靶向人工基因導入的制作方法

專利名稱：靶向人工基因導入的制作方法
背景技術：
1.發明領域本發明提供了用于針對靶細胞的細胞特異性基因導入的改良載體。根據本發明，所述載體包括一個重組核心和一個包繞該核心的人工重建表面，所述重組核心含有將被導入的遺傳物質。所述表面使載體的定位和細胞融合都更加容易，同時還為載體提供了免疫保護功能。本發明還公開了制備這些載體、以及應用這些載體轉染真核細胞的方法。
2.相關技術描述基因治療得到廣泛關注的原因是它有潛力為多種人類疾病提供有效治療，這些疾病包括少見的遺傳性缺陷以及常見病，如腫瘤、艾滋病、高血壓、動脈硬化和糖尿病。迄今為止，充分發揮基因治療巨大潛力的障礙是缺乏高效的載體系統體內或活體外將基因構建物導入細胞。
對于傳統藥物的靶向導入，基因治療的一個目標是在基因導入的局部發揮最大療效，同時使潛在的系統性副作用最小化。為了達到這個目標，理想的基因導入載體應該具有幾個特征。首先，載體應該能夠到達有機體內的靶位點，優選能夠識別特異性細胞類型。這需要載體具有較低的免疫原性，并具有較好的定位特征。其次，載體應該能夠跨越宿主細胞的膜屏障，將其治療性基因物質導入細胞內。在絕大多數情況下，現有載體系統足夠大，可以調節所需基因構建物的導入。第三，一旦進入細胞，載體必須能夠卸載其基因負荷，并允許有效基因表達。表達優選是細胞特異性的，并在整體水平沒有害處。在絕大多數申請中，載體不應具有自主復制其自身DNA的能力。第四，在需要時，載體應該在較長時期內提供可以控制的持續基因表達。第五，載體應該可以大規模商業生產，并以藥用、濃縮形式流通。
目前可以獲得的用于基因治療的載體系統中，沒有一種滿足上述所有特征。因此，基因治療的進展在很大程度上有賴于新型改良基因載體系統的開發。
目前，體內治療性基因導入最常用的方法是病毒導入系統和陽離子聚合物或基于脂質的系統。在基于病毒的系統中，在操作性用于導入治療性基因的遺傳修飾病毒中，保留病毒滲透細胞的天然能力。在聚合物或基于脂質的系統中，應用一種或多種陽離子聚合物和/或陽離子脂質濃縮治療性DNA，然后利用攜帶副電荷的細胞和攜帶正電荷的基因導入顆粒之間的吸引力，進行細胞導入。在當前大多數申請中，還沒有實現特異性細胞類型的定向。
病毒載體作為一類，具有幾個顯著劣勢，如不能有效逃逸宿主免疫系統的攻擊，局限于能被感染的細胞類型，難以制備高滴度載體，包裝大型DNA或RNA分子的能力有限，并可能整合進入宿主基因組，這有利于穩定表達，但可能在基因組功能位點產生有限的不欲插入，雖然機會較小。應用裝載到其他物質，如聚合物或脂質中的核酸進行基因轉移具有體外轉染廣譜宿主細胞的能力，但在體內導入過程中仍然面臨很多問題，如不能逃逸免疫系統，缺乏細胞特異性，由于缺乏進入機制使其進入細胞的效率很低，一旦進入細胞，載體的卸載效率也很低。
聯合應用病毒和非病毒元件可以增加基因轉移到細胞的效率。例如，Fasbender et al(J.Biol.Chem.2726479-6489(1997))指出，為了增強裝載DNA的導入效率，可以將腺病毒溶酶體降解逃逸功能與人工包裝的DNA制劑相結合。另一個聯合應用病毒與非病毒元件的示例是應用包括腺相關病毒(AAV)反轉末端重復(ITR)序列的質粒與陽離子脂質體，基因轉移后，白細胞介素-2(IL-2)的基因表達水平比沒有ITRs的質粒高3-10倍。Viewet et al.，Cancer Research 552366-2372(1995))。在另一個實施例中，應用腺病毒衣殼蛋白或腺病毒纖維蛋白與脂質體聯合，使報道基因的轉染效率提高。Hong et al.，Chinese Medical J.108332-337(1995)。
盡管最近在這些方面有了發展，但現存的靶基因導入方法中沒有一種同時滿足以下條件，免疫原性低，載體穩定性高，靶序列多功能性充分，以及基因表達效率高。因此，本發明的一個目標是克服本領域現存的這些難點，提供靶基因導入和表達的多功能載體。
發明簡述因此，本發明的一個目標是提供一種改良的非天然基因治療載體，用于將核酸細胞特異性導入到靶細胞中。
本發明的另一個目標是通過給患者應用治療有效劑量的所述載體，提供治療患者疾病的方法。
為達成這些以及其他目標，根據本發明的一個方面，提供了非天然基因治療載體，該載體包括一個重組核心和一個非天然表面功能等分，所述核心包括一個核酸分子，所述載體的至少一個表達產物是治療性核酸、肽或蛋白，所述表面功能等分包括至少一個功能元件，該功能元件選自免疫保護元件、靶元件和細胞進入元件，并且所述載體能夠與靶細胞特異性結合，并能將核心導入靶細胞。
根據本發明的一個實施方案，核心還包括至少一個病毒衣殼蛋白。在另一個實施方案中，表面功能等分包括一個免疫保護元件。在另一個實施方案中，表面功能等分包括一個靶元件。在另一個實施方案中，表面功能等分包括一個細胞進入元件。在另一個實施方案中，表面功能等分包括一個免疫保護元件、靶元件和細胞進入元件。
根據本發明的一個方面，免疫保護元件可以是合成聚合物等分。該合成聚合物組分可以包括聚(乙二醇)。該合成聚合物組分還可以包括谷氨酸與亮氨酸的共聚物。
根據本發明的另一個方面，靶等分與受體結合，該受體在病態細胞中的表達較正常細胞高。所述靶等分可以是細胞表面受體的肽配體或擬肽配體。
根據本發明的另一個方面，細胞進入元件是膜去穩定等分。該膜去穩定等分可以包括一個兩親性的α螺旋。該兩親性α螺旋可以來自病毒env蛋白的C末端功能區。在一個特定實施方案中，該C末端功能區是Moloney白血病病毒env蛋白的C末端功能區。該C末端功能區可以包括Moloney白血病病毒env蛋白的598-616氨基酸。在另一個實施方案中，膜去穩定等分包括一個谷氨酸與亮氨酸的共聚物。
在以下詳細描述中可以清晰了解本發明的其他目標、特征和優勢。但是，應該理解，詳細描述和特定實施例雖然指示了本發明優選實施例，但是僅以一種舉例說明的方式給出，因為對于本領域技術人員來說，基于該詳細描述，可以在本發明主旨和范圍內，輕易進行多種變化和改良。
附圖簡述


圖1是TAGD顆粒表面的示意圖，該表面包括一個免疫保護元件(PEG)，成融元件(膜去穩定肽)和細胞結合元件(靶肽)。
圖2顯示了兩種將配體整合到表面以產生TAGD顆粒的不同方法。
圖3顯示了將病毒顆粒與含有DSPE-PEG-若丹明的微膠粒孵育后，與病毒顆粒相關的DSPE-PEG-若丹明(紅色熒光)。
圖4顯示了能夠與人類黑色素瘤D10細胞結合的化學修飾病毒MoMuLV，而未經修飾病毒無法與該細胞結合。所述修飾病毒包括一個含有α-MSH擬肽配體的多功能、多價接頭。
優選實施方案詳述本發明為基因治療提供了新型改良組合物和方法。特別是提供了靶向人工基因導入(”TAGD”)載體，包括包繞重組病毒顆粒(核殼體)或重組核心的多功能人工表面等分。
該功能表面包括的分子元件使該載體能夠逃逸宿主免疫系統，識別特定靶細胞并與之結合，并可與靶細胞有效融合，將核心基因復合體編碼的轉基因導入靶細胞中。該表面分子元件可以包括，例如，多個肽分子和免疫保護元件。本發明還提供了應用新型組合物和方法治療遺傳性疾病的方法。
在一個實施方案中，本發明提供了多種載體，其中重組病毒的現存脂質包膜等分經過修飾，來增強或提供病毒顆粒的所需特征。例如，病毒表面可以操作性增加免疫保護元件，例如聚合物基團，如聚(乙二醇)(PEG)，該元件可以減弱病毒顆粒的免疫原性，并增加載體在血循環中的穩定性。該表面還可通過添加靶配體來修飾，增強病毒的細胞特異性。例如，應用下面將詳細描述的方法，對表面進行工程修飾，使之包括一個配體分子，該配體可以與靶細胞表面的所選受體特異性相互作用。
在另一個實施例中，表面經修飾，包括能夠增強載體細胞進入特征的元件。特別是可以應用成融肽、蛋白或聚合物，來增強載體進入靶細胞的能力。成融等分促進載體與靶細胞細胞膜的融合，使病毒核心進入細胞質更加容易。成融等分可以是天然的融合基因，如病毒成融肽，也可以是工程(非天然)等分，如含有膜活性兩親性α螺旋或其他構型特征的肽，這些肽可以使膜去穩定。此外，成融等分還可以是一種使膜去穩定的聚合物。
在每一個實施方案中，對基因導入顆粒現存表面的修飾可以是非共價修飾，其中通過化學結合修飾包括功能等分的脂質被整合到含有顆粒的核心表面上。該整合過程可以通過，例如微膠粒的形成來完成，所述微膠粒包括所需修飾等分，并且可以應用本領域熟知的方法，使微膠粒自發地與顆粒表面融合。非共價修飾還可通過靜電和/或疏水(van derWaals)作用，將功能組分吸附到顆粒表面上。
此外，修飾還可以是對基因導入顆粒的表面組分進行共價修飾。因此，例如，對于有包膜的病毒，病毒表面的膜脂質可以與化學激活的接頭進行連接，隨后可以共價附加修飾基團。膜糖蛋白上的糖基可以應用本領域眾所周知的方法進行化學氧化，產生反應性醛基，該基團允許應用，例如，含有游離氨基的聚合物質或肽進行共價修飾。其他共價修飾膜組分的方法是本領域眾所周知的。
在另一個實施例中，現存病毒表面可以通過與活化的化合物反應，來對脂質和/或蛋白組分進行化學修飾。活化的接頭化合物包括但不限于高反應性化學基團的結合，例如修飾氨基的硫酰鹵化物和/或多種活性羧酸酯；修飾碳水化合物的酰肼；修飾巰基的馬來酰亞胺基或反應性烷基鹵化物；以及本領域熟知的光敏性基團。經驗豐富的技術人員應該理解，應用其他化學活性基團也屬于本發明范疇。
此外，基因導入顆粒表面的功能基團還可應用本領域眾所周知的方法進行化學修飾，以產生反應性和/或化學選擇性基團，這些基團允許應用，例如含有游離氨基的聚合物質或肽進行共價修飾。一個特定實施例就是應用2-iminothiolane(Traut’s試劑)對病毒表面進行修飾，該試劑將病毒表面易接近的氨基轉變為巰基。通過應用結合的巰基選擇性方法，可以增強修飾的選擇性。應用Traut’s試劑修飾病毒表面還提供了一種非常方便的評估多種病毒化學修飾最佳有效水平的手段。如果化學修飾水平太低，病毒表面特征就不會按預期發生變化，而修飾水平太高，則可能使病毒沒有活性。本發明的發明人員發現，即使是非常不穩定的Moloney白血病病毒，也可以在不顯著功能性喪失病毒滴度的情況下，在其表面攜帶高負荷的化學物質。化學修飾后檢測病毒滴度的方法是本領域熟知的。
在另一個實施方案中，欲引入載體的功能基團，如PEG或靶肽或成融肽，首先與一個激活的接頭結合。該接頭優選擁有疏水位點，可以更好地與基因導入顆粒的表面親和。例如，可以應用谷氨酸與亮氨酸的共聚物(將在下面給予更加詳盡的描述)。接頭還可以攜帶正電荷，是其能夠與細胞表面更好地親和。可以保留(或重新創建)部分活性基團，用于將接頭共價附加于顆粒表面上。例如，該接頭可以在不將脆弱的病毒暴露于過度化學處理的情況下，以多種方式修飾病毒表面。
圖1是TAGD顆粒表面的示意圖，該表面包括一個免疫保護元件(PEG)，成融元件(膜去穩定肽)和細胞結合元件(靶肽)。圖2顯示了兩種將配體整合到病毒表面的不同方法。
在另一個實施方案中，提供的載體包括一個位于表面內的重組核心，該表面是重新制備的。該實施方案適用于病毒核心顆粒，無論該顆粒是否包括現存的膜。因此，例如，一個缺乏外膜層的重組病毒顆粒可以裝載到人工生成的脂質膜中。含有外膜層的重組病毒顆粒可以通過下述方式進行修飾，如(i)化學方法，(ii)裝載到新的膜中，或(iii)置換現有膜，這樣，重組病毒顆粒就包括重新合成的表面元件。因此，所得顆粒的表面可以工程修飾，包括如上所述的免疫保護劑，成融劑和細胞特異性增強劑。此外，該膜還可以包括增強載體在宿主循環中穩定性的組分，進而增加載體到達預期靶目標的機會，并為載體長時程發揮作用提供機會。
病毒核心載體的病毒核心等分可以是適用于基因治療的任何重組病毒核心。應用本領域眾所周知的方法，可以制備大量適用的病毒核心，這些病毒核心可以用作TAGD載體的內部組分。用于基因治療的病毒示例見Jain，“Textbook of Gene Therapy”，Chapter 4，pp.35-66(Hogrefe & Huber，1998)。適宜的病毒核心包括重組病毒，例如復制缺陷性慢病毒，如HIV，或其他逆轉錄病毒，例如鼠白血病病毒(MLV)如Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)或Friend MLV，腺病毒，腺相關病毒(AVV)，I型單純皰疹病毒(HSV-1)，牛痘病毒，EB病毒，狂犬病和假狂犬病病毒，Sindbis病毒，SV40，以及巨細胞病毒，流感病毒，桿狀病毒，Semliki森林病毒(SFV)，以及皰疹性口炎病毒(VSV)等。如果需要，這些病毒可以工程修飾，使之缺乏功能性env基因。通過重組方法去除env基因可以降低病毒的免疫原性，并可在細胞培養過程中增加病毒顆粒的生產水平。除去env基因的病毒缺乏與靶細胞結合并融合的天然能力。因此，這些能力必須由TAGD載體提供。
制備每一種含有適用于基因治療的外源性基因的病毒核心的方法，以及為增加安全性，去除或取代天然病毒基因組中較大片段的方法，都是本領域眾所周知的。見，例如Jain，supra，Anderson，Nature，392(6679Suppl)25-30(1998)；Verma et al.，Nature，389239-42(1997)；WO91/19798；WO 97/12622；WO 98/12314；以及美國專利號5,665,577和5,686,279。還見，Fields et al.，“Virology”(Lippincott-Raven，1996)。
經驗豐富的技術人員應該認識到，本文描述的方法和組合物還可能適用于將來應用病毒核心類似物(核酸)研發核心。
免疫保護元件在本發明上下文中，免疫保護元件是存在于載體表面并進而降低載體免疫原性的分子或分子集合。也就是說，當載體用于患者時，該元件可以降低載體與患者血清組分的相互作用，因此可以避免免疫系統的激活，降低載體在患者中的體內清除率。
免疫保護策略的示例包括降低藥物導入顆粒的電荷和/或其分子量，以及通過糖基化降低顆粒的親水性。最常應用的方法是在顆粒的表面附加“免疫誘導”元件，降低血清中調理素對顆粒的識別，進而延遲或避免免疫系統的完全激活。將誘導聚合物附加到藥物導入載體上的一種方法是通過聚合物與脂質的結合。最常用于此目的的聚合物是聚(乙二醇)(PEG)(Papahadjopoulos et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1511460-4(1991))。用于同一目的的其他元件是硅酸GM1聚二醇(Schauer，TIBSSept.1985357，Yamanauchi et al.，J.Controlled Release 113141(1995))；聚唑啉-DSPE(二硬脂酰磷脂酰氨基乙醇)衍生物(Zalipsky et al.，J PharmSci.85133-7(1996))，基于聚合物的“stealth”方法(Torchilin et al.，JPharm Sci.841049(1995))，磷脂酰聚二醇(Maruyama et al.，BiochimBiophys Acta.123474-80(1995))，fleximer聚合物(Papisov.Adv.DrugDelivery Review 32，119-138(1998)；Torchilin J.Microencapsulation 15；1-19(1998))。其他免疫保護元件包括但不限于聚谷氨酸，聚乳酸，聚羥基乙酸，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲丙烯酰胺，聚乙基唑啉，聚甲基唑啉，以及聚乙烯乙醇。如上所述，與PEG相似，如果必要，每種親水聚合物都可通過反應性化學基團與載體共價結合。本發明還提供了一種基于谷氨酸和亮氨酸共聚物的新型結合接頭，可用來在顆粒表面引入所需功能，并具有免疫保護功能。本領域經驗豐富的技術人員應該認識到，谷氨酸含有一個親水的羧基側鏈，而亮氨酸則含有一個疏水側鏈。每種組分都可應用具有相同功能特征的其他組分取代。因此，谷氨酸可被，例如天門冬氨酸取代，亮氨酸可被，例如丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和其他疏水氨基酸取代。可以應用天然氨基酸，也可應用非天然氨基酸。此外，疏水功能可以谷氨酸酯或氨基衍生物的形式引入。應該指出，隨機共聚物和/或阻斷共聚物可用于類似目的。
當PEG用作免疫保護元件時，優選PEG分子量大約為1,000-5,000道爾頓。優選地，分子量大約為2,000道爾頓的PEG可以用來獲得免疫保護。為了將含有反應性功能基團的PEG鏈定位于含有藥物導入載體的膜表面，PEG可以與磷脂結合，例如二硬脂酰磷脂酰氨基乙醇(DSPE)。技術人員應該清楚，應用其他脂質也屬于本發明范疇。含有可以進一步修飾的PEG的適宜DSPE-PEG分子是本領域眾所周知的，也可從，例如Shearwater Polymers(Huntsville，AL)處購買。
可以通過微膠粒形成將免疫保護元件整合到基因導入載體的表面中，所述基因導入載體如膜包繞的病毒核心。見，例如Uster et al.，Febs Lett.386243(1996)。DSPE-PEG分子是兩親性分子，可自發形成熱力學不穩定的微膠粒，并與病毒顆粒的較大膜表面融合。以該方式進行的成功插入可以通過下述方法進行檢驗。應用同位素標記的顆粒還可監測免疫保護元件的整合對顆粒在血中清除率的影響。
對于靶基因導入來說，多價多功能接頭有很多優勢。如下所述，基于激活的酸性、疏水性氨基酸共聚物，如谷氨酸和亮氨酸，及其功能等價物，本發明提供了一種新型多價多功能接頭。這種接頭的激活可以在第三種胺存在的情況下，通過聚合物與二-五氟苯基碳酸鹽的反應進行。經驗豐富的技術人員應該清楚，應用其他激活手段，如N，N-二環己基碳二酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺，BOP試劑，以及應用其他肽化學領域已知的濃縮試劑也屬于本發明范疇。然后可以將所需功能基團如PEG或靶肽或成融肽結合到激活接頭上。該接頭擁有疏水位點，可以更好地與病毒膜親和，并保留一些正電荷，以更好地與細胞表面親和。可以保留(或重新創建)活性基團的一些部分，用來把接頭共價附加到載體上。該接頭可以在不將脆弱的病毒暴露于過度化學處理的情況下，以多種方式修飾病毒表面。
靶元件靶元件具有將載體高度特異性附加到靶細胞膜上的潛力。例如，靶元件可以是包括一個結合區的靶肽，該結合區可以與靶細胞表面的受體或配體結合。靶元件可以選自抗體或其片段，受體配體，完全蛋白，肽，受體，作為配體的非肽有機分子，維生素，以及細胞表面蛋白的無機輔因子。優選地，靶元件可以與所需宿主細胞上高度表達的受體結合，所述宿主細胞是基因治療的靶細胞，例如腫瘤細胞。
適宜的配體包括但不限于，靶細胞是內皮細胞的血管內皮細胞生長因子，靶細胞是血管的FGF2，靶細胞是表達整合素細胞的層粘連蛋白和RGD肽。其他實施例包括(i)葉酸，其中組合物欲用來治療具有細胞表面葉酸受體的腫瘤細胞；(ii)pyridoxyl，其中組合物欲用來治療病毒感染的CD4+淋巴細胞；或(iii)唾液酸-Lewis0X，其中組合物欲用來治療炎癥區域。在一個優選實施方案中，靶等分是擬肽。見，例如，Kieber-Emmonset al.，Current Opinion in Biotechnology 8，435-441；Haubner et al.Angew.Chem.Int.Ed.Engl 36，1374-1389(1997)；Pauletti et al.，Adv.DrugDelivery Reriew.27，235-256(1997)；Boxus et al.，Bioorganic and MedicinalChemistry.6，1577-1595(1998)；Schoepfer，Bioorg.Med.8，2865-2870(1998)。
在一個優選實施方案中，擬肽指向腫瘤細胞上的受體或其他靶目標。例如，α-促黑激素抑制素擬肽類似物，([Nle4，D-Phe7]-α-MSH)，可以用來治療黑色素瘤，其中黑色素瘤細胞過量表達α-MSH受體。本領域其他腫瘤相關性擬肽也是已知的，屬于本發明范疇。見，例如Kieber-Emmons et al.，1997，supra；Haubner et al.，supra。業已有描述認為，神經緊張素和纖維蛋白溶酶原激活因子的受體結合部位是腫瘤相關配體(Schnierle and Groner，Gene Ther.31069-73(1996))。其他靶配體在美國專利號5,916,803中有描述，該專利在此全文引入，作為參考。
在本發明另一個實施方案中，可以應用本領域眾所周知的噬菌體顯示法選擇適宜的肽配體。適宜的方法在，例如美國專利號5,780,221中有所描述，該專利在此全文引入，作為參考。簡而言之，編碼隨機序列肽和預選長度肽的短核酸序列丈庫與編碼絲狀噬菌體表面蛋白的基因框架融合，所得肽在噬菌體表面表達(顯示)。然后在適宜條件下，篩選噬菌體與靶分子的結合能力，如固定在固體支持物上的細胞表面受體。可以應用大型噬菌體文庫，這樣可以同時篩選大量肽序列的結合特性。分離具有所需結合特性的噬菌體，測定編碼相應肽配體的核酸序列。這些肽可以作為配體直接用于本發明的方法，或者可以作為模板，用來設計、合成用作靶元件的擬肽。
TAGD載體表面靶等分的數量可以根據以下因素而有差異，所述因素如配體受體相互作用的強度，靶細胞表面受體的相對充裕度，以及靶細胞的相對充裕度。但是，可以預見，每個載體表面必須至少存在20-100個靶分子，才能適宜增強細胞定向。可以應用多種方法將靶等分整合到TAGD載體表面中，例如，通過熱動力學不穩定微膠粒作為媒介，以后將給予詳細描述。此外，靶等分還可應用多接頭來添加，與上述將PEG添加到載體表面的方式相同。在一個實施方案中，靶等分通過標準接頭化學與表面結合。見例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques(PierceChemical Company/Academic Press，San Diego，p785(1996))。
例如，對于含有脂質結合聚合物的表面，靶等分可以通過“獻者-受者”反應類型，與脂質聚合物結合物發生化學結合。因此，在一個實施例中，設計的靶等分攜帶一個游離巰基(獻者)，該巰基可以與脂質結合聚合物上存在的馬來酰亞胺基(受者)發生反應。反應的進展可以通過應用Ellman’s試劑，在300nm處觀察UV吸收的減少來監測，吸收減少是由于發色基團馬來酰亞胺的喪失以及游離巰基的喪失。還可應用本領域已知的其他結合方法，例如，應用親核胺基(獻者)與激活的羧基，如N-羥基琥珀酰亞胺基酯(受者)結合。經驗豐富的技術人員應該理解，獻者等分可以存在于顆粒表面，受者存在于靶等分，如果需要，反之亦然。同樣，靶等分可以與TAGD載體的脂質膜直接結合，或者與載體的脂質聚合物結合物組分直接結合，或者與存在于載體上的任何其他適宜表面等分直接結合。
一旦以這種方式結合，還需確保靶等分依然保留與所需靶細胞結合的能力。這一點可以通過應用本領域已知的方法進行。例如，可以比較非結合靶等分與其同類受體的結合能力，以及結合等分的結合能力。這一比較可以應用已經裝配的TAGD載體進行，但在整合到TAGD載體前比較結合與非結合等分會更加方便。在靶等分與裝配或部分裝配的載體的一個或多個組分直接結合的情況下，可以通過進行模型反應完成該比較，在模型反應中，靶等分與載體的一個或多個組分結合，然后將獲得的模型化合物與未結合靶等分進行比較。
本發明提供了一個間接結合法實施例，通過考慮促黑激素抑制素(α-MSH)化合物，檢驗了結合靶等分依然保留了與其靶目標結合的能力。因此，可以合成具有馬來酰亞胺功能的α-MSH，能夠與含有巰基(SH)的DSPE、PEG結合物結合。然后，以相同的納摩爾濃度，比較α-MSH、DSPE-PEG-SH和DSPE-PEG-α-MSH結合物在黑色素瘤B16細胞中誘導黑色素形成的能力。結果發現，結合肽與非結合α-MSH肽具有相似的能力。
如上所述，利用微膠粒與較大膜表面融合的能力，可以將結合物整合到TAGD載體中。適宜的方法在Kirpotin et al.(FEBS Lett.388115-8(1996))中有所描述。還見Uster，supra。例如，可以應用脂質-PEG-125Iα-MSH結合物與MoMuLV病毒顆粒共同孵育。獲得的病毒顆粒首先通過階梯蔗糖梯度離心純化，然后應用不連續梯度離心純化。結果發現，同位素計數高與含有病毒顆粒的片段相關。在另一個實施例中，應用相同類型的微膠粒可以將紅色熒光物質DSPE-PEG-若丹明等分整合到病毒顆粒中。MoMuLV與DSPE-PEG-若丹明共同孵育，然后與鼠或人細胞結合。然后將細胞與抗MoMuLV env抗體共同孵育，隨后加入FITC標記的二抗(綠色熒光)。獲得的細胞可以應用FACS分析。結果發現，在含有病毒受體的鼠細胞上可以特異性探測到這里作為追蹤劑的若丹明信號，而在缺乏鼠病毒結合受體的人類細胞上則探測不到非特異性信號。
為了顯示將靶等分整合到TAGD載體后可以改變載體的細胞結合特異性，如上所述，可以將DSPE-PEG-α-MSH結合物與MoMuLV病毒顆粒共同孵育，然后檢測其與人類黑色素瘤D10細胞結合的能力。使修飾和未修飾的MoMuLV顆粒與D10細胞結合，然后應用上述方法檢測Moloney env特異性FITC信號的存在。結果發現，自身不能與人類細胞結合的鼠病毒MoMuLV，在經過脂質-PEG-α-MSH結合物預處理后，可以與人D10細胞結合。但是，表面不含DSPE-PEG-α-MSH的MoMuLV，卻沒有檢測到結合。這些結果顯示，應用適宜的結合等分，可以改變TAGD顆粒的結合特性。本領域技術人員應該認識到，該實施例只是舉例說明，并應理解，這一結果具有廣泛的適用性。
細胞進入元件細胞進入元件通過提供膜活性組分，在TAGD載體和靶細胞之間形成融合，進而幫助TAGD載體進入宿主或靶細胞。因為在靶藥物導入中效率的主要限制因素是跨越靶細胞膜，因此具有功能性細胞進入元件的TAGD載體能夠進入靶細胞，并高效導入治療性化合物。
優選地，細胞進入元件是成融等分，如肽，即具有膜去穩定能力的肽。成融肽的存在可以通過破壞膜磷脂的有序包裝而誘導細胞膜上孔的形成。一些成融肽可以促進脂質紊亂，并以該方式增加位置鄰近的膜的合并或融合機會，所述位置鄰近的膜可以是兩個膜包裹的多種性質的顆粒(如細胞，有包膜病毒，脂質體)。其他成融肽可以同時粘附到兩個膜上，導致膜的合并，并促使它們合而為一。成融肽的示例包括來自病毒包膜蛋白外功能區的融合肽，來自病毒胞漿尾包膜蛋白膜鄰近功能區的膜去穩定肽。
其他成融肽通常還包括一個兩親性區。含有兩親性區的肽的示例包括蜂毒素，爪蟾抗菌肽，HIV1 gp41的胞漿尾，微生物和爬行動物的細胞毒肽，如bomolitin 1，pardaxin，肥大脫粒肽，crabrolin，殺菌肽，內阿米巴屬和葡萄球菌的α毒素；來自下述區域的病毒融合肽，(1)病毒包膜蛋白跨膜(TM)功能區的N末端區域，如HIV-1，SIV，流感病毒，脊髓灰質炎病毒，鼻病毒和柯薩奇病毒；(2)TM外功能區的內部區域，如semliki森林病毒，sindbis病毒，輪狀病毒，風疹病毒和來自精子蛋白PH-30的融合肽；(3)鄰近病毒包膜蛋白胞漿側的膜區域，如禽白血病增生病毒(ALV)，貓免疫缺陷病毒(FIV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，以及脾壞死病毒(SNV)。
在有疏水表面如膜存在的情況下，這些成融肽通常會傾向形成兩親性α-螺旋結構。技術人員應該理解，兩親性肽就是這樣一種肽，其一側為疏水端，另一側為親水端。一方面，成融肽序列取自病毒包膜蛋白的一部分，是包膜蛋白跨膜部分的5’越膜片段。
在天然病毒中，感興趣兩親性片段位于包膜蛋白跨膜部分越膜片段疏水區之后，長度通常大約為20個氨基酸。本發明成融肽的長度通常多種多樣。在一個實施方案中，這些肽包括一個兩親性氨基酸序列，大約有12-35個氨基酸殘基。疏水的越膜片段通常在其近胞漿端包括一個甘氨酸或脯氨酸，一般與轉折結構相關。這些近膜片段的兩親性可以通過計算它們的疏水力矩來鑒定。這些近膜兩親性片段的示例見附錄2。
在另一個實施方案中，成融肽包括一個衍生自上述氨基酸序列與上述氨基酸序列類似的氨基酸序列。衍生或類似的氨基酸序列相較于上述氨基酸序列，至少有一個氨基酸殘基的取代。在一個實施方案中，成融肽包括一個來自上述包膜蛋白胞漿部分的氨基酸序列，并進一步包括至少一部分跨膜蛋白。
表1給出了來自病毒的代表性成融肽示例。表1中，負數指病毒包膜蛋白預期跨膜區C末端區域的氨基酸殘基，正數指肽中病毒包膜胞漿尾從N末端開始的殘基數量。跨膜功能區和胞漿功能區的交界是在病毒包膜蛋白外功能區N末端延展大約20個疏水氨基酸后的第一個親水氨基酸。因此，例如，一個標記為“-2/14”的肽提示，分離的肽包括(以N末端到C末端的方向)，如N末端的最先兩個氨基酸殘基，預期跨膜部分的兩個C末端氨基酸，以及最后14個氨基酸殘基是預期胞漿尾的N末端14個氨基酸。表1列出了在很多病毒包膜蛋白中，最具有兩親性特性的近膜片段的位置。
表1還應用了下述縮寫ALV-禽白細胞增生病毒；BLV-牛白血病病毒；EIA-馬感染性貧血；FIV-貓免疫缺陷病毒；HEP C-丙型肝炎；HIV-人類免疫缺陷病毒；HTLV-人類T細胞白血病病毒；hRSV-人類呼吸道合胞病毒；infM2-流感M2病毒；INF-流感；MMTV-鼠乳腺腫瘤病毒；MPMV-Mason Pfizer猴病毒；RSV-Rous肉瘤病毒；PINF-副流感；SNV-脾壞死病毒；VSV-皰疹性口炎病毒；SimSrcV-HLB-猿肉瘤病毒；MoMuLV-Moloney鼠白血病病毒。
表1
在一個優選實施方案中，成融肽是MoMuLV包膜蛋白(env)的近膜胞漿功能區。該功能區在多種病毒中結構特征保守，并包括一個膜誘導α-螺旋。該肽在共同未決的申請序列號09/112,544中有所描述，該申請在此全文引入，作為參考。
在另一個實施方案中，使用谷氨酸與亮氨酸的共聚物作為成融元件。這些共聚物是強有力的pH依賴性親水/疏水構象載體，可以用來將多種物質導入細胞。見WO 97/40854，在此全文引入，作為參考。但是，這些共聚物業已顯示的膜跨越和膜干擾特性在本發明背景中卻用于不同的目的。與基因導入顆粒表面粘附的共聚物，不是將物質導入細胞，而是作為pH依賴性成融因子和/或多價、多功能載體發揮其他所需功能(成融，免疫保護，靶功能等)。依賴于谷氨酸和亮氨酸或其他疏水(天然或非天然)氨基酸的共聚物的pH依賴性接頭的成融特征，可以通過應用上述成融肽而得到進一步增強。
體外裝配載體一種裝配TAGD載體的方法是通過應用微膠粒制劑，所述微膠粒制劑包括欲添加到載體上的元件。因此，例如，如上所述，可以將靶配體和成融元件共價連接于聚合物脂質化合物上，然后應用獲得的結合分子制備微膠粒。將這些微膠粒添加到核心等分制劑中，這樣結合體就會插入到核心等分的表面中。相似的“擴散交換”法在例如美國專利號5,631,018中有所描述，該專利在此全文引入，作為參考。
其他可用來裝配TAGD的方法在本領域已知。例如，一種修飾天然病毒包膜的方法是通過雙重去污劑透析，如美國專利號5,766,625所述，該專利內容在此全文引入，作為參考。病毒包膜的脂質可以通過應用下述制劑來修飾，所述制劑如可以部分溶解包膜的脂質和/或免疫保護聚合物以及去污劑，如膽酸鈉。然后應用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)充分透析以去除去污劑，之后再應用脫氧膽酸鈉或其他適宜去污劑通過部分微膠粒形成插入成融等分和/或靶等分。隨后再次通過充分透析去除去污劑。
術語“部分微膠粒形成”是指“軟化”的病毒膜，這樣可以整合添加的免疫保護脂質或聚合物組分，但是病毒膜還沒有溶解(微膠粒化)到喪失雙層結構的程度。部分微膠粒形成過程可以通過應用激光散射裝置監測囊泡的光散射來控制。將充足的去污劑引入囊泡散射系統以維持光散射信號。光散射信號的消失提示完全溶解，雙層結構喪失。在一個實施方案中，部分微膠粒形成后，可以通過測定病毒滴度來檢驗TAGD顆粒的完整性。
有用的去污劑對于本領域技術人員來說是眾所周知的，包括但不限于膽鹽(膽酸鈉，去氧膽酸，牛磺膽酸)，CHAPSO，辛基配糖物，TRITON-X衍生物等。這些去污劑可以是兩性離子的，如CHAPSO，或非離子的，如辛基配糖物和Triton-X。優選非離子去污劑，因為它們不太容易導致TAGD顆粒完整性的喪失。在決定選擇去污劑的時候，應該考慮特定去污劑與插入表面蛋白之間的兼容性。
在一個實施方案中，裝配TAGD載體的另一種方法是將一個或多個免疫保護元件、靶元件和細胞進入元件共價連接到病毒顆粒表面存在的病毒蛋白上。因此，例如，制備的添加元件可以攜帶活性羧基，這樣可以與病毒蛋白賴氨酸分子的側鏈游離氨基發生反應。將分子連接于蛋白的其他方法是本領域眾所周知的。例如，表面賴氨酸分子的側鏈可以與2-iminothiolane(Traut’s試劑)發生反應，產生游離巰基。然后，這些基團可以與攜帶馬來酰亞胺基的一個或多個免疫保護元件、靶元件和細胞進入元件發生反應。
制備含有新功能元件表面的TAGD載體的方法包括在添加脂質存在的情況下，超聲波降解或旋轉包膜病毒，這樣添加的脂質就會引入到已有脂質膜中(見，例如Huang et al.，Biochemistry.8344-52(1969)描述的方法)。含有所需新功能組分的TAGD載體還可在包括顆粒核心存在的情況下，通過脂質體形成來制備。這些方法包括應用去污劑透析的脂質形成(見Kagawa et al.J.Biol.Chem.2465477-5487(1971))；凍融法(見Mayer et al.Biochimica et Biophysica Acta 817193-6，(1985)and Bally etal inLiposomes as drug carriers，edited by Gregoriadis，G.Chichester-NY-Brisbaine-Toronto-SingaporeJohn Wiley & Sons，pp.841-854(1988))；反向蒸發(見Szoka et al.Biochimica et Biophysica Acta 601559-571(1980))。最后，亮氨酸和谷氨酸的阻滯共聚物顯示，可以象脂質一樣發揮作用，形成膜。見Minoura，Langmuir，142145-2147(1998)。因此，可以應用上述方法，利用這些阻滯共聚物作為膜元件用于TAGD載體。
當TAGD核心是逆轉錄病毒載體時，可以應用美國專利號4,661,022描述的方法進行大量生產和純化，該專利在此全文引入，作為參考。
載體的給藥方法TAGD載體的給藥方法是本領域眾所周知的。載體優選胃腸外給藥，更優選靜脈內或動脈內給藥。
體外檢測載體體外檢測本發明載體的方法是本領域眾所周知的。例如，載體可能包括一個報導基因或選擇標記，可以用來追蹤載體在靶細胞的成功插入和表達。例如，載體可以工程修飾包括一個報導基因，如β-半乳糖苷酶(β-gal)，氯霉素酰基轉移酶(CAT)，熒光素酶(luc)或綠色熒光蛋白(GFP)。然后將載體應用于靶細胞群，檢測報導基因產物的表達水平。為了對照，該表達還應與另一載體表達水平進行比較，所述載體或者缺乏靶配體或細胞進入元件之一，或者缺乏全部靶配體與細胞進入元件，以及一個或所有免疫保護元件。此外，載體還可包括一個耐藥標記，如新霉素耐藥基因。在將載體用于靶細胞之后，檢測細胞的耐藥性。
體內檢測載體效果體外檢測本發明載體效率的方法是本領域眾所周知的。例如，當載體用于治療哺乳動物某種疾病時，載體的效果可以通過研究該病一種或多種癥狀的改善得以確定。優選地，可以應用已經界定的臨床終點來確定體內效果，所述臨床終點是某種疾病的進展或程度特征。可以應用基因療法治療的疾病是本領域眾所周知的。見，例如Verma et al.，Nature 389239(1997)，以及該文引用文獻。
因此，通過參考下述實施例將更容易地理解概括描述的本發明，這里提供的實施例只是為了舉例說明，無意于限制本發明。
實施例下述實施例顯示，合成的功能等分可以插入到含有顆粒的核心表面。特別是，可以通過非基因手段功能修飾逆轉錄載體，使它在其表面上包括α-MSH擬肽配體。定向攜帶該配體的TAGD載體可以用于黑色素瘤的基因治療。此外，實驗還描述了逆轉錄顆粒的包裝。
有三種方法用來完成這些步驟(1)顆粒表面的直接修飾；(2)應用微膠粒媒介完成表面插入；以及(3)應用多功能多價接頭。這些方法利用的方法，以前曾用于制備脂質體結合體，以及將小型肽直接化學粘附于生活有機體表面。見Kashkin et al.，Immunologija N6，37-40(1987)and Author’s certificate USSR N 145085.A-61 K39/39(1988)。
載體分子與靶配體的結合通過將馬來酰亞胺基衍生物與靶配體上存在的巰基發生反應，可以獲得載體分子的結合。應用本領域眾所周知的方法，可以將PEG與磷脂酰乙醇胺結合，然后應用標準技術將之轉化為馬來酰亞胺衍生物(馬來酰亞胺基-PEG-PE)。獲得的化合物需要進一步與作為靶配體肽的半胱氨酸598-616肽(ILNRLVQFVKDRISVVQAL)結合。該結合反應可以利用馬來酰亞胺基基團在300nm處的吸收特性來監測。(Hermanson，supra)。脂質(即DSPE)-PEG-SH與α-MSH maleinidoylated類似物以及其他肽的結合也可以獲得類似結果，所述α-MSH類似物以及其他肽包括α-MSHNLD，一種MSH的擬肽類似物([Nle4，D-Phe7]-α-MSH，購自NovaBiochem，San Diego，CA)。
結合過程中肽的轉化水平可以根據馬來酰亞胺基基團的摩爾吸收值(630M/cm-1)來計算。反應的完全性可以應用Ellmann’s試劑，通過監測未結合巰基來確定。結合還可通過質譜分析(ES/MS and MALDI-TOF)來確定結合體中不包括未結合肽，所述未結合肽可能干擾進一步實驗的結果。制備好的結合體以微膠粒的形式，在質子惰性媒介中，通過凝膠過濾和透析進行純化。見Karnoup et al.，J.Peptide Res.49232-239(1997)。
通過在黑色素瘤B16細胞中黑色素形成實驗檢測發現，獲得的脂質-PEG-α-MSH結合體保留了生物活性。因此，在相同納摩爾濃度下，檢測了α-MSH，DSPE-PEG-SH和DSPE-PEG-α-MSH。α-MSH結合體誘導黑色素形成的效率與未結合α-MSH肽相似。
結合體與病毒顆粒的整合及細胞靶向在構建TAGD載體的下一步中，利用了熱力學不穩定微膠粒與較大膜表面融合的能力。該方法可以用于脂質聚合物靶配體結合體與脂質體(見Kirpotin，supra)或病毒顆粒(見下)膜表面的整合。
脂質-PEG-125Iα-MSH結合體與MoMuLV病毒顆粒共同孵育。經修飾的病毒顆粒首先通過階梯蔗糖梯度離心純化，然后應用不連續梯度離心純化。結果顯示，同位素計數高與病毒顆粒沉淀的相同片段有關。
為了進一步顯示該方法的效用，應用微膠粒將DSPE-PEG-若丹明(紅色熒光)與病毒顆粒相連。從而先將MoMuLV與DSPE-PEG-若丹明孵育，然后與鼠NIH 3T3細胞或人類D10黑色素瘤細胞結合。隨后將細胞與抗MoMuLV env抗體孵育，再加入FITC標記的二抗(綠色熒光)。應用FACS分析獲得的標記細胞(以及陰性對照細胞)。結果顯示(見圖3)，通過與微膠粒孵育，僅在病毒顆粒整合了結合體的情況下，在包括病毒受體的鼠細胞中特異性探測到若丹明信號(在右上象限的紅色熒光)。因此，與預期的一樣，DSPE-PEG-若丹明進入了MoMuLV顆粒，并可在鼠宿主細胞中檢測到。
接下來，將DSPE-PEG-α-MSHNLD結合體與MoMuLV病毒顆粒共同孵育，檢測結合體改變鼠逆轉錄病毒顆粒與人黑色素瘤D10細胞結合的能力。允許經修飾和未經修飾的MoMuLV顆粒與D10細胞結合，然后應用抗env一抗和FITC標記的二抗檢測這些細胞中Moloney env特異性信號的存在(如上所述)。FACS結果顯示，應用脂質-PEG-α-MSH預處理的MoMuLV，與人類D10細胞的結合存在正向漂移。但在陰性對照組中，應用脂質-PEG修飾但缺乏α-MSH的病毒顆粒沒有顯示與人類細胞結合的相似能力。這些實驗顯示，鼠逆轉錄病毒顆粒經α-MSH擬肽結合體表面整合修飾后，可以與人黑色素瘤細胞結合。因此，業已顯示，表面修飾顆粒可能使其改變，導向新的特異性宿主細胞。
還檢測了相同顆粒轉導人類細胞的能力。通過DSPE-PEG將α-MSH結合體連接到重組病毒顆粒表面(來自產eco細胞系GPE86/LNCX)，病毒滴度可達＞102，提示標記基因(neo和β-gal)的成功導入。在應用谷氨酸和亮氨酸共聚物將α-MSH提呈到MoMuLV表面時，病毒滴度可達＞104。在鼠NIH 3T3細胞中，野生型MoMuLV未修飾、未操作的顆粒滴度是10-6。下面將給出共聚物-MSH結合體的制備細節。
另一種創建TAGD載體的方法是應用化學結合，將功能肽、擬肽和聚合物直接或通過新型多功能、多價接頭連接于病毒顆粒表面。這些化學結合方法需要應用有機助溶劑，并應用其他反應性有機化合物處理，因此，首先必須建立的是能夠保留病毒活力的各種化學修飾試劑的工作濃度。應用多種有機溶劑和結合體處理病毒。結果發現，MoMuLV對有機溶劑的處理令人驚異的穩定，在應用高達5％(v/v)氰化甲烷或DMF處理30分鐘后，MoMuLV仍可保留幾乎全部感染性。這些結果提示，病毒能夠耐受對病毒顆粒進行化學修飾所必需的條件。
結果顯示，在應用Traut’s試劑修飾后，MoMuLV還能保留其感染性。這一點提示，可以通過應用Traut’s試劑修飾病毒表面，將結合體共價粘附于病毒顆粒上，然后使修飾病毒與馬來酰亞胺基化的化合物發生反應。結果發現修飾的最佳條件是Traut’s試劑大約為1-8mM。
進一步的實驗顯示，可以應用含90％谷氨酸(w/w)和10％亮氨酸的多功能多價接頭，將α-MSH擬肽配體整合到MoMuLV表面上。見，例如Bychkova et al.，Mol.Biol.(MoscoW)14278-286(1980)。簡而言之，將聚合物(100mg)溶解于含300mg二-五氟苯基碳酸鹽的2ml DMF中。將二異丙基乙胺(DIPEA)溶解于1ml DMF中，以0.1ml為單位緩慢加入。40分鐘后，用乙醚沉淀反應產物，然后用乙醚和戊烷清洗，并干燥。獲得的活性接頭(10mg)溶解于2ml DMF中。然后加入肽(α-MSHNLD，1mg)，再加入25ul DIPEA。室溫下搖動反應過夜，然后儲存于-20℃。以該方式加入接頭可以確保仍然保留一部分活性五氟苯酯，可以進一步與基因導入載體的表面結合。
然后在與上述DSPE-PEG-MSH相似的條件下，將該接頭-MSH結合體與病毒顆粒孵育。修飾后，應用Western印跡分析檢測MoMuLV顆粒，確定α-MSH整合到病毒顆粒中的情況。結果發現，α-MSH陽性信號與修飾病毒的env蛋白相關，但在未修飾病毒中沒有該信號，所述未修飾病毒作為陰性對照添加了未結合α-MSH。以該方式添加的MSH配體還成功改變了修飾MoMuLV顆粒的結合特異性。因此，含有多功能、多價接頭的化學修飾MoMuLV能夠與人類黑色素瘤D10細胞結合，而未修飾病毒則不能，所述接頭包括α-MSH擬肽配體。還發現，應用多功能接頭進行結合，較上述化學修飾要好。這些結果見圖4。
將MuLV顆粒再包裝到新型功能表面中該實驗顯示，基因導入顆粒，如病毒顆粒，可以用新型功能表面再次包裝。應用UV滅活的仙臺病毒提供這樣一個功能性再定向、成融包膜表面，將MoMuLV顆粒的基因物質導入新的宿主。仙臺病毒以前業已顯示，可以與赤裸的膜表面融合，并已作為成融脂質體組分用于基因導入(綜述見Nakanishi et al.，Journal of Controlled Release 5461-68(1998))。應用UV滅活的仙臺病毒與編碼綠色熒光蛋白(GFP)標記基因的MoMuLV融合。把MoMuLV加入培養的Hela細胞中，沒有檢測到GFP的表達。但是，融合了仙臺病毒的MoMuLV卻可以使人類Hela細胞(＞50cfu/ml)表達GFP，提示鼠病毒MoMuLV轉導了人類細胞系。因此，這些結果顯示，應用包括融合、再定向分子的人工表面可以再次包被核心。
權利要求
1.一種能夠將核酸細胞特異性導入靶細胞的非天然病毒基因治療載體，包括一個重組病毒核心，非天然功能表面等分，以及將所述重組核心與所述功能表面等分連接在一起的接頭，其中所述核心包括核酸分子；其中所述載體促進至少一種治療性核酸、肽或蛋白的產生；其中所述功能表面等分包括至少一種選自免疫保護元件、靶元件和細胞進入元件的功能元件；以及其中所述接頭包括至少一種選自多價聚合物和聚合物修飾脂質的元件；并且其中所述載體能夠與靶細胞結合，并能夠將所述核心導入靶細胞。
2權利要求1的載體，其中所述核心還進一步包括至少一種病毒衣殼蛋白。
3.權利要求1的載體，其中所述功能表面等分包括一種免疫保護元件。
4.權利要求1的載體，其中所述功能表面等分包括一種靶元件。
5.權利要求1的載體，其中所述功能表面等分包括一種細胞進入元件。
6.權利要求1的載體，其中所述功能表面等分包括一種免疫保護元件，靶元件和細胞進入元件。
7.權利要求3的載體，其中所述免疫保護元件是合成聚合物等分。
8.權利要求4的載體，其中所述靶等分與一種受體結合，該受體在病態細胞中的表達較正常細胞高。
9.權利要求8的載體，其中所述靶等分是細胞表面受體的肽或擬肽配體。
10.權利要求5的載體，其中所述細胞進入元件是一種膜去穩定等分。
11.權利要求10的載體，其中所述膜去穩定等分包括兩親性α-螺旋。
12.權利要求10的載體，其中所述膜去穩定等分包括一種谷氨酸和亮氨酸的共聚物。
13.權利要求11的載體，其中所述兩親性α-螺旋源自病毒env蛋白的C末端功能區。
14.權利要求13的載體，其中C末端功能區是Moloney白血病病毒env蛋白的C末端功能區。
15.權利要求14的載體，其中C末端功能區包括Moloney白血病病毒env蛋白的598-616氨基酸。
16.權利要求7的載體，其中所述合成聚合物組分包括聚(乙二醇)。
17.權利要求7的載體，其中所述合成聚合物組分包括谷氨酸和亮氨酸的共聚物。
18.治療患者疾病的方法，包括給所述患者應用治療有效劑量的權利要求1的載體。
19.權利要求1的基因治療載體，其中所述接頭包括一種多價聚合物。
20.權利要求19的基因治療載體，其中所述多價聚合物基本上由谷氨酸和亮氨酸組成。
21.權利要求1的基因治療載體，其中所述接頭包括一種聚合物修飾的脂質。
22.權利要求21的基因治療載體，其中所述聚合修飾脂質的近端應用疏水或兩親性等分修飾。
23.權利要求21的基因治療載體，其中所述聚合物修飾脂質的遠端應用配體或靶等分修飾。
全文摘要
本文提供了用于基因治療的新型改良組合物和方法。特別是提供了靶向人工基因導入(“TAGD”)載體，包括包繞用于基因導入的重組病毒顆粒(核殼體)或重組核心的多功能人工表面等分。
文檔編號C12N15/867GK1420934SQ00814614
公開日2003年5月28日 申請日期2000年8月18日 優先權日1999年8月19日
發明者Y·羅岑伯格, V·梅維德金, W·F·安德森 申請人:南加州大學