25mm孔徑的篩的米粉樣品2-3g，稱量0.1000g米粉，置于100mL容量瓶中，加入1.0mL95％乙醇，輕搖容量瓶，使樣品濕潤分散，加入9.0mL 1.00mol/L的氫氧化鈉溶液，使堿液沿頸壁緩慢流下，旋轉容量瓶，使堿液沖洗掉附于瓶壁上的樣品。將容量瓶置于沸水中煮10分鐘后取出，冷卻至室溫后，加蒸餾水定容，吸取5.0mL樣品溶液，加入已盛有半瓶蒸餾水的100mL容量瓶中，再在這容量瓶中加入1.0mL 1.00mol/L的乙酸溶液，使樣品酸化。加入1.50mL碘液，充分搖勻溶液。用空白溶液于分光光度計波長620nm處調節零點并測出有色樣品液的吸光度值。
標準曲線的繪制。稱取與待測樣品保存在同樣的條件下三天以上的高、中、低已知直鏈淀粉含量的標準樣品(其直鏈淀粉含量預先經ISO6647-1987或GB7648方法準確測定)各0.1000g。用上述改進簡化法與待測樣品同時進行測定。以標樣的直鏈淀粉為縱坐標，以相對應的吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線或列出曲線的回歸方程式。
取轉基因水稻R1代的種子20粒，制備米粉樣品2-3g，經堿和酸處理后，用碘液染色，用分光光度計于波長620nm測定樣品液的吸光度值，換算后，得樣品中的直鏈淀粉含量，列于表1。表1中可以看出，在所有分析的31個不同單株中，直鏈淀粉含量均有明顯的下降，下降平均值為15％，從未轉化水稻直鏈淀粉含量的平均值12.05％，下降到轉化水稻直鏈淀粉含量的平均值10.22％；個別單株下降幅度達了30％，直鏈淀粉含量已降至8.37％。
表1轉正義水稻淀粉分支酶I基因的轉基因植株R1代種子直鏈淀粉含量的測定編號 直鏈淀粉含量 編號 直鏈淀粉含量(％)(％)F01 9.24 F27 10.72F02 8.42 F28 10.43F03 8.37 F31 9.36F04 10.31 F32 9.11F05 10.39 F33 10.35F06 10.55 F34 10.81F07 9.61 F35 10.31F08 10.47 F36 10.56F11 11.26 F38 11.25F13 10.26 F41 11.29F14 11.64 F42 10.52F15 8.62 F43 10.76F18 11.75 F45 10.35F19 10.81 F46 9.82F20 9.82轉基因植株平均值10.22F22 9.69 對照平均值12.05F23 10.0權利要求
1.一種控制植物貯存淀粉發生改變的方法，包括(a)制備嵌合基因，它包括編碼淀粉合成過程中的相關基因，該基因的上游端沿有義或反義方向可連接于一個具有啟動子活性的核酸片段上，其下游連接于一種轉錄終止子；(b)用步驟(a)的嵌合基因轉化，獲取含有步驟(a)嵌合基因的轉化植物。
2.按照權利要求1的方法，其中，所述的淀粉的改變包括淀粉含量變化。
3.按照權利要求1的方法，其中，所述的淀粉的改變包括淀粉中直鏈淀粉含量的上升或下降。
4.按照權利要求1的方法，其中，所述的淀粉的改變包括淀粉中支鏈淀粉含量的上升或下降。
5.按照權利要求1的方法，其中，所述的淀粉的改變包括淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例的變化。
6.按照權利要求1的方法，其中，所述的淀粉的改變包括淀粉支鏈淀粉分支度的變化。
7.按照權利要求1的方法，其中，所述編碼淀粉合成過程中的相關基因是水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)、水稻淀粉分支酶3基因(RBE3)、水稻可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、水稻淀粉去分支酶基因(DBE)。
8.按照權利要求1的方法，其中，所述的啟動子是在植物中能驅動外源基因表達的核苷酸序列，包括組成型表達的啟動子、組織特異性表達的啟動子、器官特異性表達的啟動子、誘導型啟動子以及不同啟動子之間或啟動子和調控序列構成的復合啟動子。
9.按照權利要求8的方法，其中，所述的組織特異性表達的啟動子包括胚乳特異性表達的啟動子、塊根或塊莖特異性表達的啟動子。
10.按照權利要求1的方法，其中，所述編碼水稻淀粉合成相關基因的核酸片段的上游端沿有義方向上連接于一個編碼一種能在胚乳組織中指導基因特異表達的啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上。
11.按照權利要求1的方法，其中，所述編碼水稻淀粉合成相關基因的核酸片段的上游端沿反義方向上連接于一個編碼一種能在胚乳組織中指導基因特異表達的啟動子的核酸片段上，其下游端連接于編碼一種用于控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段上。
12.按照權利要求1的方法，其中，轉有義的水稻淀粉合成酶基因(SSS)、轉反義的水稻淀粉去分支酶基因(DBE)以及反義的水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)可以提高淀粉含量。
13.按照權利要求1的方法，其中，轉有義的水稻水稻淀粉分支酶I基因(RBE1)和水稻淀粉分支酶3基因(RBE3)，可以降低直鏈淀粉含量或提高支鏈淀粉含量。
14.按照權利要求10、11所述的方法，其中所述的啟動子是水稻谷蛋白A亞類的GluA-1蛋白的啟動子。
15.用權利要求1的方法制備的轉化植物或其任何子代和由上述材料衍生的組織。
16.按照權利要求15所述的植物，其特征在于，該植物是貯存淀粉的植物。
17.按照權利要求16所述的植物，其特征在于，該植物是水稻、玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、甘薯、馬鈴薯及其衍生的細胞、組織。
全文摘要
一種控制植物貯存淀粉發生改變的方法,包括:(a)制備嵌合基因,它包括編碼淀粉合成過程中的相關基因,該基因的上游端沿有義或反義方向可連接于一個具有啟動子活性的核酸片段上,其下游連接于一種轉錄終止子。(b)用步驟(a)的嵌合基因轉化,獲取含有步驟(a)嵌合基因的轉化植物。使用本發明的方法可使水稻胚乳內淀粉含量和精細結構發生改變。
文檔編號C12N15/63GK1384197SQ0111582
公開日2002年12月11日 申請日期2001年5月8日 優先權日2001年5月8日
發明者朱禎, 徐軍望 申請人:中國科學院遺傳研究所