將二倍體轉變成單倍體用于遺傳診斷的制作方法

專利名稱：將二倍體轉變成單倍體用于遺傳診斷的制作方法
技術領域：
本發明得到了美國政府基金的資助，即NIH撥款CA43460、CA57345、CA62924、CA67409、CA72851。因此，美國政府保留對本發明的某些權利。本申請要求1999年10月8日提交的臨時申請流水號60/158,160的收益，而且是1999年12月15提交的專利申請流水號09/461,047的部分繼續申請。
背景技術：
至少就遺傳診斷而言，人類和其它哺乳動物的問題在于它們是二倍體。一個等位基因中的突變(諸如負責所有顯性遺傳綜合癥的突變)總是伴隨著第二個等位基因的野生型序列。雖然在過去的十年里已經開發了用于遺傳診斷的許多有力技術，但是它們都受到模板中存在的二倍性的限制。例如，與突變型條帶具有相同電泳遷移率的野生型條帶能夠使測序梯的解釋變得復雜，尤其是在突變型條帶的亮度較弱的時候。DNA區段的刪除甚至更成問題，因為在這種情況中只有野生型等位基因通過標準技術得到了擴增和分析。這些問題呈現了診斷單基因疾病的困難，而對多基因疾病甚至更成問題，其中作為原因的突變可發生于幾種不同基因之任一種。這種多基因機制是常見易感性綜合癥的規則而非例外，諸如與乳腺癌和結腸癌、失明、以及血液學、神經學、和心血管疾病有關的綜合癥。遺傳診斷這些疾病的靈敏度目前不是最佳的，其中30％-70％的情況難于遺傳分析。
本領域需要簡單的分離和分析來自人類和其它哺乳動物細胞的單個等位基因。
發明概述本發明的一個目的是提供用于檢測人類或其它哺乳動物染色體上目的基因中的突變的方法。
本發明的另一個目的是提供用于使待測細胞適用于靈敏的遺傳測試的方法。
本發明的還有一個目的是提供可用于遺傳分析的融合雜交細胞群體。
下文所述一個或多個實施方案提供了本發明的這些和其它目的。在一個實施方案中，提供了用于檢測人類或其它哺乳動物目的基因中的突變的方法。使人類或其它哺乳動物的細胞融合嚙齒類細胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細胞。通過選擇嚙齒類染色體所含第一種標記和第一人類或其它哺乳動物染色體所含第二種標記來選擇融合后雜交細胞，以形成融合后雜交細胞群體。在融合后雜交細胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細胞亞群。該第二人類或其它哺乳動物染色體與第一人類或其它哺乳動物染色體是不同的而且沒有選擇。測試雜交細胞亞群以檢測基因、所述基因的mRNA產物、或所述基因的蛋白質產物。該基因位于第二種人類或其它哺乳動物染色體上。mRNA或蛋白質產物的量減少或者基因、mRNA、或蛋白質產物的特性改變指示人類或其它哺乳動物的該基因中存在突變。
依照另一個實施方案，公開了為遺傳測試提供待測細胞的方法。待測細胞對于人類或其它哺乳動物基因而言是單倍體。使人類或其它哺乳動物的細胞融合經轉化的二倍體嚙齒類細胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細胞。通過選擇第一人類或其它哺乳動物染色體和嚙齒類染色體各自的標記來選擇融合后雜交細胞，以形成在沒有選擇人類或其它哺乳動物染色體的情況中穩定維持一或多個人類或其它哺乳動物染色體的細胞群體。在細胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞，該第二人類或其它哺乳動物染色體不同于該第一人類或其它哺乳動物染色體，而且沒有選擇。
本發明還提供了嚙齒類-人類或嚙齒類-其它哺乳動物雜交細胞群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，在其中至少2個人類或其它哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
本發明由此通過提供對于一種或多種目的基因而言是單倍體的雜交細胞用于分析而為本領域提供了可用于提高多種診斷和分析方法的靈敏度和效力的方法。雜交細胞的人類或其它哺乳動物染色體成分是穩定的且一致的。
圖的簡述


圖1用于生成雜交細胞的策略。使受者小鼠細胞系E2融合人類淋巴細胞，隨后用HAT+遺傳霉素(分別殺死未融合的E2細胞和淋巴細胞)選擇克隆。所有克隆包含負責在HAT中生長的人類X染色體。測定克隆的基因型以確定保留了哪個人類染色體。標有“A”和“B”的染色體表示代表性人類染色體的兩種同系物。圖中指出了所分析6種染色體同系物的二者皆未保留、二者都保留、或保留二者任一的克隆所占平均比例(見正文)。對保留待測基因的一個等位基因的克隆的核酸進行突變分析。
圖2雜交細胞中的等位基因狀況和基因表達。(圖2A)所示染色體的多態標記用于測定所示雜交細胞的基因型。“供體”指用于融合小鼠受者細胞的人類淋巴細胞。(圖2B)E2和4種雜交細胞的cDNA作為模板用于擴增hMSH2、hMSH6、hMLH1、hTGF、β-RII、hPMS1、hPMS2、和APC序列。結果符合圖2A中觀察到的基因型，即雜交細胞5-7保留了包含所測試基因的每種染色體的至少一個等位基因，而雜交細胞8包含染色體3、5、和7的等位基因，但不含染色體2(包含hMSH2、hPMS1、和hMSH6基因)的等位基因。
圖3難于進行標準遺傳診斷的HNPCC患者的突變分析。對來自所示雜交細胞的核酸測試染色體2和3的保留情況(使用多態標記)(圖3A)和分別位于染色體2和3上的hMSH2和hMLH1基因的表達(圖3B)。雜交細胞1、2、3、和6包含來自染色體2的等位基因A，但不表達hMSH2轉錄本；而雜交細胞4和5包含等位基因B，并表達hMSH2。hMLH1表達作為cDNA完整性的對照。(圖3C)由所示雜交細胞擴增代表所示hMSH2外顯子的序列。在包含等位基因A的雜交細胞中不存在外顯子1-6，但是在包含任一等位基因的雜交細胞中存在外顯子7-16。
圖4Warthin家族G的突變分析。(圖4A)對來自雜交細胞1(包含Warthin家族G患者的突變型等位基因)的hMSH2轉錄本的RT-PCR產物的序列分析圖示了24bp插入(標有下劃線；將反義引物用于測序)。在雜交細胞3(包含野生型等位基因)中發現了野生型序列。來自患者淋巴樣細胞的轉錄本的RT-PCR分析顯示，突變型轉錄本的表達水平顯著低于野生型序列。(圖4B)相同雜交細胞基因組DNA的序列分析顯示，插入是由于位于外顯子4剪接受體位點處的A向C突變(反義序列，以粗體和下劃線指示)，導致使用上游24bp的隱藏剪接位點。突變體C的信號不如供體DNA中的野生型A強。這種不等價在來自二倍體細胞的測序模板中并非不尋常，而且能夠導致解釋層析圖的困難。(圖4C)來自雜交細胞1和5(攜帶染色體2的突變型等位基因)的提取物不含hMSH2蛋白質，而雜交細胞2和3(攜帶野生型等位基因)的提取物包含hMSH2蛋白質。雜交細胞4不含染色體2的任一等位基因。雜交細胞1、3、4、和5都攜帶染色體3的至少一個等位基因，而且都合成hMLH1蛋白質。α-微管蛋白作為蛋白質上樣對照。顯示了使用針對所示蛋白質的抗體的免疫印跡。
優選實施方案的詳述我們已經設計了使用一種融合和選擇條件而生成包含任何期望人類或其它哺乳動物染色體的雜交細胞的策略。重要且意外的是，在這些雜交細胞中的人類或其它哺乳動物染色體是穩定的，而且它們以足以用于詳細分析的水平表達人類或其它哺乳動物基因。該方法基于的原理是，人類或其它哺乳動物細胞與嚙齒類細胞之間的融合可產生雜交細胞，該雜交細胞包含全套嚙齒類基因組和部分人類或其它哺乳動物染色體。在過去，例如通過營養缺陷型嚙齒類細胞的互補對保留特定人類或其它哺乳動物染色體的選擇，使得能夠分離包含期望染色體的雜交細胞(7，8)。雖然已經證明這種融合體可用于多種目的(8，9)，但是它們的效用受到是否有適用于許多染色體的嚙齒類受者可供利用以及融合和選擇條件的低效性和變化的限制。為了分析多基因疾病，必需為每種染色體分開進行融合和選擇。
人類或其它哺乳動物染色體在本發明雜交細胞中的穩定性是令人驚訝的。雖然輻射雜交細胞的人類遺傳結構較為穩定，但是這種穩定性推測是由于在照射供體細胞后小片段人類DNA整合到嚙齒類染色體中造成的。而人類染色體在全細胞融合中被認為是不穩定的，除非施加針對個別染色體的持續選擇壓力。在我們的實驗中出現的穩定性的原因尚不清楚，但是可能與嚙齒類配偶體的二倍體本質有關。這種二倍性反映了在經轉化嚙齒類細胞中不常見的染色體穩定性。以前的實驗確實顯示了，染色體穩定的人類細胞在與其它染色體穩定的人類細胞融合后保留了所有染色體，這與兩個配偶體之一染色體不穩定的情形不同。
本發明的二倍體嚙齒類受者細胞提供了可用于容易的生成具有功能性單倍體人類基因組的細胞的反應物。來自這些雜交細胞的核酸或蛋白質可作為反應物用于任何標準突變測定法。由于突變測定法正在不斷的得到改進并實現自動化(1)，因此雜交細胞所生成材料的價值相應的得到提高。事實上，不久將有可能檢查整個基因的序列(除了外顯子以外，還包括啟動子和內含子)。對于這種分析而言，由單個等位基因產生的核酸模板顯然是優越的，因為模板的均一本質可極大增強事實上任何診斷測定法的信噪比。因此，我們設想，這種方法可以有效的用于廣泛的研究和臨床難題。
目的基因通常是已經發現涉及遺傳性疾病的基因，包括涉及結腸癌、乳腺癌、Li-Fraumeni病、囊性纖維化、2型神經纖維瘤、vonHippel-Lindau病等的基因。經鑒定基因包括APC、merlin、CF、VHL、hMSH2、p53、hPMS2、hMLH1、BRAC1等。可以在蛋白質水平鑒定的突變包括調控轉錄或翻譯的序列中的突變、無義突變、剪接位點改變、易位、刪除、和插入，或者導致全長蛋白質顯著減少的任何其它變化。可以在核酸水平檢測更細微的其它突變，諸如通過RT-PCR產物的測序進行。
可用于融合的人類細胞是可以容易的融合嚙齒類細胞的任何細胞。易于由臨床樣本獲得的外周血淋巴細胞(PBL)是好的融合配偶體，無論事先是否進行促有絲分裂刺激，無論是新鮮的或于-80℃保存超過一年。既然遺傳突變是本發明的主題，那么可以使用人體的任何細胞，因為所有這些細胞都包含基本上相同的遺傳組成。可以使用的其它哺乳動物細胞包括(特別是)貓、狗、牛、綿羊、山羊、馬、黑猩猩、狒狒、和豬的細胞。更一般的說，其它哺乳動物細胞可選自反芻類、靈長類、食肉類、復齒類(lagomorpha)、和奇蹄類。通常，其它哺乳動物細胞融合配偶體不是嚙齒類細胞。
用于融合的嚙齒類細胞受者優選二倍體，更優選經癌基因轉化，甚至更優選因錯配修復基因缺陷而具有微衛星不穩定性。旺盛生長、穩定的二倍體、且高效融合的特定克隆的選擇完全屬于本領域普通技術人員的技術范圍之內。例如，嚙齒類細胞可以來自小鼠、大鼠、豚鼠、或倉鼠。
可以依照本領域任何已知方法來實現依照本發明的細胞融合。用于誘導融合的已知技術包括聚乙二醇介導的融合、仙臺病毒介導的融合、和電融合。可以以10∶1與1∶10之間的比率混合人類與嚙齒類的細胞。融合細胞的克隆通常在生長大約2-3周后變得明顯。
可以使用導致正選擇表型的任何標記來選擇融合后雜交細胞，包括抗生素抗性基因、有毒代謝物抗性基因、原養型標記等。本發明令人驚訝的優點是，選擇中可以使用位于一條人類或其它哺乳動物染色體上的一個標記，而且獲得不僅僅包含該所選擇的人類或其它哺乳動物染色體的穩定雜交細胞。因而，甚至在沒有對標記所處染色體進行選擇時，也可以分析位于其它染色體上的標記。
可以分析融合后雜交細胞以確定它們確實攜帶包含目的基因的人類或其它哺乳動物(非嚙齒類)染色體。可以將具有兩條相關人類或其它哺乳動物染色體之任一的雜交細胞在相互之間區分開，并且與包含兩條人類或其它哺乳動物染色體二者的雜交細胞區分開來(見
圖1)。雖然可以使用本領域用于鑒定人類或其它哺乳動物染色體的任何已知方法，但是可以通過評估位于人類或其它哺乳動物染色體上的微衛星標記而進行容易的分析。連鎖的其它多態性標記可用于鑒定雜交細胞中的期望人類或其它哺乳動物染色體。
一旦由測試的人類或其它哺乳動物分離得到包含一個拷貝的人類或其它哺乳動物目的基因的雜交細胞，就可以在雜交細胞上進行突變分析。可以直接對基因測試突變，或者可以測試基因的mRNA或蛋白質產物。使用合適抗體的Western印跡應當能夠檢測到導致全長基因產物表達減少的突變。還可以進行依賴目的基因所編碼蛋白質功能的測試法和酶測定法來檢測突變。還可以采用本領域已知的其它免疫學技術。
若使用免疫學方法來檢測雜交細胞中目的基因的蛋白質產物，則希望所用抗體與嚙齒類蛋白質不發生交叉反應。或者，可以通過突變而滅活與目的基因同源的嚙齒類基因，從而簡化蛋白質產物的分析。可以通過本領域眾所周知的靶向誘變方法來實現這種突變。
功能測試也可以用于評估每種等位基因產物的常態。例如，若將在p53轉錄激活位點下游包含β-半乳糖苷酶基因的表達構建物插入包含人類染色體17而不含內源p53的嚙齒類-人類雜交細胞，則可以通過使用X-gal染色克隆來檢測人類染色體17上的p53突變。可以設計特別為目的基因定制的其它酶促或功能測定法。
可以采用在DNA或RNA水平檢測突變的任何本領域已知方法，包括而不限于測序、等位基因特異性PCR、等位基因特異性雜交、微陣列、DGGE、和自動化測序。
有可能的是，目的基因在雜交細胞環境中的表達可能受到抑制。為了將目的基因在雜交細胞中的表達損失有意義的解釋為指示人類或其它哺乳動物中的突變，必須確認目的基因(在野生型時)在嚙齒類-人類或其它哺乳動物雜交細胞中表達。不需要為每位患者進行這種確認，而是可以在建立測定法時進行。
當本發明的測定法指示目的基因中存在突變時，可以測試其他家族成員以確定他們是否也攜帶突變。或者，可以測試其他家族成員以了解他們是否攜帶與受影響家族成員相同的染色體。這可以通過測試單倍型來測定，即在受影響家族成員中攜帶突變的染色體上找到的一套不同標記。單倍型的測定是對第一個家族成員進行本發明測定法的副產物。當例如通過使用微衛星標記來測試雜交細胞以確認雜交細胞中相關染色體的存在時，將可鑒定一套不同的標記，然后作為單倍型使用。
通過本發明融合方法生成的雜交細胞混合群體可能包含對于許多不同人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細胞。通常，在單倍體狀態的群體中，在100個、75個、50個、30個、或28個細胞中至少有1個，將存在至少2條、至少5條、至少10條、至少15條、至少20條、甚至22條人類或其它哺乳動物常染色體的每種同系物。因而，高比例的細胞包含多條人類或其它哺乳動物染色體，而且必需測試較少數目的細胞以找到包含單拷貝未選擇染色體的細胞。
由于人類或其它哺乳動物染色體在本發明雜交細胞中的高穩定性，因此由一個雜交細胞生成的細胞群體是一致的且均一的。因而，在由一個雜交細胞生成的群體中至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的細胞包含同一套人類或其它哺乳動物染色體。
下列實施例提供的實驗細節例證了進行本發明的許多方法之一。本發明不限于實施例中所采用細胞的具體方法。權利要求書和說明書作為一個整體提供了本發明的量度。
實施例所有雜交細胞都包含人類X染色體，因為該染色體包含使之能夠在HAT中生長的HPRT基因。為了測定雜交細胞中是否存在其它人類染色體，將多態性微衛星標記(12)作為探針用于基于PCR的測定法(圖2A)。我們關注已知包含結腸直腸癌(CRC)易感基因的染色體臂(2p、2q、3p、5q、7q、和16q)。在顯著比例的雜交克隆中存在這些染色體臂每一種的一個拷貝。例如，在由14個個體衍生并檢查染色體3的476個雜交細胞中，136個雜交細胞不包含任一條供體染色體，211個雜交細胞包含兩條供體染色體，60個雜交細胞包含一條親本染色體，69個雜交細胞包含另一條親本染色體。對所分析的6種染色體臂都發現相似保留頻率。對來自一條染色體兩臂的標記的測試顯示，雜交細胞保留了整條染色體而非染色體片段。對雜交細胞中期染色體涂片進行的熒光原位雜交(FISH)確認了這個結果，指出在每個雜交細胞中存在11±3條人類染色體。基于基因型數據的計算指出，就研究中的一條染色體而言，對25個雜交細胞的分析將確保有95％的概率可鑒定到至少1個包含母本等位基因的雜交細胞和至少1個包含父本等位基因的雜交細胞。此外，它將只需要45個雜交細胞來相似確保在至少一個雜交細胞中存在所有22種常染色體的每一種等位基因且與其同系物分開(13)。
上文所述結果證明，在融合小鼠細胞后可以容易的分離人類染色體的個別等位基因。
HNPCC為轉變方法的力量提供了令人信服的實證，因為它是已經廣泛研究的常見遺傳性疾病。在最近3年里，例如已經對來自遍布全世界的9個組中的303個HNPCC同類進行了主要MMR基因的廣泛研究(25-34)。根據在他們的癌中具有特征性微衛星不穩定性的這些患者的比例(30-34)，可以估計，239個(78％)同類在錯配修復基因中具有生殖系突變。然而，只在這239個同類的127個(42％)中鑒定到MMR基因突變(25-34)。我們的組是相似的，即來源于總共25個同類，其中22個患有腫瘤，而且具有微衛星不穩定性和假定的MMR基因突變。在這22個中，我們的最初分析揭示只在12個(54％)中存在突變(參考14和未發表數據)。只有在轉變分析之后揭示了其他10名患者的突變，由此將靈敏度由54％提高到100％。事實上與MSI有關的HNPCC的所有案例都歸咎于已知MMR基因的生殖系突變，這一結論與最近證明在絕大多數HNPCC患者的癌中不存在MSH2或MLH1蛋白質染色的免疫組織化學數據是一致的(40、41)。這些結果的推論是，對新的人類MMR基因的搜索不應當基于大部分HNPCC案例將證明可歸咎于這些未知基因的前提。
上文所述系統可以以直接了當的方式用于其它遺傳性疾病。應當強調的是，這種方法并非目前用于搜索特定突變的許多有力方法的替代。更正確的說，轉變可用于將現有技術的靈敏度最大化。由于轉變核酸可得到較高信噪比而且野生型等位基因不能夠掩飾或混淆突變型等位基因的檢測，因而轉變核酸為這些方法提供了優選底物。由于基于DNA的突變測定法在未來將獲得改進，而且日益增多的摻入微陣和其它自動化特征(42-44)，因此轉變生成核酸的價值將相應提高，顯著增強遺傳性疾病的遺傳測試法的效力。方法細胞培養小鼠胚性成纖維細胞衍生自MSH2缺陷型小鼠(46)并經腺病毒E1A和RAS癌基因轉化。通過在10μM 2-氨基6-巰基嘌呤中培養成纖維細胞來選擇HPRT缺陷型亞克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巰基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM)中維持克隆。細胞融合和雜交細胞的生成患者來自由阿姆斯特丹標準定義的患HNPCC同類(44)；由于缺乏足夠數目的患病個體，因而沒有一個案例可以進行連鎖分析。通過參考文獻45推薦的標記，測定了來自這些患者的癌中的微衛星不穩定性(MSI)。將3×106個E2細胞與12×106個淋巴細胞混合，清洗，在融合培養基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸鈣、0.5mM醋酸鎂、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中離心兩次，并重懸于640μl融合培養基。將溶液轉移到電擊杯(BTX電擊杯470；BTX，San Diego)中。使用BTXECM200型ElectroCell操作儀融合細胞。生成最大數目雜交細胞的設置是30V(AC)、22sec，隨后3次300V(DC)、每次15μsec脈沖。將來自一個融合的細胞轉移到裝有添加10％ FCS的DMEM的3個48孔板(Costar)中。24小時后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遺傳霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的DMEM更換培養基。一周后更換培養基。融合兩周后雜交克隆變得明顯，并在測定基因型前再擴增一周。由一個融合獲得平均23±15個雜交克隆。用于本文所述實驗的淋巴細胞衍生自外周血淋巴細胞的Epstein-Barr病毒感染，但是發現新鮮采集的淋巴細胞也能夠成功的使用相同方法進行融合和分析。基因型測定如參考文獻12所述進行基因型測定。在6％變性凝膠上分離PCR產物并通過放射自顯影可視化。所用微衛星標記是分別來自染色體2p、2q、3p、5q、7q、和16q的D2S1788和D2S1360、D2S1384、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。如先前所述進行熒光原位雜交(21)。PCR和測序如先前所述純化聚腺苷酸化RNA并進行RT-PCR。使用ABI Big Dye終止物和ABI 377型自動化測序儀進行測序。用于擴增和測序的所有引物將可以通過互聯網站點獲得。統計分析所測試每種染色體的等位基因二者皆無、二者都包含、或僅包含二者之一的雜交細胞的數目符合多維正態分布。蒙特卡洛模擬用于估計生成包含特定數目每種染色體的單等位基因雜交細胞所需要的雜交細胞數目。
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10.E2細胞衍生自由MSH2缺陷型小鼠(由T.Mak慷慨提供)衍生的小鼠胚性成纖維細胞并經腺病毒E1A和RAS癌基因轉化。通過在10μM2-氨基6-巰基嘌呤中培養成纖維細胞來選擇HPRT缺陷型亞克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巰基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM)中維持克隆。
11.將3×106個淋巴細胞混合，清洗，在融合培養基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸鈣、0.5mM醋酸鎂、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中離心兩次，并重懸于640μl融合培養基。將溶液轉移到電擊杯(BTX電擊杯470；BTX，San Diego)中。使用BTX ECM200型ElectroCell操作儀融合細胞。生成最大數目雜交細胞的設置是30V(AC)、22sec，隨后3次300V(DC)、15μsec脈沖。將來自一次融合的細胞鋪到裝有添加10％FCS的DMEM的3個48孔板(Costar)中。24小時后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遺傳霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersberg，MD)的DMEM更換培養基。一周后更換培養基。融合兩周后雜交克隆變得明顯，并在測定基因型前再擴增一周。用于本文所述實驗的淋巴細胞衍生自外周血淋巴細胞的Epstein-Barr病毒感染，但是我們發現新鮮采集的淋巴細胞也能夠成功的使用相同方法進行融合和分析。
12.如F.S.Leach等人，Cell，751215，1993中所述進行基因型測定。在6％變性凝膠上分離PCR產物并通過放射自顯影可視化。所用微衛星標記是分別來自染色體2p、2q、3p、5q和16q的D2S1788和D2S13360、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。
13.所測試每種染色體的二者皆未包含、二者都包含、或僅包含二者之一的雜交細胞的數目符合多維正態分布。蒙特卡洛模擬用于估計生成包含特定數目每種染色體的單等位基因雜交細胞所需要的雜交細胞數目。
14.如B.Liu等人，Nat Medicine，2169，1996中所述純化聚腺苷酸化RNA并進行RT-PCR。
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18.使用ABI Big Dye終止物和ABI 377型自動化測序儀進行測序。用于擴增和測序的所有引物將可以通過Science互聯網站點獲得。
19.將雜交細胞的胞質提取物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，并用針對人類hMSH2(#NA26，Calboiochem)、人類hMLH1(#13271A，Pharmingen)、或β-微管蛋白(#N357，Amersham)的特異性抗體進行免疫印跡。
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權利要求
1.用于檢測非嚙齒類哺乳動物目的基因中的突變的方法，包括下列步驟融合非嚙齒類哺乳動物細胞與嚙齒類細胞受者，以形成非嚙齒類哺乳動物-嚙齒類雜交細胞；通過選擇嚙齒類染色體所含第一標記和第一非嚙齒類哺乳動物染色體所含第二標記來選擇融合后雜交細胞，以形成融合后雜交細胞群體；在融合后雜交細胞群體中檢測對于第二非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細胞亞群，所述第二非嚙齒類哺乳動物染色體與第一非嚙齒類哺乳動物染色體不是相同染色體，而且沒有經過選擇；分析雜交細胞亞群以檢測所述基因或其mRNA產物中的突變，其中該基因位于第二非嚙齒類哺乳動物染色體上。
2.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞是二倍體。
3.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者是錯配修復缺陷的。
4.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者是遺傳霉素抗性的。
5.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者經癌基因轉化。
6.權利要求5的方法，其中癌基因是ras。
7.權利要求5的方法，其中癌基因是E1A。
8.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者經ras和E1A癌基因轉化。
9.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者是MSH2。
10.權利要求1的方法，其中嚙齒類細胞受者是二倍體而且包含可選擇標記和反選擇標記。
11.權利要求10的方法，其中反選擇標記是HPRT缺陷。
12.權利要求1的方法，其中還包括步驟在融合后雜交細胞群體中檢測第三非嚙齒類哺乳動物染色體，其中第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且第二和第三非嚙齒類哺乳動物都沒有經過選擇。
13.權利要求1的方法，還包括步驟在融合后雜交細胞群體中檢測第三和第四非嚙齒類哺乳動物染色體，其中第一至第四非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且第二至第四非嚙齒類哺乳動物染色體都沒有經過選擇。
14.權利要求12的方法，其中還包括步驟測試所述雜交細胞亞群以檢測第二基因的mRNA產物或所述第二基因的蛋白質產物，其中第二基因位于第三非嚙齒類哺乳動物染色體上，其中來自所述第二基因的所述mRNA或蛋白質產物的量降低或所述mRNA或蛋白質產物的特性改變指示該非嚙齒類哺乳動物的第二基因中存在突變。
15.權利要求13的方法，其中還包括步驟測試所述雜交細胞亞群以檢測第二和第三基因的mRNA產物或所述第二和第三基因的蛋白質產物，其中第二和第三基因位于第三和第四非嚙齒類哺乳動物染色體上，其中所述第三或第四基因的所述mRNA或蛋白質產物的量降低或者所述mRNA或蛋白質產物的特性改變指示該非嚙齒類哺乳動物的第三或第四基因中存在突變。
16.權利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物細胞是淋巴細胞。
17.權利要求1的方法，其中檢測對于第二非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細胞亞群的步驟是通過鑒定第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的微衛星標記而實現的。
18.權利要求1的方法，其中分析以檢測突變的步驟是通過選自下組的技術而進行的核酸測序、等位基因特異性PCR、等位基因特異性雜交、微陣列雜交、不連續梯度凝膠電泳(DGGE)、和自動化核酸測序。
19.用于為遺傳測試提供待測細胞的方法，其中所述待測細胞對于非嚙齒類哺乳動物基因而言是單倍體，該方法包括下列步驟使非嚙齒類哺乳動物的細胞融合經轉化的二倍體嚙齒類細胞受者，以形成非嚙齒類哺乳動物-嚙齒類雜交細胞；通過選擇第一非嚙齒類哺乳動物染色體和嚙齒類染色體各自的標記來選擇融合后雜交細胞，以形成在沒有選擇非嚙齒類哺乳動物染色體的情況下穩定維持一或多個非嚙齒類哺乳動物染色體的細胞群體；在細胞群體中檢測對于第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞，所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體與第一非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且沒有經過選擇。
20.權利要求19的方法，其中嚙齒類細胞受者是遺傳霉素抗性的。
21.權利要求19的方法，其中嚙齒類細胞受者經癌基因轉化。
22.權利要求21的方法，其中癌基因是ras。
23.權利要求21的方法，其中癌基因是E1A。
24.權利要求19的方法，其中嚙齒類細胞受者經ras和E1A癌基因轉化。
25.權利要求19的方法，其中嚙齒類細胞受者是錯配修復缺陷的。
26.權利要求19的方法，其中嚙齒類細胞受者包含反選擇標記。
27.權利要求26的方法，其中反選擇標記是HPRT缺陷。
28.權利要求19的方法，其中非嚙齒類哺乳動物細胞是淋巴細胞。
29.權利要求19的方法，其中檢測對于所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞的步驟是通過鑒定所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的微衛星標記而實現的。
30.權利要求19的方法，還包括步驟在細胞群體中檢測對于第四非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞，其中所述第四非嚙齒類哺乳動物染色體與第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的而且沒有經過選擇。
31.權利要求19的方法，還包括步驟在細胞群體中檢測對于第四、第五、和第六非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞，其中所述第四至第六非嚙齒類哺乳動物染色體與第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的而且沒有經過選擇。
32.權利要求19的方法，還包括步驟對對于第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞的核酸測試第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
33.權利要求19的方法，還包括步驟對對于第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞測試該第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
34.權利要求1的方法，其中對雜交細胞亞群中細胞的mRNA測試第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
35.權利要求1的方法，其中對雜交細胞亞群中細胞的蛋白質測試第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
36.嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細胞群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少2種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
37.權利要求36的群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
38.權利要求36的群體，其中，在50個細胞中至少有1個細胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
39.權利要求36的群體，其中，在30個細胞中至少有1個細胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
40.權利要求36的群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
41.權利要求36的群體，其中，在50個細胞中至少有1個細胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
42.權利要求36的群體，其中，在30個細胞中至少有1個細胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
43.權利要求36的群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
44.權利要求36的群體，其中，在50個細胞中至少有1個細胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
45.權利要求36的群體，其中，在30個細胞中至少有1個細胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
46.權利要求36的群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
47.權利要求36的群體，其中，在50個細胞中至少有1個細胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
48.權利要求36的群體，其中，在30個細胞中至少有1個細胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
49.權利要求36的群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
50.權利要求36的群體，其中，在50個細胞中至少有1個細胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
51.權利要求36的群體，其中，在30個細胞中至少有1個細胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
52.嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細胞群體，其穩定維持它們的非嚙齒類哺乳動物染色體成分，使得至少95％的雜交細胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
53.權利要求52的嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細胞群體，其中至少97％的雜交細胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
54.權利要求52的嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細胞群體，其中至少99％的雜交細胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
55.權利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物是人類。
56.權利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物選自山羊、綿羊、馬、牛、豬、肥豬、貓、和狗。
全文摘要
與遺傳性疾病有關的突變的檢測因哺乳動物細胞的二倍性而變得復雜。在一個等位基因中存在的突變常常受到另一等位基因的野生型序列的掩飾。在由通過一個融合產生的雜交體細胞中,每一染色體的各等位基因可分離開。可以以明確的方式對來自雜交細胞的核酸分析突變。將這種方法用于檢測先前難于遺傳診斷的兩種引起癌癥的突變。研究的家族之一(Warthin家族G)是具有生物醫學文獻中描述的遺傳性結腸癌綜合癥的第一個家族。
文檔編號C12Q1/68GK1384887SQ00814879
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月6日 優先權日1999年10月8日
發明者B·沃戈爾斯滕, K·W·金澤勒, H·炎, N·派帕多普勒斯 申請人:約翰斯霍普金斯大學