專利名稱：基因工程制備人白細胞介素4的方法及其表達載體和工程菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用重組DNA技術生產蛋白質或多肽藥物的領域，更具體地，本發明涉及基因工程人白細胞介素4(Interleukin-4，IL-4)的制備方法，還涉及有關的表達載體和工程菌。
白細胞介素4是一種由輔助性T細胞(Th細胞)產生的細胞因子，能作用于體內的多種細胞包括B細胞、T細胞、巨噬細胞等，能增強IgE介導的體液免疫和殺傷細胞的殺傷能力。
IL-4屬于Th2細細胞產生的特征性細胞因子，對多種免疫活性細胞的功能具有明顯的作用可增強機體的體液免疫(特別是IgE反應)及特異性和非特異性的細胞免疫功能。對B細胞，IL-4是IgE的特異性誘導劑，IL-4還能增加B細胞表達MHC-II類分子、LFA1、LFA3和CD23(低親和力IgE受體)，并能能維持抗原活化B細胞的生長和擴增。對T細胞，IL-4能誘導TCR/δ前T細胞分化。在一定條件下可維持胸腺細胞和活化T細胞生長，誘導活化T細胞表達CD23。IL-4還能增加抗原特異性CTL的活性。對NK細胞，IL-4能誘導其增殖。IL-4對造血功能也有一定影響，能增加G-CSF誘導的粒細胞集落，增加EPO誘導的紅細胞集落，增加IL-6誘導的紅細胞和粒/單核細胞集落，增加IL-3誘導的嗜堿/肥大細胞集落等。IL-4能通過增加呼吸爆發增強中性粒細胞的吞噬功能；增加中性粒細胞表達膜結合型和可溶性IL-1RII，這種作用與IL-4的抗炎效應有關。IL-4能增強單核巨噬細胞表達MHC-II類分子、LFA-1、CD23；減少CD14和FcγR(CD64、CD32和CD16)表達。阻斷巨噬細胞介導的ATCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)但不影響細胞吞噬。抑制單核細胞自發釋放或被誘導釋放細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN)的能力，但增加細胞釋放IL-1受體拮抗因子，IL-4還能誘導單核細胞凋亡；抑制單核細胞分泌膠原酶，從而降低細胞對細胞外基質的降解作用；抑制細胞釋放超氧化離子和PGE2。這些作用說明IL-4是有效的抗炎因子。
樹突狀細胞(DC)是已知的機體內功能最強的抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)，是目前發現的唯一一種能直接激活初始型T細胞的APC。DC在激活、啟動機體免疫應答尤其是細胞免疫應答反應中起著十分重要的作用。作為腫瘤細胞與特異性免疫效應細胞之間的“橋梁”，DC所具有的處理、加工和提呈抗原的功能在腫瘤抗原誘導宿主免疫反應，尤其是T細胞介導的抗腫瘤免疫功能的過程中所發揮的作用極為重要。近年來，隨著對DC研究的不斷深入，尤其是DC大量擴增技術的建立，以DC為基礎的腫瘤特異性免疫治療和基因治療的研究成為相當熱門的研究課題，并顯示出良好的基礎研究及臨床應用前景，有望為腫瘤的治療提供新的途徑。在該方面最引人囑目的研究工作是應用抗原或抗原多肽在體外沖擊致敏(pulsing)DC，然后將之回輸或免疫接種至荷瘤宿主，進行的腫瘤免疫治療，臨床試驗已證明該療法能顯著地誘導機體產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應并能治療腫瘤患者。目前常用的培養擴增人樹突狀細胞的方法需要加入人白細胞介素4，因此基因工程人白細胞介素4在樹突狀細胞介導的腫瘤的免疫治療中有著廣泛的應用前景。
由于IL-4具有多方面生物學功能，其臨床適應癥較廣。IL-4可發揮其抗腫瘤作用而用于某些腫瘤的治療；IL-4的抗炎作用可能在某些炎癥或自身免疫病中有治療價值，如應用于關節炎的治療；IL-4增加抗HBV特異性抗體產生的作用也有應用價值；IL-4還可能成為防治糖尿病的藥物。目前國外應用基因工程IL-4治療腫瘤已進入I期和II期臨床試驗。
國內外有關IL-4的表達和純化研究工作亦有數家報道，但是目前IL-4的表達量不高，一般均在為菌體蛋白的5-10％，特別是由于IL-4的本身的生物學特性，使得從原核表達產物中復性較困難，復性得率較低(通常小于10％)，活性較差。制備后的IL-4的比活性一般為1.0-3×106單位/毫克，很難滿足腫瘤免疫治療的臨床研究需求。因此用何種表達載體和宿主細胞來表達IL-4，提高復性得率，一直是本領域技術人員研究的焦點所在。
因此，本發明的目的就是提供一種高效地制備基因工程人白細胞介素4的方法(包括分離純化工藝)，以及有關的載體和宿主細胞。
在本發明的第一方面，提供了一種表達基因工程人白細胞介素4的表達載體，該載體為含有人白細胞介素4序列的原核pK223-3m載體，且人IL一4編碼序列位于pL和rrnBT1T2序列之間。
較佳地，該載體是pK223-3m-hIL-4，其結構如圖2所示。
在本發明的第二方面，提供了一種宿主細胞，其特征在于，它被本發明所述的載體所轉化。較佳地，所述的宿主細胞是原核細胞，如大腸桿菌。
在本發明的第三方面，提供了一種制備人白細胞介素4的方法，該方法包括在適合表達IL-4的培養條件下，培養權利要求3中所述的大腸桿菌宿主細胞，從而表達出IL-4；分離純化出IL-4，得到所表達的人白細胞介素4。
較佳地，分離純化包括以下步驟(a)制備包含體；(b)洗滌包含體；(c)溶解包含體，(d)復性；(e)陽離子交換；(f)凝膠過濾。
此外，在一實施例中，復性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復性液進行稀釋復性，并靜置0.5-24小時，其中該復性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
更佳地，該復性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1M NaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且靜置時間為2-5小時。
附圖包括
圖1是編碼人IL-4的核苷酸序列。
圖2是pK223-3m-hIL-4載體的構建示意圖，其中將人IL-4 cDNA克隆入pK223-3m載體，形成表達載體pK223-3m-hIL-4。
圖3為用pK223-3m-hIL-4轉化的DH5α發酵后rhIL-4表達量的電泳照片。其中泳道M為分子量標記；泳道1-3分別連續三批發酵后rhIL-4的表達結果。
圖4是基因工程人IL-4純化過程的陽離子交換圖譜。
圖5是基因工程人IL-4的凝膠過濾圖譜。
圖6是純化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE電泳鑒定照片。其中泳道1-3為三批純化的rhIL-4(非還原型)；泳道M為低分子量標準蛋白；泳道4-6為三批純化的rhIL-4(還原型)。泳道7為國外標準品(見圖6)。
本發明的發明人發現，通過將編碼hIL-4的核苷酸序列克隆入一種載體即pK223-3m，可十分高效地表達基因工程人IL-4。通過優化培養及制備工藝，完成了本發明。
在一個較佳例子中，結合特別設計的分離純化重組IL-4過程，充分體現出本發明的表達載體和/或工程菌的高效性。特別是純化過程通過優化IL-4的復性過程，使純化IL-4的得率大大提高。
表達載體pK223-3m的元件來源于pK223-3(Pharmacia公司，GenBank登錄號M77749)和pJL6這兩個載體，經構建后重命名為pK223-3m；其中主要包括基因的轉錄啟動子-λ噬菌體的PL啟動子，以及控制該啟動子的溫度敏感的阻抑蛋白cIts857，這一對元件構成基因轉錄啟動元件；其它的元件則包括質粒復制啟動子、抗氨芐青霉素的抗性基因以及調節轉錄終止的元件。插入人IL-4基因后命名為pK223-3m-hIL-4，其中人白細胞介素4的序列如
圖1所示，表達載體的結構如圖2所示。
本發明新型的表達載體是這樣構建的采用中國人外周血單個核細胞作為人IL-4基因的來源，采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法獲得編碼人IL-4 cDNA；將人IL-4 cDNA克隆到原核表達載體pK223-3m中；經核酸測序證明，人IL-4序列正確，在該載體中，人IL-4基因的轉錄受到cIts857啟動子的控制。該重組表達載體命名為pK223-3m-hIL-4；
采用大腸桿菌DH5α作為宿主細胞，用載體pK223-3m-hIL-4轉化DH5α細菌，經過反復篩選和表達分析，獲得高表達人IL-4的生產菌株DH5α/pK223-3m-hIL-4。
可用于本發明的宿主細胞宜為原核細胞，更佳地為大腸桿菌，最佳地為大腸桿菌DH5α菌株。
表達載體的轉化可采用常規的方法，如氯化鈣法、電穿孔法等。選用的培養基可以是本領域的常規使用的培養基。
在本發明中，可用多種常規方法使攜帶表達載體的菌株表達IL-4。在下面的實施例4給出了一個優選方案。在一級種子培養中，采用LB培養基，培養時間一般為12-16小時，收獲時的OD600光吸收應大于約0.6，一般為0.6-0.8。在二級種子培養中，采用2YT培養基，培養時間一般為12-16，收獲時的OD600光吸收應大于約2.0。在發酵罐培養中，當收獲時的OD600光吸收大于約3.0時，可升高溫度以誘導IL-4在熱誘導調控元件下進行表達。誘導時間一般為2-6小時，較佳地為2.5-4小時。收獲時OD600光吸收一般應大于約5.0，一般為4.5-5.5。這樣，獲得的IL-4表達量一般占菌體中蛋白的20-30％。
表達蛋白后的分離純化步驟，一般包括以下步驟(a)制備包含體，(b)洗滌包含體，(c)溶解包含體，(d)復性，(e)陽離子交換柱層析和(f)凝膠過濾柱色譜。
本發明的另一改進之處在于復性步驟。一種優選的復性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復性液進行稀釋復性，并靜置0.5-24小時，其中該復性液配方含有20-250mMNa2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mMGSSG。更佳地，該復性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1MNaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且靜置時間為2-5小時。
純化工藝可采用本領域中常規使用的純化工藝，也可采用本發明人專門設計的純化工藝，其中純化工藝包括包含體制備、洗滌包含體(任選步驟)、溶解包含體、復性、陽離子交換、凝膠過濾等步驟。一種純化方案是用工程菌DH5α/pK223-3m-hIL-4，在發酵條件下進行發酵，收集菌體通過包含體的制備，復性后轉換緩沖液，進行CM Sepharose FF柱層析，Sephacryl S-200凝膠過濾純化制成半成品，用本發明人選擇的工藝進行純化，最終可獲得純度大于95％基因人白細胞介素4制品。
本發明的優點在于(1)表達量高。目前，現有技術中人IL-4的重組表達量占菌體總蛋白的5-10左右，本發明通過優化表達載體并結合培養發酵條件，使其表達量高達30％。
(2)復性得率高采用其它方法復性得率＜10％，本發明通過對復性液的改進，優化復性條件，使復性得率提高至35％以上。
以下結合實施例和附圖，來進一步詳細地闡述本發明。下列實施例用于說明目的而并非用于限制本發明范圍。實施例1、hIL-4 cDNA的克隆天然成熟的人白細胞介素4由129個氨基酸組成。
本發明人通過反轉錄PCR從中國人的健康成人外周血單個核細胞中克隆出人白細胞介素4的cDNA。
本發明所采用的上游引物為5’-AATGCACAAGTGCGATATCACCT-3’，下游引物為5’-CGGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAA-3’(含BamHI酶切位點)。
RT-PCR按常規方法進行，得到的PCR產物被直接克隆至pK223-3m載體，進行DNA測序，測序引物為5’-CTTTGGGGTGTGTGATAC-3’DNA的測序證實，本發明人所克隆的人白細胞介素4 cDNA序列是正確的(
圖1)。實施例2、表達IL-4原核載體的構建在該實施例中所采用pK223-3m原核載體含有PL啟動子，熱誘導表達調控元件cIts857等元件。
對實施例1制備的pK223-3m-hIL-4載體即可直接用于誘導表達。經酶切鑒定，pK223-3m-hIL-4載體的酶切圖譜正確，含有所插入的rhIL-4 cDNA序列(圖2)。實施例3.IL-4表達工程菌的建立及其鑒定在該實施例中，將pK223-3m-hIL-4載體轉化至大腸桿菌DH5α，從而建立表達人IL-4的轉化的宿主細胞(工程菌)DH5α/rhIL-4。
獲得的原始工程菌菌種用含15％甘油的LB培養基保存于-70℃，每支1.0ml。工程菌在LB軟瓊脂平板上生長呈典型的大腸桿菌菌落特征。為檢查工程菌的穩定性，每傳20代作一次酶切圖譜分析，結果與原始菌種一致，這證明本發明中的工程菌是很穩定的。
該工程菌于2001年4月11日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，中國，武漢，保藏編號為CCTCC No.M201009。實施例4.發酵(a)種子培養將菌種0.1ml接種入含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基(一級種子培養基)，在搖床中30℃、200rpm培養12-16小時，在OD600光吸收為大于0.6時(在該例子中為0.8)進行收取。
取一級種子培養基中擴增后的種子2.5ml，接種入含250ml二級種子培養基(同發酵培養基)的1L培養瓶中，在搖床中30℃、200rpm培養12～16小時，在OD600光吸收應大于2.0時(在該例子中為2.2)。發酵罐培養發酵培養基以M9基本培養為基礎，添加其它物質，其配方如下酪蛋白水解氨基酸5.0g/LNa2HPO46.0g/L
KH2PO43.0g/LNaCl 3.0g/LNH4Cl 0.5g/L用NaOH調PH值至7.2，高壓滅菌。
添加以下微量元素配方FeCl3125mMMnSO420mMZnSO420mMCuSO420mMCoCl220mMH3BO320mMNa2MoO420mM上述物質分別溶解于1N HCl中，過濾除菌。
臨用前無菌加入下述物質1M MgSO41ml/L0.1M CaCl21ml/L1mg/ml硫胺素 1ml/L葡萄糖 5g/L微量元素 1ml/L100mg/ml氨芐青霉素 1ml/L工作體積為10L的發酵罐，接種入500ml培養好的二級種子培養液，開始發酵。發酵參數設置如下攪拌速率 200-600rpm通氣量 2.0L/分鐘罐壓 5.0PSI溶解氧 30％PH值控制 6.5溫度 32.0℃發酵中用NH4OH控制PH值；產生過量泡沫時，用Antifoam 204(Sigma)0.2ml消泡；溶氧控制為與攪拌速率級聯，溶氧低于30％時自動加快攪拌速度，以滿足氧的供應。發酵過程中測定OD600光密度值，監測細菌的生長情況，OD600光密度值為3.0左右時，開始升溫至42℃，誘導細菌表達IL-4。
誘導表達4小時后，此時OD600值為5.5-6.5時收獲菌體，這相當于菌體濕重為5～8克/升發酵終產物。IL-4表達量為菌體總蛋白的30％(圖3)。4℃離心收集菌體，保存于-20℃備用。實施例5.基因工程人IL-4的純化包含體制備取實施例4中發酵好的凍存菌體25克，加入50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液250ml，待樣品融化后制成懸液，9000rpm離心15分鐘收集菌體。
加入含50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液500ml，制成懸液后，靜置20分鐘。
冰浴下超聲，功率300W，占空比為50％，每個循環30秒，總時間為15分鐘，處理樣品體積為250ml，超聲粉碎的細菌經革蘭氏染色后，4℃、9000rpm離心20分鐘，收集沉淀。
在收集的沉淀中，加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。4℃、7000rpm離心20分鐘收集菌體。
再加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA PH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。4℃、7000rpm離心20分鐘收集菌體。
加入50mM Tris 2mM EDTA PH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。
最后按上述方法用50mM PB 1mMEDTA PH7.0攪拌洗滌菌體一次，離心收集沉淀。溶解包含體在如上制備的包含體中，加入6M鹽酸胍、10mM DTT、1mM EDTA、50mMTris/HCl，pH＝9.0的溶液(按每克包含體加入10ml)，吹打，充分攪拌，直至包含體完全溶解。4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用。復性取上述溶解后的包含體，加入3倍體積的甘油，充分混勻后，在室溫下靜置30分鐘。然后用5倍體積的復性液進行稀釋復性得，室溫下靜置4小時。
復性液的成分如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.00.1M NaCl2mM GSH/2mM GSSG4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用緩沖液轉換取上述復性后組分，超濾濃縮至原體積的1/10，然后加入10倍體積的50mM檸檬酸緩沖液，PH＝5.4，繼續超濾濃縮至1/10體積。重復一次后，所得的樣品經4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用。陽離子交換柱層析層析柱為CM-Sepharose FF 2.6×10cm，樣品為上述的包含體溶解液，緩沖液為A為50mM檸檬酸，PH＝5.0，緩沖液B為含2M NaCl的50mM檸檬酸，PH＝5.0。
上樣后采用NaCl線性梯度洗脫，收集各組分，SDS-PAGE鑒定后，合并含IL-4的組分進行下一步純化(圖4)。凝膠過濾柱層析上述組分采用凝膠過濾柱層析進一步純化，方法如下層析柱為SephacrylS2002.6×100cm，緩沖液為50mM PB PH7.0，流速為60ml/小時，上樣量為柱體積的1/10，收集蛋白峰。層析圖如圖5所示。凍干上述制備的基因人IL-4純品，用20mM谷氨酸，PH＝7.0，0.1M NaCl溶液稀釋到終濃度100ug/ml，加入甘露醇至終濃度2％，人血白蛋白至終濃度0.1％。分裝至西林瓶中，冷凍干燥后制成基因工程人IL-4成品。該制品可以-20℃保存2年而無明顯的活性喪失。實施例6 基因工程人IL-4的鑒定和活性測定用常規方法進行SDS-PAGE電泳測定純化后的IL-4進行常規SDS-PAGE電泳，銀染后掃描測得IL-4為單一條帶。圖6是純化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE電泳鑒定照片。其中泳道1-3為三批純化的rhIL-4(非還原型)；泳道M為低分子量標準蛋白；泳道4-6為三批純化的rhIL-4(還原型)。泳道7為國外標準品(見圖6)用常規方法進行N末端氨基酸殘基測定N端15個氨基酸鑒定結果與天然的IL-4完全一致，為MetHisLysCysAspIleThrLeuGlnGluIleIleLysThrLeu。
用常規方法進行比活性測定即采用TF-1依賴株、MTT法測定純化的IL-4活性，測定的活性單位IL-4蛋白質絕對含量之比為比活性(單位為國際標準單位/毫克)。結果表明，采用實施例5方法純化的IL-4終產品比活性為6.5×106國際標準單位/毫克。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種表達基因工程人白細胞介素4的表達載體，其特征在于，該載體為含有人白細胞介素4序列的原核pK223-3m載體，且人IL-4編碼序列位于pL和rrnBT1T2序列之間。
2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，該載體是pK223-3m-hIL-4，其結構如圖2所示。
3.一種宿主細胞，其特征在于，它被權利要求1所述的載體所轉化。
4.如權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，它是大腸桿菌。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，它是大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α/pK223-3m-hIL-4，CCTCC M 201009。
6.一種制備人白細胞介素4的方法，其特征在于，該方法包括在適合表達IL-4的培養條件下，培養權利要求3中所述的大腸桿菌宿主細胞，從而表達出IL-4；分離純化出IL-4，得到所表達的人白細胞介素4。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，分離純化包括以下步驟(a)制備包含體；(b)洗滌包含體；(c)溶解包含體，(d)復性；(e)陽離子交換；(f)凝膠過濾。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，復性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復性液進行稀釋復性，并靜置0.5-24小時，其中該復性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
9.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該復性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.00.1M NaCl2mM GSH/2mM GSSG。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，靜置時間為2-5小時。
全文摘要
本發明提供了一種表達基因工程人白細胞介素4(rhIL－4)的表達載體pK223－3m－hIL－4,還公開了用該表達載體轉化的大腸桿菌DH5α,以及用上述表達載體和/或宿主細胞發酵表達、純化人基因工程白細胞介素4的工藝方法。用本發明可表達載體及工程菌可高獲得IL－4的高表達,并通過復性及純化獲得人IL－4純品,且獲得的基因工程IL－4比活性高。
文檔編號C12N15/03GK1380419SQ01105968
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月12日 優先權日2001年4月12日
發明者王建莉 申請人:上海華康生物技術有限公司