專利名稱：自絮凝細胞顆粒清液連續發酵淀粉質原料生產酒精的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及到一種自絮凝細胞顆粒清液連續發酵淀粉質原料生產酒精的工藝技術。
迄今為止，國內外淀粉質原料酒精發酵均采用帶渣發酵的生產工藝，主要以玉米為原料，并根據原料玉米前處理方法的不同分為干法和濕法二條技術路線。在濕法工藝中，原料玉米浸泡后經胚乳分離、蛋白分離和纖維分離等工藝步驟得到粗淀粉乳作為后續酒精發酵的原料；而在干法工藝中，原料玉米直接脫胚或脫胚脫皮粉碎后得到玉米粉作為后續酒精發酵的原料。其共同點為粉漿經雙酶法液化和糖化后得到的醪液不經過濾或澄清處理直接送入發酵工段，酵母細胞將可發酵性糖發酵生成酒精和二氧化碳后得到的發酵醪中含有原料殘渣和大量酵母細胞。
發酵醪蒸餾過程中從粗餾塔塔釜排出大量廢糟液。由于原料殘渣及酵母細胞在酒精蒸餾過程中受熱分解產生很多副產物，當廢糟液直接循環使用時，盡管這些副產物在系統中達到平衡濃度，但實驗研究和生產實踐均表明，如果廢糟液直接循環使用的比例高于50％，這些副產物在系統中的平衡濃度會明顯抑制酵母細胞的生長和酒精發酵過程。因此，現有淀粉質原料帶渣發酵工藝中50％以上的廢糟液不得不采用全蒸發濃縮即DDGS(Dry Distilled Grain Soluble)技術處理，蒸發裝置投資大，運行過程能耗高。
本發明的目的在于提出一種采用自絮凝細胞顆粒的淀粉質原料清液酒精發酵的工藝技術路線，即粉漿液化糖化后得到的醪液在酒精發酵之前進行固液分離，去除原料殘渣得到澄清糖化液，在此基礎上使用自絮凝細胞顆粒連續發酵使之生成酒精和二氧化碳。由于細胞自絮凝形成毫米級大小的顆粒，因而在生物反應器中可以實現完全固定化，不僅生物反應器單位體積的細胞密度顯著提高，酒精發酵的平均發酵時間相應縮短，而且送至蒸餾工段的發酵液不再含有原料殘渣和細胞，蒸餾后得到的廢液中有害副產物減少，可以全部直接循環使用。
實現本發明的工藝步驟如下1、粉漿配制淀粉乳或玉米粉按照工藝要求的料水比(視淀粉乳的實際濃度和玉米粉的淀粉含量而定)配制成粉漿，使粉漿的淀粉總糖濃度達到20-22％(w/v)，調節pH值為6.0-6.2，并按每克淀粉15-20活力單位加入淀粉酶，預熱至55-60℃。
2、粉漿液化采用蒸汽直接噴射液化技術使粉漿快速加熱到108-110℃后進入維持器，維持8-10分鐘后常壓閃蒸冷卻到97-98℃后進入液化柱，繼續液化90分鐘。
3、糖化液化醪冷卻到60-62℃后，使用硫酸調節pH值為4.0-4.5，并按每克淀粉150-200活力單位加入糖化酶，糖化時間為10-15h，使DE值達到90以上，滿足后續自絮凝細胞顆粒酒精發酵工藝對糖化工藝的特殊要求。
4、固液分離采用過濾或沉降的方式分離糖化醪中的原料殘渣，得到澄清糖化液。
5、種子培養與連續發酵使用自絮凝細胞顆粒，種子培養級數和生物反應器規模可根據裝置的生產規模確定，應保證逐級接種的接種量為5-10％。種子擴大培養用培養基為糖濃度稀釋到10-12Bx、添加5g/L NH4HCO3和1.5g/LKH2PO4、pH值調節到5.0-5.5的糖化液，培養方式為間歇培養和連續流加培養結合，即接種后先間歇培養至殘糖濃度降低到1.0％(w/v)，然后開始流加糖化液進行連續培養。種子培養的工藝條件如下1)培養溫度30-32℃；2)pH值3.8-4.2；3)以0.1vvm的速率通風供氧；4)通過調節培養基流加速率控制殘糖濃度為0.8-1.0％(w/v)；5)生物反應器中單位體積細胞密度以細胞干重計達到40-50g/L。
生物反應器中種子培養達到規定的密度后，將種子培養用培養基切換成糖濃度20-22％(w/v)的高糖濃度發酵培養基，添加無機鹽的濃度從初期的1.5g/LNH4HCO3和0.5g/L KH2PO4逐步遞減到0.5g/L NH4HCO3和0.15g/L KH2PO4，可以維持發酵液中無機N和P的濃度分別為0.2-0.3g/L和50-60mg/L，滿足自絮凝細胞顆粒正常酒精發酵的要求。采用多級生物反應器串聯的工藝方案可以提高發酵終點發酵液中酒精濃度，生物反應器串聯級數視生物反應器容積規模而定。酒精發酵的工藝操作條件如下1)發酵溫度34-36℃；2)pH值為3.8-4.2；3)CO2的通氣速率為0.05vvm；4)糖液流加速率為0.04-0.05h-1，相當于平均發酵時間20-25h。
按照上述工藝條件，發酵終點酒精濃度可以達到11-14％(v)，其他各項工藝技術指標達到現有酒精發酵工藝的最佳水平。
6、發酵液蒸餾粗餾塔采用再沸器間接加熱的工藝技術方案以減少塔釜排出廢液總量，保證后續廢液直接循環使用時總體工藝水平衡。發酵液蒸餾后得到的廢液送固液分離工段洗滌濾渣，再次過濾后所得低濃度糖液送粉漿配制工段配制粉漿。
本發明的效果和益處在于細胞以自絮凝顆粒的方式在生物反應器中實現完全固定化，不僅生物反應器單位體積細胞密度顯著提高，酒精發酵的平均發酵時間縮短到現有工藝的1/3-1/2，而且自絮凝細胞顆粒要求清糖液發酵，這些技術特征使得發酵液蒸餾后得到的廢液不再含有原料殘渣和細胞，全部可以直接循環使用，節省了現有酒精發酵工藝廢糟液蒸發濃縮的能耗及新建裝置中蒸發濃縮設備的建設投資。
。
附圖是自絮凝細胞顆粒連續培養和酒精發酵生物反應器的結構示意圖。
主體結構包括1封頭；2沉降區環形擋板；3沉降區外筒體；4沉降區穩流導筒；5緩沖區過渡節；6主發酵區筒體；7顆粒懸浮導流筒；8底部封頭。
主要工藝接管包括a培養基入口；b多余自絮凝細胞顆粒排放口；c驅動氣進口，種子擴大培養時使用空氣，酒精發酵時使用CO2；d發酵液出口；e接種口；f種子擴大培養時作為尾氣出口，酒精發酵時作為CO2出口。
以下結合附圖詳細敘述本發明的最佳實施例。
本發明最佳實施例中所用菌種為一株具有自絮凝特性且酒精發酵性能優良的酵母，已送指定微生物菌種保藏機構保藏。
本發明最佳實施例中自絮凝細胞顆粒連續擴大培養和酒精發酵的生物反應器如附圖所示，公稱容積為0.5M3。封頭(1)Dg800標準橢圓封頭；沉降區環形擋板(2)Dg700筒體，高度1200mm；沉降區外筒體(3)Dg800，高度1200mm；沉降區穩流導筒Dg550，高度500mm，其上端與發酵液出口接管(d)中心線距離300mm；緩沖區過渡節(5)的錐角為60°；主發酵區筒體(6)Dg400，高度3200mm；顆粒懸浮導流筒(7)Dg150，高度3945mm，其底端與主發酵區筒體(6)的底端平齊；底部封頭(8)Dg400標準橢圓封頭。除顆粒懸浮導流筒(7)采用厚度2mm的不銹鋼板卷制外，其余部分均采用厚度4mm的碳鋼板制造。培養基入口(a)為Dg10法蘭連接接管；多余自絮凝細胞顆粒排放口(b)為Dg25法蘭連接接管；驅動氣進口(c)為內徑φ4nn的噴嘴；發酵液出口(d)為Dg50法蘭連接接管，其中心線距離沉降區外筒體(3)底端500mm；接種口(e)為發酵行業通用快接頭；種子擴大培養時作為尾氣出口及酒精發酵時作為CO2出口的接管(f)為Dg50法蘭連接接管。
上述生物反應器的其他尺寸，包括冷卻方式等均采用發酵行業常規設計。
以干法脫胚脫皮、粉碎細度60目、淀粉含量78-80％的玉米粉為原料，淀粉酶和糖化酶均為中國無錫星達生物工程有限公司生產的工業用酶制劑，活力分別為20000u/g和100000u/g。
四臺上述生物反應器并串聯混合使用，自絮凝酵母細胞顆粒種子培養階段并聯操作，酒精發酵階段串聯操作，依靠高位差使發酵液在生物反應器之間流動。
培養基組成如下1#培養基組成為(g/L)葡萄糖10，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中游離細胞到自絮凝顆粒的培養；2#培養基組成為(g/L)葡萄糖30，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中自絮凝顆粒的擴大培養；3#培養基組成為糖度10-12Bx的糖化液，分別添加5g/L的NH4HCO3和1.5g/L的KH2PO4，用于發酵罐中自絮凝細胞顆粒的擴大培養；4#培養基組成為糖度20-22Bx的糖化液，用于酒精發酵，由于廢液循環過程中殘余N和P等營養物質的積累，發酵培養基中添加NH4HCO3和KH2PO4的濃度分別由初始的1.5g/L和0.50g/L逐漸降低到0.45g/L和0.15g/L，可以滿足自絮凝細胞顆粒正常酒精發酵過程的營養需求。
上述培養基、生物反應器和工藝管道使用前均需熱滅菌，按照發酵行業的常規操作進行。
液化糖化在二臺帶有夾套、容積5M3的標準機械攪拌式糖化罐中進行，操作步驟如下按照料水比1∶2.5配制粉漿，用NaOH溶液調節pH值為6.0-6.2，并按15u/g玉米粉加入淀粉酶，粉漿預熱到55-60℃后，使用直接蒸氣快速加熱到108-110℃并維持10min，卸壓閃蒸使液化醪溫度降低到97-98℃，維持90min，完成粉漿液化操作。將液化醪冷卻到60-62℃后，使用H2SO4調節pH值為4.0-4.5，按照150u/g玉米粉加入糖化酶，糖化時間10h。糖化后的醪液使用板式過濾機過濾得到澄清糖化液供后續自絮凝細胞顆粒培養和酒精發酵使用，所得濾渣經蒸餾廢液洗滌回收殘留糖份后作為副產物排出系統。
將斜面試管保藏的菌種接種到裝有100mL 1#培養基的250mL三角瓶中，在150rpm和30℃條件下培養24h，酵母細胞可以完全自絮凝形成顆粒，搖瓶停止旋轉后，自絮凝酵母細胞顆粒迅速沉降，培養液變得澄清，棄去上清液并更換2#培養基進行分瓶擴大培養，間隔24h再次棄去上清液分瓶擴大培養，直至達到生物反應器接種要求的種子量。
將搖瓶培養的種子接種到裝有3#培養基的一臺生物反應器中，按照如前所述工藝條件進行通風培養。當生物反應器中殘糖濃度降低到1％(w/v)時，開始流加培養，培養基流加速度根據殘糖濃度調節，保持殘糖濃度不低于1％(w/v)，流加培養3d后各發酵罐中自絮凝細胞顆粒的密度以細胞干重計可以達到20-30g/L時，將培養的自絮凝酵母細胞顆粒種子等分到四臺生物反應器中，四臺生物反應器并聯操作，重復上述培養過程種子至各生物反應器中自絮凝酵母細胞顆粒以細胞干重計細胞密度達到40-50g/L，種子培養結束。
切換4#培養基，同時將通風切換成CO2，并將各生物反應器由并聯操作調整為依次串聯操作。基于發酵罐總有效容積的稀釋速率為0.05h-1，相當于平均發酵時間20h。裝置運行過程中間隔24h檢測各生物反應器中自絮凝酵母細胞顆粒的濃度、發酵液中總N和總P。當自絮凝酵母細胞顆粒的密度超過50g/L時，可以從生物反應器下部排放口排出多余酵母，保持生物反應器中自絮凝酵母細胞顆粒濃度在工藝規定的范圍內，同時使發酵液中總無機N和P保持在0.2-0.3g/L和50-60mg/L范圍內。
末級生物反應器流出的發酵液進行蒸餾處理，得到蒸餾廢液用來洗滌糖化醪過濾所得濾渣，再次過濾得到稀糖液用于配制粉漿。
上述四級串聯生物反應器系統可以穩定運行，達到工藝步驟(5)規定的各項技術指標，整個過程無廢液向系統外排放。
權利要求
1.一種自絮凝細胞顆粒清液連續發酵淀粉質原料生產酒精的工藝方法，其特征在于a)淀粉質原料，制備滿足自絮凝細胞顆粒酒精發酵工藝特殊要求糖化液的技術，控制糖化時間為10-15h,DE值達到90，糖化后固液分離去除糖化醪中原料殘渣；b)淀粉質原料，使用自絮凝細胞顆粒清液發酵生產酒精的技術，生物反應器中的細胞密度以單位體積干重計達到40-50g/L以上，生物反應器多級串聯操作，在連續發酵的平均發酵時間20-25h條件下，發酵終點酒精濃度達到11-14％(v)；c)與淀粉質原料自絮凝細胞顆粒清液酒精連續發酵工藝相匹配的蒸餾廢液全循環使用的技術。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域,特別涉及到一種自絮凝細胞顆粒清液連續發酵淀粉質原料生產酒精的工藝方法。自絮凝細胞顆粒在生物反應器中實現固定化,生物反應器中的細胞密度以單位體積細胞干重計可以高達40－50g/L以上。生物反應器多級串聯,在平均發酵時間為20－25h的條件下,發酵終點酒精濃度達到11－14%(V)。在此基礎上,提出了制備滿足自絮凝細胞顆粒酒精發酵工藝要求糖化液及酒精蒸餾廢液直接循環使用的技術。節省了廢糟液蒸發濃縮的能耗。
文檔編號C12P7/06GK1323903SQ01114010
公開日2001年11月28日 申請日期2001年5月28日 優先權日2001年5月28日
發明者白鳳武, 云戰友, 劉傳斌, 謝健, 李寧 申請人:大連理工大學