專利名稱：一種魚類電脈沖精子轉基因方法
技術領域：
本發明涉及基因轉移領域，尤其涉及魚類的轉基因方法。
基因轉移可以用于基因表達、物種改良，也可以用于研究基因的功能，開發生物反應器等。用簡單易行的方法獲得大量轉基因個體則是其前提和基礎。目前，顯微注射法、電脈沖基因轉移法、精子介導法、磷酸鈣共沉淀法、反轉錄病毒介導法、基因鳥銃法等轉基因方法相繼建立，在這些方法中，顯微注射法因其直觀、準確、有效而成為常用的方法之一，但由于它存在操作過程煩瑣，技巧要求高，以及容易使受體細胞損傷等不足，因此在許多物種上難以應用。磷酸鈣共沉淀法、反轉錄病毒介導法、脂質體介導法和基因鳥銃法，則存在設備昂貴，操作復雜等缺點，難以推廣應用。與上述方法相比，精子介導或電脈沖介導的基因轉移方法，其操作較為簡單，但這兩種方法存在著基因轉移效率低，很不穩定，且電脈沖對卵的損傷較大等缺陷。因上述各種方法均存在著各自的不足，大大限制了對動物的轉基因研究和開發。
本發明的目的是提供一種改進的魚類轉基因方法，該方法將電脈沖法和精子介導法有機地結合起來，進行參數的優化，用簡易的設備，方便的操作，即可高效、快速地獲得大量的轉基因個體。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案基于電脈沖處理將使外源基因和精子外膜結合更緊密的原理，將電脈沖法和精子介導法結合起來，對混有外源基因的精子懸浮液進行電脈沖處理，再用處理過的精子與卵子受精。這樣，外源基因即可進入卵子。為了使卵子時能及時得到受精，可提前取得并電脈沖處理精子，其在4℃下的保存液中可保存7天，并用超出常規量10～50倍的精子進行授精以突破卵子質量方面的瓶頸。
本發明和現有技術相比，具有以下優點和效果優化后的電脈沖精子轉基因法可以使轉基因的成功率達到19.6％～46.8％；對采用電脈沖精子轉基因法得到的5月齡草魚尾鰭進行PCR檢測得知，有35.7％的個體中含有外源基因；而僅采用精子介導法得到的轉基因魚在總數中占的比例為2.2％～4.3％。與以前的轉基因方法相比，此方法的成功率可提高4～10倍。謝岳峰等人在1989年對泥鰍進行電脈沖介導的轉基因，陽性率為10％(謝岳峰，劉東，鄒鈞等，1989，泥鰍受精卵的電脈沖基因轉移，水生生物學報，13(4)387-389)。Inoue等人在1990年報道，90％青鳉受精卵經受電脈沖休克后，只有25％的受精卵最后孵化出苗，孵化魚苗攜帶外源基因的占4％(Inoue，K.，S.Yamashita，J-i.Hata，S.Kabeno，S.Sada，E.Nagahisa &T.Fujita，1990.Electroporation as a new technique for producingtransgene ifsh.Cell Diff.Devel.29123-128)。Lu等人在1992年的實驗中，有70％的受精卵孵化出苗，其中20％的魚苗攜帶外源基因(Lu，J-K.，T.T.Chen，C.L.Chrisman，O.M.Andrisani & J.E.Dixon，1992.Integration，expression，and germ-line transmission of foreign growthhormone genes in medaka(Oryzias latipes).Mol.Mar.Biol.Biotech.1366-375)。1994年于建康等用精子介導法用于金魚的轉基因，成功率為6.7％(于建康，閻維，張玉廉等.1994.精子介導魚類基因轉移和聚合酶鏈反應檢測技術.動物學報，40(1)96-99)。1999年Jung-Ha Kang等用電脈沖-精子法得到的陽性率是20％(Jung-Ha Kang，Goro Yoshizaki，Osamu Homma.et al.1999.Effect of an osmoticdifferential on the efficiency of gene transfer by eletroporation of fishspermatozoa.Aquaculture，vol.173，297-307)。
與顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法、反轉錄病毒介導法、脂質體介導法、基因鳥銃法等轉基因方法相比，電脈沖精子轉基因法具有簡便、易行、高效、便宜和適用范圍廣等優點。對于卵膜不易去除，或卵很脆弱的魚類，具有很高的實用價值。另外，受精卵所需要的外源基因要遠比精子所需要的多，因此，要獲得大量的轉基因魚，此法對于外源基因的消耗也是很少的。
本發明采用下列步驟1、構建外源基因重組質粒，用DNA內切酶將其線性化，溶解成濃度為1～10μg/μl的溶液。
2、獲取精卵采用人工催青方法獲得成熟的魚類精子和卵子，將精子保存在4℃的等體積精子保存液(葡萄糖29g/L，檸檬酸三鈉10g/L，碳酸氫鈉2g/L，氯化鉀0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L，溶劑為水)中備用。
3、電脈沖處理精子取90μl精子懸液加入電脈沖樣品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混勻，用電脈沖儀處理，設置參數為電壓10kV、脈沖數210、脈沖周期0.4秒、循環數12。調節電脈沖正極使其剛好接觸精子懸液液面，激發電脈沖，待12個循環結束后，再次激發電脈沖，如此反復4次。精子可以提前進行處理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化取成熟的卵子迅速與電脈沖處理過的精子混和，進行人工干法受精、孵化。
5、取孵化后3～5天的各實驗組魚苗，每尾分別置于滅菌的1.5ml的離心管，加入50μl新配制的組織勻漿緩沖液(Tris0.05M；NaCl0.02M；SDS0.1％；pK1mg/ml)；55℃下消化1小時，輕輕振蕩離心管，再在55℃下溫育2～16小時；1000轉/分離心30秒，加入150μl去離子水，混和均勻后在95～100℃水浴下熱休克處理6～7分鐘。取1μl魚苗勻漿物加入到終體積為25μl的PCR反應體系，其中含有1×PCR Buffer，0.2mMdNTPs，0.04pmol/μl引物，0.02U/μl的Taq，1.5mM的MgSO4。PCR程序包括94℃預變性4分鐘；30個循環擴增反應，每個循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃引物延伸1分鐘。PCR產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，UVP成像系統分析。
實施例1、外源基因重組質粒的構建外源基因重組質粒含啟動子部分和編碼序列，啟動子為鯉魚的β-肌動蛋白基因啟動子(CA)，先采用高保真PCR產生具有匹配的酶切位點的編碼序列，與啟動子部分CA連接成重組質粒成重組質粒，再轉化入大腸桿菌，在LB液中大量培養、擴增，收獲重組質粒。用DNA內切酶將外源基因重組質粒線性化，溶解為濃度為2μg/μl的溶液。
2、草魚精卵的獲取采用人工催青方法獲得成熟的草魚精子和卵子，將精子保存在4℃的等體積精子保存液(葡萄糖29g/L，檸檬酸三鈉10g/L，碳酸氫鈉2g/L，氯化鉀0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L，溶劑為水)中備用。
3、電脈沖處理精子取90μl精子懸液加入電脈沖儀樣品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混勻。設置好電脈沖參數，其中電壓參數為10kV，脈沖數為210，脈沖周期為0.4sec，循環數為12。調節電脈沖正極使正電極距離旋鈕讀數為200，此時電極剛好接觸精子懸液液面，按“激發電脈沖”鍵，待12個循環結束后，再次按“激發電脈沖”鍵，如此共4次，進行電脈沖處理，精子可以提前進行處理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化取成熟的卵子迅速與電脈沖處理過的精子混和，進行人工干法受精、孵化。
5、用PCR檢測草魚苗的轉基因陽性率組織勻漿處理取2～5日齡的各實驗組魚苗，置于滅菌的1.5ml的離心管，加入5μl新配制的組織勻漿緩沖液(Tris0.05M；NaCl0.02M；SDS0.1％的溶液pK1mg/ml)；55℃下消化1小時，輕輕振蕩離心管，勿旋轉，再在55℃下溫育2～16小時；1000轉/分鐘離心30秒，加入150μl去離子水，混和均勻后在95℃～100℃水浴下熱休克處理6～7分鐘。
PCR25μl PCR反應體系含1μl組織勻漿液，1×PCRBuffer，0.2mmol/LdNTPs，0.04pmol/μl引物溶液，0.02U/μl的Taq，1.5mM的MgSO4，進行PCR反應。PCR程序為94℃預變性4分鐘；30循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃引物延伸1分鐘；4℃保持。引物P15＇-TGGCGTGATGAATGTCG-3＇，位于CA上，引物P25＇-CTGTTTTCCGCAATGGC-3＇，位于編碼序列上。兩個引物在模板NDA間的距離為550bp，PCR產生用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，UVP成像系統分析。
權利要求
1.一種魚類電脈沖精子轉基因方法，其特征在于，可采用貯藏精子，提前處理精子，超量使用精子，對混有外源基因的精子懸浮液進行電脈沖處理，再用處理過的精子使卵子受精，具體方法包含下列步驟a、構建外源基因重組質粒，用脫氧核糖核酸內切酶將外源基因重組質粒線性化，溶解為濃度為1～10μg/μl的溶液；b、采用人工催青方法獲得成熟的魚類精子和卵子，將精子保存在4℃下等體積的精子保存液中備用；c、取90μl精子懸液加入電脈沖樣品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混勻，用電脈沖儀進行處理，在4℃下的保存液中可保存7天；d、將電脈沖處理過的精子迅速與卵子混和，進行人工干法授精、孵化。
2.根據權利要求1所述的一種魚類電脈沖精子轉基因方法，其特征在于，用精子保存液保存精子并作為脈沖電場的介質，所述的精子保存液采用葡萄糖29g/L，檸檬酸三鈉10g/L，碳酸氫鈉2g/L，氯化鉀0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L。
3.根據權利要求1所述的一種魚類電脈沖精子轉基因方法，其特征在于，用電脈沖儀處理時，按如下方法進行調節電脈沖正極使其剛好接觸精子懸液液面；電脈沖儀的參數設置為電壓7.5～10kV、脈沖數29～211、脈沖周期0.2～0.8秒、循環數8～16；激發電脈沖，循環結束后，再次激發電脈沖，如此反復2～6次。
4.根據權利要求1所述的一種魚類電脈沖精子轉基因方法，其特征在于，所述的超量使用精子是對每萬個卵子使用0.2～1.0ml的精子。
全文摘要
本發明公開了一種優化的魚類電脈沖精子轉基因方法,該方法基于電脈沖處理將使外源基因和精子外膜結合更緊密的原理,將電脈沖轉基因法和精子介導轉基因法相結合,對混有外源基因,并保存在保存液中的精子進行電脈沖處理,再與卵子受精,可使轉基因的成功率達到19.6%～46.8%。對5月齡的草魚尾鰭通過此法,經PCR檢測得知,有35.7%的個體中含有外源基因。本方法具有簡便、易行、高效、便宜和適用范圍廣等優點,對于卵膜不易去除,或卵很脆弱的魚類,尤其適用。
文檔編號C12N15/64GK1385534SQ0111420
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月16日 優先權日2001年5月16日
發明者朱作言, 鐘家玉 申請人:中國科學院水生生物研究所