一種用于葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法

專利名稱：一種用于葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體涉及一種用于葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法。
葡萄糖測定在醫療診斷、發酵工業中占有相當重要的地位。葡萄糖電極也是最早報道的、研究和應用最多、最廣泛的生物傳感器。1984年Cass等首先報道了一種以二茂鐵衍生物作為電子媒介體的葡萄糖傳感器，由此開創了酶—介體生物反應以及介體生物傳感器的研究領域，這類生物傳感器被稱為第二代傳感器。經與絲網印刷技術結合，構成能大批量生產的、性能優良的一次性(disposable)酶電極。其主導產品便攜式血糖酶電極已經擁有大約50％世界市場份額，是迄今開發最為成功的生物傳感器。然而，這類酶電極存在一個弱點，那就是線性范圍比較狹窄，檢測上限一般在20—25mmol/L，不能滿足高血糖病患者的需要。
本發明的目的是提供了一種用葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法，線性范圍寬，響應信號大，解決了傳統葡萄糖傳感器線性范圍狹窄的問題。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施所說的基因修飾的葡萄糖氧化酶是指在基因水平上，將能與介體二茂鐵甲酸特異接合的聚賴酸肽引入葡萄糖氧化酶的C末端。經過表達、純化，得到的融合蛋白用于制備葡萄糖傳感器。其步驟是1、合成編碼聚賴氨酸的DNA鏈(兩端含有克隆所需要的酶切位點)5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-32、通過基因拼接，構建融合蛋白的表達載體pPICGLT(GLT代表所構成的融合蛋白，即含有連接肽和聚賴氨酸鏈的葡萄糖氧化酶)上述合成的DNA鏈在65℃褪火7分鐘形成雙鏈的短DNA片段(片段1)；質粒pGEM-TGOL(2)DNA用限制性內切酶SnaBI和HindIII雙酶切，瓊脂糖電泳回收約1.7Kb左右片段，為片段2；質粒pPIC9 DNA用SnaBI和NOtI雙酶切回收8.0kb左右的片段，為片段3。片段1、片段2、片段3用T4DNA連接酶連接，得到融合蛋白的表達載體pPICGLT(GLT代表GOD-(Ser-Gly)5-(Lys)10)(見附

圖1)。
3、表達載體pPICGLT經限制性內切酶Stul線性化后，用原生質體轉化法轉化進酵母Pichiapastoris GS115中。
4、酵母重組子的篩選提取酵母的基因組DNA作PCR(聚合酶鏈式反應)檢測。
5、融合蛋白GLT的表達、純化，轉化子在30℃下MD培養基(酵母基本氯源培養基(YNB)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，生物素400μg/L)培養基中培養至OD600＝1.2-1.5，2000轉/分離心收集酵母細胞。將細胞重懸于10ml液體MM(YNB 1.7g/L，硫酸銨5g/L，甲醇12ml/L，生物素400μg/L，酪蛋白水解物10g/L，pH5.6)培養基中，每24小時向培養物中補加2ml甲醇，培養約72小時。離心收取上清液。用強陰離子交換柱Q-Sephorose Fast Flow純化柱純化。
6、融合蛋白GLT與介體的連接，融合蛋白中的聚賴氨酸鏈上的氨基與與介體二茂鐵甲酸上的羧基通過縮水反應連接。
7、葡萄糖傳感器的制備取經介體修飾的酶各2μl滴于工作電極的工作面積上。在室溫下干燥后，在電極表面覆蓋一層醋酸纖維膜，切成單個的電極，置于4℃干燥器中備用。
8、電化學檢測循環伏安檢測和計時電流檢測參照Model 270/250電化學軟件用戶手冊確定實驗過程。將制備好的介體酶電極與電化學系統連接，用微量注射器取20μl待測樣品滴于電極表面，立即啟動電化學系統進行循環伏安掃描。掃描參數如下起始電壓(EIi＝-0.5V，終止電壓(Eλ)＝+0.5V，掃描速度為20mV/S。樣品中含有0.1mol/L氯化鉀，起支持電解質的作用。計時電流法用來記錄響應電流，在固定的電壓下(+0.45V，相對于Ag/AgCl參比電極)，加入20μl樣品溶液后，電化學檢測便開始啟動，加緩沖液可得到背景電流值。在第30秒的電流值被記錄下來進行實驗分析。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果線性范圍寬，可達45mmol/L，且響應信號大，保存期長。
圖1為融合蛋白表達載體pPICGLT的構建流程圖。
圖2為融合蛋白瓊脂糖電泳檢測從重組酵母的基因組中PCR擴增的GLT基因示意圖。M1Kb DNA梯度分子量標準；1陽性對照；2，3PCR產物；4陰性對照。
圖3為三種酶電極的循環伏安檢測圖。a)Fc-GLT電極；b)Fc-GODc電極；c)Fc-GODw電極。(起始電壓，終止電壓(EI)＝-0.5V(Eλ)，掃描速度＝+0.5VmV/s)。
圖4為三種酶電極的線性范圍。a)Fc-GLT電極；b)Fc-GODc電極；c)Fc-GODw電極。(工作電壓＝450mV)下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述根據圖1、圖2、圖3、圖4可知，其具體步驟是1、合成(上海生工公司)編碼聚賴氨酸的DNA鏈(兩端含有克隆所需要的酶切位點)5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-32、通過基因拼接，構建融合蛋白的表達載體pPICGLT上述合成的DNA鏈在65℃褪火7分鐘形成雙鏈的短DNA片段(片段1)；質粒pGEM-TGOL DNA用限制性內切酶SnaBI和HindIII雙酶切，瓊脂糖電泳回收約1.7Kb左右片段，為片段2；質粒pPIC9 DNA用SnaBI和NOtI雙酶切回收8.0kb左右的片段，為片段3。酶切體系(60μl)10×bμffer 6μl，質粒DNA 45μl，0.1％BSA 6μl，限制性內切酶3μl。
酶切產物經瓊脂糖電泳(8％)檢測，用膠回收試劑盒(Sangon，Uniq-10)回收目的片段。片段1、片段2、片段3用T4DNA ligase連接，得到融合蛋白的表達載體pPICGLT(GLT代表GOD-(Ser-Gly)5-(Lys)10)(見附圖1)。連接體系中片段1、片段2、片段3的DNA含量之比為3∶1∶1。
連接體系(20μl)1.7Kb DNA8μl，8.0kb DNA9μl，10×緩沖液 2μl
I4DNA連接酶 1μl3、表達載體pPICGLT經限制性內切酶StuI線性化后，用原生質體轉化法轉化進酵母Pichia pastoris GS115中。
StuI酶切體系pPICGLTDNA44μl10×緩沖液6μlStuI 4μl滅菌的雙蒸水 6μl原生質體轉化法的步驟將50ml GS115培養物培養至細胞至OD600＝0.2，于2000轉/分離心5分鐘收集細胞，依次用10ml水、10ml SCE溶液(1mol/L山梨醇，1mmol/L EDTA，10mmmol/L檸檬鈉)洗滌，重懸細胞于10ml SK溶液(1mol/L山梨醇，67mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.5)中，加入20μl裂解酶(Lyticase)30℃作用30分鐘。原生質體依次用10ml山梨醇(1mol/L)洗兩次，10ml CaS(10mmol/L CaCl2，1mol/L山梨醇)洗一次，重懸原生質體于0.6ml的CaS中。取100ul原生質體、10ul質粒DNA、5ul鮭魚精DNA混合在室溫下溫育20分鐘，而后加入1.2ml PEG(3350)繼續溫育15分鐘，于3000g/min離心4分鐘，收集原生質體，加入150ul SOS(1mol/L山梨醇，10mmol/LCaCl2，0.3*YPD)，室溫下溫育30分鐘，使細胞壁再生。用1mol/L山梨醇稀釋至0.5ml，加入保溫于56℃的上層瓊脂培養基，然后倒在RD平板上，迅速用混合液蓋滿整個平板，室溫下放置4分鐘，讓瓊脂糖硬化，表面應非常平，沒有突起。于室溫下倒置平板2—3小時，讓多余的水分揮發，而后在28—30℃溫箱中孵育4—7天，進行篩選。
4、酵母重組子的篩選提取酵母轉化子的基因組DNA作PCR檢測。酵母基因組的提取方法具體操作步驟如下首先制備原生質體，方法同上，重懸原生質體于8ml lysis緩沖液中(含1％SDS，10mmol/L pH7.4 Tris-HCl，10mmol/L EDTA，0.05mol/LNaCl)，加入70μl蛋白酶K(15mg/ml)和80μl RNA酶，在37℃下溫育2小時，并于70℃下10分鐘以終止反應，而后加入1/10體積的5mol/L的冰冷醋酸鉀緩沖液。置于冰上30分鐘。于4℃下16,000轉/分離心去除白色沉淀，加入等體積的酚—氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)抽取DNA，將上清轉移至一離心管，加入2倍的100％冷乙醇沉淀DNA，離心以回收DNA并將其溶于2倍的TE緩沖液，加入1/10體積的冷3mol/L NaAc和0.6倍異丙醇中沉淀DNA，離心去上清。最后將DNA溶于100—200ul的緩沖液中。
PCR體系(50μl)10×緩沖液5μlMg2+3μl上游引物*1μl上游引物*1μldNTP 4μl酵母基因組DNA 1μlTaq DNA聚合酶 0.3μlDDW 34.7μl(*上游引物5’TACGTAAGCAATGGCATTGAAGCCAGC-3’*游引物5’-GGCCGCCTTCTTTTTCTTCTTTTTCTTCTTCTTCTTA-3’)PCR熱循環條件反應在PE480熱循環儀上進行。94℃，3分鐘，1個循環，94℃，1分鐘，57℃，1分鐘，72℃，2分鐘，30個循環。凝膠電泳條件0.5×TBE緩沖液(配制0.7％瓊脂糖凝膠，0.5μg/μL溴化乙錠預染色，60V穩壓電泳1—2小時，核酸分子量對照為1kb DNA梯度分子量標準。紫外燈下觀察和記錄結果(見附圖2)。
5、融合蛋白的表達、純化轉化子在30℃下MM培養基(基本氯源培養基YNB0.17g，(NH4)2SO40.5g，5％甲醇)培養72小時，每24小時加一次甲醇，GLT融合基因在AOX1啟動子的作用下在PichiapastriesGS115中表達。蛋白質的純化步驟如下裝柱→用20％乙醇洗柱→用雙蒸水洗柱→用0.02mol/L檸檬酸緩沖平衡層析柱→上樣→梯度洗脫(洗脫液為0—0.1mol/L或0—0.2mol/LNaCl溶液，洗脫速度為1.8ml/min)→分步收集(每管7ml)→檢測收集管中樣品的酶活和蛋白含量→收集具有酶活性的樣品(約100ml)。收集到的蛋白質經超濾濃縮-20℃保藏備用。過柱洗脫時，用UV700蛋白/核酸檢測儀檢測(上海六一儀器廠)在線檢測蛋白質濃度。檢測GOD酶活的方法如下以Sigma公司商品GOD(A.niger)作標準曲線。用pH5.6、0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液配制2mg/ml葡萄糖、2mg/ml鄰聯苯二茴香胺和100U/ml辣根過氧化物酶溶液。在5ml離心管中分別加入1ml葡萄糖溶液、2ml甘油及鄰聯苯二茴香胺和辣根過氧化物酶溶液各100μl。30℃保溫10分鐘后，加入20μlGOD標準溶液或樣品，迅速搖勻。在30℃下反應30分鐘后，加入2ml 5mol/L鹽酸終止反應，測定0D525。
6、融合蛋白與介體的連接蛋白與介體的連接具體操作步驟如下80mg GOD溶解于4ml的(N—(2—羧羧乙基)—哌嗪—N—2(丙磺酸))(0.15mol/L)緩沖液中形成微混的pH7.3左右的溶液(若有必要，可適當用0.1mol/LHCl或0.15mol/L的Na-HEPES調節pH值)加入100mg的碳二亞胺(EDC)和480mg尿素，pH值重新調節為7.2-7.3，隨后加入60mg的葡萄糖氧化酶，將溶液裝入玻璃瓶中，用石蠟封好置于冰上過夜。用0.1mol/L，pH6.0的檸檬酸緩沖液透析48小時，在此過程中透析液更換4—8次，以除去沒有反應的二茂鐵甲酸和其他的小分子物質。將被二茂鐵甲酸修飾過的融合蛋白、野生型酶、商品酶分Fc-GLT、Fc-GODwFc-GODc。
7、葡萄糖傳感器的制備實驗中絲網印刷電極包括一個工作電極和一個Ag/AgCl參比電極。在15×15CM的PVC(聚氯乙烯片)上，印刷30個電極，電極的印刷電極過程。電極在使用前依次用酒精和水沖洗。取三種經介體修飾的酶各2μl滴于工作電極的工作面積上，在室溫下干燥后，在電極表面覆蓋一層醋酸纖維膜，切成單個的電極，置于4℃干燥器中備用。
8、電化學檢測循環伏安檢測和計時電流檢測參照Model 270/250電化學軟件用戶手冊確定實驗過程。將制備好的介體酶電極與電化學系統連接，用微量注射器取20μl待測樣品滴于電極表面，立即啟動電化學系統進行循環伏安掃描。掃描參數如下起始電壓(Ei)＝-0.5V，終止電壓(Eλ)＝+0.5V，掃描速度為20mV/S。樣品中含有0.1mol/L氯化鉀，起支持電解質的作用(結果見附圖3)。計時電流法用來記錄響應電流，在固定的電壓下(+0.45V，相對于Ag/AgCl參比電極)，加入20μl樣品溶液后，電化學檢測便開始啟動，加緩沖液可得到背景電流值。在第30秒的電流值被記錄下來進行實驗分析。測量均為三支電極重復測定結果的平均值。
權利要求
1.一種用于葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法，它包括下列步驟A、合成編碼聚賴氨酸的DNA鏈或兩端含有克隆所需要的酶切位點5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-3；B、通過基因拼接，構建融合蛋白的表達載體pPICGLT，上述合成的DNA鏈在65℃褪火形成雙鏈的短DNA片段，質粒pGEM-TGOL DNA用限制性內切酶SnaBI和HinaIII雙酶切，瓊脂糖電泳回收片段，質粒pPIC9 DNA用SnaBI和NOtI雙酶切回收片段；C、表達載體pPICGLT經限制性內切酶Stul線性化后，用原生質體轉化法轉化進酵母Pichia pastoris GS115中；D、酵母重組子的篩選，提取酵母的基因組DNA作PCR檢測；E、融合蛋白GLT的表達、純化，轉化子在30℃下在MD培養基中培養，離心收集酵母細胞，將細胞重懸于10ml液體MM培養基中，每24小時向培養物中補加2ml甲醇，培養約72小時，離心收取上清液，用強陰離子交換柱Q-Sephorose Fast Flow純化柱純化；F、融合蛋白GLT與介體的連接，融合蛋白中的聚賴氨酸鏈上的氨基酸與介體二茂鐵甲酸上的羧基通過縮水反應連接；G、葡萄糖傳感器的制備，取經介體修飾的酶各2μl滴于工作電極的工作面積上，在室溫下干燥后，在電極表面覆蓋一層醋酸纖維膜，切成單個的電極，置于4℃干燥器中備用；H、電化學檢測，將制備好的介體酶電極與電化學系統連接，用微量注射器取20μl待測樣品滴于電極表面，啟動電化學系統進行循環伏安掃描，電化學檢測便開始啟動，加緩沖液在30秒的電流值被記錄下來進行實驗分析。
2.根據權利要求1所述的一種用葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法，其特征是融合蛋白與介體的連接，首先將80mgGOD溶解于4ml的NaHEPES緩沖液中形成微混的pH7.3的溶液，其次加入100mg的碳二亞胺和480mg尿素，pH7.2-7.3，第三是加入60ml的葡萄糖氧化酶，將溶液裝入玻璃瓶中，用石蠟封好，第四是用0.1mol/L，pH6.0的檸檬酸緩沖液透析48小時，透析更換4—8次。
全文摘要
本發明公開了一種用于葡萄糖傳感器的融合蛋白的制備方法,其步驟是:首先合成編碼聚賴氨酸的DNA鏈,將合成的DNA鏈在65℃褪火形成雙鏈的短DNA片段;其次是通過基因拼接,構建融合蛋白的表達載體pPICGLT;第三是表達載體pPICGLT經限制性內切酶StuⅠ線性化后,用原生質體轉化法轉化進酵母中;第四是酵母重組子的篩選,提取酵母的基因組DNA作檢測;第五是融合蛋白的表達、純化,轉化子在30℃下MM培養基中培養72小時,每24小時加一次甲醇;第六是融合蛋白與介體的連接;第七是葡萄糖傳感器的制備;第八是電化學檢測。本發明制備葡萄糖傳感器測量線性范圍寬,可達45mmol/L,且響應信號大,保存期長。
文檔編號C12N15/81GK1328156SQ01114379
公開日2001年12月26日 申請日期2001年7月25日 優先權日2001年7月25日
發明者張先恩, 陳立群, 謝衛紅, 張治平, 李偉 申請人:中國科學院武漢病毒研究所