紫菜種質(zhì)鑒定試劑及使用方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：紫菜種質(zhì)鑒定試劑及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)，具體地說(shuō)是一種紫菜種質(zhì)鑒定試劑及使用方法。
紫菜是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海藻，目前，紫菜采苗主要以絲狀體做為種苗進(jìn)行采苗，但單憑絲狀體的顏色等感觀特征不能有效地鑒別種間、種內(nèi)的差異，生產(chǎn)中會(huì)引起混亂使用，因此，建立一套快速、有效的紫菜種質(zhì)檢測(cè)技術(shù)十分必要。紫菜種質(zhì)檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)水平即形態(tài)外表特征的鑒定，染色體水平即細(xì)胞中染色體鑒定，同工酶水平即生化蛋白質(zhì)大分子的鑒定，和近年來(lái)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)水平的研究鑒定技術(shù)。
從分子標(biāo)記方法角度看，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)脫氧核糖核酸(RAPD)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、間隔簡(jiǎn)單重復(fù)序列(ISSR)等技術(shù)不斷出現(xiàn)，這些高技術(shù)在藻類(lèi)方面的應(yīng)用剛剛開(kāi)始。國(guó)外已對(duì)海帶、紫菜、單細(xì)胞藻、馬尾藻、江籬屬的一些種，開(kāi)展了分子遺傳標(biāo)記的研究，主要目的是闡述海藻的分子、生化水平的進(jìn)化關(guān)系。
海洋生物領(lǐng)域中的分子標(biāo)記技術(shù)，目前僅局限在RAPD、RFLP水平。RAPD方法雖然成本低，相對(duì)技術(shù)簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)室的可交流性差；RFLP方法要求的DNA質(zhì)量高，但要使用放射性同位素，具有一定危險(xiǎn)性。目前，國(guó)內(nèi)一些研究單位在DNA提取、擴(kuò)增反應(yīng)條件等方面，一般實(shí)驗(yàn)室主要采用RAPD技術(shù)作了探索，但隨引物、模板的差異其結(jié)果有較大的不同，可重復(fù)性差，難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此，受到許多限制，如果發(fā)明具有分子標(biāo)記作用的鑒定試劑，對(duì)經(jīng)濟(jì)海藻種質(zhì)檢測(cè)、雜交鑒定、病害診斷等可以進(jìn)行應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種能提高紫菜種質(zhì)鑒定的特異性和標(biāo)準(zhǔn)性的紫菜種質(zhì)鑒定試劑及使用方法，具有可重復(fù)性、有效性，能在原有的RAPD擴(kuò)增基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步對(duì)紫菜的細(xì)胞系作更嚴(yán)格的鑒定。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是紫菜種質(zhì)鑒定試劑，按濃度計(jì)，取三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris.HCl)7～15mM，乙二胺四乙酸(Ethlenediaminetetra-acetic acid縮寫(xiě)EDTA)18～22mM，氯化鈉(NaCl2)1.2～1.4M；按體積百分比計(jì)，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化銨(Cetyl trimethylammonium bromide)，1.5～2.5％十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate縮寫(xiě)SDS)；所述三羥甲基胺基甲烷鹽酸pH值為8.0～8.3；其使用方法，按如下步驟操作a.紫菜絲狀體DNA的提取，紫菜絲狀體研磨，離心，用所述試劑溶解液，在35～70分鐘時(shí)間范圍內(nèi)裂解；用氯仿∶異戊醇抽提，上清液加入0.2～0.25倍于上清液體積的10％SDS水溶液和0.3～0.36倍于上清液體積的3.5～4.5M乙酸鉀(KAc)水溶液，置于冰中10～15分鐘，用氯仿∶異戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置30～50分鐘，離心10～15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗1～3次，抽干，用0.8～1.2mL三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris.EDTA)緩沖液溶解沉淀；加RNA酶10～13mg/ml，35～38℃保溫1～1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍上清液體積的醋酸鈉水溶液，1.5～2.5倍上清液體積的無(wú)水乙醇，-18～-22℃沉淀，離心10～20分鐘；用70～80％乙醇洗，抽干，用1～2倍于上清液體積的Tris.EDTA緩沖液溶解沉淀，取2～4μl DNA樣品在0.7～0.9％的瓊脂糖(Agarose)膠電泳，溴化乙錠(EtBr)染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度。
b.所述紫菜絲狀體DNA的純化
DNA粗提物，與300～500μl溶膠液、8～12μl玻璃奶(Glassmilk)混勻，冰上放置10～20分鐘，中間輕搖2～3次；離心30～50秒，去上清液，其沉淀用300～500μl漂洗液漂洗，吹干；用500～1000μl H2O或1～3倍于上清液體積的500～1000μl Tris.EDTA緩沖液在50～70℃范圍內(nèi)保溫5～10分鐘，離心1～3分鐘，上清液保存?zhèn)溆谩?br> c.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有50～60mM Tris.HCl，2～5mM氯化鎂(MgCl2)，0.2～0.5mM二磷酸多苷(DNTP)，0.8～1.0％富可400(Ficoll400)，1～3mM酒石磺(Tartarzine)，4～6μm牛肉血壓清蛋白(BSA)，30～50ng引物，5～10ng模板DNA，0.5～0.7單位Taq聚合酶。
多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘。
PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果。
d.ISSR反應(yīng)10～15mM Tris.HCl，2～6mM MgCl2，0.2～0.6mM DNTP，0.8～1.0％Ficoll400，1～3mM Tartarzine，4～6μm BSA，30～60ng引物，5～10ng模板DNA，0.6～0.8單位Taq聚合酶。
ISSR反應(yīng)參數(shù)條件96℃ 1分鐘；94℃ 30秒，退火溫度+4℃10秒，72℃ 60秒，2～4個(gè)循環(huán)；
94℃ 30秒，退火溫度+2℃10秒，72℃ 60秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火溫度℃10秒，72℃ 70秒，35～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其電泳結(jié)果處理與PCR反應(yīng)相同。
所述氯仿∶異戊醇比例為24∶1；步驟a中所述醋酸鈉pH值在5.0～5.4范圍內(nèi)；所述Tris.HCl pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)；所述DNTP為二磷酸腺苷(DATP)、二磷酸胞苷(DCTP)、二磷酸胸苷(DTTP)和二磷酸鳥(niǎo)苷(DGTP)；優(yōu)化反應(yīng)條件所述引物為ISSR25、ISSR28或ISSR30；所述退火溫度根據(jù)不同的引物在46～50℃之間；所述EDTA的pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)由于本發(fā)明簡(jiǎn)化了紫菜絲狀體DNA的提取步驟，采用Glassmilk進(jìn)行純化，用PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化了反應(yīng)條件，具有可重復(fù)性、穩(wěn)定性，鑒定效率高特點(diǎn)。本發(fā)明屬分子標(biāo)記的商品試劑，可以應(yīng)用于紫菜的種質(zhì)鑒定，有效地區(qū)分紫菜或非紫菜材料、紫菜不同細(xì)胞系，還可以對(duì)紫菜生產(chǎn)單位選擇育種有重要作用。另外，在區(qū)別具有同一感官特征的紫菜細(xì)胞系時(shí)，也可以進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，區(qū)別出具有不同遺傳背景的紫菜細(xì)胞系，為紫菜混雜的區(qū)分提供一種有效的方法。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1紫菜種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取10mmolL-1Tris.HCl，pH值為8.0，20mmolL-1EDTA，1.4M NaCl2；按體積百分比計(jì)，取2％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，1.5％SDS。
所述試劑的使用具體操作如下1.紫菜絲狀體DNA的提取
紫菜絲狀體及硅膠及液氮研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過(guò)含有15mL所述試劑溶解液，65℃保溫35min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.2倍于上清液體積的10％SDS水溶液和1/3倍于上清液體積的4M KAc水溶液，置于冰中10分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，上清液加入0.6倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中30分鐘，12000rmp離心10分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗一次，抽干乙醇，用1mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；加2μl無(wú)DNA酶的RNA酶10mg，在37℃情況下保溫1小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，加0.1倍上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.2)，2倍上清液體積的無(wú)水乙醇，-18℃沉淀2小時(shí)以上，12000rmp離心10分鐘；用70％乙醇洗一次，抽干除去多余的乙醇，用200μl 1倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取2μl DNA樣品在0.8％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度。
2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與300μl溶膠液、10μl Glassmilk混勻，冰上放置10分鐘，中間輕搖3次；1000rpm離心30秒，去上清液，其沉淀用300μl漂洗液漂洗3次，吹干；用500ul H2O漂洗，于60℃溫度下保溫5分鐘，12000rpm離心1分鐘，上清保存?zhèn)溆谩?br> 3.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有50mM Tris HCl(pH8.3)，2mM MgCl2，0.2mM DATP、0.2mM DCTP、0.2mM DTTP和0.2mM DGTP，0.8％Ficoll400，1mM Tartarzine，5μm BSA，30ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.5單位TaqDNA聚合酶。
多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件
94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38個(gè)循環(huán)；72℃保溫5分鐘。
PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果。
4.ISSR反應(yīng)10mM Tris HCl(pH8.3)、2mM MgCl2、0.2mM DATP、0.2mM DCTP、0.2mM DTTP和0.2mM DGTP，0.8％Ficoll400，1mM Tartarzine，5μm BSA，30ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.6單位Taq DNA聚合酶。
反應(yīng)參數(shù)條件96℃ 1分鐘；94℃ 30秒，退火溫度46℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，2個(gè)循環(huán)；94℃ 30秒，退火溫度46℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，2個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火溫度46℃ 10秒，72℃ 70秒，36個(gè)循環(huán)；72℃保溫4分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其電泳結(jié)果處理與RAPD相同。
實(shí)施例2紫菜種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取15mmolL-1Tris.HCl，pH值為8.1，18mmolL-1EDTA，1.3M NaCl2；按體積百分比計(jì)，取1.5％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，1.2％SDS。
所述試劑的使用具體操作如下1.紫菜絲狀體DNA的提取紫菜絲狀體及硅膠及液氮研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過(guò)含有15mL所述試劑溶解液，50℃保溫45min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.23倍于上清液體積的10％SDS水溶液和0.36倍于上清液體積的3.5M KAc水溶液，置于冰中13分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，加入0.7倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中40分鐘，12000rmp離心15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗2次，抽干乙醇，用0.8mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.5，1mMEDTA，pH8.2)溶解沉淀；加2μl無(wú)DNA酶的RNA酶15mg，在38℃情況下保溫1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，加0.2倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.0)，1.5倍于上清液體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀2小時(shí)以上，12000rmp離心15分鐘；用75％乙醇洗一次，抽干乙醇，用200μl 1倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取3μl DNA樣品在0.7％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度。
2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與400μl溶膠液、18μl Glassmilk混勻，冰上放置15分鐘，中間輕搖2次；1000rpm離心40秒，去上清液，其沉淀用400μl漂洗液漂洗3次，吹干；用2倍于上清液體積的1000μl Tris.EDTA漂洗，或于50℃溫度下保溫8分鐘，12000rpm離心2分鐘，上清液保存?zhèn)溆谩?br> 3.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有55mM Tris HCl(pH8.5)，4mM MgCl2，0.5mM DATP、0.5mM DCTP、0.5mM DTTP和0.5mM DGTP，1％Ficoll400，2mM Tartarzine，4μm BSA，40ng引物ISSR28，8ng模板DNA，0.6單位Taq DNA聚合酶。
多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，4個(gè)循環(huán)；
94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，40個(gè)循環(huán)；72℃3保溫5分鐘。
PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果。
4.ISSR反應(yīng)13mM Tris HCl(pH8.1)、3mM MgCl2、0.4mM DATP、0.4mM DCTP、0.4mM DTTP和0.4mM DGTP，1％Ficoll400，3mM Tartarzine，4μm BSA，60ng引物ISSR28，10ng模板DNA，0.7單位Taq DNA聚合酶。
反應(yīng)參數(shù)條件96℃ 1分鐘；94℃ 30秒，退火溫度50℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，4個(gè)循環(huán)；94℃ 30秒，退火溫度50℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，4個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火溫度50℃ 10秒，72℃ 70秒，35個(gè)循環(huán)；70℃保溫6分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其電泳結(jié)果處理與RAPD相同。
實(shí)施例3紫菜種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取7mmol L-1Tris.HCl，pH值為8.3，22mmolL-1EDTA，1.2M NaCl2；按體積百分比計(jì)，取2.5％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，2.5％SDS。
所述試劑的使用具體操作如下1.紫菜絲狀體DNA的提取紫菜絲狀體及硅膠及液氮研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過(guò)含有15mL所述試劑溶解液，35℃保溫70min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.25倍于上清液體積的10％SDS水溶液和0.3倍于上清液體積的4.5M KAc水溶液，置于冰中15分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，上清加入0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中50分鐘，12000rmp離心13分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗3次，抽干乙醇，用1.2mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.2，1mM EDTA，pH8.5)溶解沉淀；加2μl無(wú)DNA酶的RNA酶12mg，在35℃情況下保溫1.3小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提3次，加0.3倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.4)，2.5倍于上清液體積的無(wú)水乙醇，-22℃沉淀2小時(shí)以上，12000rmp離心20分鐘；用80％乙醇洗一次，抽干乙醇，用200μl 1倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取4μl DNA樣品在0.9％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度。
2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與500μl溶膠液、12μl Glassmilk混勻，冰上放置20分鐘，中間輕搖3次；1000rpm離心50秒，去上清液，其沉淀用500μl漂洗液漂洗3次，吹干；800ul的H2O漂洗，或于70℃溫度下保溫10分鐘，12000rpm離心3分鐘，上清液保存?zhèn)溆谩?br> 3.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有60mM Tris HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，0.4mM DATP、0.4mM DCTP、0.4mM DTTP和0.4mM DGTP，0.9％Ficoll400，3mM Tartarzine，6μm BSA，50ng引物ISSR30，10ng模板DNA，0.7單位Taq DNA聚合酶。
多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，45個(gè)循環(huán)；72℃保溫5分鐘。
PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物在1.5％Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果。
4.ISSR反應(yīng)15mM Tris HCl(pH8.4)、5mM MgCl2、0.6mM DATP、0.6mM DCTP、0.6mM DTTP和0.6mM DGTP，0.9％Ficoll400，2mM Tartarzine，6μm BSA，40ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.8單位Taq DNA聚合酶。
反應(yīng)參數(shù)條件96℃ 1分鐘；94℃ 30秒，退火溫度48℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30秒，退火溫度48℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，3個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火溫度48℃ 10秒，72℃ 70秒，40個(gè)循環(huán)；75℃保溫5分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其電泳結(jié)果處理與RAPD相同。
權(quán)利要求
1.一種紫菜種質(zhì)鑒定試劑，其特征在于按濃度計(jì)，由三羥甲基氨基甲烷鹽酸7～15mM，乙二胺四乙酸18～22mM，氯化鈉1.2～1.4M；按體積百分計(jì)算，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化銨，1～2％十二烷基硫酸鈉。
2.按照權(quán)利要求1所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑，其特征在于所述三羥甲基胺基甲烷鹽酸pH值為8.0～8.3。
3.一種按照權(quán)利要求1所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于按如下步驟操作a.紫菜絲狀體脫氧核糖核酸的提取，紫菜絲狀體研磨，離心，用所述試劑溶解液，在35～70分鐘時(shí)間范圍內(nèi)裂解；用氯仿∶異戊醇抽提，上清液加入0.20～0.25倍于上清液體積的10％十二烷基硫酸鈉水溶液和上清液體積的3.5～4.5M乙酸鉀水溶液，置于冰中10～15分鐘，用氯仿∶異戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置30～50分鐘，離心10～15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗1～3次，抽干，用0.8～1.2mL三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液溶解沉淀；加核糖核酸酶10～13mg/ml，35～38℃保溫1～1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液，1.5～2.5倍于上清液體積的無(wú)水乙醇，-18～-22℃沉淀，離心10～20分鐘；用70～80％乙醇洗，抽干，用1～2倍于上清液體積的三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液溶解沉淀，取2～4μl脫氧核糖核酸樣品在0.7～0.9％的瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda脫氧核糖核酸對(duì)照，估算脫氧核糖核酸濃度。b.所述紫菜絲狀體脫氧核糖核酸的純化脫氧核糖核酸粗提物，與300～500μl溶膠液、8～12μl玻璃奶混勻，冰上放置10～20分鐘，中間輕搖2～3次；離心30～50秒，去掉上清液，其沉淀用300～500μl漂洗液漂洗，吹干；用500～1000μl H2O或1～3倍于上清液體積的500～1000μl三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液在50～70℃范圍內(nèi)保溫5～10分鐘，離心1～3分鐘，上清液保存?zhèn)溆?。c.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)脫氧核糖核酸反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有50～60mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，2～5mM氯化鎂，0.2～0.5mM二磷酸多苷，0.8～1％富可400，1～3mM酒石磺，4～6μm牛肉血壓清蛋白，30～50ng引物，5～10ng模板脫氧核糖核酸，0.5～0.7單位Taq聚合酶。多聚循環(huán)反應(yīng)參數(shù)條件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘。多聚循環(huán)反應(yīng)反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳分離，澳化乙錠染色，紫外照相記錄結(jié)果。d.間隔簡(jiǎn)單重復(fù)序列反應(yīng)10～15mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，2～6mM氯化鎂，0.2～0.6mM二磷酸多苷，0.8～1％富可400，1～3mM灑石磺，4～6μm牛肉血壓清蛋白，30～60ng引物，5～10ng模板脫氧核糖核酸，0.6～0.8單位Taq聚合酶。間隔簡(jiǎn)單重復(fù)序列反應(yīng)參數(shù)條件96℃ 1分鐘；94℃ 30秒，退火溫度+4℃10秒，72℃ 60秒，2～4個(gè)循環(huán)；94℃ 30秒，退火溫度+2℃10秒，72℃ 60秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火溫度℃10秒，72℃ 70秒，36～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其電泳結(jié)果處理與多聚循環(huán)反應(yīng)相同。
4.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述氯仿∶異戊醇比例為24∶1。
5.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于步驟a中所述醋酸鈉pH值在5.0～5.4范圍內(nèi)。
6.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述三羥甲基氨基甲烷鹽酸pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
7.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述二磷酸多苷為二磷酸腺苷、二磷酸胞苷、二磷酸胸苷和二磷酸鳥(niǎo)苷。
8.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于優(yōu)化反應(yīng)條件所述引物為ISSR25、ISSR28或ISSR30。
9.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述退火溫度根據(jù)不同的引物在46℃到50℃之間。
10.按照權(quán)利要求3所述紫菜種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述乙二胺四乙酸pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
全文摘要
一種紫菜種質(zhì)鑒定試劑及使用方法。按濃度計(jì),由三羥甲基氨基甲烷鹽酸7～15mM,乙二胺四乙酸18～22mM,氯化鈉1.2～1.4M;按體積百分計(jì)算,取1.5～2.5%十六烷基三甲基溴化銨,1～2%十二烷基硫酸鈉;其使用方法是通過(guò)紫菜絲狀體DNA的提取,及玻璃奶技術(shù)路線純化DNA,得高純度紫菜DNA;PCR擴(kuò)增、RAPD檢測(cè),得初級(jí)鑒定圖譜;使用通用引物和ISSR鑒定技術(shù),可以得到紫菜不同細(xì)胞系間清晰和可重復(fù)的多態(tài)圖譜。純化后擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)重復(fù)性高,區(qū)分不同細(xì)胞系的差異,可有效有鑒定紫菜種質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1366068SQ01106080
公開(kāi)日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月16日
發(fā)明者段德麟, 赫英俊, 李笑紅, 連紹興, 于義德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所