專利名稱：核酸網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)的制作方法
技術(shù)范圍本發(fā)明是一項(xiàng)全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有多項(xiàng)特性。適用于快速檢測傳染性病原體，和正?；虍惓；?；以及基因組的表達(dá)；抗原、抗體檢測，及蛋白質(zhì)的定性、定量檢查。實(shí)用于血液病、腫瘤、傳染病、法醫(yī)學(xué)、血庫以及遺傳性疾病的診斷，以及新藥的研究與開發(fā)。
背景技術(shù)：
目前，有許多用于快速準(zhǔn)確檢測異?；蚧虿≡w的方法。例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；連接酶鏈反應(yīng)(LCR)；鏈取代擴(kuò)增(SDA)；以及轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(TBA)等技術(shù)均為檢測微量病原體核酸序列的有效方法。然而，上述所有技術(shù)都有不足之處，PCR需要昂貴的設(shè)備，而且擴(kuò)增溫度須隨靶核酸的不同而不同。為此，給臨床的實(shí)際檢測工作帶來了諸多不便，這些困難在對(duì)于定量PCR和多個(gè)靶核酸的DNA/RNA檢測時(shí)，顯得尤為突出。至于其他的原位擴(kuò)增和檢測，由于加熱所造成的形態(tài)學(xué)的改變，小擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)散及重復(fù)性差等問題的存在，使其技術(shù)難度甚高，難以應(yīng)用于臨床檢測，此外，蛋白質(zhì)檢測，由于敏感度低，臨床應(yīng)用受到限制。
優(yōu)異性1、本發(fā)明方法，利用DNA多聚酶引物的延伸及分離特性，使同一種酶能完成引物延伸，及網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增。因此，百萬倍擴(kuò)增可在同一溫度下短時(shí)間內(nèi)順利完成。此外，網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增可在無酶參與情況下完成，因而更為簡單而方便。
2、網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增使用通用引物，在同一反應(yīng)試管中可同時(shí)檢測多個(gè)靶核酸。
3、由于靶核酸捕獲，環(huán)狀擴(kuò)增反應(yīng)，以及檢測三步驟，都可在同一固體支持物上完成。從而，簡化了檢測方法，使其可在一般診所，臨床化驗(yàn)室，甚至露天中操作，具有很強(qiáng)的實(shí)用，應(yīng)用價(jià)值。
4、本發(fā)明方法，使分離、擴(kuò)增、檢測靶核三步驟可在同一反應(yīng)試管中完成；并運(yùn)用連接反應(yīng)，即結(jié)合靶核酸的環(huán)狀探針，能特異地與引物連接區(qū)相結(jié)合。因此，這一特性可被用于檢測單一堿基突變，如廉刀細(xì)胞性貧血，或K-ras癌基因。
5、網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增技術(shù)，可用于核酸檢測，以及蛋白質(zhì)檢測。包括抗原、抗體、氨基酸和固體支持物，此方法檢測快速，簡潔，無需任何酶學(xué)反應(yīng)參與。
圖1是環(huán)狀擴(kuò)增探針圖，圖2是網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增圖，圖3是網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增圖，圖4是延伸網(wǎng)狀擴(kuò)增圖，圖5是環(huán)狀擴(kuò)增圖，圖6是網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增圖，圖7是熒光探針圖。
權(quán)利要求
權(quán)力要求一種用于檢測樣品中靶核酸的技術(shù)方法，即核酸網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)。1、A．這種檢測靶核酸方法，是利用寡聚核甘酸的探針，通過其本身的互補(bǔ)序列與樣品中的核酸進(jìn)行雜交。這種寡聚核甘酸探針是由一個(gè)或多個(gè)捕獲探針、擴(kuò)增探針組成。此捕獲探針的3’端不與靶核酸相互補(bǔ)，而5’端則能與靶核酸互補(bǔ)和雜交。反之，如3’端與靶核酸互補(bǔ)和雜交，則5’端不能為之。此捕獲探針具有與配體相結(jié)合的分子，而這個(gè)分子安固于支持物上。(見
圖1)擴(kuò)增探針的3’端和5’端能與靶核酸互補(bǔ)及雜交，而3’端和5’端之間的核酸序列不能與靶核酸結(jié)合，由靶核酸，捕獲探針，擴(kuò)增探針?biāo)M成的復(fù)合體，通過其捕獲探針的配體與支持物結(jié)合。此復(fù)合物可反復(fù)沖洗，以去除樣品雜質(zhì)。B、將擴(kuò)增探針3’端和5’端首尾相互連接形成一個(gè)環(huán)形分子。C、網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增由以下步驟實(shí)現(xiàn)引物與環(huán)狀擴(kuò)增探針上的連接區(qū)相結(jié)合，并由DNA聚合酶沿環(huán)狀擴(kuò)增探針延伸，產(chǎn)生多個(gè)重復(fù)性單位，多個(gè)反向引物與單鏈DNA相結(jié)合，并可被DNA多聚酶延伸引物延伸后，使其下游的引物及其延伸的DNA與模板DNA分離。而分離的單鏈可作為正向引物的模板，此過程為網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增。D、此過程循環(huán)往復(fù)，直至所有單鏈DNA都變成雙鏈DNA。E、檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，如有產(chǎn)物DNA的出現(xiàn)，表明樣品中有靶核酸存在。(見圖2)
2.在權(quán)力要求1所述的方法中，配體是由生物素、抗原、半抗原、抗體以及重金屬衍生物和多聚核甘酸組成。這個(gè)配體的連接部分是由鏈霉抗生物素蛋白，生物素蛋白，抗體、抗原，以及硫基物和多聚核甘酸組成。
3.在權(quán)力要求1中，引物數(shù)量可多于2個(gè)以上。
4.檢測單一細(xì)胞中靶核酸的技術(shù)方法網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增技術(shù)。A、將細(xì)胞包藏于細(xì)胞基質(zhì)中。B、環(huán)形探針的3’端和5’端可與細(xì)胞內(nèi)靶核酸相互補(bǔ)并雜交。3’端和5’端之間的被標(biāo)記的非互補(bǔ)區(qū)域有配體連結(jié)，如此形成一個(gè)復(fù)合物。(見圖3)C、當(dāng)環(huán)形探針的3’端和5’端首尾相連，則構(gòu)成一個(gè)環(huán)形分子。D、加入一個(gè)與配體相連接的分子后，此分子與環(huán)狀分子上的配體相結(jié)合，同時(shí)加入信號(hào)探針，與連結(jié)分子相結(jié)合，形成一個(gè)帶有信號(hào)標(biāo)記的復(fù)合物。E、沖洗帶有信號(hào)標(biāo)記的復(fù)合物。如在細(xì)胞檢測中發(fā)現(xiàn)信號(hào)標(biāo)記，即證明細(xì)胞內(nèi)存在有靶核酸。
5.A、檢測樣品中的核酸方法。網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)，是由寡聚核甘酸探針通過其本身的互補(bǔ)序列與樣品中的核酸進(jìn)行雜交。寡聚核甘酸探針是由一個(gè)或多個(gè)捕獲探針組成，在此反應(yīng)中過程中，靶核酸能與捕獲探針的3’或5’端中任一端相互補(bǔ)雜交。B、擴(kuò)增環(huán)形探針的3’游離端與5’游離端之間的間隔存在，使得靶核酸能被整合其中，而進(jìn)一步拷貝，擴(kuò)增樣品核酸。(見圖4)C、加入DNA聚合酶，此酶由3’端向5’端引伸，加入連結(jié)物，使3’和5’末端首尾相連。
6.檢測樣品中靶核酸的技術(shù)方法環(huán)狀擴(kuò)增技術(shù)。A、在檢測試管中，有一個(gè)或多個(gè)捕獲探針存在，其捕獲探針的3’端不與靶核酸互補(bǔ)，但5’端能與靶核酸順序互補(bǔ)和雜交。反之，當(dāng)捕獲探針的3’端與靶核酸順序互補(bǔ)和雜交時(shí)，則5’端不與其互補(bǔ)。B、分離靶核酸，環(huán)狀擴(kuò)增探針和捕獲探針的復(fù)合物。C、把擴(kuò)增探針3’端和5’端首尾相連接成一個(gè)環(huán)形分子。D、環(huán)狀擴(kuò)增探針由以下步驟實(shí)現(xiàn)正向引物與環(huán)狀探針區(qū)域相結(jié)合，并經(jīng)由DNA多聚酶沿環(huán)狀探針延長，產(chǎn)生多個(gè)可重復(fù)的單鏈DNA，這一過程即環(huán)狀擴(kuò)增。(見圖5)E、檢測到單鏈DNA存在，則表明樣品中有靶核酸存在。
7.一種檢測樣品中蛋白的技術(shù)方法——網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增技術(shù)A、一種蛋白(抗原或抗體)有配體附著，通過連接物與信號(hào)探針相連接，形成一個(gè)帶有信號(hào)標(biāo)記的復(fù)合物。B、沖洗帶有信號(hào)標(biāo)記的復(fù)合物。C、檢測到信號(hào)標(biāo)記，即表明有被檢測蛋白的存在。被檢測蛋白可是抗原、抗體或者為氨基酸(見圖6)
8.檢測樣品中核酸的技術(shù)方法；瑩光探針技術(shù)。A、在檢測試管中，加入瑩光探針，此瑩光探針是由兩個(gè)單鏈寡聚核酸探針組成，并通過其本身的互補(bǔ)序列相互雜交。長鏈探針的3’端，通過其互補(bǔ)序列與擴(kuò)增環(huán)形探針上的連接區(qū)相結(jié)合。長鏈探針的5’端攜帶有一個(gè)瑩光分子(如FITC)，而短鏈探針的3’端具有一個(gè)瑩光吸收分子(如DABCYL)。長短兩鏈相互雜交形成雙鏈的瑩光探針，5’端瑩光分子的能量可傳遞給3’端的吸收分子，因此沒有瑩光顯示。B、在網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增或環(huán)狀擴(kuò)增反應(yīng)中加入此瑩光探針。長鏈探針與環(huán)形探針的連接區(qū)相互補(bǔ)雜交。DNA聚合酶由3’端延伸并盡而形成多個(gè)重復(fù)單鏈DNA。C、反向引物與此重復(fù)的單鏈DNA相互補(bǔ)雜交后，在DNA多聚酶作用下，由3’端向5’端延伸，并使其與之結(jié)合的短鏈探針被分離掉，而長鏈探針上的瑩光能量因沒有被短鏈探針上的吸收分子所吸收，因此，有瑩光發(fā)出。D、檢測到樣品中瑩光信號(hào)，即表明樣品中有靶核酸存在。(見圖7)
全文摘要
一種核酸網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)，利用DNA多聚梅引物的延伸及分離特性，使同一種酶能完成引物延伸，及網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增。因此，百萬倍擴(kuò)增可在同一溫度下短時(shí)間內(nèi)順利完成。網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增可在無酶參與情況下完成，由于靶核酸捕獲，環(huán)狀擴(kuò)增反應(yīng)，以及檢測三步驟，都可在同一固體支持物上完成。從而，簡化了檢測方法，使其可在一般診所，臨床化驗(yàn)室，甚至露天中操作。網(wǎng)狀雜交擴(kuò)增技術(shù)，可用于核酸檢測，以及蛋白質(zhì)檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1317576SQ01104108
公開日2001年10月17日 申請(qǐng)日期2001年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者張永 申請(qǐng)人:張小麗, 張永, 劉宣力