肝癌高表達基因、其編碼的蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：肝癌高表達基因、其編碼的蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼人HCCA3蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽及其特異性抗體的用途和制備。具體地說，本發明的HCCA3蛋白是一種新的在肝癌中高表達的蛋白。
1986年著名生物學家諾貝爾獎獲得者Renato Dulbecco在Science雜志上率先提出“人類基因組計劃”(Human Genomic Project，簡稱HGP)，該建議的提出引發了科學界長達三年的激烈爭論。1990年10月美國政府決定出資30億美元正式啟動“人類基因組計劃”，預期到2005年拿到人體的全部基因序列(共約30億個核苷酸全序列)；隨后研究其相互作用和基因功能，從而揭開人類全部遺傳信息之謎，使人類對自身的認識達到一個新的高度。
人類基因組計劃可以說是人類有史以來最為偉大的認識自身的世紀工程之一。1997年底，有人提出HGP的最終目標應該是提供生物學周期表，這個周期表的“元素”就是決定人類一切性狀的10-14萬個基因。完成30億個堿基的測序只不過為這個目標打下了結構上的基礎(即結構基因組學)，而比較基因組學(包括其編碼的蛋白質)和整個基因組的功能研究(功能基因組學)在基因組的價值發現上才能直接發揮其重要作用。隨著基因組學的發展，人們設計和創造了許多重要的生物分子，廣泛用于制藥、農業、食品、化工、化妝品、環境、能源等各領域，不僅會推動科學的進步，還將產生驚人的經濟效益，從而引發產業革命，以基因組學為基礎的生命科學工業已經形成。人類有限的基因資源正在做著一次性分配，獲取基因效率最高和數量最多的企業，有望利用其基因專利來壟斷未來生物和制藥工業市場。比爾.蓋茨曾說下一個創造出更大財富的人將出現在基因領域。
隨著基因組計劃的迅猛發展，攻克包括肝癌在內的惡性腫瘤在不久的將來將成為現實。我國是原發性肝細胞肝癌(primary hepatocellular carcinoma，HCC)的高發地區，其死亡率已占我國部分農村和城市的第一、二位，是嚴重影響我國人民健康的重大疾病，每年世界上有38.6萬人死于肝癌，而其中的45％是在中國。目前認為，肝癌的發生、發展，亦和其它惡性腫瘤一樣，是多基因、多因素參與的復雜過程，包括體細胞基因突變、抑癌基因的丟失、癌基因的激活和過表達等等，許多癌基因、抑癌基因，及相關基因的異常激活或失活是肝癌發生的分子基礎。從理論上講，應該有更多的基因參與其中，但目前已發現的許多基因，其詳盡功能仍不十分清楚。目前已證明與人類肝癌相關的癌基因或異常表達基因包括pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R(c-met)/HGF、c-fms(CSF-IR)、c-erbB-1(EGF-R)/c-erbB-2(neu)、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2等等，但沒有一個為肝癌特異性表達基因，因此，尋找新的肝癌異常表達或缺失基因，從基因水平認識肝細胞的生長、分化、再生和癌變的分子機理，并闡明其信號傳遞過程與途徑，不僅有重要的生物學意義，而且對于肝癌的早期基因診斷和信息治療，均具有重大的臨床應用意義和經濟開發價值，在人類基因組的研究中也能占領新的制高點。
隨著分子生物學技術的迅猛發展，尋找、分離基因的新方法不斷出現，主要有以下四種1、從cDNA或mRNA出發的方法利用細胞基因表達的差異來分離致病基因是一類重要方法，目前進展較快。包括cDNA消減雜交法、mRNA差異顯示技術、EST(Expressed sequence tags)差異雜交篩選等；2、從分析蛋白質入手根據蛋白的位置、結合特點或部分功能出發，先分離所需蛋白，再得到相應的基因。包括免疫沉淀法、雙向電泳法、酵母雙雜交系統法等；3、從尋找基因組DNA片段出發尋找到與目標基因座位緊密連鎖的遺傳標記或部分功能信息，從而確定某性狀相關的基因在基因組中某區段的位置，然后再利用不同方法找到該區段染色體內的表達序列，最終克隆到目的基因。包括復雜探針篩庫法、Northern雜交法、剪接位點篩選法、CpG島篩選法、種間同源序列雜交法、PCR直選法、外顯子捕獲、一致序列克隆法等；4、從全基因組出發根據有關基因的效應直接分離該基因的克隆，而不必事先探知其生化功能或圖譜定位，也不需要假設基因的數目或其相互作用方式，包括基因組錯配掃描及代表性差別分析等。上述尋找新基因的方法各有利弊，使用哪一種方法，應根據各自實驗室的條件與優勢，揚長避短，采取切實可行的方法。
1992年美國學者Liang Peng等(Liang P，Pardee AB.Differential display ofeukaryotic messenger RNA by means of polymerase chain reaction.Science，1992257(5072)967-971)首次應用mRNA差別顯示技術分離和鑒定不同組織和細胞間的基因表達，使用該方法，人們已經發現了大量的未知基因，如Liang等(Liang P，Averboukh L，Khandan K，et al.Differential display and cloning of messengerRNAs from human breast cancer versus mammany epithelial cell.Cancer Res，1992；52(24)6966-6968)用該方法比較正常乳腺和乳腺癌的mRNA，發現了全長600bp的S1基因；Chen等(Chen SL，Maroulakou IG，Green JE，et al.Isolation andcharacterization of novel gene expressed in multiple cancers.Oncogene，199612(4)741-751)用該方法發現了一個新基因N8，全長2.4kb，定位于8q13染色體上，在肺癌組織中過表達；日本學者Shibabara等(Shibahara K；Asano M；Ishida Y；Aoki T；Koike T；Honjo T.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is inducedupon programmed cell death.Gene，1995 Dec，166(2)297-301)用該方法分離到一個引起細胞程序性死亡的新基因MA-3，等等。但是DDPCR技術目前尚存在一些不足，近年來雖然一些學者已在這方面做了許多改進，如引物設計的合理性、如何減少假陽性等，但仍需不斷完善，相信DDPCR技術的不斷完善，將會在生命科學領域中成為十分有用的工具。
因此，為治療和診斷目的研究和開發在肝癌中高表達的基因和/或蛋白具有重要意義。本領域迫切需要新的在肝癌中高表達的基因和/或蛋白。目前尚未見有HCCA3基因cDNA序列或氨基酸序列的報導。
本發明的目的是提供一種新的、在肝癌中高表達的人HCCA3蛋白(protein ofhepatocellular carcinoma susceptible gene 3，簡稱為“HCCA3蛋白”)多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發明人應用DDPCR法(Liang P，et al.Science，1992257967)從肝癌組織中獲得一基因片段，進而通過基因克隆技術克隆了一個與HCC正相關新基因全長cDNA序列，該基因序列與原發性肝細胞肝癌(HCC)高度相關。該基因在肝癌中的表達高達78.57％，而癌旁肝組織不表達或表達極低。該基因編碼一264個氨基酸的蛋白質。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的HCCA3蛋白多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述人HCCA3蛋白多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中681-1472位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-1706位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備具有人HCCA3蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人HCCA3蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人HCCA3蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的人HCCA3多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-1706個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人HCCA3多肽活性的化合物，以及抑制人HCCA3多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人HCCA3多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在HCCA3蛋白的方法，它包括將樣品與HCCA3蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HCCA3蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與人HCCA3多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用于篩選促進人HCCA3多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人HCCA3多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發明的人HCCA3蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的人HCCA3多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤等病癥。
本發明其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發明具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。


圖1顯示了本發明人HCCA3蛋白的氨基酸序列及其編碼序列，其中氨基酸序列采用標準的氨基酸單字母縮寫。全長HCCA3蛋白是264個氨基酸(不包括終止密碼子)。
圖2顯示了HCCA3基因在肝癌(K)、癌旁組織(L)內的Northern印跡雜交(上)和相應RNA甲醛變性電泳(下)結果。
圖3顯示了HCCA3在正常組織中Northern印跡雜交(上)和相應RNA甲醛變性電泳(下)結果。其中各泳道為1小腸；2肌肉；3肺；4肝；5胰腺；6腦組織；7胃；8脾臟；9大腸；10心臟組織。
在本發明中，術語“HCCA3蛋白”、“HCCA3多肽”或“肝癌高表達蛋白HCCA3”等可互換使用，都指具有人肝癌高表達蛋白HCCA3氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。該術語包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌高表達蛋白HCCA3。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的HCCA3蛋白或多肽”是指HCCA3多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化HCCA3蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人HCCA3蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然人HCCA3蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“人HCCA3多肽”指具有人HCCA3蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人HCCA3蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人HCCA3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人HCCA3 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HCCA3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人HCCA3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人HCCA3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HCCA3多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供人HCCA3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HCCA3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人HCCA3蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少85％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸所編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼HCCA3蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的人HCCA3核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或HCCA3蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的HCCA3多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人HCCA3多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人HCCA3多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人HCCA3編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人HCCA3蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HCCA3蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗HCCA3蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人HCCA3蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人HCCA3蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人HCCA3 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人HCCA3基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HCCA3基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人HCCA3蛋白的分子，也包括那些并不影響人HCCA3蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人HCCA3基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人HCCA3基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HCCA3蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人HCCA3蛋白功能的抗體以及不影響人HCCA3蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人HCCA3基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人HCCA3基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人HCCA3蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人HCCA3蛋白。此外，與人HCCA3蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發明中的抗體可用于治療或預防與人HCCA3蛋白相關的疾病。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人HCCA3蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人HCCA3蛋白陽性的細胞(例如肝癌細胞等)。由于本發明的HCCA3蛋白在肝癌細胞中是特異性高表達的，這種雜交抗體可用于定向地殺滅肝癌細胞。
多克隆抗體的生產可用人HCCA3蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白及其抗體，通過各種常規篩選方法，可篩選出與HCCA3蛋白發生相互作用的物質，如與其功能密切相關的相互作用蛋白、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或其作用蛋白等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用于疾病治療，如那些在腦和肺等組織中表達低下而導致某些疾病狀態的治療，而該多肽的拮抗劑可用于腫瘤尤其是肝癌方面的治療。在使用本發明HCCA3蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明HCCA3多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的HCCA3蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
人HCCA3蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于HCCA3蛋白的無表達或異常/無活性的HCCA3蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的HCCA3蛋白(尤其是改變其蛋白質-蛋白質相互作用結構域和磷酸化修飾位點)，以抑制(或競爭性抑制)內源性的HCCA3蛋白活性而阻止HCCA3的細胞內信號傳導。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將HCCA3基因轉移至細胞內。構建攜帶HCCA3基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.“分子克隆”)。另外重組人HCCA3基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制人HCCA3 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人HCCA3蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。
本發明還涉及定量和定位檢測人HCCA3蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人HCCA3蛋白水平，可以用作解釋人HCCA3蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷HCCA3蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在HCCA3蛋白的方法是利用HCCA3蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與HCCA3蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HCCA3蛋白。
HCCA3蛋白的多聚核苷酸可用于HCCA3基因相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HCCA3蛋白的多聚核苷酸可用于檢測HCCA3基因的表達與否或在疾病狀態下HCCA3基因的異常表達。如HCCA3 DNA序列可制備成特異性探針用于對活檢標本的雜交以判斷HCCA3基因的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HCCA3蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HCCA3蛋白的轉錄產物。
檢測HCCA3基因的突變也可用于診斷HCCA3蛋白相關的疾病。HCCA3蛋白突變的形式包括與正常野生型HCCA3 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR(SSCP)和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據本發明HCCA3蛋白的cDNA(位于3’-UTR序列)設計并合成PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關系。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從胎盤cDNA文庫(該文庫可從美國Clontech公司購得)中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1706個堿基，其開放讀框位于681-1472位，編碼全長為264個氨基酸的人HCCA3蛋白(SEQ ID NO2)。該HCCA3蛋白是一種肝癌高表達蛋白，HCCA3在肝癌中的表達率高達78.57％，而在癌旁肝組織的表達率和表達水平極低。因此HCCA3多核苷酸、HCCA3蛋白及其抗體，以及HCCA3蛋白相關的拮抗劑、激動劑等可為治療包括肝癌等多種疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1組織總RNA的提取共采用42對HCC及相應癌旁肝組織，1例正常肝組織，1例健康人的肝、小腸、大腸、脾、胰腺、肌肉、肺、腦、胃、心臟組織。
采用一步法提取組織總RNA，基本步驟如下0.5g組織加入5ml變性液(含4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，0.5％十二烷基肌酸鈉，0.1M β-巰基乙醇)，于絞切式勻漿器(Polytron)勻漿5分鐘，混勻后加水飽合酸性苯酚3ml，0.6ml氯仿/異戊醇(24∶1)，振搖10秒鐘靜置冰浴15分鐘。于4℃10000g離心20分鐘，水相移至新管，加等體積異丙醇，置-20℃30分鐘后10000g離心15分鐘，沉淀用75％乙醇洗兩次，干燥后溶于200μl用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子水中，取2μl紫外分光光度計定量，其余-80℃保存。用OD260/OD280計算RNA純度，所有RNA樣品純度均在1.70以上。計算RNA濃度RNA濃度(mg/ml)＝OD260×0.04μg/ml×稀釋倍數，并計算40μg RNA所需體積。
實施例2逆轉錄PCR和DDPCR(1)cDNA第一鏈的合成取一例上述制備的總RNA 3μl(約3μg，標本號23)，分別加入DDPCR下游引物各5μl(共四種，濃度為10μM)，加入DEPC處理水2μl，總體積10μl→70℃變性10分鐘→冰浴2分鐘→加入0.1M DTT 2μl，5×逆轉錄緩沖液 4μl，RNA酶抑制劑(Rnasin)1μl，2.5mM dNTPs 2μl→42℃反應2分鐘→加1μl MMLV逆轉錄酶(20U/μl)→42℃反應50分鐘→70℃15分鐘滅活逆轉錄酶，產物存于-80℃。
(2)PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳a.PCR反應總體積20μl
混合后進行PCR擴增，反應條件94℃4分鐘→93℃1分鐘→40℃2分鐘→70℃1分鐘20秒，共40個循環→72℃延伸10分鐘，熱啟動。b.聚丙烯酰胺凝膠電泳灌制6％(v/v)變性聚丙烯酰胺凝膠，使用1×TBE緩沖液，55W，1900V預電泳40分鐘。取上述PCR產物3μl，加入6μl DNA上樣緩沖液，100℃變性5分鐘，冰浴5分鐘，每泳道加入3μl進行電泳55W、1900V、60mA電泳4.5小時，取下電泳膠，用保鮮膜包裹，于暗室壓入X光片，-80℃自顯影過夜，第二天沖洗自顯影片。
實施例3差異片斷的回收純化和二次PCR擴增將X光片仍于顯影時原樣與電泳膠緊密相貼，對照X光片顯示的差異條帶(癌與癌旁或正常肝組織比較)，用刀片切除(反復燒烤刀片，防止污染)對應位置的電泳膠，放入1.5ml離心管，加入100μl TE(pH8.0)，存-20℃。
回收的聚丙烯酰胺凝膠條帶，100℃煮15分鐘，冷卻后取10μl為PCR反應模板，補加ddH2O 23μl，10×PCR緩沖液5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，Mg離子(25mM)2.5μl，對應的(與得到該片段一致的引物)3’端引物(10μM)2.5μl，5’端引物(10μM)2.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，總體積50μl，反應條件94℃4分鐘→93℃1分鐘→40℃2分鐘→70℃1分鐘20秒→共40個循環→72℃延伸10分鐘，熱啟動。反應結束后取5μl PCR產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶明顯者，將剩余45μl PCR產物繼續電泳，回收擴增出的DNA片段，條帶不明顯者，取2μl PCR產物為模板，進行第三次PCR擴增，反應總體積100μl，反應條件同上。使用QIAEXII凝膠回收試劑盒(glassmilk)(Qiagen)回收純化瓊脂糖凝膠條帶用手術刀片將含目的片段凝膠切下，加入5倍體積的凝膠溶解液55℃加熱10分鐘，使其充分溶解，再加入20μl玻璃奶(glassmilk)室溫混勻15分鐘，10000g離心30秒，棄上清，沉淀用含80％乙醇的PE緩沖液洗2次，55℃干燥后，加入20μl TE震蕩混勻，55℃加熱5分鐘，10000g離心30秒，取上清，再重復2次加入20μl TE洗脫，共得到約50μl洗脫液，分光光度計或電泳定量。
實施例4差異片斷與源標本的Northern印跡雜交(1)探針的標記采用隨機引物標記法，按Prime-a-GeneLabeling System試劑盒(promega)的Protocol進行將25ng DNA溶于30μl水中，100℃水浴加熱變性5分鐘，冰浴5分鐘，加入5×標記緩沖液(含隨機寡核苷酸引物)10μl，α-32P-dATP(3000Ci/mmol)5μl，Exo(-)Klenow酶1μl，BSA(10mg/ml)2μl，dNTPs(15mM的dTTP、dGTP、dCTP等體積混合)2μl，總體積50μl，充分混勻后24℃溫育1-5小時，加入終止液2μl。標記后的探針用QIAquick標記核酸純化試劑盒進行純化用5倍標記物體積(250μl)的鹽溶液PN緩沖液將標記物混勻，加入吸附柱，6500g離心1分鐘，再用500μl含80％乙醇的PE緩沖液洗2次，以去除游離同位素α-32P-dATP，然后用250μl TE洗脫2次，收集洗脫液，取1μl測比活性5.0×108cpm/μg DNA，余置-20℃備用。
(2)RNA甲醛凝膠電泳和Northern吸印轉膜按分子克隆介紹的方法加以改進1.5g瓊脂糖加水130.5ml，加熱融化后冷卻至70℃左右，加10×MOPS緩沖液(0.2mol/LMOPS，80mmol/L乙酸鈉，10mmol/L EDTA pH80)15ml，甲醛4.5ml，灌膠凝固備用。各種RNA樣品40μg加水至11.25μl，加10×MOPS緩沖液5μl 37％甲醛8.75μl，甲酰胺25μl，55℃變性15分鐘轉至冰浴，加5μl加樣緩沖液(50％甘油，1mmol/L EDTA，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青FF)混勻后總體積50μl，加樣至甲醛凝膠，在裝有1×MOPS緩沖液的電泳槽內，電壓120V電泳。待溴酚藍泳動至凝膠2/3位置時停止電泳。在高于裝有20×SSC(3M氯化鈉，0.3M檸檬酸三鈉，調pH至7.0，加水至1L)淺盤液面的平臺上，放置一張全部浸透且兩端浸入20×SSC的濾紙，將電泳后的凝膠在水中稍事漂洗，翻轉置于該濾紙上，凝膠四周圍以膠片屏障，凝膠上依次放置濕潤的相應大小的硝酸纖維素濾膜、2層2×SSC溫潤的濾紙、5cm厚的干紙巾、玻璃板及500g重物。吸印18小時，及時更換紙巾。轉移結束后用6×SSC漂洗硝酸纖維素濾膜，室溫干燥30分鐘，80℃烘干固定2小時以備雜交。
(3)預雜交、雜交、洗膜及放射自顯影濾膜經2×SSPE浸漂5分鐘，再以20ml預雜交浸潤，放入相應大小的塑料盒中，置42℃恒溫振蕩水浴中6小時。換20ml的新的預雜交液，將放射性標記探針置100℃水浴變性10分鐘，轉冰浴驟冷至0℃，加入雜交盒中，繼續于42℃振蕩溫育24小時，小心倒出雜交液，濾膜用500ml 2×SSC，0.1％SDS室溫洗滌半小時再分別用1×SSC，0.1％SDS、0.2×SSC，0.1％SDS、0.1×SSC，0.1％SDS 56℃洗滌30分鐘。將濾膜置于濾紙上室溫晾干，包塑料膜平置片盒內，暗室中將醫用X光片及增感屏置于膜上，置-70℃放射自顯影2小時，用FLA-2000富士熒光及射線影像分析儀觀測雜交結果，觀測后雜交膜繼續-70℃放射自顯影7-10天。
實施例5將差異片斷克隆到T載體和PCR鑒定(1)感受態細胞的制備挑宿主菌DH5α、JM109單菌落于無抗生素(XL1-Blue加四環素至20μg/ml)的3ml LB中，37℃振搖培養過夜，次日取菌液1ml接種至100ml LB中，37℃振搖培養2-3小時(OD600約0.3-0.4)，冰浴10分鐘，4℃4000g離心10分鐘，棄培養液，加入冰預冷的0.1M CaCl210ml重懸菌體，冰浴30分鐘，4℃4000g離心10分鐘，棄上清，再加入冰預冷的0.1M CaCl24ml重懸菌體，置4℃冰箱12-24小時后使用。
(2)差異片斷與T載體的連接和連接產物的PCR鑒定取差異表達的PCR純化片段2μl，加入T4 DNA連接酶緩沖液1μl，T載體1μl，T4 DNA連接酶1μl，去離子水5μl，使總體積為10lμl，置4℃冰箱連接過夜。第二天連接產物65℃10分鐘，以滅活T4連接酶。取連接產物5μl，加入200μl感受態細菌中，冰浴30分鐘，加入800μl無抗生素LB，10μl 20％葡萄糖，37℃搖蕩培養1小時(轉速低于100rpm/分鐘)，以使細菌復蘇，并表達質粒編碼的抗性基因，低速離心菌液后取200μl已轉化的感受態細胞沉淀，涂于含50μg/ml氨芐青霉素，和表面涂布X-gal(20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)的LB瓊脂平板培養基表面，待液體吸收后倒置平皿，37℃培育16小時。第二天，將瓊脂板放4℃4小時，挑取白色單菌落于40μl LB中，用PCR法鑒定該菌落是否含重組體T載體兩端含噬菌體T7、SP6啟動子序列，針對該序列設計引物T7引物序列5’TAATAC GAC TCA CTA TAGGG 3’，SP6引物序列5’CTA TTT AGG TGA CAC TAT AG 3’。PCR反應體系如下總體積20μl，ddH2O 12μl，10×PCR緩沖液2μl，dNTPs混合物(2.5mM)1.6μl，Mg離子(25mM)1μl，T7、SP6端引物(10μM)各1μl，含單菌落的LB培養液1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，反應條件94℃ 4分鐘→94℃ 30秒→56℃ 45秒→72℃ 1分鐘→共35個循環→72℃延伸10分鐘，熱啟動。反應結束后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，含目的片斷的剩余菌液，接種至含氨芐青霉素(50μg/ml)的5ml LB培養液(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L加5N NaOH 200μl調pH至7.0)中，37℃振搖培養過夜。
(3)質粒的小量提取過夜培養菌液12000g離心30秒，棄上清培養液，沉淀菌重懸于冰預冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris/HCl pH8.0，10mmol/L EDTApH8.0)200μl，置冰浴5分鐘，加溶液II(0.2M氫氧化鈉，1％十二烷基磺酸鈉)400μl，顛倒混勻置冰上5分鐘，加溶液III(3M乙酸鉀pH4.8)300μl，冰浴放置10分鐘后12000g離心10分鐘，移上清至新管，加等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，12000g離心10分鐘，棄上清，沉淀重溶于含RNA酶(1μg/ml)的100μl TE溶液中，37℃溫育1小時，酚/氯仿抽提，離心后取水相加0.1體積3M乙酸鈉(pH5.2)，2倍體積乙醇，室溫放置5分鐘后12000g離心10分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌，室溫干燥后重溶于TE溶液。所提質粒DNA經1％瓊脂糖凝膠電泳定量。
實施例6差異片斷測序和GeneBank查詢按T7測序試劑盒說明書操作，并略有改動質粒6μl(約6μg)加入T7或SP6測序引物(2pM)3μl，1N NaOH 1μl→65℃變性8分鐘→加入1N HCL 1μl，5×退火緩沖液3μl→從65℃逐漸冷卻至37℃→在冰浴下加入0.1M DTT 1μl，dNTPs混合物2μl，ddH2O 1.5μl，T7噬菌體測序酶(3U/μl)0.5μl，同位素α-35S-dATP 1μl→分裝4管，每管4.5μl，并分別加入四種雙脫氧核糖核酸3μl→55℃延伸8分鐘→加入5μl終止液→100℃變性5分鐘，冰浴2分鐘→取3μl用6％(v/v)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，2000V，100mA，55W電泳5小時→80℃烤干凝膠2小時，壓醫用X膠片室溫放射自顯影3-5天。測序結果輸入國際NCBI非重復數據庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn/nr/)進行同源性比較，證實是否為新基因。
結果獲得了一個的新基因片段。
實施例7篩選胎盤cDNA文庫和Southern印跡雜交分析(1)人胎盤cDNA文庫和M13K07輔助噬菌體的滴度測定將受體菌XL1-Blue單菌落接種于50ml 2×YT培養基(含20μg/ml四環素，0.2％麥芽糖)，37℃搖振培養過夜。第二天菌液37℃輕微搖蕩培養(搖速＜50rpm/分)，以利于受體君鞭毛的長出。室溫4000g離心10分鐘，去上清，沉淀加入25ml 10mM MgSO4，37℃搖蕩培養1小時，菌液立即使用或存4℃保存。取100ml經PSB溶液稀釋的，不同滴度的人胎盤cDNA文庫或M13K07輔助噬菌體(含卡那霉素抗性，終濃度50μg/ml)，加入100μl XL1-Blue受體菌，37℃靜置培養20分鐘(利于噬菌體貼附于受體菌)，加入保存在47℃的3ml頂層瓊脂(濃度0.7％)，混均后立即倒入含1.5％底層瓊脂(在37℃預熱)的90mm平皿，室溫放置5分鐘后，37℃倒置培養6-8小時，計數噬斑數，并計算出噬菌體的滴度滴度/ml＝噬斑數×稀釋度/0.1ml。
(2)轉膜和初篩根據測得的文庫滴度計算噬菌體的用量，要求每150mm平皿噬斑數在4-5萬左右。頂層瓊脂用0.7％瓊脂糖替代，用量8ml，加入XL1-Blue受體菌800μl，其余同滴度測定。將噬菌體轉印至孔徑0.45μm過濾膜上(經100℃高壓處理15分鐘，防止濾膜縮水)，用變性液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)、中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-ClpH8.0)分別處理10分鐘，6×SSC漂洗，室溫晾干，80℃烤箱烘烤2小時，存室溫。已印有cDNA文庫的濾膜放入預雜交液中，42℃預雜交5小時，加入已標記變性的探針(不需換雜交液)，42℃雜交40小時，分別用2×SSC、0.1％SDS，1×SSC、0.1％SDS，0.1×SSC、0.1％SDS在室溫(5分鐘)、42℃(1小時)、56℃(1小時)洗膜，用微型同位素檢測儀測CPM值(＜10)，濾膜晾干，包保鮮膜后-80℃自顯影3天。
(3)復篩沖洗自顯影片，根據X光片雜交信號的位置，相對應挑取瓊脂快，置于1ml PSB中(含50μl氯仿)，37℃搖蕩1小時，存4℃冰箱。測初篩陽性克隆噬菌體釋放液的滴度，按每150mm平皿約1000個噬斑鋪板，進行第二輪篩選(保留第一輪的雜交液，第二、三輪繼續使用)，同法進行第三、四輪篩選，鋪噬斑密度為100個/150mm平皿，直到可靠挑取單個噬斑為止。
(4)制備Bluescript質粒本實驗用于構建胎盤cDNA文庫的噬菌體載體是λZAPII載體，該載體是一插入型載體，進入宿主菌后，在M13輔助噬菌體的存在下，攜帶克隆化DNA的質粒部分可從載體上切下，形成質粒Bluescript SK(M13)(簡稱PBS)，利于這一特性，可從噬菌體直接轉化為質粒，而不需PCR擴增插入片段，再連入T載體等。100μl噬菌體釋放液+200μl新鮮制備的XL1-Blue菌→37℃靜置孵育15分鐘→加入10μl M13K07輔助噬菌體→37℃靜置孵育15分鐘→加入10mg/ml卡那霉素15μl，3ml2×YT培養基→37℃搖蕩培養5小時→70℃熱滅活20分鐘，使噬菌粒釋放出→離心4000g，15分鐘，保留上清(含PBS質粒)→取上清10μl，加入200μl過夜培養的SOLR細胞(或用其它宿主菌制備的感受態細菌)→37℃靜置孵育15分鐘→取50μl用于鋪含氨芐青霉素的瓊脂板，37℃培養過夜。
(5)含目的基因PBS質粒的鑒定和Southern印跡雜交PBS質粒載體多克隆位點兩端含T7、T3噬菌體啟動子序列，根據該序列設計引物T7引物序列同上述鑒定T載體時的引物序列，T3引物序列5’ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3’。將上述過夜培養瓊脂板單菌落挑人40μl LB培養液，用PCR方法鑒定菌落是否含目的基因，含目的片斷的質粒再小量搖菌，提取質粒。根據PBS質粒多克隆位點兩端含限制性內切酶EcoR I、Xho I的酶切位點，用這兩種內切酶雙酶切PBS質粒，1％瓊脂糖電泳分離目的片斷→電電泳結束后凝膠在變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)、中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-ClpH7.0)分別處理45分鐘，蒸餾水沖洗→搭橋在20×SSC中轉膜20小時(同Northern雜交)→轉膜結束后，印有核酸的硝酸纖維素濾膜在6×SSC中泡5分鐘，晾干，80℃烘烤2小時→按上述Northern雜交方法，進行預雜交、雜交、洗膜→-80℃自顯影4-6小時，觀測結果。
結果發現了數個大小不等，含目的基因片段的PBS質粒。
實施例8 HCCA3基因cDNA全長的獲得選擇實施例7中含目的基因最大的質粒，用ABI377全自動測序儀進行測序，結果僅得到1125bp，含完整的3’端，距polyA前16bp處具有AATAAA加尾信號，3’端非翻譯區長230bp；5’端含大量的GC序列，但未見終止密碼子，5’端對照Northern印跡雜交結果(大小約1.7Kb)，差600bp左右。對照GeneBank今年4月20日公布的18號染色體部分序列(登錄號AC007734，長197057bp)，HCCA3基因與其100％同源，因此考慮HCCA3基因cDNA來源于該基因組，也定位于18染色體上。從DDPCR所得HCCA3基因5’沿18號染色體延伸，很快見到終止密碼子，共延伸581bp，延伸后序列長1706bp(SEQ IDNO1)，其大小符合Northern雜交結果。延伸后所得HCCA3基因序列，其681bp處最大開放閱讀框第一個起始密碼子ATG，緊鄰ACC序列，它的-3和+4位為嘌呤堿基，符合真核細胞RNA有效轉錄的需要，因此有理由推斷這里是起始密碼子，編碼264個氨基酸。
結果表明，一種分離的DNA是一新基因，其序列如SEQ ID NO1所示，序列全長為1706個堿基，其開放讀框位于681-1472位，編碼全長為264個氨基酸的人HCCA3蛋白(SEQ ID NO2和
圖1)。
實施例9 RT-PCR從肝癌組織中獲得HCCA3編碼序列引物合成合成如下引物RT引物15’-CACTGCGACC ATGTTCGTTC CCTGC-3’RT引物25’-AGAAATTAGA TCAGAAAAGT GCAGG-3’逆轉錄(RT)反應管(總20μl)中含1μg總RNA和2.5μM引物2。70℃反應10min；冰浴2min后，加入1μM DTT，0.2mM dNTP混合物，1×逆轉錄反應緩沖液，5U逆轉錄酶，20U RNA酶抑制劑，在37℃反應1h，最后在70℃加熱15min終止反應分裝后保存于-80℃。
PCR擴增、克隆及測序反應管(總100μl)中含5μl逆轉錄反應產物，2.5μM引物1和引物2，0.2mM dNTP混合物，1.25mM MgCl2和2.5U Taq酶。PCR擴增的循環參數和程序為94℃，5min→94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min 20s，35循環→72℃，8min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAEX II kit(GIAGEN公司)進行純化，然后克隆入克隆載體pBluescript SK(或表達載體pGEX-5X-1或pcDNA3)，再進行測序。結果表明擴增產物與SEQ ID NO1所示的HCCA3編碼序列相符。
實施例10大量樣品的Northern印跡雜交分析利用HCCA3基因全長序列作為探針，對42對肝癌和對應癌旁組織，以及10種正常人體組織，進行Northern印跡分析，發現HCCA3基因僅在肝癌組織中表達，癌旁肝組織不表達(個別病例極弱表達)，結果如圖2所示，雜交陽性率是78.57％(33/42)。HCCA3基因在人體肺(3)、脾(8)、大腸(9)中高表達，在胰臟(5)、腦組織(6)、心臟(10)中中度表達，在小腸(1)、肌肉(2)中弱表達，在肝(4)和胃(7)組織中不表達(圖3)。
對HCCA3基因在42對肝癌和癌旁組織中的表達的進一步試驗表明，其表達與腫瘤的大小和分化程度、甲胎蛋白(AFP)的分泌水平、HBsAg陽性、和有無癌栓等指標無關(χ2檢驗，P＞0.05)，但與肝癌包膜的完整性、衛星灶和增殖細胞核抗原Ki-67蛋白的表達有關(χ2檢驗，P＜0.05)，結果如表A所示。
表A HCCA3在肝癌內的表達與肝癌病理特征的關系病理特征 總例數 癌組織中高表達例數癌組織中高表達百分數 P值腫瘤大小＜5cm 10 660.00＞5cm 32 27 84.38 ＞0.05分化程度I-II 7 457.14III-IV 35 29 82.86 ＞0.05AFP≤25 19 15 78.95＞25 23 18 78.26 ＞0.05血清HbsAg+ 35 28 80.00- 7 571.43 ＞0.05包膜侵犯+ 32 28 87.50- 10 550.00 ＜0.05鏡下癌栓+ 26 21 76.92- 16 12 82.35 ＞0.05癌旁衛星灶+ 28 25 89.29- 14 857.14 ＜0.05Ki-67蛋白表達+ 34 29 85.29- 8 450.00 ＜0.05實施例11制備GST融合蛋白(1)GST融合蛋白表達載體的構建在該基因編碼區，針對該基因C端設計PCR引物5’端引物對應于HCCA3的5’端編碼序列并引入合適內切酶位點。3’端引物使用含該基因PBS質粒載體上的T7序列引物，使用高保真Taq DNA聚合酶(Clontcch公司)，反應總體積100μl，反應參數94℃4分鐘→94℃40秒→56℃50秒→72℃1分鐘→共35個循環→72℃延伸10分鐘，熱啟動。擴增出的PCR片段經瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，酶切后，連入GST融合蛋白表達載體PGEX-5X-1的多克隆位點。PCR鑒定大小正確的菌落，搖菌抽提質粒。測序驗證，證實了所克隆的PCR片段序列的正確性(與含該基因的PBS質粒比較，以防堿基突變)。
(2)GST融合蛋白的鑒定和大量制備100μl過夜培養、含重組子的宿主菌，接種到2ml LB培養基(含50μg/ml氨芐青霉素)，37℃搖振培養1小時，部分培養管加入2μl 1M IPTG(1/1000體積)，30℃搖振培養3小時，取1ml菌液，10000g離心2分鐘，去上清，沉淀加入50μl蛋白上樣緩沖液，100℃變性10分鐘，12000g離心10分鐘后，取20μl進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，120V電泳3小時后，凝膠用考馬斯亮藍R250染色1小時，脫色觀測結果。
結果表明，GST融合蛋白的分子量與預計的相符。
(3)大量制備GST融合蛋白100ml過夜培養的宿主菌，接種到900ml LB中，37℃搖振培養1小時，加入1ml 1M IPTG(1/1000體積，終濃度是1mM)，30℃誘導培養3小時，6000rpm離心15分鐘，菌體重懸于50ml冰預冷的PBS中，4000rpm離心10分鐘。菌體加入20ml冰預冷的TS緩沖液(含50mM Tris-HCl pH8.0，25％蔗糖)，加入2ml溶菌酶(50mg/ml)，冰浴20分鐘，加入2ml蛋白酶抑制劑的混合液(含0.5M EDTA 1.68ml，1.6mg/ml aprotinin 0.2ml，17.4mg/ml PMSF 120μl)，冰浴10分鐘，加入4ml 10％Triton X-100，混均，冰浴30分鐘。超聲波處理菌液10分鐘，冰浴10分鐘，離心20000rpm，45分鐘，將上清轉移至50ml離心管，加入1.5ml GST-bead，4℃孵育3小時(期間經常搖動離心管)，離心12000rpm 3分鐘，沉淀用冰預冷的PBS洗3次，將GST-bead轉移到吸附柱中，并用還原型谷光苷肽洗脫，收集洗脫液，每管取10μl電泳鑒定，其余存-20℃。
實施例12抗體制備免疫家兔產生抗體和抗體的純化首次免疫2mg GST融合蛋白，逐滴加入等體積Freun’s Adjuvant Complete，反復抽吸，使之成油包水型，多點注射到2.5kg健康雄性家兔背部皮下，兩周后第二次免疫1mg GST融合蛋白逐滴加入等體積Freun’sAdjuvant Incomplete中，反復抽吸，使之成油包水型，免疫途徑同第一次；間隔兩周第三次免疫注射0.5mg融合蛋白，再兩周后第四次接種0.5mg融合蛋白，8周時從家兔頸動脈取血，血液37℃放1小時，4℃過夜。離心血液4000rpm 10分鐘，吸出血清，部分凍存于-20℃，部分進行純化。20ml血清加20ml生理鹽水，逐滴加入40ml飽和過硫酸氨中，并不斷攪拌，4℃靜置3小時以上，4000rpm離心30分鐘，沉淀溶于20ml生理鹽水中，逐滴加入10ml飽和過硫酸氨，4℃靜置3小時以上，4000rpm離心30分鐘，沉淀溶于10ml生理鹽水中，并重復2次，最后將沉淀溶于10ml PBS中，于4℃透析24小時(期間換液3次)。透析結束后，將抗體分裝，存-20℃。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發明名稱肝癌高表達基因、其編碼的蛋白及其應用(iii)序列數目2(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1706bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGCAGGAGGG AAAGGTTATG GGTCGGCCCG GCGGTCTCTC CCAGCACCCG CGACTCTCAC 60CTTGCTCAGC TGCTGGTGGA TGAGCTGCTT CAGCTCGGAG GCTTTCTCCG GAGGCAGCGA 120CATGCTGGCA GCCGGCGTCT CCCCGCCGCT TCTCCCCGCC TCAGATGCCC TAACTGCGCG 180GCCCCAGCCG GGCCAGGGAG CGTTAGGAGC GACTGGAGCA CAAAGCGCCG CAGCCGTTCG 240CCTAGCGCAG CTCCCGGGGG ACGCAACGCC GCGTCAGGCC GGGGGCTGAC CTGGAAATGA 300GGCCCCGGCG GCGGCGGCGC CAACTGTTTT CAAACAGTGG CGGACAAACA GGGCTTGGGG 360CTGGCCCGCA CGCTGCCTGA TCGTTTCCGC CCGCCGCTCC ACCTCCCCGC GGGCCCCGCA 420CCCCGAGACC TCAGCGCACC CCATCGCCTT GCTTGCCAGG GTCTCCGAAA GCGCTGCTGG 480CCCCTCTTCG CGGCCACCCG GCGGCCTCTT TCCGCCCTCT GAACCGGCAG TTAGCTGGCA 540GCCTCAAGGG CCCGGCGCCC AGGGACTCAA AGGACCCTCC CGCGCCCCGC GAGGCTCCGG 600GGTCTCGGGC TTCCGCCTTC TTGCTGCCCT CGTTCTTGCC AGGGCCGCGG TTAGTCCCTG 660CTGGCCACCC CACTGCGACC ATGTTCGTTC CCTGCGGGGA GTCGGCCCCC GACCTTGCCG 720GCTTCACCCT CCTAATGCCA GCAGTATCTG TTGGAAATGT TGGCCAGCTT GCAATGGATC 780TGATTATTTC TACACTGAAT ATGTCTAAGA TTGGTTACTT CTATACCGAT TGTCTTGTGC 840CAATGGTTGG AAACAATCCA TATGCGACCA CAGAAGGAAA TTCAACAGAA CTTAGCATAA 900ATGCTGAAGT GTATTCATTG CCTTCAAGAA AGCTGGTGGC TCTACAGTTA AGATCCATTT 960TTATTAAGTA TAAATCAAAG CCATTCTGTG AAAAACTGCT TTCCTGGGTG AAAAGCAGTG 1020GCTGTGCCAG AGTCATTGTT CTTTCAAGCA GTCATTCATA TCAGCGTAAT GATCTGCAGC 1080TTCGTAGTAC TCCCTTCCGG TACCTACTTA CACCTTCCAT GCAAAAAAGT GTTCAAAATA 1140AAATAAAGAG CCTTAACTGG GAAGAAATGG AAAAAAGCCG GTGCATTCCT GAAATAGATG 1200ATTCCGAGTT TTGTATCCGC ATTCCGGGAG GAGGTATCAC AAAAACACTC TATGATGAAA 1260GCTGTTCTAA AGAAATCCAA ATGGCAGTTC TGCTGAAATT TGTTTCAGAA GGGGACAACA 1320TCCCAGATGC ATTAGGTCTT GTTGAGTATC TTAATGAGTG GCTTCAGATA CTCAAACCAC 1380TTAGCGATGA CCCCACAGTA TCTGCCTCAC GGTGGAAAAT ACCAAGTTCT TGGAGATTAC 1440TCTTTGGCAG TGGTCTTCCC CCTGCACTTT TCTGATCTAA TTTCTGTTTT ATACCTTATA 1500CCCAAAACAC TTACTACCAA CACAGCTGTT AAACATTCTA TACAAAAAAA TTGTATGATC 1560TGGTATTAGG AAATTACTTT CACAGTAAAT ATCAAAGAAA AAAGATTAAG GGTCTCTTTG 1620CCATGCTTTT CATCATATGC ACCAAATGTA AATTTTGTAC AATAAAATTT TATTTCCTAA 1680GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1706(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度264個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MFVPCGESAP DLAGFTLLMP AVSVGNVGQL AMDLIISTLN MSKIGYFYTD CLVPMVGNNP 60YATTEGNSTE LSINAEVYSL PSRKLVALQL RSIFIKYKSK PFCEKLLSWV KSSGCARVIV 120LSSSHSYQRN DLQLRSTPFR YLLTPSMQKS VQNKIKSLNW EEMEKSRCIP EIDDSEFCIR 180IPGGGITKTL YDESCSKEIQ MAVLLKFVSE GDNIPDALGL VEYLNEWLQI LKPLSDDPTV 240SASRWKIPSS WRLLFGSGLP PALF 26權利要求
1.一種分離的人HCCA3蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中681-1472位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1706位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求6所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
8.一種具有人HCCA3蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達人HCCA3蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人HCCA3蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的人HCCA3蛋白特異性結合的抗體。
10.一種核酸分子，它含有權利要求3所述的多核苷酸中連續的10-800個核苷酸。
全文摘要
本發明公開了一種新的人HCCA3蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生這種多肽的方法。本發明還公開了此多肽的藥物組合物用于治療肝癌等多種疾病的方法。本發明還公開了HCCA3蛋白特異性抗體的制備方法以及該抗體用于疾病診斷和治療等多種用途。本發明還公開了編碼這種新的人HCCA3蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/10GK1371917SQ01105508
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者王紅陽, 王征旭, 吳孟超 申請人:第二軍醫大學東方肝膽外科研究所