用于測定5′－核苷酸酶活性的方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：用于測定5′－核苷酸酶活性的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于測定體液、組織制備物和/或細胞元件中的5’-核苷酸酶(5’-核糖核苷酸磷酸水解酶)活性的方法。本發明還涉及可用于依照本發明的方法的試劑盒。
在惡性過程偶聯、伴隨和作為其維持因素的代謝擾動中，核苷酸代謝變化同樣發揮重要作用。這解釋了在腫瘤治療所采用的干預中將影響與這些過程密切相關的DNA/RNA合成和核酸-核苷酸代謝作為主要目標的原因。
檢查核酸-核苷酸代謝過程在檢測腫瘤過程和區分良性與惡性過程中具有突出重要性。在監測腫瘤治療時檢查核酸代謝過程的變化同樣是必不可少的，因為在壓倒性多數的化療中當人為引起核酸-核苷酸代謝擾動和人為損害DNA合成時顯示治療效果。這些人為引起的變化是腫瘤治療有效性的決定性因素，但是它們對健康細胞的基本損害和對細胞及器官功能的擾動也負有責任。
在常規條件下，5’-核苷酸酶(5’-核糖核苷酸磷酸水解酶)即由Reis檢測到的一種酶(J.Reis，ber die spezifische Phosphataseder Nerwengewebe，Enzymologia，2110-115，1937)的活性測定是最合適的方法之一。這種酶只催化核苷酸戊糖單磷酸(5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMOP、5’-TMP、dAMP、dCMP、dUMP、等)的水解，生成核苷酸和無機磷酸(O.Bodansky、M.K.Schwartz，5’-Nucleotidase(5’-核苷酸酶)，Adv.Clin.Chem.，11277-327，1968)，而且可以看作是最靈敏的質膜標記之一。5’-核苷酸酶的活性測定既用于臨床目的又用于實驗測試；在前一種情況中，通常在非溶血血清和/或血溶物上進行測量，而在后一種情況中，通常在體液、組織制備物(如質膜)和/或細胞元件(如微粒體、細胞質、溶酶體)上進行測量(A.Solyom、E.G.Trans，Enzyme Markers inCharacterization of Isolated Plasma Membranes(分離質膜表征中的酶標記)，Enzyme，13329-372，1972)。
由于5’-核苷酸酶特異分割核苷酸戊糖單磷酸，因此廣泛用于測定5’-核苷酸酶的方法是將生物學樣品與核苷酸戊糖單磷酸底物一起保溫，然后在加入合適的顯色劑后通過比色法(分光光度法)測定單位時間內在酶的作用下釋放的無機磷酸的量。若待檢驗的生物學樣品還包含干擾5’-核苷酸酶的成分(對于血液或血清，這種成分是堿性磷酸酶；對于溶酶體膜，這種成分是其它糖磷酸)，則在存在能夠抑制其作用的抑制劑時進行保溫。在存在還原劑(通常是氯化錫，任選與肼鹽或抗壞血酸一起)時使用鉬酸銨作為顯色劑，它與無機磷酸發生反應而形成強烈的藍色復合物。考慮到鉬酸銨會沉淀生物學樣品中的蛋白質，因此或是在進行顯色反應之前除去蛋白質，或是通過向混合液中添加適當增溶劑而使蛋白質保留在溶液中。根據我們最新的知識，后者是最新式的比色法之一。采用這種方法時，測定所需樣品甚至能夠降至幾十微升，而測定的精度能夠得到相當大的提高。下列論文及其引用的參考文獻等詳細描述了依據上述原理的5’-核苷酸酶活性測定J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，718-25，1969；13453-459，1975；15715-718，1977；18781-788，1980；Clin.Chem.，232311-2323，1977；27464-465，1981；Adv.Clin.Chem.，11277-332，1968。
以前為了診斷或一般實驗目的而根據上述原理測定5’-核苷酸酶活性的所有常規方法的共同特征是只在單一底物上測量酶活性。作為底物，最常用的是腺苷-5’-單磷酸(5’-AMP)，胞苷-5’-單磷酸(5’-CMP)或肌醇-5’-單磷酸或者(在血溶物中)尿苷-5’-單磷酸(5’-UMP)次之。
在我們進行的用于檢測惡性過程和監測腫瘤治療效果的實驗中，在一份生物學樣品中在六種不同底物即腺苷-5’-單磷酸(5’-AMP)、胞苷-5’-單磷酸(5’-CMP)、尿苷-5’-單磷酸(5’-UMP)、鳥苷-5’-單磷酸(5’-GMP)、肌醇-5’-單磷酸(5’-IMP)和胸苷-5’-單磷酸(5’-TMP)上平行測量5’-核苷酸酶活性。在β-甘油磷酸底物上測量該生物學樣品中的非特異磷酸酶活性，并將此作為修正。我們發現，盡管在不同核苷酸戊糖單磷酸上測量得到的5’-核苷酸酶活性值彼此在數量上不同，然而對于健康個體而言在不同底物上測量得到的活性值之間存在嚴格的相關性。這是因為在生理條件下血清中存在核酸-核苷酸代謝過程的動態平衡狀態，就像普通的代謝池。我們還發現，在健康和患病個體的血清中在上述六種底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性值差異不能歸于底物化學本質的差異，而是來自生理學過程。我們出乎意料的還發現，上述嚴格相關性在化療后發生改變，而且根據治療是否對嘌呤代謝、嘧啶代謝、或胸苷代謝發生影響而顯示相當大的差異。因而，根據在上述六種不同底物上進行的活性測量的結果，可以確定采用的治療是否有效，它對意欲影響的領域是否有效，和它是否誘導非期望細胞損傷。這種認識構成了本發明的基礎。
我們還發現，在化療后，甚至短時間(24小時)，在所有六種不同底物上呈現了5’-核苷酸酶活性的易見變化，因而能夠在較短時間內、以較少不確定性作出關于維持、更改或終止治療的很有根據的決定。出于比較的目的，我們在這里要提到，只有在治療大約1周后才能夠在大多數腫瘤標記中觀察到可以作為決策依據的變化。
我們還發現，當在所有上述六種底物上平行測量5’-核苷酸酶活性并將結果相綜合時，對于個體的條件、肝和骨過程的發生建立的診斷要比只在單一底物上進行的測量可靠得多。這可以為惡性過程的早期識別提供有價值的幫助。
最后，我們還發現，根據生化過程的因果互聯，在上述六種底物上進行的5’-核苷酸酶活性測量能夠取代在實驗和臨床實踐中不常使用的酶活性測定，因為后者要復雜得多，而且根本難以作為常規測試進行。這些取代或替代可能如下5’-CMP核苷酸酶→胞苷激酶→胞苷脫氨酶→胞苷三磷酸合酶；5’-GMP核苷酸酶→鳥苷脫氨酶；5’-IMP核苷酸酶→IMP脫氫酶；5’-TMP核苷酸酶→胸苷激酶←→胸苷合酶。
因此，一方面，本發明涉及測定5’-核苷酸酶活性的方法，其中以本身已知的方式、在本身已知的條件下將生物學樣品與作為底物的核苷酸戊糖單磷酸一起保溫，用鉬酸銨和還原劑處理釋放的無機磷酸而將其轉變成有色復合物，通過已知方法測量顏色強度，并使用已知計算方法和/或借助校準曲線，由測量值計算5’-核苷酸酶活性或單位時間內釋放的無機磷酸的量(該數值與5’-核苷酸酶活性成正比)。依照本發明，將5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP用作核苷酸戊糖單磷酸，在所有這六種底物上進行測量。
在上文引用的文獻和論文等中能夠找到關于測量需要的反應物、反應條件和計算方法的詳細資料。作為范例，我們在下文中給出了可用于測量而無需清除蛋白質的試劑系統的組成，經證明它是特別優選的，還描述了應當如何將它與計算方法一起用于在血清樣品上進行的測量，但是并非將本發明的方法限于下文討論的試劑系統和條件。
將要使用的試劑如下(1)緩沖劑/激活劑溶液75-400mM Tris、5.0-10.0mM MgCl2或2.0-5.0mM MnCl2、1.0-5.0mM KCl；用3-6M HCl水溶液將溶液的pH調至9-9.5。
(2)抑制劑只有在生物學樣品包含干擾5’-核苷酸酶活性測定的物質時才使用抑制劑。對于血液和血清，這種物質是堿性磷酸酶，可以用含10-20g/L L-半胱氨酸或L-賴氨酸或等同量的L-半胱氨酸鹽或L-賴氨酸鹽或者50-250mg/L伴刀豆凝集素A的溶液(溶劑是上文所述緩沖液)進行抑制。當在溶酶體膜上進行測量時，將上述緩沖液中的5-50mML(+)-酒石酸(鹽)溶液用于抑制存在的糖磷酸。
(3)底物使用5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP的1-10mM脫礦質水溶液作為底物。還應當在相同濃度的溶液中使用β-甘油磷酸或苯基磷酸二鈉作為底物。后兩種底物是測定非特異磷酸酶活性的兩種已知底物；也應當測定此活性，以精確測定5’-核苷酸酶活性。
(4)蛋白質增溶劑最高純度級的純凈的(濃縮的)甲酸或丙酸。
(5)穩定劑1∶9-4∶6v/v甘油與水的混合液，或0.5-5％(w/w)山梨醇水溶液，或0.25-2.5％(w/w)甘露醇水溶液，或1∶2-1∶1v/v正丙醇與水的混合液。
將少量(0.001-0.01％w/w)疊氮化鈉溶于穩定劑以提高其耐貯性是明智的。
(6)顯色劑5-10g/L鉬酸銨的脫礦質水溶液。
(7)還原液溶于1M氫氯酸水溶液的1-5g/L SnCl2溶液，或1-5g/L抗壞血酸的脫礦質水溶液。
(8)磷標準液1.61mM無機磷酸溶液，系列稀釋。
如下進行測量通過以下列v/v比率混合蛋白質增溶劑來制備用于測定無機磷酸量的測定劑-4∶1-1∶1(甘油水溶液)，或-3∶1-1∶1(山梨醇水溶液)，或-5∶1-1∶2(甘露醇水溶液)，或-7∶1-4∶1(正丙醇水溶液)，并向生成的混合液中加入15-25％體積(相對于最終混合液的總體積)的顯色劑。
以表1所示比率混合表1前五行所列成分，并將生成的混合液于37℃保溫60分鐘。然后向混合液中加入表1所列其它成分，攪動生成的混合液，靜置15分鐘，并測量溶液在620-720nm的吸光率。表1中以“5’-ND+ALP”為標題的那列表示一起測量5’-核苷酸酶活性與堿性磷酸酶活性(即未使用抑制劑)的測量值，而以“5’-ND”為標題的那列表示在存在堿性磷酸酶抑制劑時的測量時。在兩種測量的結果中都出現了非特異磷酸酶活性。分別在存在抑制劑時在β-甘油磷酸底物上測定非特異磷酸酶活性；分別由先前獲得的5’-核苷酸酶+堿性磷酸酶活性或5’-核苷酸酶活性減去得到的數值。
如下進行計算(1)計算消光差值(ΔE值)β-甘油磷酸E樣品-E盲試＝ΔEβ-甘油磷酸其它底物E樣品-E樣品盲試＝ΔE5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5-TMP、5’-IMP標準E標準-E試劑盲試＝ΔE標準(2)根據上文ΔE值計算酶活性 其中K是由如下公式計算得到的常數保溫總體積(ml)×1000----------------------------------------------保溫時間(min)×樣品體積(ml)×比色杯厚度(3)由上文活性數據計算各種酶活性或聯合活性非特異磷酸酶活性＝在β-甘油磷酸上測量得到的活性在不同核苷酸戊糖單磷酸上測量得到的5’-核苷酸酶活性＝5’-ND活性-非特異磷酸酶活性5’-核苷酸酶+堿性磷酸酶活性＝5’-ND+ALP-非特異磷酸酶活性堿性磷酸酶活性＝5’-ND+ALP-5’-ND-非特異磷酸酶活性若生物學樣品不是血清，則以相同方式進行測量，只是有時不需要抑制劑，或使用其它抑制劑。同樣如上所述進行計算。
表1溶液5’-ND+ALP 5’-ND 樣品盲試標準試劑盲試緩沖劑/激活劑0.125ml0.125ml 0.125ml - -脫礦質水 0.075ml0.050ml 0.075ml - -抑制劑 - 0.025ml -- -樣品(血清) 0.025ml0.025ml -- -底物 0.025ml0.025ml -- -測定劑 0.750ml0.750ml 0.750ml 0.750ml 0.750ml脫礦質水 - - -0.125ml 0.250ml樣品(血清) - - 0.025ml - -底物 - - 0.025ml - -標準 - - -0.125ml -還原液 0.125ml0.125ml 0.125ml 0.125ml 0.125ml根據在上文一系列測量中在各種底物上得到的5’-核苷酸酶活性值，可以得出如下結論關于狀況的決策當六個測量活性值相加得到的數值高達54-65U/L、同時堿性磷酸酶活性為10-25U/L時，指示無疾病狀態。若堿性磷酸酶活性超過50U/L、同時5’-核苷酸酶活性值的和為54-65U/L，則指示骨過程。若5’-核苷酸酶活性的和超過70U/L，則這是患病狀態的可靠指示。若同時堿性磷酸酶活性超過35U/L，則這是存在肝損傷的可靠指示。對于惡性肝腫瘤，5’-核苷酸酶活性值的和及堿性磷酸酶活性都比正常值高4-10倍。
關于治療的評估在5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP底物上測量得到的活性變化指示腫瘤治療干預了嘌呤代謝，而在5’-CMP、5’-UMP和5’-TMP底物上測量得到的活性變化指示對嘧啶代謝的干預。數值無變化指示治療無效。活性降低總是指示治療對過程產生了有益干預。在許多情況中，5’-核苷酸酶活性在進行化療后顯著降低，以至于在各種底物上分別測量的活性和這些活性的和都低于10U/L，甚至有時5’-核苷酸酶活性還能夠獲得負值。這是由于治療攻擊核苷酸代謝但不影響非特異磷酸酶活性值；在應當由較低5’-ND活性值減去較高非特異磷酸酶活性值時即獲得負活性值。當5’-核苷酸酶活性值低于那些由健康對照獲得的數值時，這已經指示對具有快速核苷酸代謝的健康細胞(主要是腸粘膜、骨髓和紅細胞)的細胞毒性損傷，特別是當在所有六種底物上測量的所有5’-核苷酸酶活性都發生這種變化的時候。
根據又一方面，本發明涉及本發明方法用于診斷是否存在惡性過程和/或監測在惡性過程治療中所采用療法的效果的用途。
本發明還涉及可用于本發明方法的試劑盒，除了可通過形成無機磷酸、將生成的磷酸轉變成有色復合物、并通過光度法測量顏色強度而用于測定5’-核苷酸酶活性的試劑盒的常規成分以外，它還包含5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP作為底物。
試劑盒的常規成分可以是那些例如上文引用的發表物中公開的已知方法所采用的試劑。優選試劑盒可包含下列常規成分-緩沖劑-蛋白質增溶劑-穩定劑-顯色劑-還原劑-磷標準還有(如果需要的話)-抑制劑，和/或-除了核苷酸戊糖單磷酸以外的其它底物(諸如β-甘油磷酸)。
上文本發明方法的例示性描述中所列的那些成分是上文常規成分的優選代表。試劑盒可以上述濃度的溶液的形式或使用前需要稀釋的更濃的溶液的形式或純凈的化學品的形式包含常規成分。
下文給出了在血清樣品上進行的5’-核苷酸酶活性測量的結果作為范例，以及可由此得出的結論。各種底物的量和測定條件始終如表1中所示。測量中所用各種試劑的準確組成如下(1)緩沖劑/激活劑溶液75.0mM Tris·HCl、5.0mM MgCl2、5.0mM KCl；pH9.3。(2)抑制劑將0.29g L-半胱氨酸·HCl溶于20.0ml緩沖劑/激活劑溶液。(3)底物8.0mM 5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP、5’-TMP和β-甘油磷酸的脫礦質水溶液。(4)蛋白質增溶劑最高分析純級的純凈的(濃縮的)甲酸。(5)穩定劑300ml最高分析純級的甘油+700ml脫礦質水+0.05gNaN3。(6)顯色劑8.0g/L鉬酸銨的脫礦質水溶液。(7)還原液將0.20g SnCl2溶于100ml 1.0M氫氯酸水溶液。(8)磷標準液濃度為1.61mM的“Dyalab”型無機磷酸鹽溶液(用于進一步的千倍稀釋)。測定劑將200ml成分(4)與200ml成分(5)和100ml成分(6)混合。
對下列情況進行測量-健康個體和臨床診斷患有腫瘤的治療前個體。結果列于表2。-監測乳腺腫瘤患者手術后的CMF(環磷酰胺-氨甲蝶呤-5-氟尿嘧啶)治療。結果列于表4和5。-監測骨肉瘤患者的氨甲蝶呤(葉酸拮抗劑)治療。結果列于表7。
出于簡化目的，在表2和所有后面的表格中，只給出了各種底物的符號；但是這些符號始終表示在指定底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性值。
根據表2的數據，對于患有驗訖惡性瘤的患者，在六種底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性值與健康對照值相比顯著升高，除了淋巴瘤+骨表現是例外。對于肺腫瘤和/或偶聯肝表現的淋巴瘤，5’-核苷酸酶活性值的和(∑5’-ND)顯示最突出的升高。對于偶聯骨表現的淋巴瘤，堿性磷酸酶活性的升高與5’-核苷酸酶活性的變化相比是最突出的。
表2酶活性±標準偏差(U/L)測試組 5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP ∑5′-ND 堿性磷酸酶健康對照6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.5 40.9 13.2n＝157 ±1.2±2.2±1.6±1.1±0.9±1.6±1.43±4.4乳癌23.4550.9234.8 13.7610.6 27.87161.4 45.7n＝341 ±4.1±9.8±4.7±4.3±3.3±5.8±5.33±7.8卵巢癌 47.5695.8767.1 33.2 13.7 30.4 287.8 65.5n＝189 ±7.8±9.1±6.9±4.4±3.5±6.1±6.3 ±11.2甲狀腺癌34.6670.3 45.4 22.3 17.8 45.1 235.5657.6n＝76 ±7.2±9.7±5.9±4.4±5.2±9.5±6.98±12.3非何杰金氏淋巴瘤23.5 46.8 34.5 11.6 9.11 18.6 144.1123.4n＝45 ±5.6±8.4±5.1±6.3±2.2±3.2±5.13±4.4何杰金氏病 34.6 80.6 57.5 21.2 10.7 15.5 220.1 43.3n＝36 ±3.9±12.7 ±7.4±5.2±1.9±3.2±5.71±6.2惡性黑素瘤 10.8 23.7 15.8 5.7 8.8 23.2 88.01 41.3n＝1567 ±2.3±3.8±2.9±0.89 ±1.5±4.3±2.61±6.8肺瘤67.7 123.478.3 34 23 34 360.4 62.2n＝76 ±13.4 ±19.4 ±13.5 ±5.9±3.9±4.5±10.15 ±11.2(表2)酶活性±標準偏差(U/L)測試組 5′-AMP 5′-CMP5′-UMP5′-GMP5′-IMP 5′-TMP ∑5′-ND 堿性磷酸酶淋巴瘤+骨表現9.2 10.88.25.43.3 9.8 45.8 167.6n＝23±2.3±1.7 ±1.1 ±0.9 ±0.2 ±1.8 ±1.33 ±23淋巴瘤+肝表現89.7 189.7 102.6 45.8 34.934.6497.3 56.7n＝76±19 ±23±31 ±12 ±8.9 ±4.6 ±16.41±11.2
根據表3的數據，對于患有驗迄惡性瘤的治療前患者和健康對照二者，可以在針對各種底物的5’-核苷酸酶活性值之間找到嚴格相關性，在5’-AMP上測量得到的活性與在β-甘油磷酸上測量得到的活性(它指示非特異磷酸酶活性)之間也存在嚴格相關性。
表3相關性配對 相關性5′-AMP 5′-CMP 0.99435′-AMP 5′-UMP 0.97285′-AMP 5′-GMP 0.92345′-AMP 5′-IMP 0.96565′-AMP 5′-TMP 0.98785′-CMP 5′-UMP 0.94565′-CMP 5′-GMP 0.96785′-CMP 5′-IMP 0.94895′-CMP 5′-TMP 0.89785′-UMP 5′-GMP 0.89895′-UMP 5′-IMP 0.93235′-UMP 5′-TMP 0.95625′-GMP 5′-IMP 0.89785′-GMP 5′-TMP 0.95455′-AMP β-甘油磷酸 0.8978表4和5給出了為了對進行乳瘤切除術然后進行化療的患者監測治療而進行的測量的結果。表4概述了成功的病例的數據，而表5概述了耐受CMF療法的病例的數據。表5還給出了改變治療后獲得的數據。在治療改變中，對患者進行順鉑治療，并在第一次治療后第一天(*)和終止治療后第一天(料)測量5’-核苷酸酶活性。在所有其它病例中，在現行化療24小時后進行測量。出于比較目的，還給出了在健康對照上測量得到的數值。
表45’-核苷酸酶活性±標準偏差(U/L)5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP 5′-ND健康對照 6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.540.9±1.2 ±2.2±1.6±1.1±0.9±1.6 ±1.43患病，CMF前 29.4 34.7 11.8 7.9 7.6 19.8 112.2±3.7 ±7.8±3.4±1.8±1.1±3.7 ±3.51組CMF后 11.6 3.4 4.6 2.3 3.2 4.529.6±2.1 ±0.9±1.2±0.8±0.9±1.4 ±1.23組CMF后 3.4 2.3 2.1 -2.4 -2.8 1.11.28±1.1 ±0.9±0.9±0.1±0.8±0.03 ±0.636組CMF后 0.7 -1.7 2.2 -3.3 1.1 -3.4 -4.4±0.04±0.3±0.7±0.8±0.1±0.7 ±0.44根據上述數據可以得出以下結論在5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性早在第一組CMF治療后就顯著降低。在第三組CMF治療后，可以在以5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP底物測量得到的5’-核苷酸酶活性中觀察到相當大的降低。在第六組CMF治療后，在以5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-IMP底物測量得到的5’-核苷酸酶活性中出現顯著降低。關于藥物組合，由于各種成分的攻擊點不同，因此難以確定在攻擊點發揮的作用。因而，在這種情況中，與治療前的狀況進行比較可以作為指導。測量數據顯示，所用藥物組合通過對嘌呤和嘧啶代謝過程發揮影響而以兩個階段發揮其治療作用。
表55’-核苷酸酶活性±標準偏差(U/L)5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP ∑5’-ND健康對照 6.5 10.1 8.4 4.1 3.3 8.5 40.9±1.2±2.2±1.6±1.1±0.9±1.6±1.43患病，CMF前 39.6 72.4 45.8 23.7 18.9 24.7 225.11±8.67 ±11.3 ±10.9 ±7.8±3.5±6.2±8.051組CMF后 26.7 68.9 40.2 19.8 16.4 21.1 193.1±5.3±10.2 ±9.9±6.9±4.6±5.2±7.01順鉑后(*) 20.3 43.2 26.5 4.2 2.3 8.9 115.4±3.4±8.1±5.7±1.1±0.9±1.8±3.5順鉑后(**)4.1 3.6 4.4 -1.6 1.1 1.2 12.8±1.3±0.9±1.5±0.8±0.6±0.3±1.2在無效的CMF治療之后，未能在以各種底物測量得到的5’-核苷酸酶活性中觀察到顯著變化；因此用順鉑繼續治療。根據上述結果，我們觀察到針對個別底物的5’-核苷酸酶活性的顯著變化早在順鉑治療的第一階段就已經發生了(治療后24小時；表中以*表示)；主要在參與嘌呤代謝的底物上能夠觀察到可觀降低。在終止順鉑治療后第一天測量得到的數值(表中以**表示)指示從時間上說嘌呤代謝的變化之后跟隨著嘧啶代謝的變化，注意兩種代謝過程的變化是疊加的。我們的測試早在診斷性腫瘤標記CA 15-3測量(它也指示無效)的5天前就已經揭示了CMF治療的無效性，因而患者能夠免去多余的5天CMF治療。
成功且有效的治療同樣由在不同底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性值之間的最初嚴格相關性發生變化的事實得到反映。下文表6列出了成功治療后計算得到的相關值，還出于比較目的而給出了治療前的數值。
表6相關性相關性配對 化療前 化療后5′-AMP 5′-CMP 0.9856 0.67675′-AMP 5′-UMP 0.8997 0.45615′-AMP 5′-GMP 0.7845 0.32675′-AMP 5′-IMP 0.8967 0.45195′-AMP 5′-TMP 0.7897 0.46875′-CMP 5′-UMP 0.9897 0.56395′-CMP 5′-GMP 0.7868 0.23455′-CMP 5′-IMP 0.8887 0.26895′-CMP 5′-TMP 0.6767 0.11235′-UMP 5′-GMP 0.8978 0.34935′-UMP 5′-IMP 0.8889 0.05675′-UMP 5′-TMP 0.8992 0.36355′-GMP 5′-IMP 0.9981 0.46845′-GMP 5′-TMP 0.9767 0.47815′-IMP 5′-TMP 0.8898 0.4356表6的數據顯示了在不同底物上測量得到的5’-核苷酸酶活性之間的最初嚴格相關性停止了，這還反映了在不同底物上進行的測量使得我們能夠分開檢測并評估在治療過程中進行的各種生物學過程。
當化療對核苷酸代謝沒有直接影響時，使用上述六種底物進行的5’-核苷酸酶活性測定同樣為那些情況提供了不可替代的有用信息。這種情況的一個較好范例是骨肉瘤患者的氨甲蝶呤治療。氨甲蝶呤是具有葉酸拮抗作用的物質，它對核苷酸代謝沒有直接作用，因而氨甲蝶呤治療后發生的每一種核苷酸代謝變化都指示從頭核苷酸合成即健康細胞的損害。伴隨治療發生的任何損害總是具有嚴重后果；這種后果可能是例如細胞和體液免疫力降低，這還可能誘導次生腫瘤的形成。
表7概述了由用12.0g劑量的氨甲蝶呤進行治療的骨肉瘤患者測量得到的5’-核苷酸酶活性變化。
根據表7的數據可以得出以下結論在六種底物上進行的、用于檢驗嘧啶和嘌呤代謝變化的5’-核苷酸酶活性測定的結果顯示，在第一階段，治療影響嘧啶代謝。兩種代謝途徑之間的差異在治療后44小時特別突出。由表7的數據還可以看出，甚至在同一代謝途徑中，也可以在各種底物之間觀察到顯著差異。這種現象毫無疑問是由于各種底物的生化功能之間的差異所致。在監測依照本發明方法的治療后，有可能在檢測的擾動將導致更嚴重變化即晚期后果之前就停止或改變治療。
表75’-核苷酸酶活性(U/L)時間嘧啶代謝嘌呤代謝5′-AMP 5′-CMP 5′-UMP 5′-GMP 5′-IMP 5′-TMP0分鐘 -8.395.335.053.34 3.771.565分鐘 -3.122.210.140.57 -0.2-6.7530分鐘-11.87 -2.19 1.92-2.192.98-6.891小時 -5.052.411.2 -2.1 1.34-1.012小時 -4.845.972.772.84 -3.49 -2.493小時 -0.5 8.6 4.057.61 5.682.414小時 -3.636.764.190.92 -0.28 -3.986小時 -10.32 -1.63 -1.85 -5.48-2.7-3.712小時-1.71-0.15 1.481.98 3.69-4.4921小時-2.566.045.83-0.990.35-4.8444小時31.384.697.891.99 -12.95 -9.4669小時7.96 18.42 14.93 13.1613.01 8.690小時6.83 13.09 15.16 3.49 10.13.63162小時 -12.66.9729.53 -6.33-1.99 -1.35186小時 1.41 7.5312.16 14.946.540.35210小時 5.76 4.487.393.91 -3.91 0.92234小時 8.61 3.4810.88 8.68 5.476.11258小時 3.99 2.422.640.22 0.43-5.82330小時 9.25 7.472.998.46 10.53 -2.7358小時 9.67 5.474.9 5.97 -2.28 2.56402小時 5.18 8.039.598.24 6.045.4
盡管上文已經聯系診斷用途而描述了依照本發明的方法和試劑盒，然而本發明的范圍不限于這種用途。本發明的方法和試劑盒還可用于研究目的而具有極好結果，例如用于檢測某些惡性過程的機制、測試已知或新型抗癌劑和檢驗它們的作用機制。
權利要求
1.用于測定5’-核苷酸酶活性的方法，其中以本身已知的方式、在本身已知的條件下將生物學樣品與作為底物的核苷酸戊糖單磷酸一起保溫，用鉬酸銨和還原劑處理釋放的無機磷酸而將其轉變成有色復合物，通過已知方法測量顏色強度，并使用已知計算方法和/或借助校準曲線，由測量值計算5’-核苷酸酶活性或單位時間內釋放的無機磷酸的量，該數值與5’-核苷酸酶活性成正比，其特征為使用核苷酸戊糖單磷酸5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP，并在所有這六種底物上進行測量。
2.權利要求1中所要求的方法，特征為將生物學樣品與底物在任選存在抑制劑時在緩沖介質中一起保溫，然后除了鉬酸銨和還原劑還向保溫的混合液中添加蛋白質增溶劑和穩定劑。
3.權利要求1或2中所要求的方法，特征為以1-10mM濃度水溶液的形式使用所述核苷酸戊糖單磷酸底物。
4.權利要求1-3之任一中所要求的方法，特征為將全血、血清或血溶物用作生物學樣品，并且在存在和不存在堿性磷酸酶抑制劑的條件下與底物一起進行保溫。
5.用于進行權利要求1-4之任一所要求的方法的試劑盒，它包含5’-AMP、5’-CMP、5’-UMP、5’-GMP、5’-IMP和5’-TMP作為底物，以及可用于通過形成無機磷酸、將生成的磷酸轉變成有色復合物、并通過光度法測量顏色強度而測定5’-核苷酸酶活性的試劑盒的常規成分。
6.權利要求5中所要求的試劑盒，它包含緩沖劑、蛋白質增溶劑、穩定劑、顯色劑、磷標準作為常規成分，任選的抑制劑和/或除了核苷酸戊糖單磷酸以外的其它底物。
7.權利要求1-4之任一中所要求的方法或權利要求5或6中所要求的試劑盒用于診斷是否存在惡性過程和/或監測惡性過程治療中所采用療法的效果的用途。
全文摘要
本發明涉及用于測定5’－核苷酸酶活性的方法，其中以本身已知的方式、在本身已知的條件下將生物學樣品與作為底物的核苷酸戊糖單磷酸一起保溫，用鉬酸銨和還原劑處理釋放的無機磷酸而將其轉變成有色復合物，通過已知方法測量顏色強度，并使用已知計算方法和/或借助校準曲線，由測量值計算5’－核苷酸酶活性或單位時間內釋放的無機磷酸的量(該數值與5’－核苷酸酶活性成正比)。依照本發明，將5’－AMP、5’－CMP、5’－UMP、5’－GMP、5’－IMP和5’－TMP用作核苷酸戊糖單磷酸，并在所有這六種底物上進行測量。本發明還涉及用于進行上述方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/42GK1454262SQ0081963
公開日2003年11月5日 申請日期2000年7月3日 優先權日2000年5月24日
發明者A·博塔, I·圖洛克 申請人:普羅諾克生物技術有限責任公司