一全合成培養基及其應用方法

專利名稱：一全合成培養基及其應用方法
技術領域：
本發明涉及一種甲醇營養型畢赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)培養基及其應用方法。
甲醇營養型畢赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)已經被公認為外源分泌蛋白和胞內蛋白生產的一優秀的表達系統，并且由于其強勁的生長和一些獨特的特性已開發成外源蛋白商業生產的重組表達系統。由于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在釀造上的地位和歷史原因，人們對其遺傳學和生物學方面了解的比較全面，且其安全性也被人們容易接受，但隨著人們對甲醇營養型畢赤酵母的研究，認為該菌在以下方面比釀酒酵母更具優勢(1)具有日益成熟的高密度發酵工藝。已經有了大規模工業化高密度生產的發酵工藝，且細胞密度達到150g(DCW)/L，以及廉價的原料配方。
(2)具有甲醇精確調控的強啟動子(PAOX)。它受甘油、乙醇或葡萄糖等碳源的阻遏，而受甲醇的誘導且誘導準確。
(3)外源蛋白分泌的高效率性。為了使表達的外源目的蛋白分泌到發酵液中，需要一信號肽序列(Signal Sequence)。最方便的是利用外源蛋白本身的信號序列，但大多數情況下，甲醇營養型畢赤酵母不能有效地識別這些信號肽以指導分泌，而采用了釀酒酵母α交配因子(α-mating factor)前89個氨基酸殘基引導或用酸性磷酸酶1(PH01)中21個氨基酸殘基的信號肽融合到外源蛋白的N端，均能極有效地指導外源蛋白分泌，還有采用間質金屬蛋白酶(NMP)/間質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)信號序列等。據報道用釀酒酵母的交配因子信號序列可使甲醇營養型畢赤酵母分泌人血清蛋白達10g/L的水平。
(4)外源蛋白基因遺傳高穩定性。由于外源目的蛋白載體以線性質粒整合到甲醇營養型畢赤酵母染色體上，隨染色體的復制而復制，因此外源目的基因在世系傳代中異常穩定，不易丟失。
(5)外源目的蛋白的高表達率。甲醇營養型畢赤酵母在甲醇誘導下迅速形成過氧化物酶體(Peroxisome)，它是一種合成儲存蛋白質的區域化結構，可使表達的外源蛋白免受蛋白酶的降解，且不對細胞產生毒害，從而提高了目的蛋白的表達產量。
甲醇加入畢赤酵母的培養基后，能迅速誘導合成大量的醇氧化酶(AlcoholOxidase,AOX)，而AOX的合成在含甘油培養基中生長的細胞中受到抑制。AOX是甲醇利用途徑的第一個酶，它催化甲醇氧化成甲酸，進而氧化釋放出二氧化碳。
由于AOX與氧的親和力低，所以畢赤酵母代償性產生大量的AOX，約占全部可溶性蛋白質的30％。畢赤酵母含有兩個醇氧化酶基因，分別為AOX1、AOX2基因(aox1,aox2)，二者的編碼序列相似，有92％同源性，其蛋白質產物則有97％的同源性。aox1的蛋白質產物在氧化過程中起主要作用。aox1的轉錄水平大大高于aox2，且aox1在轉錄水平上受到嚴格的雙重調控甲醇誘導AOX合成，一般的碳分解代謝產物抑制AOX產生。在碳饑餓狀態下，只有在甲醇誘導后，才能啟動aox1的信號轉錄、翻譯。
以甲醇誘導強啟動子PAOX1而起動基因轉錄這一特性對于利用畢赤酵母生產外源蛋白是十分重要的。由于重組蛋白對細胞有毒性作用，在大容量、高密度培養過程中，需要將細胞繁殖階段與表達階段分開。其它表達系統需極高濃度的抑制物來阻遏表達，誘導前又需將之除去。對于畢赤酵母的生物量增長階段，只需少量的抑制物，通常為甘油，即可滿足細胞生長并有效地抑制外源基因的表達；在表達階段，只需讓細胞耗盡剩余的甘油，再加入甲醇誘導即可，這樣高密度連續培養可以使表達產量提高。
大多數研究者一般使用美國Invitrogen公司提供的方法來進行搖瓶培養誘導外源蛋白的表達，其中含有蛋白胨，YNB等有機復合培養基，與在發酵罐上進行發酵的合成培養基相差甚遠，這對采用搖瓶發酵表達外源蛋白優化條件來應用于發酵罐上發酵，其指導意義不大，甚至結果大相徑庭。而最近一些研究者采用SM合成培養基，如Kaoru K等培養基(Journ.of Biosci.Bioeng.2000,Vol.89(5),479-484)，來進行搖瓶發酵條件優化研究，其主要缺點是1碳源(甲醇等)一次性加入，當甲醇濃度過高時，造成細胞甲醇中毒，不利于表達；而當甲醇適當時，因碳源不足發酵時間不能足夠長，影響搖瓶發酵結果。2其沒有采用pH緩沖系統。因為不同的外源蛋白活性要求一定的pH條件，如鼠表皮生長因子(EGF)表達時，要求pH為3.0左右，而重組人血清白蛋白表達的較適pH范圍是5.5～6.4。當細胞生長時其pH必定下降，這對目的蛋白的表達是不利的。
為了使在小量培養基中(如搖瓶規模)與大批量發酵(如發酵罐規模)的外源蛋白表達發酵工藝相一致，避免繁瑣的重復實驗和/或重新的探索試驗，小量培養基必須有充足的緩沖能力、保證最大通氣量和與大批量發酵培養基相同或極近似的培養基等發酵條件。為此，提供一種新的畢赤酵母培養基是基因工程所十分期望的。
本發明的目的在于公開一種根據在FUS-50(A)多參數全自動發酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數據和根據細胞代謝物流平衡的原理、適用于基因工程巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)搖瓶表達外源蛋白的全合成培養基，它既能滿足把搖瓶發酵結果放大到發酵罐上的需要，也克服了許多研究者采用Invitrogen Kit提供的與發酵罐發酵不同的復合搖瓶培養基的困難，同時為在搖瓶發酵規模優化表達外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
本發明的目的之二在于公開上述培養基在基因工程方面的應用。
本發明的技術構思是這樣的(1)通過優化培養基pH值的范圍和選擇合適的緩沖系統，使蛋白質降解減到最低程度；(2)通過添加充足的碳源、氮源和磷源，以利于外源蛋白的高表達；(3)通過添加充足的無機鹽、維生素、生物促進劑等，以利于外源蛋白的高表達；實現本發明目的的技術方案本發明所說的培養基包括碳源、氮源、磷源、無機鹽、PTM1和pH緩沖溶液，其含量為碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源磷酸根(PO43-)濃度為0.01-1.0moL/L無機鹽 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/L
pH緩沖溶液的加入量使培養基的pH保持為2.5-9.0。
所說的碳源為甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油等；所說的氮源為(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4等；所說的磷源為磷酸和磷酸鹽，包括磷酸鉀、磷酸二氫鉀(鈉)、磷酸氫二鉀(鈉)等；所說的無機鹽為鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、鐵(Fe2+,Fe3+)、銅(Cu2+)或鋅(Zn2+)的無機鹽，如氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化(亞)鐵、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、氯化銅、氯化鋅或硫酸鋅等中的一種或一種以上；所說的SO42+選自硫酸鹽，包括硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸等中的一種或一種以上；所說的PTM1是采用Invitrogen公司產品(貨號Cat.No.Q300-12或Q300-13其中含有CuSO4,NaI,MnSO4,Na2MoO4,H3BO3,CoCl2,ZnCl2,FeSO4,H2SO4和生物素。
所說的pH緩沖可采用檸檬酸緩沖系統、克拉克-盧勃斯(Clark-Lubs)緩沖液和磷酸鹽緩沖系統等。
本發明優選的含量為碳源0.1-4.0％(v/v)，較優為0.1-1.0％；氮源0.1-20g/L，較優為5-10g/L；磷源磷酸根(PO43-)濃度為0.01-2.0moL/L，較優為0.1-1.0moL/L；無機鹽 0.002-3.0g/L，較優為0.1-1.5g/L；SO42+0.001-0.5mol/L，較優為0.1-0.1moL/L；PTM11-16mL/L，較優為4-12mL/L；pH緩沖溶液的加入量使培養基的pH保持為3.0-7.5，較優為5.0-7.0。
本發明所說的培養基的制備是一種常規的方法。
本發明的培養基適用于①基因工程甲醇營養型酵母(Methylotrophic yeastPichia pastoris)的不同遺傳表型(Mut+His+,MutsHis+等)、不同的啟動子(PAOX1、PAOX2)、不同的表達載體(如PIC4.5等)以及載體的不同存在方式(如附加型、整合型等)；②采用PAOX1、PAOX2啟動子等的其它基因工程酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、漢遜酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等的外源蛋白表達搖瓶培養。
本發明的畢赤酵母適用菌株包括(以下菌株Invitrogen公司均有售或構建方法)(1)NRRL Y-11430-SC5(Mut+)；(2)GS115(his4)或GTS115(3)KM71(his4,aox1::ARG4)；(4)PPF1(his4,arg4)；(5)SMD1163(his4,pep4,prB1)；(6)SMD1165(his4,prB1)；(7)SMD1168(his4,pep4)；(8)其它采用PAOX1或PAOX2啟動子構建的基因工程菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、漢遜酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等。
畢赤酵母常用表達載體由于畢赤酵母是廣泛應用的宿主細胞，至今已構建了許多表達載體來使用，常用表達載體見下表。載體名稱克隆位點 選擇標記 特點pPIC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠ His4 多克隆位點載體G418EcoRⅠAvrⅢ.NotⅠpPSC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠHis4 Kan 多克隆位點載體，并可EcoRⅠ AvrⅢ.NotⅠ 用選擇多拷貝克隆pPSC3 EcoRⅠ His4 His4 KanpHIL-D1 EcoRⅠ His4 原始構建的載體pAO815 EcoRⅠ His4 用于體外構建多拷貝的載體pPIC9 EcoRⅠ AvrⅡXhoⅠSnaBⅠ His4 分泌表達NotⅠpPIC9K XhoⅠ SnaBⅠHis4 Kan 分泌表達和并可用G418EcoRⅠ AvrⅡ NotⅠ 選擇多拷貝克隆表達載體構建巴氏畢赤酵母表達載體通常是穿梭質粒(Shuttle plasmid)，典型的表達載體含有醇氧化酶基因(5′AOX1啟動子、3′AOX1終止序列、3′AOX1序列)，其中含多克隆位點(如BamHⅠ,NcoⅠ,SnaBⅠ,EcoRⅠ,AvrⅢ,NotⅠ,XhoⅠ等)供外源基因插入；以組氨酸脫氫酶基因(his4)作為互補性篩選標志或其它篩選標記，如eptone,Zeocinr,his6等；如作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質粒，它還有部分pBR322或pUC18、pUC19、pBR329、pKK232-3等)的序列。表達載體轉化到酵母宿主系統有二種方式，即附加型(Episome)和整合型(Integration)。附加型的重組質粒存在于細胞質內，則重組質粒在構建時要插入自主復制序列(Autonomous Replication Sequence,ARS)，如大腸桿菌的復制序列(CoIE1 ori)，以利于在酵母胞內自主復制。整合型表達載體中無酵母復制起點，它是靠同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩定地存在。將表達載體用不同的酶切(如BglⅡ、NotⅠ或SalⅠ、StuⅠ等)后線性化，使之整合于酵母基因組中的aox1或his4的位點。整合的方式通常有四種一是雙位點互換(Double Cross-over),發生在染色體阿AOX1位點和表達載體的PAOX1及轉錄終止區，含PAOX1、外源基因和轉錄終止區的表達單元置換染色體上有完整功能的aox1，產生的菌株表型為MutsHis+(aox1-aox2-)。當酵母的aox1基因被替換而丟失后，就產生了Muts表型(Methanol utilization slow)，此時它們將利用弱的aox2基因啟動合成AOX，故在含甲醇的培養基中生長緩慢。二是aox1單位點互換(Single Cross-over)，發生在染色體aox1位點和表達載體的aox1區。外源基因的表達盒插在aox1基因的上游或下游，aox1基因仍然有活性，菌株的表型為Mut+His+(aox1+aox2+)，這種轉化子仍然利用甲醇；三是his4單位點置換，發生在染色體his4位點和表達載體的his4位點，使得一個或多個表達盒插入在his4位點，獲得的菌株表型是Mut+His+(aox1+aox2+)；四是His4雙交換，結果菌株表型為Mut+His+(aox1+aox2+)，不過這種轉化子不能被檢出而已。


圖1為搖瓶誘導表達外源目的蛋白電泳圖。
圖2為不同甲醇濃度搖瓶培養誘導惡性瘧原蟲融合抗原電泳圖。
本發明根據在FUS-50(A)多參數全自動發酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數據和根據細胞代謝物流平衡的原理提出的適用于基因工程巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)搖瓶表達外源蛋白的全合成培養基，既能滿足把搖瓶發酵結果放大到發酵罐上的需要，也克服了許多研究者采用Invertogen Kit提供的與發酵罐發酵使用的復合搖瓶培養基的困難，同時為在搖瓶發酵規模優化表達外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
實施例1將0.5％甲醇(體積)、150g/L(NH4)2SO4、0.5g/L氯化鈣、30g/L硫酸鉀(SO42+)、4mL/L PTM1和pH為6.0的磷酸緩沖液置于去離子水中，即獲得所說的培養基。
實施例2基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶培養表達重組人血清白蛋白1.1菌株巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115 HSA-1菌株，遺傳表型為Mut+his+，啟動子為PAOX1，表達載體pPIC9K，蛋白信號肽序列為來自釀酒酵母的α-雜交因子AMF，外源基因為人血清白蛋cDNA，載體呈線型整合在染色體上(基因構建方法和重組菌株篩選按有關的克隆手冊進行)。1.2搖瓶培養方法以在YPD培養基平板30度培養5至7天的單菌落挑至MGY種子培養基(20mL/250mL三角瓶)中，MGY培養基組分及含量見下表，30℃，220r/min培養22h，OD600約20左右。離心搖瓶生長培養基，棄去上清液，按搖瓶生長培養基體積與本發明全合成培養基之比為1∶1，接入實施例1的全合成培養基(20mL/250mL三角瓶)，30℃,200-220r/min培養120h。每24h補加100％甲醇(A.R)至一定終濃度。放瓶離心后，取上清液進行分析，總蛋白為考馬斯亮蘭染色法，目的蛋白分析方法為SDS-PAGE凝膠電泳，然后電泳膠經計算機掃描根據電泳帶染色強度進行定量分析(GIS-1000數碼凝膠圖像分析系統，2.0版本，按說明書操作，背景消除按自動進行，低分子標準蛋白為上海麗珠東風生物技術有限公司產品。
MGY種子培養基
注生物素單獨過濾除菌，其它混勻后8磅滅菌15分鐘。1.3搖瓶誘導表達外源目的蛋白結果從電泳結果(
圖1)可明顯看出以本發明的全合成搖瓶表達培養基在不同的誘導的時間內目的蛋白即重組人血清白蛋白(rHSA)的表達是十分明顯的，在不同的搖瓶培養時間有不同的目的蛋白表達量。雖然從搖瓶培養12小時到72小時均有目的蛋白表達，但不同的目的蛋白(如分子量大小、氨基酸組成以及蛋白質的立體空間結構的不同)就應有不同的搖瓶誘導培養時間，最好為48h-120h。
實施例3基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶培養表達惡性瘧原蟲融合抗原1.1菌種畢赤氏酵母GS115/pfcp菌株，遺傳表型為Mut+His-,啟動子為PAOX1，重組質粒為pPIC3.5/pfcp，外源蛋白為惡性瘧原蟲融合cDNA，線性整合在染色體上。1.2搖瓶培養方法同實施例2.1.3搖瓶培養不同甲醇濃度誘導表達惡性瘧原蟲融合抗原蛋白電泳分析根據本發明的全合成培養基在不同的甲醇誘導濃度搖瓶培養誘導惡性瘧原蟲融合抗原蛋白，甲醇濃度范圍為0.5％-3.0％均有目的蛋表達，但最好的甲醇濃度范圍為1.5-2.0％。由甲醇殘留濃度和細胞菌濃可知，當甲醇濃度較低時，因甲醇限制了細胞的能量代謝和碳源代謝，而引起目的蛋白表達量不高；當甲醇濃度較高時，有可能是甲醇使細胞代謝有抑制作用，從而導致目的蛋白表達濃度下降。其結果見下表及圖2。
不同甲醇濃度搖瓶培養誘導惡件瘧原蟲融合抗原
權利要求
1．一全合成培養基，其特征在于組分和含量包括碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源(PO43-)濃度為0.01-1.0moL/L無機鹽 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/LpH緩沖溶液的加入量使培養基的pH保持為2.5-9.0；所說的無機鹽為鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、鐵(Fe2+,Fe3+)、銅(Cu2+)或鋅(Zn2+)的無機鹽；所說的SO42+選自硫酸鹽或硫酸；所說的PTM1為Invitrogen公司產品貨號Cat.No.Q300-12或Q300-13。
2．如權利要求1所述的培養基，其特征在于，組分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；無機鹽 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L；pH緩沖溶液的加入量使培養基的pH保持為3.0-7.5。
3．如權利要求2所述的培養基，其特征在于，組分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；無機鹽 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L。pH緩沖溶液的加入量使培養基的pH保持為5.0-7.0。
4．如權利要求1、2或3任一所述的培養基，其特征在于所說的碳源為甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油；所說的氮源為(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4；所說的磷源為磷酸或磷酸鹽；所說的無機鹽為氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化(亞)鐵、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、氯化銅、氯化鋅或硫酸鋅等中的一種或一種以上；所說的SO42+選自硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鈉或硫酸鉀中的一種或一種以上；所說的pH緩沖系統可采用檸檬酸緩沖系統、克拉克-盧勃斯(Clark-Lubs)緩沖液和磷酸鹽緩沖系統。
5．如權利要求4所述的培養基，其特征在于，磷酸鹽為磷酸鉀、磷酸二氫鉀(鈉)或磷酸氫二鉀(鈉)。
6．如權利要求1～3任一所述的培養基的應用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達搖瓶培養。
7．如權利要求4所述的培養基的應用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達搖瓶培養。
8．如權利要求5所述的培養基的應用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達搖瓶培養。
全文摘要
本發明公開了一種一全合成培養基及其應用方法。本發明根據在FUS－50(A)多參數全自動發酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數據和根據細胞代謝物流平衡的原理,通過優化培養基pH值的范圍和選擇合適的緩沖系統、通過添加充足的碳源、氮源和磷源、通過添加充足的無機鹽、維生素、生物促進劑等方法以利于外源蛋白的高表達的適用于基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶表達外源蛋白的全合成培養基,為搖瓶發酵規模優化表達外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
文檔編號C12N15/81GK1309178SQ01105699
公開日2001年8月22日 申請日期2001年3月20日 優先權日2001年3月20日
發明者張嗣良, 郭美錦, 儲炬, 莊英萍, 杭海峰 申請人:華東理工大學