一種酰胺化重組多肽及其制備方法

專利名稱：一種酰胺化重組多肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種包含至少一種編碼α-酰胺化酶的核酸序列以及待酰胺化的目標多肽的核酸序列之核酸構建體，本發明進一步涉及含有所述核酸構建體的表達載體、原核宿主細胞。本發明還涉及通過利用所述核酸構建體在原核宿主中表達，制備酰胺化重組多肽，尤其是酰胺化重組降鈣素的方法。
眾所周知，在神經和內分泌系統產生的具有生物學活性的多肽中，大多數其C末端需要被酰胺化，而且C末端α-酰胺基對多肽的生物活性至關重要，其可能延長多肽的半衰期或增強多肽與受體的親和力(Fuhlendorff，J.等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87182-186)。C端的α-酰胺基來自多肽前體的翻譯后加工，由α-酰胺化酶(以下簡稱為α-AE，又稱為肽酰甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM))催化，該反應是活性多肽生物合成過程中的限速步驟。屬于這一類活性多肽的例子有降鈣素、催產素、加壓素、促皮質釋放激素、促甲狀腺釋放激素、神經激肽、咽側體抑制素、Lem-KI、紅色素濃縮激素、促黃體激素釋放激素、白細胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽、神經調節肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蠅毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1等，其C-末端的酰胺化對其生物活性至關重要。
現在已能利用重組DNA技術在原核生物中生產具有臨床和商業使用價值的蛋白質和多肽，由于原核生物表達體系沒有α-AE，因此不能用于生產酰胺化多肽，但可生產C-末端帶有Gly的活性多肽前體。為了對這類重組活性多肽之前體進行酰胺化，目前一般采用下列方法1)利用從天然來源的動物組織中獲得的α-AE體外催化多肽前體進行酰胺化
Engels，J.W.等(核苷與核苷酸(Nucleosides & Nucleotides)6185-195)將人生長激素釋放因子前體(hGHCF-Gly)的基因在大腸桿菌中表達形成包涵體，經過一系列純化步驟后得到hGHCF-Gly，同時從天然來源的牛垂體中分離純化α-AE，利用純化的α-AE催化hGHCF-Gly的體外酰胺化。由于天然來源的動物組織中α-AE含量很低，分離純化困難，這種方法難以擴大用于活性多肽的商業化生產。2)利用基因工程方法獲得的α-AE體外催化多肽前體進行酰胺化Ray等(Bio/Technology，1164-70)用CHO細胞分泌表達大鼠α-AE，經疏水層析和離子交換層析初步純化后，利用純化的α-AE催化大腸桿菌表達的鮭魚降鈣素前體(sCT-Gly)的體外酰胺化，反應的質量比(酰胺化產物的質量/酶的質量)能達到1000以上，可以用于鮭魚降鈣素的大規模生產。但是sCT-Gly和α-AE在兩個不同的表達體系中分別表達，需要將所述酰胺化酶及目標多肽分別純化后才能進行酰胺化反應，酰胺化反應完成后還需要將酰胺化的降鈣素(sCT)進一步純化，步驟繁多，工藝復雜，收率低，成本高。
李元等人在中國專利96105118.3中公開了用重組DNA技術在淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)中分泌表達鮭魚降鈣素的前體(sCT-Gly)的方法，然而該技術不能直接產生酰胺化的鮭魚降鈣素。
目前也有在真核宿主表達體系中成功制備酰胺化多肽的報道，Takahashi等(肽(Peptides)，18(3)439-44)公開了在COS-7和CHO細胞系中表達具有生物活性的酰胺化鮭魚降鈣素的方法。由于真核表達體系存在培養成本較高，對生產條件要求嚴格，且從培養液中回收目標多肽困難等方面的問題，不適于大規模工業生產。
目前臨床上廣泛使用的生物學活性依賴于酰胺化的多肽主要有降鈣素、催產素、加壓素等。隨著具有潛在臨床和商業使用價值的其它需要酰胺化的多肽日益增多，迫切要求一種更為經濟、有效的多肽酰胺化技術。為了簡化工藝步驟、降低成本，本發明設計了一種核酸構建體，所述核酸構建體至少含有一種編碼酰胺化酶的核酸序列和編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列。通過基因工程方法將含有該核酸構建體的表達載體轉化特定原核宿主，經表達可直接獲得酰胺化的、具有生物活性的目標多肽。
本發明的一個方面涉及包含至少一種編碼酰胺化酶的核酸序列和編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列之核酸構建體。
本發明另一個方面涉及含有所述核酸構建體的表達載體。本發明另一個方面涉及含有所述表達載體的宿主細胞。本發明還涉及所述表達載體和宿主細胞的制備方法。
本發明又一方面涉及通過在所得適當表達宿主中表達所述核酸構建體編碼的目標多肽，制備酰胺化重組多肽的方法。
本發明的又一方面還涉及利用分別帶有編碼酰胺化酶的核酸序列以及編碼待酰胺化的目標多肽不同的相容性表達載體，共轉化同一原核宿主，制備酰胺化目標多肽的方法。
本發明的又一方面還涉及利用分別經編碼酰胺化酶的核酸序列的表達載體以及編碼待酰胺化的目標多肽的表達載體轉化的原核宿主進行共培養，制備酰胺化目標多肽的方法。
為了獲得具有生物活性的酰胺化多肽，本發明制備了一種包括至少一種編碼α-酰胺化酶的核酸序列和編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列之核酸構建體。1.編碼α-酰胺化酶的核酸序列本領域技術人員知曉，本發明中所用的α-酰胺化酶可來自多種來源，包括但不限于如豬、牛、小鼠、大鼠、蟾蜍等來源的α-酰胺化酶。α-酰胺化酶的選擇一般取決于所要酰胺化的目標多肽以及采用的表達宿主。在本發明的一個優選實施方案中，所述α-酰胺化酶來自于大鼠的心房組織。在一個優選實施方案中，編碼所述α-酰胺化酶的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
如本領域技術人員知曉，由于α-酰胺化酶mRNA的多樣性，在不同來源的生物甚至是同一生物的不同組織中存在多種形式的α-酰胺化酶。因此，本發明中所用的編碼α-酰胺化酶之核酸序列可以由于密碼子的簡并性、mRNA的不同剪接形式的不同而具有多種形式。因此，本發明也包括編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述核酸序列可由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO1不同。本發明還包括編碼這樣一種α-酰胺化酶的核酸序列，其與SEQ IDNO1的核酸序列有一定程度的同源性，同源性至少約為80％、優選地約85％、更優選地約90％、甚至更優選地約95％、最優選地約97％。對于本發明而言，可通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美國國家科學院院報80726-730)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，應用同一性表和所選多重對比參數測定兩種核酸序列間同一性的程度。本發明也包括編碼一種α-酰胺化酶的核酸序列，其在低度嚴格條件下、更優選地中度嚴格條件下、甚至更優選地高度嚴格條件下、最優選地極高嚴格條件下可與如此處所述的SEQ ID NO1的核酸序列或其互補鏈、或其等位變體及其亞序列雜交(Sambrook等人，1989，出處同上)。此處所述的“嚴格條件”對于長度至少為100的核苷酸，低度到極高度嚴格條件分別被定義為按照標準Southern印跡程序，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并變性的鮭精DNA和對于低度、中度、高度和極高度嚴格性分別為25％、35％或50％的甲酰胺中，42℃預雜交和雜交。對于長度至少為100的核苷酸的長探針，最后用2×SSC、0.2％SDS將該載體物質洗滌3次，每次15分鐘，洗滌溫度優選地至少45℃(極低嚴格性)，更優選地至少50℃(低嚴格性)，更優選地至少55℃(中嚴格性)，更優選地至少60℃(中-高度嚴格性)，甚至更優選地至少65℃(高嚴格性)，最優選地至少70℃(極高嚴格性)。對于長度為大約15個核苷酸到約70個的核苷酸，嚴格條件被定義為按照標準Southern印跡程序，在比按照Bolton和McCarthy(1962，美國國家科學院院報481390)計算的Tm低5℃-10℃的溫度下，在每ml含0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中預雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度為大約15個核苷酸到約70個的核苷酸，在比計算的Tm低5℃-10℃的溫度下，將載體物質在6×SSC加0.1％SDS中洗一次15分鐘，并用6×SSC洗兩次，每次15分鐘。2.α-酰胺化酶多肽由上述編碼本發明的α-酰胺化酶之核酸序列可知，可用于本發明的α-酰胺化酶包括具有如SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的α-酰胺化酶。本領域技術人員周知，可對所述多肽進行一個或多個氨基酸殘基的保守性修飾，如插入、刪除或替換，而基本上不會影響本發明α-酰胺化酶的生物學活性。因此，本發明還涉及上述α-酰胺化酶的變體、衍生物或其片段，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列有一定程度同一性的氨基酸序列，至少約80％，優選地至少約85％，更優選地至少約90％，甚至更優選地至少約95％，甚至最優選地至少約97％同一性多肽。在一個優選實施方案中，所述同一性多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列相差5個氨基酸、優選地4個氨基酸、更優選地3個氨基酸、甚至更優選地2個氨基酸、最優選地1個氨基酸的氨基酸序列。對于本發明而言，通過Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)測定同一性。優選地，本發明的α-酰胺化酶多肽可為包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其片段，只要該片段具有α-酰胺化酶活性。在一個更優選的實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一個優選實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其片段，只要該片段具有α-酰胺化酶活性。在一個更優選的實施方案中，本發明的α-酰胺化酶多肽由SEQ IDNO2的氨基酸序列組成。3.編碼目標多肽的核苷酸序列及多肽的氨基酸序列本發明所述的待酰胺化的目標多肽涵蓋多種多肽，這類多肽具有臨床或醫藥用途，且其生物學活性均有賴于C-末端的酰胺化，包括但不限于降鈣素、催產素、加壓素、促皮質釋放激素、促甲狀腺釋放激素、神經激肽、咽側體抑制素、Lem-KI、紅色素濃縮激素、促黃體激素釋放激素、白細胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽、神經調節肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蠅毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1。本領域技術人員應理解，編碼所述目標多肽的核苷酸序列可以為合成的、或天然來源的。只要所選目標多肽的C-末端具有與所用α-酰胺化酶發揮功能相適應的結構，從而可被α-酰胺化酶酰胺化。本領域技術人員還應知曉，待酰胺化的目標多肽的表達不應影響所選表達宿主的基本代謝、生理過程。在一個優選實施方案中，本發明所述目標多肽為降鈣素，包括鮭魚降鈣素、雞降鈣素或豬降鈣素。在一個優選實施方案中，本發明所述待酰胺化的目標多肽是鮭魚降鈣素。在又一個優選實施方案中，本發明所述待酰胺化的目標多肽是降鈣素類似物、衍生物或其有等同的生物學活性的片段。在一個優選實施方案中，編碼待酰胺化的鮭魚降鈣素的核苷酸序列含有SEQ ID NO3的核苷酸序列。在一個優選實施方案中，待酰胺化的多肽是SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。4.核酸構建體如本發明所用，術語“核酸構建體”定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其可為人工合成的或分離自天然存在的基因，或經修飾含有以自然界中不會存在的方式組合及并列的核酸片段。本發明所述核酸構建體可以為單鏈或雙鏈的DNA或RNA分子。在一個優選實施方案中，本發明的核酸構建體包含至少一個編碼α-酰胺化酶的核酸序列以及編碼所述待酰胺化的目標多肽的核酸序列。本發明核酸構建體中所包含的編碼α-酰胺化酶的核酸序列與編碼所述待酰胺化的目標多肽的核酸序列在核酸構建體中的相互位置關系可以有多種情況，兩種編碼核酸序列可以位于同一核苷酸鏈上，也可以分別位于兩條核苷酸鏈上。當兩種核酸序列位于同一核苷酸鏈上時，二者可以相鄰或不相鄰，串聯或不串聯，且可以具有相同或不同的轉錄方向，只要所述α-酰胺化酶經表達后可以將待酰胺化的目標多肽酰胺化。此外，本發明中所述的兩種核酸序列二者可各自獨立地含有表達所需的控制序列，所述控制序列可以相同或不相同。所選控制序列主要取決于所控制的編碼目標蛋白質之核苷酸序列以及采用的表達宿主。本領域普通技術人員知曉，可使用任何可在所選表達宿主中有效控制目標多肽表達的控制序列。另外，本發明構建體中還可分別包括一個或多個拷貝的本發明中所述的兩種核酸序列。用于調節所述核酸序列表達的控制序列可位于核酸序列的5’末端或3’末端的任意一側，優選地位于待表達的核酸序列之5’側，只要該控制序列可有效地控制目的蛋白質的表達。在本發明的一個優選實施方案中，所用的控制序列分別為來自melC1基因的分泌信號肽編碼序列及其上游序列。
如需要，核酸構建體中還可含有一個或多個與表達所含目標多肽編碼序列相關的其它控制序列。在本發明的一個優選實施方案中，所述核酸構建體分別在編碼α-酰胺化酶的核酸序列以及編碼降鈣素前體的核酸序列的5’側帶有用于分泌表達的信號肽序列。在另一個優選實施方案中，本發明核酸構建體中位于兩種核酸序列的多肽之5’側的用于分泌表達的信號肽序列均來自melC1基因。本發明的核酸構建體，其可包括與本發明所述編碼α-酰胺化酶的核酸序列以及編碼待酰胺化的多肽的核酸序列有效連接地一種或多種調節序列，用以引導本發明的編碼序列在適當宿主細胞中表達。應當理解，表達包括參與多肽產生的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
術語“編碼序列”在此定義為直接針對其蛋白質產物的氨基酸序列部分的核酸序列。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以用多種方式將所述編碼α-酰胺化酶的核酸序列以及編碼待酰胺化的多肽的核酸序列插入到適當的表達載體中，如需要，在插入載體之前可對核酸序列進行加工或修飾，這取決于表達載體。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術在本領域中眾所周知。
在此將術語“控制序列”定義為包括為本發明多肽的表達所必需的或有利的所有組分。每種控制序列對于編碼多肽的核酸序列而言可以是自身的或外源的。這類控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子和轉錄及翻譯終止信號。控制序列可具有接頭，旨在引入特定的限制酶切位點，以便于控制序列與編碼目標多肽的核酸序列的編碼區相連接。術語“有效連接”在此定義為一種構型，其中一種控制序列被適當地置于與DNA序列編碼序列相關的位置，使得該控制序列引導多肽的產生。
控制序列可以是一種適當的啟動子序列，即為了核酸序列的表達而由宿主細胞識別的一種核酸序列。啟動子序列中含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型和雜合型啟動子，并可從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因中獲得。
在采用細菌表達宿主細胞的情況中，引導本發明的核酸構建體轉錄的適當啟動子的實例是從下列基因中獲得的啟動子淺青紫鏈霉菌的β半乳糖苷酶基因、長孢鏈霉菌(Streptomyces longisporus)的絲氨酸蛋白酶抑制劑STI-II基因、弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)的氨基糖苷磷酸轉移酶(aph)基因、刺糖鏈霉菌(Streptomyces erythraeus)的紅霉素抗性基因(ermE)和唐德鏈霉菌(Streptomyces tendae)的α-淀粉酶抑制劑(tendamistat)基因的啟動子，以及淺青紫鏈霉菌中tipA基因的可被硫鏈絲菌素誘導的啟動子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xyl A和xyl B基因、大腸桿菌lac操縱子、原核生物的β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美國國家科學院院報753727-3731)以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學院院報8021-25)。在《科學美國人》(Scientific American)，1980，24274-94中的“來源于重組細菌的有用蛋白質”；和Sambrook等人，1989，同上中描述了更多的啟動子。對于鏈霉菌屬的宿主中可用的啟動子還包括但不限于aphD，tsr，ermE，ermE-up，ssi，vsi，STI-II，β-gal，vph，tipA等。
控制序列也可以是適當的轉錄終止序列，即由宿主細胞識別而終止轉錄的一種序列。終止序列與編碼多肽的核酸序列的3′端有效連接。在所選宿主細胞中有功能的任何終止子均可用于本發明。
控制序列也可以是合適的前導序列，即對于宿主細胞翻譯至關重要的mRNA的非翻譯區。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5′端有效連接。在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列均可用于本發明。
控制序列也可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基端相連接的氨基酸序列，該氨基酸序列能引導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸序列編碼序列的5′端可固有地含有一種信號肽編碼區，該編碼區與編碼分泌多肽的編碼區片段在翻譯讀框內天然連接。此外，編碼序列的5′端可含有一種對于編碼序列為外源的信號肽編碼區。當編碼序列不是正常地含有信號肽編碼區時，可能需要外源的信號肽編碼區。此外，外源信號肽編碼區可簡單地替換天然信號肽編碼區以獲得增強的多肽分泌。然而，能引導表達的多肽進入所選宿主細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區均可用于本發明。
對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是例如在鏈霉菌宿主中有效的唐德鏈霉菌的α-淀粉酶抑制劑基因、長孢鏈霉菌絲氨酸蛋白酶抑制劑STI-II基因、α-淀粉酶基因、葡激酶基因、β-半乳糖苷酶基因以及酪蛋白酶melC1基因的信號肽、從芽孢桿菌NCIB 11837的產麥芽淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)或枯草芽孢桿菌prsA基因中獲得的信號肽編碼區。Simonen和Palva，1993，微生物學綜述(Microbiological Reviews)57109-137描述了更多的信號肽。
控制序列也可以是前肽編碼區，其編碼一種位于多肽氨基端的氨基酸序列。得到的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或者有時稱為酶原(zymogen))。多肽原通常無活性，通過從多肽原上催化或自催化地切割前肽可轉化為成熟的活性多肽。前肽編碼區可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因中獲得。
加入能夠調節與宿主細胞生長有關的多肽表達的調節序列也是所希望的。調節系統的實例是那些應答化學或物理刺激(包括調節化合物的存在)而引起基因表達被打開或關閉的調節系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac和trp操縱子系統等。
構建體的調節序列可包含一種或多種啟動子、增強子、負調節元件、轉錄結合位點或這些序列的組合。5.表達載體本發明另一個方面涉及含有所述核酸構建體的表達載體，其中優選地還含有啟動子和轉錄及翻譯終止信號等控制序列。上述多種核酸和控制序列可以有效連接在一起產生一種重組表達載體，該載體還優選地包含一種或多種適宜的限制酶切位點，以便于目的核酸序列在這些位點的插入或置換。此外，也可通過向合適的表達載體中插入核酸序列或含有該序列的核酸構建體來表達本發明的核酸序列。在構建表達載體中，應使編碼序列位于載體中，使得編碼序列與用于表達的適當控制序列有效連接。
重組表達載體可以是能方便地進行重組DNA操作并能導致核酸序列表達的任何載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇一般取決于載體與待引入載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環狀的質粒。
載體可以是自主復制性載體，即，作為一種染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可含有保證自復制的任何元件。另外，載體也可以是這樣一種載體，當引入宿主細胞后，它整合到基因組中并與所整合的染色體一起復制。此外，也可使用一種載體或質粒或者兩種或多種載體或質粒，它們一起含有被引入到宿主細胞基因組中的總DNA。
本發明的載體優選地含有一種或多種使轉化細胞能得到方便篩選的選擇性標記。選擇性標記是這樣一種基因，其產物提供抗生素抗性、殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性等等。細菌選擇性標記的實例是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或是賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的標記或用于鏈霉菌篩選的硫鏈絲菌素抗性。
本領域技術人員知曉，適當的表達載體的選擇取決于待表達的目標多肽及所選原核宿主細胞。適用于本發明的表達載體包括但不限于pIJ101衍生質粒pIJ680，pGM16，pSGL1，或它們的衍生物，例如對于鏈霉菌屬的表達宿主，可為帶有強啟動子aph的pIJ680，其它優選的表達載體參見Kieser等，鏈霉菌遺傳學實踐(PracticalStreptomyces Genetics，The John Innes Foundation，Norwich，2000)，例如pIJ486/487，pIJ702，pFD666；對于大腸桿菌宿主，優選的表達載體為pUR278，pEX2，pMR100，pKC30，pET-3a等，如Sambrook等人，分子克隆(第二版，1989，紐約Cold Spring Harbor LabortoryPress)中所述；對于芽孢桿菌表達宿主，優選的表達載體可以為例如pWVO1，pGA14等。
對于自主復制而言，載體可進一步含有使載體能在所述宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，允許在鏈霉菌中復制的pIJ101、pJV1、pSG5、pSGL1的復制起點，以及允許在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。復制起點可以具有使其在宿主細胞內的作用變成溫度敏感的突變(見例如，Ehrlich，1978，美國國家科學院院報751433)。
本領域技術人員周知可以將超過一個拷貝的本發明的目標核酸序列插入宿主細胞中來增強目的產物的產生。獲得核酸序列拷貝數增加的方法包括，將該序列的至少另一個拷貝整合到宿主細胞基因組中，或者使核酸序列含有可擴增的選擇性標記基因，通過在適當選擇劑的存在下培養細胞，能篩選出含有擴增拷貝的選擇性標記基因、并因而含有另外拷貝的核酸序列的細胞。
用于連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法為本領域的技術人員所周知(Sambrook等人，出處同上)。6.宿主細胞本發明也涉及含有具有本發明的核酸構建體之重組表達載體的宿主細胞，其用于目標酰胺化多肽的重組生產。將含有本發明的核酸構建體之表達載體引入宿主細胞中，使載體作為染色體整合體或作為如前所述的自復制的染色體外載體而保持于其中。術語“宿主細胞”還包括由于復制期間發生突變而與親代細胞不同的親代細胞的任何子代。宿主細胞的選擇很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
本發明中所用的宿主細胞可以是單細胞微生物，如原核生物。可用于本發明的有用的單細胞是細菌細胞，如革蘭氏陽性菌，包括但不限于鏈霉菌屬的種類，例如，淺青紫鏈霉菌的菌株，包括例如淺青紫鏈霉菌1326、TK21、TK24、TK54、TK64，天藍色鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，芽孢桿菌屬的菌株，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或者是革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌和假單胞菌屬的種類。在一個優選實施方案中，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌TK24。在另一個優選實施方案中，所用宿主細胞是淺青紫鏈霉菌TK54。
向細菌宿主細胞中引入重組表達載體的方法可以是例如原生質體轉化(見，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(MolecularGeneral Genetics)168111-115)、使用感受態細胞(見，例如，Young和Spizizin，1961，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜志56209-221)、電穿孔法(見，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技術(Biotechniques)6742-751)或接合法(見，例如，Koehler和Thorne，1987，細菌學雜志1695771-5278)。對于利用相容性質粒共轉化同一原核表達宿主的方法可參見Sambrook等人，出處同上以及Hopwood，D.A.等人，鏈霉菌遺傳操作(Genetic Manipulationof Streptomyces)，The John Innes Foundation，Norwich，1985中所述的方法。7.重組酰胺化多肽的制備方法本發明也涉及制備具有生物學活性的酰胺化多肽的方法，包括(a)在適當的條件下培養如上所述獲得的帶有重組表達載體的宿主細胞，產生含有目標酰胺化多肽的培養上清液；和(b)從培養上清液中回收該多肽。
在本發明的一個優選實施方案中，獲得具有生物學活性的酰胺化重組降鈣素方法包括(a)在有利于α-酰胺化酶以及降鈣素產生的條件下培養鏈霉菌宿主細胞，其中該所述宿主細胞已經用含有如SEQ ID NO1和3所示的核苷酸序列或其變體的表達載體轉化；以及(b)直接從培養上清液中回收酰胺化降鈣素。
本發明的又一方面還涉及利用分別含有編碼酰胺化酶的核酸序列的表達載體以及相容性的編碼待酰胺化目標多肽的核酸序列之表達載體共轉化同一原核宿主，例如鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬或大腸桿菌的菌株，制備酰胺化目標多肽的方法。其中分別含有所述編碼酰胺化酶的核酸序列以及編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列的表達載體是相容性的。此處所述的相容性是指不同質粒可以在同一宿主細胞中共存。判斷是否為相容性質粒的實驗屬于本領域技術人員知識范圍中。本發明中可選的用于表達目標酰胺化多肽的相容性質粒，對于鏈霉菌屬的菌株而言，包括但不限于pIJ101及其衍生質粒和pSGL1及其衍生質粒，pIJ101及其衍生質粒和pJV1及其衍生質粒，pIJ101及其衍生質粒和pSG5及其衍生質粒；對于大腸桿菌屬的菌株而言，包括但不限于pUC18及其衍生質粒和p15A及其衍生質粒，pUC18及其衍生質粒和pSC101及其衍生質粒。不同載體對宿主的轉化可同時進行，或依次進行。本領域技術人員知曉，所選表達載體應當與所選表達宿主相適應。在本發明的又一優選實施方案中，獲得具有生物學活性的酰胺化降鈣素方法，包括(a)用含有編碼酰胺化酶的核酸序列的表達質粒以及相容性的含有編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列之表達質粒共轉化原核宿主細胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目標多肽產生的條件下，培養所得原核宿主細胞；以及(c)從培養物中回收酰胺化目標多肽。
在本發明的又一優選實施方案中，獲得具有生物學活性的酰胺化降鈣素方法包括(a)在有利于α-酰胺化酶以及降鈣素產生的條件下，混合培養由分別含有編碼酰胺化酶的核酸序列以及編碼待酰胺化目標多肽的核酸序列之不同表達載體轉化的獨立的鏈霉菌宿主細胞；以及(b)從共培養物中回收酰胺化降鈣素。本發明中共培養的經分別轉化的鏈霉菌宿主細胞可為如前面所列舉的多種鏈霉菌表達宿主中任一種類型之一的相同類型或不同類型的菌株，只要所選表達宿主細胞在共培養過程中能有效產生酰胺化降鈣素。
在本發明的酰胺化多肽產生方法中，用本領域公知的方法在適于多肽產生的營養培養基中和需氧培養條件下培養細胞。例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵)培養細胞，在合適的培養基中和使多肽能表達和/或分離的條件下進行。用本領域公知的方法在含有適當量的碳源和氮源以及無機鹽等的適當營養培養基中進行培養。合適的培養基可從商業供應商處得到或根據公開的組成(例如，美國典型培養物保藏中心的目錄中所公開的)制備，也可參見Hopwood，D.A.等人，出處同上)中所述的那些適于鏈霉菌屬的菌株生長的培養基。對于多肽分泌到發酵培養基中的情況，則可直接從發酵培養基中回收該多肽。在本發明中，所述適于在鏈霉菌表達宿主中進行α-酰胺化酶以及降鈣素表達的條件基本上如Hopwood，D.A.等人，出處同上)中所述的方法中所述，采用如YEME培養基、TSB培養基、LB培養基，在20-37攝氏度，優選在22-30攝氏度，更優選在25-28攝氏度下于含有該培養基的搖瓶中和/或實驗室規模的自動發酵罐中培養由上述所制備的鏈霉菌宿主。在所述條件下發酵進行大約30-200小時后，優選進行60-180小時后，更優選進行80-140小時后結束發酵。在發酵終點優選地通過監測發酵培養液中累積的酰胺化目標多肽的量以及監測表達宿主的生長狀況決定。
在本發明的一個實施方案中，使用多種本領域公知的方法直接或間接地檢測酰胺化降鈣素及其生物活性。這些檢測方法可包括HPLC、飛行質譜法、N-端氨基酸序列測定、放射免疫(RIA)或酶免疫(EIA)方法、體內血清鈣水平測定等。
得到的酰胺化目標多肽可通過本領域公知的方法回收。例如，可用常規方法從營養培養基中回收多肽，這些方法包括但不局限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。在本發明的一個實施方案中，采用離心除去培養液中表達宿主鏈霉菌的菌絲體，回收上清液。為保證所得目標多肽的活性，調節所得上清液的pH至適當的范圍。經過硫酸銨沉淀得到酰胺化多肽。
本發明的多肽可用本領域公知的多種方法純化，這些方法包括但不局限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(見，例如，《蛋白質純化》(ProteinPurification)J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，紐約，1989)。在本發明的一個實施方案中，采用多步體積排阻層析方法進行純化。8.發明的有益效果本發明通過基因工程方法，構建了一種含有至少一種編碼α-AE和編碼待酰胺化的目標多肽核酸序列的核酸構建體。在本發明的一個實施方案中，通過構建了含有編碼大鼠α-AE(SEQ ID NO1)和鮭魚降鈣素前體(SEQ ID NO3)的核酸構建體，將所得核酸構建體經基因工程方法導入構建的表達載體pIJ-mel-AE/mel-sCT，用該表達載體轉化淺青紫鏈霉菌TK54，得到重組菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]，獲得可以直接分泌產生酰胺化鮭魚降鈣素的基因工程菌。此外，本發明還通過共轉化法，用相容性的分別具有α-酰胺化酶及鮭魚降鈣素前體編碼序列之不同表達載體共轉化同一鏈霉菌宿主細胞，得到重組菌株淺青紫鏈霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]。通過培養如上述所得的重組菌株，或者通過共培養分別由含有酰胺化酶表達載體及含有重組降鈣素表達載體的鏈霉菌重組菌株淺青紫鏈霉菌[pMS680]和淺青紫鏈霉菌[pSGLN-mel-AE]，直接從發酵液中回收所得酰胺化鮭魚降鈣素，簡化了獲得酰胺化目標多肽的工藝步驟，提高了收率，從而大大降低了生產成本。
現結合下面的附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。


圖1為分別帶有控制序列的α-AE基因和鮭魚降鈣素前體基因的核酸構建體之示意圖。
圖2為含有核酸構建體的重組表達載體pIJ-mel-AE/mel-sCT的示意圖。
圖3為單獨含有鮭魚降鈣素前體編碼基因及控制序列的重組表達載體pMS680的示意圖。
圖4為單獨含有α-AE編碼基因及控制序列的重組表達載體pSGLN-mel-AE的示意圖。
圖5為酰胺化降鈣素的高壓液相色譜分析結果。圖中本發明所得酰胺化鮭魚降鈣素的保留時間為16.61分鐘，市售的酰胺化鮭魚降鈣素(Sigma公司，標準品)的保留時間為16.79分鐘。兩者的保留時間差異在測量的系統誤差范圍之內。
圖6為酰胺化鮭魚降鈣素的飛行質譜分析結果。
BcllP25’TGCACTGCAGGCGCGGGCGGCGGGAAG 3’(SEQ IDNO6) PstI利用上述引物對P1和P2，以抗生鏈霉菌ATCC 10382的總DNA為模板，通過如下PCR反應擴增得到一個370bp的DNA片段以總體積50μl進行PCR反應，95℃變性10分鐘后加Taq DNA聚合酶，按94℃變性1分鐘，36℃退火1.5分鐘，72℃延伸1.5分鐘循環反應5次，然后再按94℃變性1分鐘，42℃退火1分10秒，72℃延伸1.5分鐘，循環反應25次，最后在72℃延伸10分鐘。從聚丙烯酰胺凝膠電泳上回收所得PCR反應片段，經限制性內切酶PstI和BclI酶切，用T4連接酶連接，克隆入經Pst I和Bam HI酶切的pUC19的Pst I和Bam HI位點處，其中BamHI與BclI的酶切粘性末端互補，獲得帶有melC1分泌信號肽及其上游序列的重組質粒pUC19-mel，經ABI公司自動測序儀(儀器型號373A)測定該片段序列，表明擴增序列與文獻報道的序列完全相符。2.帶有melC1分泌信號肽及其上游序列的鮭魚降鈣素前體sCT-Gly編碼序列(mel+sCT-Gly)之核酸構建體的制備利用基本上如中國專利96105118.3中所述的方法，通過PCR擴增，使用如下引物P35’TGCACTGCAGCAACCTCAGCACCTGT 3’(SEQ ID NO7)P45’GCGGATCCTACTAGCCCGGCGTACCACTTCCCG 3’(SEQID NO8)從鮭魚DNA模板中擴增得到一個117個堿基對的DNA片段。將所得PCR產物經Pst I和Bam HI酶切后克隆于大腸桿菌質粒pUC19的相應酶切位點，獲得重組質粒pUC19-sCT，經ABI公司自動測序儀(儀器型號373A)測定該片段序列，表明擴增序列與已知鮭魚降鈣素編碼序列完全相符。
參照如中國專利96105118.3中所述的方法，將如上所得pUC19-sCT用PstI和BamHI酶切，前述制備的pUC19-mel用EcoRI和PstI酶切，與通過EcoRI和BamHI酶切的大腸桿菌質粒pUC19連接，得到帶有melC1分泌信號肽及其上游序列的鮭魚降鈣素前體sCT-Gly編碼序列(mel+sCT-Gly)的重組質粒pUC19-mel-sCT。3.帶有melC1分泌信號肽及其上游序列的鮭魚降鈣素前體sCT-Gly編碼序列(mel+sCT-Gly)的鏈霉菌表達質粒pMS680的制備利用Hopwood，D.A.等人，出處同上，中所述的PEG介導的原生質體轉化方法，制備淺青紫鏈霉菌TK54的原生質體，參照中國專利96105118.3中所用的方法，將鏈霉菌質粒載體pIJ680用Sac I和Xba I雙酶切得到的4.6kb的片段，同時將如上所得pUC19-mel-sCT用Sac I和Xba I雙酶切得到的0.5kb的融合基因，連接后轉化經處理成為原生質體的淺青紫鏈霉菌TK54，獲得了具有硫鏈絲菌素抗性(50μg/ml)的轉化子。提取轉化子中的質粒進行酶切鑒定，結果表明轉化子中含有帶有melC1分泌信號肽及其上游序列的鮭魚降鈣素前體sCT-Gly編碼序列(mel+sCT-Gly)的鏈霉菌表達質粒pMS680。在表達質粒pMS680中，融合基因處于新霉素磷酸轉移酶基因(aph)的強啟動子下游，除了利用本身的melC1的啟動子外，還可利用aph的強啟動子來表達鮭魚降鈣素。帶有如上所述構建的重組表達質粒pMS680的重組淺青紫鏈霉菌菌株MS680已于1996年4月24日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏號CGMCC0262。實施例2帶有melC1分泌信號肽編碼序列及其上游序列的α-酰胺化酶編碼序列(mel+α-AE)之核酸構建體的制備1.大鼠α-AE編碼序列的制備利用本領域周知的酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法從大鼠心房組織中提取總RNA(參照Chomczynski P等，分析生物化學(AnalBiochem.)，162156-159)。將大鼠心房組織(約1克)置于預冷的溶液D(GIT 4mol/L，檸檬酸鈉25mmol/L，pH7.0，十二烷基肌氨酸鈉0.5％，2-巰基乙醇0.1mol/L)中，冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，然后轉移到離心管中，依次加入1ml 2mol/L NaAc(pH4.0)，10ml水飽和酚以及2ml氯仿-異戊醇(49∶1)，每加入一種成分之后都充分混勻，最后劇烈振搖10秒，冰浴冷卻15分鐘，4℃下12,000轉/分離心20分鐘，吸取水相并加入10ml異丙醇，-20℃沉淀1小時后，4℃下12,000轉/分離心20分鐘。將所得沉淀用3ml溶液D溶解，加入2倍體積的乙醇，-20℃沉淀1小時，4℃下12,000轉/分離心20分鐘，用80％乙醇洗滌兩次，真空抽干，溶于DEPC處理過的雙蒸水中，-70℃保存備用。
反轉錄采用GIBCO/BRL公司的SuperscriptTMPreamplificationSystem for First Strand cDNA Synthesis試劑盒。將如上述所得總RNA12μl(1-5μg)、20U RNasin和2μg隨機六聚體引物，混勻后70-80℃變性10-20分鐘，冰浴1分鐘，再依次加入30U RNasin，2μl 10×緩沖液，1μl 10mmol/L dNTPs，2μl 0.1mmol/L DTT，1μl逆轉錄酶(200U)，20℃溫浴10分鐘后，42℃延伸50分鐘，99℃加熱6分鐘，最后95℃加熱5分鐘終止反應，冰浴降溫，加入1μl RNase H(2U)，37℃保溫20分鐘，得到逆轉錄產物，-20℃保存備用。
根據已知的大鼠α-AE之cDNA序列(Eipper BA等人，生物化學雜志，2674008-4015)和大鼠心房組織中成熟α-AE的氨基端序列，設計正向引物P3和反向引物P4。
P55’AGCCCACTTTCTGTCTTTAAG3’(SEQ ID NO9)P65’TCAAACTGACCGATGCTCCATT3’(SEQ ID NO10)以如上所得逆轉錄產物為模板進行PCR擴增。50μl反應體系中含有逆轉錄產物2-3μl，引物P3和P4分別為10pmol，dNTP各10nmol，1×PCR緩沖液(Mg++濃度為1mmol/L)，Taq聚合酶2U。置于PCR擴增儀(MJ Research，Inc.)按如下條件進行擴增94℃變性5分鐘后進入循環反應，93℃變性40秒，59℃退火35秒，70℃延伸2.5分鐘，15個循環；93℃變性40秒，59℃退火35秒，70℃延伸2分鐘(每個循環后增加10秒)，20個循環；最后70℃延伸8.5分鐘。通過PCR擴增得到2.1kb的編碼α-AE的cDNA片段。將所得PCR擴增片段用T4 DNA聚合酶修平，克隆入SmaI酶切并經CIAP脫磷酸化的pUC18中，得到帶有編碼α-酰胺化酶的核苷酸序列之重組載體pUC18-AE，經ABI公司自動測序儀(儀器型號373A)測定目標片段，證明該DNA片段的序列與預期的α-AE編碼基因完全相符。
用限制性酶DpnI切割所得的pUC18-AE，從低熔點瓊脂糖凝膠中分離純化2.02kb的DNA片段；類似地，用限制性酶PstI切割如上所述得到的pUC19-mel，用T4 DNA聚合酶修平，再用CIAP脫去5’磷酸基團。將上述兩片段以3-5∶1的濃度比混合，加入T4 DNA連接酶按廠家推薦的條件進行連接。所用大腸桿菌JM109感受態細胞的制備、轉化及質粒提取步驟均按Sambrook等人，出處同上，中所述方法進行。將上述連接產物轉化至大腸桿菌JM109的感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB瓊脂平板，37℃培養過夜，挑取菌落，提取其中的質粒進行酶切鑒定，根據酶切結果鑒定插入片段的大小和方向。選擇具有期望大小和正確方向的插入片段，從而得到編碼帶有melC1分泌信號肽的α-AE片段的重組質粒pUC19-mel-AE。由于質粒pUC19-mel-AE中融合基因兩側可供利用的酶切位點不多，為了便于表達載體的構建，用SmaI/HindIII把上述編碼melC1分泌信號肽及α-AE片段的融合基因從pUC19-mel-AE中切下來，并用Klenow補平，然后依類似于上面的連接條件，與SmaI切割并經CIAP脫磷酸化處理的pUC18連接，得到帶有編碼melC1分泌信號肽的α-酰胺化酶片段的重組質粒pUC18-mel-AE。實施例3含有mel+α-AE片段以及mel+sCT-Gly片段之核酸構建體的鏈霉菌表達載體的制備用XbaI酶切實施例1中所得表達質粒pMS680，與同一內切酶酶切并脫磷酸化處理的pUC18-mel-AE連接，轉化大腸桿菌后篩選重組子，酶切鑒定重組質粒中插入片段的大小和方向，得到pUC18-mel-AE/MS680，在該質粒中melC1分泌信號肽編碼序列及其上游序列與α-AE的融合基因插入sCT-Gly基因的下游，其轉錄方向與sCT-Gly基因一致。用EcoRI/HindIII酶切pUC18-mel-AE/MS680，分離純化大片段，Klenow酶補平后加入T4 DNA連接酶連接，用于轉化淺青紫鏈霉菌TK54，獲得了具有硫鏈絲菌素抗性的轉化子。提取轉化子中的質粒進行酶切鑒定，結果表明轉化子含有表達質粒pIJ-mel-AE/mel-sCT，將所得轉化子命名為基因工程菌淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]。實施例4產生酰胺化降鈣素的基因工程菌淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]的發酵培養及酰胺化降鈣素的分離純化1.基因工程菌淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]的發酵培養將如實施例3所述制備的基因工程菌淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]接種于下列發酵培養基中，其組分為葡萄糖5.5％，酪蛋白水解物3％，酵母提取物3％，微量元素3％(ZnCl2.7H2O 0.02％，FeSO4.H2O 0.1％，CuCl2.H2O 0.0025％，H3BO3.10H2O 0.00056％，MnSO4.7H2O 0.1％，CaCl2.H2O 0.01％，(NH4)6Mo7O24.4H2O0.001％)。28℃振蕩培養35小時，再以10％的接種量接種于新鮮的同種培養基中，于28℃繼續培養65小時左右。2.酰胺化降鈣素的分離、純化按上述條件培養工程菌65小時后，3000轉/分離心12分鐘，取上清液棄菌絲，進行大孔吸附樹脂X5柱層析脫色(發酵液∶樹脂(體積)＝1∶12.5)，收集流出液，進一步進行疏水柱層析(Phenyl SepharoseHigh Performance柱，流出液∶介質(體積)＝1∶25)，以50mM磷酸緩沖液(含1.5M(NH4)2SO4)進行洗脫。以實施例5中所述的EIA檢測監視流出液中的酰胺化降鈣素，合并含有酰胺化降鈣素的級分，經截流分子量為1000的超濾膜利用Amicon(美國)超濾儀(操作條件參照儀器說明書)進行超濾，將所得級分濃縮并脫鹽。超濾得到的樣品經冷凍干燥，于-20℃保存備用。進而采用制備型高壓液相色譜進行進一步純化。制備柱為SupelcosilTMLC-308，25cm×10.0mm。流動相A乙腈，B0.05％ 三氟乙酸。流速2ml/分，梯度A10％-80％，B90％-20％，時間0分-60分，紫外檢測波長220nm。以實施例5中所述的EIA檢測監視流出液中的酰胺化降鈣素，收集含有酰胺化降鈣素的級分。實施例5酰胺化鮭魚降鈣素的檢測及鑒定1.酰胺化鮭魚降鈣素的高壓液相色譜分析采用分析型高壓液相色譜分析檢測酰胺化降鈣素，所用分析柱為SupelcosilTMLC-308，5cm×2.6mm。流動相A乙腈，B0.05％三氟乙酸；流速1.15ml/分，梯度A5％-80％，B95％-20％；時間0分-50分，檢測波長220nm。酰胺化鮭魚降鈣素標準品購自美國Sigma公司，圖5是如實施例4所述制備的酰胺化鮭魚降鈣素的高壓液相色譜分析圖，結果顯示，所得酰胺化鮭魚降鈣素與標準品保留時間一致，表明本發明基因工程菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]可分泌表達酰胺化的鮭魚降鈣素。2.酰胺化鮭魚降鈣素的飛行質譜分析采用MALDI-TOF質譜法測定鮭魚降鈣素分子量。如實施例4所得酰胺化鮭魚降鈣素分子量經測定顯示與Sigma公司標準品一致，分子量為3430.7。已知非酰胺化鮭魚降鈣素分子量為3492，這表明本發明的基因工程菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]分泌表達鮭魚降鈣素為C端酰胺化的。圖6是本發明所得酰胺化鮭魚降鈣素的飛行質譜分析結果。3.酰胺化鮭魚降鈣素的N端氨基酸序列分析采用ABI公司Procise 491型氨基酸自動分析儀進行酰胺化鮭魚降鈣素的N端氨基酸序列分析。由此對本發明所得基因工程鮭魚降鈣素N端15個氨基酸進行序列分析，其N端1-15位氨基酸依次為Cys，Ser，Asn，Leu，Ser，Thr，Cys，Val，Leu，Gly，Lys，Leu，Ser，Gln，Glu。結果表明本發明所得酰胺化鮭魚降鈣素與天然鮭魚降鈣素完全一致。4.酰胺化鮭魚降鈣素的生物活性測定A.采用酶免疫測定法(EIA)測定降鈣素的體外活性酶免疫測定法用EIA檢測試劑盒(購自美國PENISULALABORATORIES公司)，按照公司提供操作步驟進行。分別取50μl待測樣品溶液和含不同濃度的鮭魚降鈣素(sCT)標準品溶液，加樣至96孔酶標板的不同孔內(平板預先用蛋白A包被)，隨后依次向每孔中加入25μl sCT的抗體和25μl生物素標記的sCT，于4℃放置過夜。室溫下用檢測試劑盒提供的緩沖液300μl/孔洗滌平板5次，然后于每樣品孔加入鏈親和素-辣根過氧化物酶試劑100μl，室溫放置1小時，再以緩沖液300μl/孔洗滌平板5次，每樣品孔加入100μl底物溶液(H2O2，TMB)，室溫下放置1小時，向各孔分別加入100μl 2N鹽酸以終止反應，于半小時內用酶標比色計450nm比色測定結果。采用如上方法檢測實施例4中所得的酰胺化鮭魚降鈣素，實驗結果顯示，基因工程菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]可分泌表達酰胺化鮭魚降鈣素，在培養至70-90小時時分泌量達到峰值。酰胺化降鈣素在6個不同批次的發酵樣本中的平均分泌表達水平為10.3mg/L。B.采用降低大鼠血清鈣水平方法測定降鈣素的體內活性已知鮭魚降鈣素的生理功能為降低血清中游離鈣水平。本發明中降鈣素體內活性實驗按照英國藥典98年版中所述的方法進行。實驗動物為SD大鼠，雄性，體重158.9±9.2克，25只動物隨機分為5組進行。鈣液體試劑盒為北京中生生物工程高科技公司產品，采用OCPC方法(Ray Sarkar，BC和Chauhan，UPS，分析生物化學20155)測定血清中鈣離子含量。待測樣品及標準品分別以生理鹽水溶解。實驗大鼠給藥前夜禁食，不限飲水，皮下注射藥物1小時后，以3％戊巴比妥鈉麻醉，取主動脈血，不抗凝，室溫靜置后取血清，采用OCPC法測定血清中的鈣水平。采用如上所述方法測定實施例4所述獲得的降鈣素，結果表明本發明的基因工程菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]分泌表達的基因工程鮭魚降鈣素比活＞4000IU/mg，與天然鮭魚降鈣素活性基本一致。鑒于未酰胺化鮭魚降鈣素活性低于200IU/mg，上述實驗結果表明，本發明的基因工程菌株淺青紫鏈霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]所分泌的降鈣素為酰胺化的鮭魚降鈣素。實施例6與表達質粒pMS680相容的帶有melC1分泌信號肽編碼序列及其上游序列的α-酰胺化酶編碼序列(mel+α-AE)的表達質粒pSGLN-mel-AE的構建利用Hopwood等人，出處同上，中所述的方法從球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)C-1027(FERM BP-1299)中提取質粒，經瓊脂糖凝膠電泳及酶切鑒定確認所得質粒為pSGL1(李曉平和李元，中國抗生素雜志，1992，17(5)326-332)。
用Xba I酶切并脫磷酸化處理實施例2中所得pUC18-mel-AE，與如上述所得質粒pSGL1經Sal I/Xba I雙酶切的大片段(約4.4kb)以及質粒pIJ680經Xho I/Xba I雙酶切的小片段(新霉素抗性基因，約1.2kb)連接，其中XhoI與SalI的酶切粘性末端互補，連接產物轉化大腸桿菌JM109，經重組子篩選，酶切鑒定重組質粒中插入片段的大小和方向，得到質粒pUC18-mel-AE/SGLN，用EcoRI/HindIII酶切pUC18-mel-AE/SGLN，分離純化大片段，Klenow酶補平后加入T4DNA連接酶連接，用于轉化淺青紫鏈霉菌TK54，按照類似實施例1的方法利用帶有10μg/ml新霉素的培養基篩選具有新霉素抗性的轉化子，得到能夠表達大鼠α-酰胺化酶的重組淺青紫鏈霉菌[pSGLN-mel-AE]。提取轉化子中的質粒進行酶切鑒定，結果表明轉化子中確實含有α-AE的表達質粒pSGLN-mel-AE。實施例7用分別表達降鈣素和酰胺化酶的相容性質粒pMS680和pSGLN-mel-AE共轉化鏈霉菌制備原核重組表達菌株根據文獻報道，pIJ101及其衍生質粒和pSGL1及其衍生質粒為相容性質粒(洪斌和李元，微生物學報，38(4)256-260)。按照類似于實施例1中所述的方法，將如上述實施例1和6中所得的重組表達質粒pMS680和pSGLN-mel-AE共轉化淺青紫鏈霉菌TK54，利用帶有50μg/ml硫鏈絲菌素和10μg/ml新霉素的培養平板，篩選同時具有硫鏈絲菌素和新霉素抗性的轉化子。所得轉化子即為在不同的相容性質粒上分別具有α-AE基因和鮭魚降鈣素前體基因的重組表達菌株淺青紫鏈霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]。實施例8重組表達菌株淺青紫鏈霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]的發酵培養及酰胺化降鈣素的分離純化1.重組表達菌株淺青紫鏈霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]的發酵培養將如實施例7所述制備的基因工程菌淺青紫鏈霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]接種于如實施例4中所述發酵培養基中。28℃振蕩培養35小時，再以10％的接種量接種于新鮮的同種培養基中，于28℃繼續培養65小時左右。2.酰胺化降鈣素的分離、純化按上述條件培養該基因工程菌65小時后，3000轉/分離心12分鐘，取上清液棄菌絲，進行大孔吸附樹脂X5柱層析脫色(發酵液∶樹脂(體積)＝1∶12.5)，收集流出液，進一步進行疏水柱層析(Phenyl SepharoseHigh Performance柱，流出液∶介質(體積)＝1∶25)，以50mM磷酸緩沖液(含1.5M(NH4)2SO4)進行洗脫。以實施例5中所述的EIA檢測監視流出液中的酰胺化降鈣素，合并含有酰胺化降鈣素的級分，經截流分子量為1000的超濾膜利用Amicon(美國)超濾儀(操作條件參照儀器說明書)進行超濾，將所得級分濃縮并脫鹽。超濾得到的樣品經冷凍干燥，于-20℃保存備用。進而采用制備型高壓液相色譜進行進一步純化。制備柱為SupelcosilTMLC-308，25cm×10.0mm。流動相A乙腈，B0.05％三氟乙酸。流速2ml/分，梯度A10％-80％，B90％-20％，時間0分-60分，紫外檢測波長220nm。以實施例5中所述的EIA檢測監視流出液中的酰胺化降鈣素，收集含有酰胺化降鈣素的級分。酰胺化降鈣素在6個不同批次的發酵樣本中的平均分泌表達水平為9.8mg/L。實施例9利用重組淺青紫鏈霉菌[pSGLN-mel-AE]和重組淺青紫鏈霉菌[pMS680]的共培養制備酰胺化降鈣素按照實施例1中所述的方法，分別用pSGLN-mel-AE和pMS680轉化淺青紫鏈霉菌TK24和TK54，利用帶有50μg/ml硫鏈絲菌素和10μg/ml新霉素的培養平板，分別篩選具有硫鏈絲菌素和新霉素抗性的轉化子，得到重組菌株淺青紫鏈霉菌TK24[pSGLN-mel-AE]和重組菌株淺青紫鏈霉菌TK54[pMS680]。參照實施例4中的發酵培養條件，分別于28℃培養淺青紫鏈霉菌TK24[pSGLN-mel-AE]和淺青紫鏈霉菌TK54[pMS680]的種子35小時，然后所得兩種接種培養物以1∶1-5的體積比接種于如實施例4中所述的發酵培養基中，于28℃培養65小時。按照實施例5中所述的EIA檢測方法測定共培養物中酰胺化降鈣素的表達。待表達量達到最高值時，終止發酵，按照實施例4中所述的分離純化方法，從共培養物中分離純化所得酰胺化鮭魚降鈣素，在6個不同批次的發酵樣本中的平均分泌表達水平為9.2mg/L。
序列表SEQ ID NO1編碼大鼠酰胺化酶的核苷酸序列AGCCCACTTTCTGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTTGCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATACTTCTGCATGTCCATGCGTCTGCCTGTGGATGAGGAAGCCTTCGTGATTGACTTCAAGCCTCGTGCCAGCATGGATACTGTCCACCATATGCTGCTGTTTGGATGCAATATGCCCTCGTCCACTGGAAGTTACTGGTTTTGTGATGAAGGAACCTGTACAGATAAAGCCAATATTCTATATGCCTGGGCAAGGAATGCTCCCCCCACCCGGCTCCCGAAAGGTGTTGGATTCAGAGTTGGAGGAGAAACTGGAAGCAAATACTTCGTCCTTCAAGTTCACTATGGCGATATCAGTGCTTTTCGAGATAATCACAAAGACTGCTCTGGCGTGTCCGTACATCTCACACGTGTGCCCCAGCCTTTAATTGCGGGCATGTACCTTATGATGTCTGTTGACACTGTCATACCACCAGGAGAGAAAGTAGTGAATGCTGACATTTCGTGCCAATACAAAATGTATCCAATGCATGTGTTTGCCTACAGAGTCCACACTCACCATTTAGGTAAGGTGGTGAGCGGATACAGAGTAAGAAACGGACAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTTGGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGGTGAAGGGAGGACAGAGGCCACCCACATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACATCATGTATTACATGGAAGCCAAATATGCACTTTCCTTCATGACCTGTACAAAGAACGTGGCTCCAGATATGTTCAGAACTATCCCAGCAGAGGCCAATATCCCAATTCCTGTCAAACCGGACATGGTTATGATGCACGGGCATCACAAAGAAGCAGAAAACAAAGAAAAGAGTGCTTTAATGCAGCAGCCAAAACAGGGAGAGGAAGAAGTATTAGAGCAGGATTTCCATGTGGAAGAAGAACTGGACTGGCCTGGAGTGTACTTGTTACCAGGCCAGGTTTCTGGGGTGGCCCTGGATTCTAAGAATAACCTAGTGATTTTCCACAGAGGTGACCATGTTTGGGATGGAAACTCTTTTGACAGCAAGTTTGTTTACCAGCAAAGAGGTCTTGGGCCAATTGAAGAAGACACCATCCTGGTCATTGACCCAAATAATGCTGAAATCCTCCAGTCCAGTGGCAAGAACCTGTTTTATTTACCACACGGCTTGAGCATAGATACAGATGGAAATTATTGGGTCACAGATGTGGCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCGCTCTTAATTCTGGGAAGGAGCATGCAACCTGGGAGTGACCAAAATCATTTCTGCCAGCCCACCGATGTGGCTGTGGAGCCCAGTACTGGAGCTGTCTTCGTGTCAGACGGTTACTGTAACAGTCGGATTGTGCAGTTTTCACCAAGCGGAAAGTTCGTCACCCAGTGGGGAGAAGAGTCCTCTGGAAGCAGTCCTAGGCCAGGCCATTTCAGTGTTCCTCACAGTTTGGCCCTTGTGCCTCATTTGGACCAGTTGTGTGTGGCAGACAGGGAAAATGGCCGAATCCAATGCTTCAAAACTGACACCAAAGAATTTGTGAGAGAGATTAAGCACGCATCATTTGGAAGGAATGTCTTTGCCATTTCATATATACCAGGTTTCCTCTTTGCCGTAAACGGGAAGCCTTACTTTGGAGACCAAGAGCCCGTGCAAGGATTTGTGATGAACTTTTCCAGTGGGGAAATTATAGACGTCTTCAAGCCAGTACGCAAGCACTTCGACATGCCTCATGATATTGTGGCTTCTGAAGATGGGACTGTGTACATTGGAGACGCACACACAAACACCGTGTGGAAGTTCACCCTGACTGAAAAAATGGAGCATCGGTCAGTCTGASEQ ID NO2大鼠酰胺化酶的氨基酸酸序列SPLSVFKRFKETTRSFSNECLGTIGPVTPLDASDFALDIRMPGVTPKESDTYFCMSMRLPVDEEAFVIDFKPRASMDTVHHMLLFGCNMPSSTGSYWFCDEGTCTDKANILYAWARNAPPTRLPKGVGFRVGGETGSKYFVLQVHYGDISAFRDNHKDCSGVSVHLTRVPQPLIAGMYLMMSVDTVIPPGEKVVNADISCQYKMYPMHVFAYRVHTHHLGKVVSGYRVRNGQWTLIGRQNPQLPQAFYPVEHPVDVTFGDILAARCVFTGEGRTEATHIGGTSSDEMCNLYIMYYMEAKYALSFMTCTKNVAPDMFRTIPAEANIPIPVKPDMVMMHGHHKEAENKEKSALMQQPKQGEEEVLEQDFHVEEELDWPGVYLLPGQVSGVALDSKNNLVIFHRGDHVWDGNSFDSKFVYQQRGLGPIEEDTILVIDPNNAEILQSSGKNLFYLPHGLSIDTDGNYWVTDVALHQVFKLDPHSKEGPLLILGRSMQPGSDQNHFCQPTDVAVEPSTGAVFVSDGYCNSRIVQFSPSGKFVTQWGEESSGSSPRPGQFSVPHSLALVPHLDQLCVADRENGRIQCFKTDTKEFVREIKHASFGRNVFAISYIPGFLFAVNGKPYFGDQEPVQGFVMNFSSGEIIDVFKPVRKHFDMPHDIVASEDGTVYIGDAHTNTVWKFTLTEKMEHRSVSEQ ID NO3編碼鮭魚降鈣素前體的核苷酸序列5’TGC TCC AAC CTC AGC ACC TGT GTG CTG GGC AAA CTG TCC CAA GAG CTG CATAAA TTG CAG ACG TAC CCC CGC ACC AAC ACG GGA AGT GGC ACG CCT GGC 3’SEQ ID NO4鮭魚降鈣素的氨基酸酸序列Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro ArgThr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro GlySEQ ID NO5引物15’GCTGATCACGTCAGTTTTCG3’SEQ ID NO6引物25’TGCACTGCAGGCGCGGGCGGCGGGAAG3’SEQ ID NO7引物35’TGCACTGCAGCAACCTCAGCACCTGT3’SEQ ID NO8引物45’GCGGATCCTACTAGCCCGGCGTACCACTTCCCG3’SEQ ID NO9引物55’AGCCCACTTTCTGTCTTTAAG3’SEQ ID NO10引物65’TCAAACTGACCGATGCTCCATT3’
權利要求
1.一種核酸構建體，其中包括至少一種編碼酰胺化酶的核酸序列和編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列。
2.權利要求1所述的核酸構建體，其中所述待酰胺化的目標多肽為降鈣素、催產素、加壓素、促皮質釋放激素、促甲狀腺釋放激素、神經激肽、咽側體抑制素、Lem-KI、紅色素濃縮激素、促黃體激素釋放激素、白細胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽、神經調節肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蠅毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1。
3.權利要求1所述的核酸構建體，其中所述目標多肽為鮭魚降鈣素。
4.權利要求1所述的核酸構建體，其中所述的酰胺化酶為大鼠α-酰胺化酶。
5.一種含有權利要求1所述的核酸構建體的重組表達載體，其中所述表達載體還含有表達控制序列，包括啟動子、增強子、終止序列。
6.一種含有權利要求5所述表達載體的原核表達宿主，其選自鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬的菌株以及大腸桿菌。
7.權利要求6所述原核表達宿主，其為淺青紫鏈霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
8.權利要求7所述的原核表達宿主，其中所述表達載體為來源于pIJ101的質粒或者是來源于pSGL1的質粒。
9.權利要求8所述的原核表達宿主，其中所述重組表達質粒為pIJ-mel-AE/mel-sCT。
10.一種制備酰胺化多肽的方法，其包括(1)用帶有權利要求1中所述的核酸構建體之重組表達載體轉化適當的原核宿主；(2)在有利于α-酰胺化酶以及目標多肽產生的條件下培養所得的原核表達宿主細胞，(3)從培養物中回收酰胺化目標多肽。
11.權利要求10的方法，其中所述待酰胺化的目標多肽為鮭魚降鈣素。
12.權利要求10的方法，其中所述原核宿主為淺青紫鏈霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
13.權利要求10的方法，其中所述重組表達宿主中含有pIJ-mel-AE/mel-sCT。
14.一種制備酰胺化多肽的方法，其包括(a)用含有編碼酰胺化酶的核酸序列的表達質粒以及相容性的含有編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列之表達質粒共轉化原核宿主細胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目標多肽產生的條件下，培養所得原核表達宿主細胞；以及(c)從培養物中回收酰胺化目標多肽。
15.權利要求14的方法，其中所述待酰胺化的目標多肽為鮭魚降鈣素。
16.權利要求14的方法，其中所述原核宿主為淺青紫鏈霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
17.權利要求14的方法，其中所述表達宿主含有pMS680及pSGLN-mel-AE。
18.一種制備酰胺化多肽的方法，其包括(a)分別用含有編碼酰胺化酶的核酸序列的表達質粒以及含有編碼待酰胺化的目標多肽的核酸序列之表達質粒轉化兩個獨立的原核宿主細胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目標多肽產生的條件下，共培養所得原核表達宿主細胞；以及(c)從培養物中回收酰胺化目標多肽。
19.權利要求18的方法，其中所述待酰胺化的目標多肽為鮭魚降鈣素。
20.權利要求18的方法，其中所述原核宿主各自獨立地選自淺青紫鏈霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
21.權利要求18的方法，其中所述兩種表達宿主中分別含有pMS680或pSGLN-mel-AE。
全文摘要
本發明涉及一種包含至少一種編碼α－酰胺化酶的核酸序列以及待酰胺化的目標多肽的核酸序列之核酸構建體,本發明進一步涉及含有所述核酸構建體的表達載體、原核宿主細胞。本發明還涉及通過利用所述核酸構建體在原核宿主中表達,制備酰胺化重組多肽,尤其是酰胺化重組鮭魚降鈣素的方法。
文檔編號C12N15/63GK1370838SQ0110490
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月23日 優先權日2001年2月23日
發明者李元, 洪斌, 武兵元, 劉伯英, 郭連宏, 王醒, 姜蓉, 李寶義, 吳劍波 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所