轉谷氨酰胺酶的制備方法

專利名稱：轉谷氨酰胺酶的制備方法
發明的背景本發明涉及在棒桿菌中分泌生產外源蛋白，特別是轉谷氨酰胺酶的方法。用該方法分泌生產的外源蛋白質是產業上有用的酶或有生理活性的蛋白質等，轉谷氨酰胺酶被廣泛地應用于食品加工和制藥領域等中。
到目前為止，對于外源蛋白質的分泌生產已有很多報道，如有關利用桿菌屬細菌分泌生產外源蛋白質的綜述[Microbiol.rev.，57，109-137(1993)]，利用甲基營養酵母Pichia pastoris分泌生產外源蛋白的綜述[Biotechnol.，11，905-910(1993)]，以及利用曲霉菌屬霉菌進行工業生產的報道[Biotechnol.，6，1419-1422(1988)；Biotechnol.，9，976-981(1991)]等。
根據本發明的一個實施方式，分泌生產的轉谷氨酰胺酶是催化位于蛋白質肽鏈內的γ-羧酰胺基的酰基轉移反應的酶。該酶作用于蛋白質時，可以通過形成ε-(γ-Glu)-Lys橋及Gln脫酰胺化，產生Gln置換為Glu的反應。該轉谷氨酰胺酶可用于果凍等膠狀食品、酸奶酪、干酪、或膠狀化妝品等的制造或改善肉類食品的肉質等(特開平1-50382)。另外該酶也可用于制備熱穩定微膠囊的材料、固定化酶的載體等，是工業上利用性高的酶。
到目前為止，已知有源于動物和源于微生物(微生物轉谷氨酰胺酶，以下略作“MTG”)的轉谷氨酰胺酶。源自動物的轉谷氨酰胺酶是依賴于鈣離子的酶，分布在動物的臟器、皮膚、血液等。例如，有豚鼠肝臟轉谷氨酰胺酶(K.Ikura et al.Biochemistry 27，2898(1988))，人表皮角質細胞轉谷氨酰胺酶(M.A.Phillips et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry 25，6900(1990))。
源自微生物的轉谷氨酰胺酶有在鏈輪絲菌(Streptoverticillium)屬細菌中發現的鈣非依賴性轉谷氨酰胺酶。這樣的細菌，例如灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂鏈輪絲菌肉桂亞種(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819(特開昭64-27471)等。這些微生物產生的轉谷氨酰胺酶的一級結構經肽譜以及基因結構解析，結果表明與源自動物的轉谷氨酰胺酶完全沒有同源性(歐洲專利公開公報0481 504 A1)。
源自微生物的轉谷氨酰胺酶(MTG)由于是從上述菌類等的培養物經純化操作制備的，所以在供給量、效率等方面存在問題。因此也正在嘗試通過基因工程技術來制備轉谷氨酰胺酶。轉谷氨酰胺酶及其基因，例如在Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)、Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，88-92(1994)、Biochimie，80，313-319(1998)、Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)、WO96/06931、WO 96/22366等中已有報道，其中有關于利用淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)、oryzae曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大腸桿菌(Escherichia coli)等宿主載體系統表達生產的報道。除此之外，還有通過E.coli、酵母等微生物分泌表達(特開平5-199883)的方法，以及通過大腸桿菌將MTG以非活性融合蛋白質包涵體表達后，再用蛋白質變性劑溶解，經去除變性劑使其復性來生成有活性的MTG的方法的報道(特開平6-30771)。然而，在E.coli、酵母等微生物的分泌表達中存在著其表達量非常少的問題。
而為了利用棒桿菌有效分泌生產外源蛋白質的研究到目前為止已有一些報道，如利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(以下略作C.Glutamicum)分泌核酸酶(nuclease)或脂肪酶[US4965197，J.Bacteriol.，174，1854-1861(1992)]以及枯草桿菌蛋白酶等蛋白酶[Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)]的研究，有關棒桿菌的細胞表面蛋白質的分泌的研究[特表平6-502548]，在以上研究基礎上展開的纖連蛋白結合蛋白分泌的研究[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]和利用變異型分泌手段提高蛋白質分泌的研究報道[特開平11-169182]等，但只是有關極其有限的蛋白質的極少數的報道。從蛋白蓄積量來看，雖然有在Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)文獻中報道的利用源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的枯草桿菌蛋白酶基因(aprE)的啟動子、核糖體結合位點以及信號肽的序列使源自節瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)的堿性蛋白酶的基因在谷氨酸棒桿菌中表達，確認蓄積了大約2.5mg/ml的該蛋白的例子，但在US4965197、特表平6-502548、特開平11-169182的描述中都沒有記載具體的分泌蓄積的蛋白量，而在分泌纖連蛋白結合蛋白[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]的報道中被確認的分泌蓄積量最大不過是約為2.5μg/L的非常少的量。所以使外源蛋白以實用水平有效地蓄積在培養基中的報道還未看到。
棒桿菌的基因操作技術是通過原生質體轉染法的建立[J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Bacteriol，161，463-467(1985)]、各種載體的開發[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)；J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol.，130，2237-246(1984)；Gene，47，301-306(1986)；Appl.Microbiol.Biotechnol.，31，65-69(1989)]、基因表達調控法的開發[Bio/Technology，6，428-430(1988)]、粘粒的開發[Gene.39，281-286(1985)]等、以及利用質粒和嗜菌體系統發展起來的。另外有關源自棒桿菌的基因克隆也有報道[Nucleic AcidsRes.，14，10113-1011(1986)；J.Bacteriol，167，695-702(1986)；Nucleic Acids Res.，15，10587(1987)；Nucleic Acids Res.，15，3922(1987)；Nucleic Acids Res.，16，9859(1988)；Agric.Biol.Chem.，52，525-531(1988)；Mol.Microbiol.，2，63-72(1988)；Mol.Gen.Genet.，218，330-339(1989)；Gene，77，237-251(1989)]。
另外，有關源自棒桿菌的轉移因子也有報道[WO93/18151；EP0445385；特開平6-46867；Mol.Microbiol.，11，739-764(1994)；Mol.Microbiol.，14，571-581(1994)；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；FEMS Microbiol.Lett.，126，1-6(1995)；特開平7-107976]。
所謂轉移因子是在染色體上可轉移的DNA片段，存在于從原核生物到真核生物范圍很廣的生物中。開發利用轉移因子的轉座子[WO93/18151；特開平7-107976；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)、特開平9-70291]、以及通過轉座子使外源基因表達已成為可能。
本發明人著眼于無論是信號肽還是前體部分在放線菌等的分泌蛋白質分泌過程中都起著重要作用的事實，直至發明了有效分泌生產工業上有用的外源蛋白質，特別是轉谷氨酰胺酶的方法。
就是說，本發明是有關外源分泌型蛋白質的制備方法的發明，其特征是使在源自棒桿菌的信號肽的下游連接含有前體結構部分的外源分泌型蛋白質的融合蛋白質在棒桿菌中生成和分泌，然后將前體結構部分切除來獲得外源蛋白質。
更具體地說，本發明提供的方法是，將在編碼源自棒桿菌的信號肽區，特別是細胞表面蛋白質的信號肽區的序列的下游結合了含有前體結構部分的目的蛋白質基因序列，特別是轉谷氨酰胺酶原基因序列的表達重組體導入棒桿菌，對得到的轉化棒桿菌進行培養，使生成的蛋白質有效地分泌到菌體外，用蛋白酶對釋放到菌體外的蛋白質進行處理，切去前體結構部分，進而制備大量的目的外源蛋白質，特別是轉谷氨酰胺酶。
另外，本發明還提供獲得轉谷氨酰胺酶的一種方法，即，對蛋白酶等也象轉谷氨酰胺酶基因重組體那樣構建這些蛋白酶等的表達型基因重組體，然后與含有轉谷氨酰胺酶原基因的表達重組體都導入棒桿菌，對得到的轉化棒桿菌進行培養，或導入到別的棒桿菌，對得到的轉化棒桿菌與導入轉谷氨酰胺酶原基因的細菌共同培養，通過使轉谷氨酰胺酶原和這些蛋白酶分泌表達，可以得到切除了轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶。
另外在本說明書中，所謂蛋白質或肽被“分泌”是指蛋白質或肽分子被轉移到菌體外(細胞外)，最終這些蛋白質或肽分子完全游離在培養基中，當然也包括只有一部分存在于菌體外的情況以及存在于菌體表面的情況。
實施發明的最佳方式依照本發明的方法，用棒桿菌作為宿主載體系統，構建在棒桿菌細胞表面蛋白質的信號肽的下游結合了含有分泌型的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因的表達重組體，然后將該重組體導入棒桿菌內，對被表達、分泌到菌體外的轉谷氨酰胺酶原用蛋白酶等進行處理，切除前體結構部分，就可得到大量的切除了前體結構部分的轉谷氨酰胺酶。
另外依照本發明的方法，對蛋白酶等也象轉谷氨酰胺酶基因重組體那樣構建這些蛋白酶等的表達型基因重組體，然后與轉谷氨酰胺酶原基因重組體都導入棒桿菌，對得到的轉化棒桿菌進行培養，或導入到別的棒桿菌，對得到的轉化棒桿菌與導入轉谷氨酰胺酶原基因的細菌共同培養，通過分泌表達，可以直接在菌體外得到切除了轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶。
分泌型蛋白質一般以前導肽或前導肽原形式被翻譯，然后變成成熟型蛋白質。即一般以前導肽或前導肽原形式被翻譯后，切除信號肽(“前導部分”)使之變成成熟肽或肽原，肽原再經蛋白酶處理，切除前體部分使之成為成熟肽。在本說明書中，所謂“信號序列”是指存在于分泌型蛋白質前體的N末端，且不存在于天然成熟蛋白質中的序列，所謂“信號肽”是指從該蛋白質前體中切除的肽。一般來說，信號序列隨著蛋白質分泌到菌體外的同時，就被蛋白酶(通常稱之為信號肽酶)切除了。這樣的信號肽雖然在所有生物中都有某些共同的序列上的特征，但在某種生物中表現出分泌功能的信號肽在其他生物中未必發揮能分泌功能。
在本說明書中，有時將信號肽和前體部分都含有的蛋白質，即初次翻譯產物稱之為“前蛋白質原”，將不含信號肽而含有前體部分的蛋白質稱之為“蛋白質原”。蛋白質原的前體部分有時也稱之為“前體結構部分”或“前體結構”，在本說明書中蛋白質的“前體結構部分/前體結構”與蛋白質的“前體部分”之間可互換使用。在前蛋白原或前蛋白質中，其信號肽可以來自于不同的蛋白質，也可以是天然存在于目的蛋白質的信號肽，但最好是使用源自所用宿主的分泌型蛋白質。或者按照所用宿主的密碼子使用頻率將信號肽改造成具有最適密碼子的信號肽。而可用于本發明的信號肽也可以含有信號肽來源的天然的成熟蛋白質的N末端氨基酸序列的一部分。信號肽源自不同的蛋白質時，有時也將前蛋白原特別稱之為“外源融合前蛋白原”。例如，蛋白質為轉谷氨酰胺酶時，可分別稱之為“前轉谷氨酰胺酶原”、“轉谷氨酰胺酶原”和“外源融合前轉谷氨酰胺酶原”。所謂“切除前體部分的”蛋白質是指通過切斷肽鍵，除去至少一個以上構成前體部分的氨基酸的蛋白質，包括該N末端區與天然成熟蛋白質的N末端區完全一致的蛋白質，以及只要具有該蛋白質活性，與天然蛋白質相比其N末端多出一個以上源自前體部分的氨基酸的蛋白質以及與天然成熟蛋白質相比氨基酸序列短的蛋白質也都包括在內。
到目前為止，利用棒桿菌將外源蛋白分泌到菌體外的例子如在闡述以往的的技術時所描述的那樣非常少，而且從技術上也沒有完善。另外也沒有棒桿菌通過自身將蛋白酶等蛋白質分泌到菌體外的例子，但內源性DNase的分泌[US4965197]和本發明使用的細胞表面蛋白[特表平6-502548]從細胞表面剝落并出現在菌體外的事實是已經知道的例子。但是，就棒桿菌來說，對參與分泌的信號肽除了細胞表面蛋白質以外到現在還不清楚。到目前為止所了解的棒桿菌的細胞表面蛋白只是谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的細胞表面蛋白PS1和PS2的基因[特表平6-502548]以及產氨棒桿菌(以下略作C.ammoniagenes)的細胞表面蛋白質S1pA的基因[特開平10-108675]。在這些蛋白質內，雖然PS1和S1pA之間能看到有許多同源性(30％)，但在其他蛋白質之間幾乎看不到同源性，另外關于信號序列區域也看不到它們之間的同源性。作為信號序列的例子，如序列號29和1給出的谷氨酸棒桿菌的PS1和PS2的信號序列，以及序列號2給出的產氨棒桿菌的S1pA的信號序列。
本發明人從谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)(舊名稱為乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum))ATCC13869菌株克隆PS2蛋白質基因，測定其序列時，雖然沒有看出在信號序列區與源自谷氨酸棒桿菌的已知蛋白質基因序列有什么差別，但在成熟型細胞表面蛋白質的N末端氨基酸的38位殘基前的序列中確認有2個不同之處(序列號7給出的氨基酸序列中第40位氨基酸殘基的Thr是Asn，第55位的Gly是Glu)。序列號6給出了含有編碼其信號序列號30個氨基酸殘基和成熟細胞表面蛋白質的N末端38個氨基酸殘基的共68個殘基的堿基序列以及啟動子區的其5’-上游區序列，序列號7給出了其氨基酸序列。
然后，為了在棒桿菌中嘗試使外源蛋白質大量分泌到菌體外是否可行，本發明人利用含有細胞表面蛋白質的啟動子區和信號肽區的序列進行了外源蛋白質的分泌研究。
已知源自放線菌的轉谷氨酰胺酶基因GC含量高，但棒桿菌與它相近，另外密碼子利用性也近似，所以可直接利用放線菌基因。因此，本發明人就能否可以直接利用放線菌轉谷氨酰胺酶基因進行了研究，結果表明源自放線菌的轉谷氨酰胺酶的信號肽在棒桿菌中不起作用。但是，編碼與源自棒桿菌的細胞表面蛋白的信號肽融合的包含源自放線菌的前體結構部分的成熟蛋白的轉谷氨酰胺酶基因可直接有效地發揮其功能，并可作為含有前體結構部分的蛋白原有效地分泌到菌體外。另外，使用多出了細胞表面蛋白質的信號肽30個氨基酸殘基與成熟細胞表面蛋白質的N末端部分的38個氨基酸殘基，即，使用融合了成熟細胞表面蛋白質的N末端部分的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因時，轉谷氨酰胺酶原向菌體外分泌的效率將進一步增大。
本發明中所說的棒桿菌是需氧的革蘭式陽性桿菌，包括以前屬于短桿菌屬，現在都合并到棒桿菌屬的細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，以及包括與棒桿菌屬親緣關系近的短桿菌屬細菌。作為使用棒桿菌的優點，與到目前為止適用于外源蛋白分泌的霉菌、酵母或枯草桿菌屬細菌相比，它本來分泌到菌體外的蛋白質就非常少，所以分泌生產外源蛋白質時的純化過程可以簡化和省略，另外在糖、氨和無機鹽等簡單培養基中能很好生長，在培養基花費和培養方法、培養生產效率方面也都有優勢。
本發明中作為宿主菌使用的棒桿菌有，以L-谷氨酸生成菌為代表的解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum，又稱為谷氨酸棒桿菌)ATCC13869、玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum，又稱為谷氨酸棒桿菌)ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、谷氨酸棒桿菌ATCC13032，百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes，又稱為產氨棒桿菌)ATCC6871等野生株，以及由這些野生株誘變的變異株，例如失去谷氨酸生成能力的變異株，還包括生成賴氨酸的氨基酸生成變異株，生成如肌苷等核酸那樣的其他物質的變異株。
本發明使用的基因重組體，一般都在適當位置中含有啟動子、編碼合適的信號肽的序列和編碼目的蛋白的核酸片段、以及為了使目的蛋白基因在棒桿菌表達所必需的調控序列(起始因子和終止因子)，并能使它們發揮作用的基因重組體。目的蛋白也可以在N末端含有前體結構部分。用于該重組體的載體沒有特別限制，只要是在棒桿菌中能夠發揮功能的就可以，象質粒那樣在染色體外自我增殖的，還是插入細菌染色體的載體都可以，最好是源自棒桿菌的質粒。其中包括諸如pHM1519(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))、pAM330(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))以及將它們進行改造使之含有抗藥性基因的質粒。另外人工轉座子等也可以利用。使用轉座子時，通過同源重組或它們自身轉移能力將目的基因導入染色體中。
本發明中使用的啟動子沒有特別限定，只要是在棒桿菌中發揮功能的啟動子一般都可以使用，甚至源自外源的，例如優選tac啟動子等源自E.coli的啟動子。其中更優選tac啟動子等強力啟動子。源自棒桿菌的啟動子有，細胞表面蛋白質的PS1、PS2、S1pA基因的啟動子，各種氨基酸合成系統，例如谷氨酸合成系統的谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酰胺合成系統的谷氨酰胺合成酶基因、賴氨酸生物合成系統的天冬氨酸激酶基因、蘇氨酸生物合成系統的同型絲氨酸脫氫酶基因、異亮氨酸和纈氨酸生物合成系統的乙酰羥酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系統的2-異丙基蘋果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系統的谷氨酸激酶基因、組氨酸生物合成系統的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成系統的脫氧阿拉伯庚糖醛磷酸(DAHP)合成酶基因、肌苷酸和鳥苷酸那樣的核酸生物合成系統中的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基轉移酶基因、肌苷酸脫氫酶基因和鳥苷酸合成酶基因的啟動子。
本發明使用的信號肽是作為宿主的棒桿菌的分泌型蛋白質的信號肽，最好是棒桿菌細胞表面蛋白質的信號肽。作為棒桿菌的細胞表面蛋白質有源自谷氨酸棒桿菌的PS1和PS2[特表平6-502548]、以及產氨棒桿菌的S1pA[特開平10-108675]。序列號29給出了PS1的氨基酸序列，序列號1給出了PS2的氨基酸序列，序列號2給出了S1pA的氨基酸序列。另外按照美國專利4965197的描述，在源自棒桿菌的DNase中也包含有信號肽，那樣的信號肽也可以用于本發明。
在信號肽中也可以加上信號肽來源的分泌型蛋白質的N末端氨基酸序列的一部分。信號序列在翻譯產物分泌到菌體外時就被信號肽酶切去了。編碼信號肽的基因可以直接使用天然型的基因，也可以根據使用宿主的密碼子使用頻率進行改變，使之具有最適密碼子。
使用這些信號肽時，編碼目的蛋白的基因接在編碼信號肽的基因的3’-末端一側，并使它受到源自上述啟動子的表達調控。
通過本發明分泌生產的有用的蛋白質實質上包括源自動植物或微生物的所有分泌型蛋白質，但并沒有被特別限定。例如蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、膠原酶和幾丁質酶等蛋白質都可以通過本發明進行分泌生產。通過本發明分泌生產的蛋白質優選天然且為分泌型蛋白質，更優選帶有前體結構部分的蛋白質，特別優選將轉谷氨酰胺酶作為通過本發明分泌生產的有用的蛋白質。作為本發明可利用的轉谷氨酰胺酶基因可以是放線菌，例如茂原鏈輪絲菌IFO13819、肉桂鏈輪絲菌IFO12852、灰色肉鏈輪絲菌IFO12776、利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)[WO9606931]等和Oomycetes[WO9622366]等霉菌的分泌型轉谷氨酰胺酶基因。編碼這些蛋白質的基因按照使用的宿主以及為了獲得所希望的活性可以進行改變，其中包括添加、缺失、置換一個以上的氨基酸等改變，可以根據需要變換成響應宿主密碼子使用頻率的最適密碼子。
通過本發明分泌生產以天然的前肽原形式表達的蛋白質時，最好使用編碼含有前體結構部分(前體部分)的蛋白原的基因片段。作為前體結構部分的例子有，序列號3(源自茂原鏈輪絲菌)和序列號4(源自肉桂鏈輪絲菌)給出的源自放線菌的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的序列。蛋白質的前體結構部分可以通過適當的手段，例如利用蛋白酶切除，也可以用氨肽酶、在適當位置進行切割的內肽酶、或使用更特異的蛋白酶，但最好是使用能在特定位置切斷，并能使生成的蛋白質具有與天然蛋白質同樣的或更高的活性的蛋白酶。或者是改變編碼目的蛋白質或目的蛋白質的前體結構部分的基因序列，設計成能表達在所希望的位置含有特異的蛋白酶識別位點的蛋白質。包括上述那樣的誘變技術、基因克隆技術、生成蛋白質的檢測技術在內的常規分子生物學手法業內人士都很清楚。例如可以參照下列文獻Sambrook etal.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York、DNA cloningA Practical Approach，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.1985)、F.M.A usubel et al.(eds)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc，(1994)、PCR TechnologyPrinciples and Application for DNAAmplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press等。
作為改變了序列號3和4所示的前體結構部分的前體結構部分的例子，如具有序列號30～38所示的氨基酸序列的修飾前體結構部分。<序列表說明>序列號30～37茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶的修飾前體結構部分序列號38茂原鏈輪絲菌和肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶前體結構部分的嵌合這些修飾前體結構部分具有以下特征序列號30＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的AP。序列號31＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的FRAP。序列號32＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的N末端的D。序列號33＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的N末端的DNGAGE。序列號34＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的RAP改變成了GPK。序列號35＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的RAP改變成了GPR。序列號36＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的GPSFRAP改變成了GPK(FRAP缺失，C末端的S改變成R)。序列號37＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分(45個氨基酸殘基)的C末端的GPSFRAP改變成了GPR(FRAP缺失，C末端的S改變成R)。序列號38＝由源自茂原鏈輪絲菌的前體結構部分一部分(15個氨基酸殘基)和源自肉桂鏈輪絲菌的前體結構部分(41個氨基酸殘基)的一部分構成的嵌合前體結構部分(56個氨基酸殘基)。
這樣，只要在特定位置有了蛋白酶的特異識別位點，就可以在前體結構部分置換、缺失、插入或添加一個以上的氨基酸。
蛋白酶分解獲得的蛋白質的N末端區未必與天然的蛋白質一樣，即使是多添加了1～數個氨基酸，或缺失了1～數個氨基酸都可以。一般來說，從蛋白質活性觀點出發，優選在與天然蛋白質幾乎相同的位置切斷，更優選與天然產物一樣的成熟肽。例如，有關茂原鏈輪絲菌和肉桂鏈輪絲菌的成熟型轉谷氨酰胺酶的序列分別是序列號5和43給出的序列。因此，一般來說最優選能在生成與天然成熟蛋白質一樣的蛋白質的位置切斷肽原的特異性蛋白酶。然而，為了特定目的，與天然蛋白質相比，N末端或多或少1～數個氨基酸的肽有時具有更適合的活性。這樣的蛋白酶中除了包括象分散酶(Dispase)(BoeringerManheim公司制)那樣可購買的酶以外，也包括從微生物培養液、例如從放線菌的培養液中獲得的酶。這樣的蛋白酶未經純化就可使用，也可根據需要純化至適當的純度后再使用。
其他適用的蛋白酶的例子有白灰淺鏈霉菌(Streptomycesalbogriseolus，以下略作S.albogriseolus)生成的絲氨酸蛋白酶SAMP45。而源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶原由于SAMP45優先切斷序列號3的前體結構部分的第41位的Ser和42位的Phe之間肽鍵，可生成在序列號5給出的天然型成熟轉谷氨酰胺酶的N末端附加了前體結構部分的C末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸結構的蛋白質。本發明人確認這樣的蛋白質也具有轉谷氨酰胺酶活性。另外SAMP45基因序列已經確定，序列號39給出了附加了前體結構的蛋白質(SAMP45原)的氨基酸序列(J.Bacteriol，179，430-438(1997))。SAMP45以白灰淺鏈霉菌的培養液或白灰淺鏈霉菌菌體的形式作用于轉谷氨酰胺酶原時，可以切除前體結構的一部分，結果可以得到除去大部分前體結構的轉谷氨酰胺酶。或者是將導入了前SAMP45原基因的棒桿菌與使轉谷氨酰胺酶原分泌到菌體外的棒桿菌一起培養，同樣可以得到除去大部分前體結構的轉谷氨酰胺酶。另外，用同樣的方法將SAMP45基因導入攜有前轉谷氨酰胺酶原基因的棒桿菌中，使SAMP45與前轉谷氨酰胺酶原基因同時分泌到菌體表面或菌體外，可以更有效地通過切去前體結構部分使轉谷氨酰胺酶活化。
另外，通過將本發明人發現的茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)與SAMP45配合使用，也可以除去附加在N末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸，得到與天然型一樣的成熟的轉谷氨酰胺酶。
該svPEP是能夠在下述式(1)中↓處特異切斷式(1)表示的肽或肽的類似物，即特異切斷從N末端開始的第3或第4位脯氨酸羧基側的肽鍵的酶。
Y-Pro-↓-Z(1)(式中，Y是由2個或3個氨基酸殘基構成的寡肽，Z代表氨基酸、肽、酰胺、或酯)。
更具體地說，該脯氨酸特異性肽酶是具有以下(1)～(8)性質的脯氨酸特異性肽酶。(1)可以在↓所示位置、即在脯氨酸的羧基側切斷以下至少一種含有脯氨酸的肽(pNA代表對硝基酰替苯胺)。Ala-Ala-Pro-↓-pNA、Ala-Phe-Pro-↓-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-↓-pNA(與Phe-Arg-Ala-Xaa(序列號68)相同(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA表示對硝基酰替苯胺))(2)最適pH為6.0～6.5。(3)pH4～9時穩定。(4)最適溫度為25～30℃。(5)20℃以下時穩定。(6)活性可被苯基甲基磺酰氟化物、氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽抑制。(7)等電點為10.2。(8)分子量大約為50000。
該svPEP可以按以下步驟制備。按照放線菌培養中通常用的方法培養生成具有svPEP活性的肽酶的放線菌，例如放線菌茂原鏈輪絲菌IFO13819。培養放線菌IFO13819的培養基用含有通常的碳源、氮源、無機離子等常用的培養基就可以。作為碳源可以使用葡萄糖、淀粉、蔗糖以及其他碳源。作為氮源根據需要可以適當選用蛋白胨、酵母提取液、肉湯、麥芽提取液、銨鹽和其他的氮源。培養是在好氧條件下進行的，例如可以將條件控制在pH5.0到8.5、溫度從15℃到37℃的合適的范圍內。培養時間雖然因溫度、pH、培養基不同而不同，但通常為1～10天左右，一般來說，在svPEP的產率達到最大時停止培養最好。
經上述時間培養后，從培養物回收菌體，輕輕洗滌后，從菌體表面洗脫出含有svPEP的組分，通過配合使用HPLC、FPLC等通常蛋白質純化中使用的業內人士熟悉的各種純化手段進行純化，可以獲得純化的svPEP標準品。從菌體表面洗脫svPEP組分，可以通過將菌體在例如0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)等緩沖液中，振蕩一定時間、如1～5小時左右來洗脫。為了防止酶失活，此時的溫度最好控制在0℃～5℃范圍內。也可以從培養上清液分離純化出svPEP，但此時雜蛋白質較多，因此還是從洗滌的菌體洗脫純化為好。
另外，確認各個純化階段的活性組分可以通過測定各個組分中的酶活性來進行。酶活性的測定可以配合使用適當的底物和反應生成物的檢測方法，例如以Ala-Ala-Pro-pNA、Ala-Phe-Pro-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-pNA為底物進行酶反應，通過算出游離的pNA(對硝基酰替苯胺)量，對活性進行定量測定。
根據需要，可以使用反相色譜等將上述純化的svPEP進一步純化，測定其部分氨基酸序列，通過設計合適的探針可以得到編碼svPEP的基因。這樣的操作過程業內人士是很熟悉的，例如可參照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p9.31(1989)]。序列號41和42分別給出了上述得到的svPEP的基因的堿基序列和它所編碼的整個氨基酸序列，序列號40給出了svPEP成熟蛋白質的氨基酸序列。
使SvPEP以茂原鏈輪絲菌的培養液或茂原鏈輪絲菌菌體的形式與蛋白酶一起作用于轉谷氨酰胺酶原時，可以完全除去前體結構部分，結果可以得到前體結構部分完全切除的成熟型的轉谷氨酰胺酶。或者是通過將導入了前svPEP原基因和蛋白酶基因的棒桿菌與將轉谷氨酰胺酶原分泌到菌體外的棒桿菌共同培養，同樣可以得到前體結構部分完全切除的成熟型的轉谷氨酰胺酶。另外，通過在導入了前轉谷氨酰胺酶原基因的棒桿菌中按照同樣方法再導入SAMP45基因和svPEP基因兩者，使得svPEP和轉谷氨酰胺酶原以及SAMP45同時分泌到菌體表面或菌體外，可以有效地生成具有與天然結構一樣的成熟型的轉谷氨酰胺酶。
將本發明使用的基因重組體導入棒桿菌的方法沒有特別限定，可以利用通常使用的方法，例如原生質體法(Gene，39，281-286(1985))、電穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等方法。得到的導入了基因的轉化體按照通常使用的方法和條件進行培養。例如，轉化體可以用含有碳源、氮源和無機離子的常用的培養基進行培養。為了要獲得高增殖，也可以根據需要添加維生素、氨基酸等有機微量營養素。
作為碳源可以使用象葡萄糖和蔗糖那樣的碳水化合物，醋酸那樣的有機酸、醇類以及其他碳源。作為氮源可以使用氨氣、氨水、銨鹽和其他氮源。作為無機離子根據需要可以適當使用鈣離子、鎂離子、磷酸根離子、鉀離子、鐵離子等。培養在pH5.0～8.5、15℃～37℃等合適的范圍內通氧條件下進行。培養1～7天左右。通過在這樣的條件下培養轉化體，目的蛋白質在菌體內大量生成并被有效地分泌到菌體外。就轉谷氨酰胺酶來說，已知如果在微生物菌體內大量蓄積一般都會導致菌體死亡，但如果利用本發明，由于生成的轉谷氨酰胺酶都釋放到菌體外，菌體不會受到致死的影響，所以可以連續地生產轉谷氨酰胺酶。
利用本發明分泌到培養基的蛋白質按照同行都熟悉的方法可以從培養后的培養基中分離純化。例如，通過離心分離除去菌體后，再通過鹽析、乙醇沉淀、超濾、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、中高壓液相層析，反相層析、疏水層析等已知的合適的方法、或配合使用進行分離純化。利用本發明分泌到菌體表面的蛋白質也可使用同行都熟悉的方法，例如提高鹽濃度、使用表面活性劑等使其溶解后，象分泌到培養基中的蛋白質那樣進行分離純化。有時分泌到菌體表面的蛋白質不進行可溶化，例如作為固定化酶使用。
結合以下實施例，對本發明進一步進行具體說明，但本發明并不限定于這些實施例。實施例1源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的前轉谷氨酰胺酶原在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中的表達(1)源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的前轉谷氨酰胺酶原基因的獲得源自茂原鏈輪絲菌DSMZ菌株的轉谷氨酰胺酶基因的序列已經被確定[Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)]。參考該序列，合成如序列號8和9所示的引物，利用PCR法從按照常規方法(齋藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制備的茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA中擴增編碼成熟轉谷氨酰胺酶序列的區域。在PCR反應中使用Pyrobest DNA polymerase(寶酒造公司制)，反應條件參照廠家推薦的方案。(序列號8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’(序列號9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號8、9PCR引物然后對擴增的大約1.0kb的DNA片段用Random Primer DNALabeling Kit Ver.2(寶酒造公司制)和[α-32P]dCTP，按照說明書附帶的方案進行反應，制備DNA探針。使用制備的探針和茂原鏈輪絲菌IFO13819染色體DNA，按照Molecular Cloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，p9.31(1989)]所述的方法進行Southern blot雜交，便可確認在用限制酶Sac I酶切出的大約4kb的片段中存在著轉谷氨酰胺酶基因。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)通過瓊脂糖凝膠電泳回收用Sac I切茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA得到的大約4kb的片段，并插入pUC18(寶酒造公司制)的Sac I位點后，導入大腸桿菌JM109(寶酒造公司制)的感受態細胞，構建文庫。
使用先前制備的轉谷氨酰胺酶的DNA探針按照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p1.90(1989)]所述的菌落雜交方法進行文庫的篩選，獲得含有轉谷氨酰胺酶基因片段被克隆的質粒的菌株，從該菌株回收質粒，取名為pUITG。測定克隆于pUITG的片段的堿基序列，可以確認茂原鏈輪絲菌IFO13819轉谷氨酰胺酶基因與茂原鏈輪絲菌DSMZ株的轉谷氨酰胺酶基因具有同樣的堿基序列。
堿基序列測定的結果表明，該Sac I的大約4kb的片段是缺了一部分信號序列(前導部分)的不完全的DNA片段。于是進行了啟動子區和完整的信號序列區的克隆的嘗試。克隆是利用TAKARA LA PCR invitro Cloning Kit(寶酒造公司制)和序列號10和11所示的引物，按照說明書附帶的方案實施的。(序列號10)5’-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3’(序列號11)5’-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3’<序列表說明>序列號10、11用于克隆茂原鏈輪絲菌的啟動子區和信號序列的PCR引物。
結果表明，使用Sal I的試劑盒引物時得到大約800bp的PCR擴增片段，測定該片段的堿基序列，可確認該片段是含有轉谷氨酰胺酶基因的啟動子區和信號序列區的片段。通過將這個大約800bp的PCR擴增片段插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，得到pVITGS5。然后通過用Sal I消化pUITG，通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有轉谷氨酰胺酶基因的約4kb片段，再將該片段插入pVITGS5的Sac I位點，構建含有全長的轉谷氨酰胺酶基因的質粒pVITGC。另外堿基序列的測定使用Dye Terminator Cycle Sequencing kit(PE AppliedBiosystems公司制)和DNA測序儀(PE Applied Biosystems公司制)。序列號12給出了前轉谷氨酰胺酶原基因的序列，而N末端的31個氨基酸序列被認為是信號序列(前導部分)。前轉谷氨酰胺酶原的氨基酸序列如序列號13所示。(2)轉谷氨酰胺酶基因啟動子區的轉換谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白PS2基因序列已經確定[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。參考該序列合成序列號14和序列號15所示的引物，通過PCR法從常規方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869染色體DNA中擴增含有PS2蛋白質基因的起始密碼5’-上游區的啟動子的區域。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號15)5’-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3’<序列表說明>序列號14、15PCR引物以實施例1(1)中測定的轉谷氨酰胺酶基因序列為基礎，合成序列號16和9所示的引物，利用PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG擴增前轉谷氨酰胺酶原基因區。(序列號16)5’-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3’<序列表說明>序列號16PCR引物接下來，將擴增的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869 PS2基因的啟動子的區域與已擴增的轉谷氨酰胺酶基因區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉(cross over)PCR，擴增與含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白基因啟動子的區域相連的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，得到pVKPTGO。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。(3)前轉谷氨酰胺酶原基因在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中的表達用實施例1(1)構建的pVITGC(啟動子和前轉谷氨酰胺酶原基因都源自茂原鏈輪絲菌)或實施例1(2)構建的pVKPTGO(啟動子源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因，前轉谷氨酰胺酶原基因源自茂原鏈輪絲菌)轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的CM2S瓊脂培養基(將10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g蔗糖、5g NaCl、15g瓊脂用水配成1升溶液)中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVITGC或pVKPTGO的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的MM液體培養基(將葡萄糖30g、硫酸鎂7水合物0.4g、硫酸銨30g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鐵7水合物0.01g、硫酸錳5水合物0.01g、硫胺素鹽酸鹽200μg、生物素500μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸鈣50g用水配成1L溶液，pH調節為7.5)分別于30℃條件下培養48小時。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法(例如，J.Sambrook等人(1989)所述的通常步驟)進行Western blot。
結果沒有檢測出轉谷氨酰胺酶的分泌。從以上結果可以確認茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶的信號序列在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中沒有起作用。實施例2利用編碼谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum ATCC13869)的細胞表面蛋白質的信號肽和源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的成熟轉谷氨酰胺酶的融合基因進行轉谷氨酰胺酶的分泌生產(1)具有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質信號序列的轉谷氨酰胺酶基因的構建谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白PS2的基因序列已經確定了[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。參考該序列合成序列號14和序列號17所示的引物，利用PCR法從實施例1(2)方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴增含有編碼相當于PS2蛋白質基因的N末端一側的44氨基酸殘基(信號肽30個氨基酸殘基和成熟細胞表面蛋白質的14個氨基酸殘基)區和啟動子區的5’-上游區。為了構建與轉谷氨酰胺酶融合基因，序列號17給出的引物含有編碼成熟轉谷氨酰胺酶的N末端一側的氨基酸序列的堿基序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號17)5’-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’<序列表說明>序列號17PCR引物以實施例1(1)中測定的轉谷氨酰胺酶基因序列為基礎，合成序列號8和9所示的引物，利用PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG擴增成熟的轉谷氨酰胺酶基因區。
接下來，將擴增的含有編碼相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質N末端一側的44個氨基酸殘基的區域和啟動子區的5’-上游區的PCR反應液1μl與已擴增的成熟的轉谷氨酰胺酶基因區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，擴增含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側44個氨基酸殘基的區域相連的成熟轉谷氨酰胺酶的融合基因。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.7kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，得到pVKTG3。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。
通過用KpnI和XbaI消化pVKTG3，切出大約1.7kb的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側44氨基酸殘基的區相連的成熟轉谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收，然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點，構建pPKTG3。
(2)利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質的信號序列進行成熟轉谷氨酰胺酶的分泌用構建的質粒pVKTG3或pPKTG3(兩者中由啟動子和信號肽以及N末端14個氨基酸殘基構成的基因都源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869，成熟轉谷氨酰胺酶基因源自茂原鏈輪絲菌)轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKTG3或pPKTG3的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養基于30℃培養48小時。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot。結果在兩種菌株的培養上清中能夠檢測出少量的具有與成熟轉谷氨酰胺酶大致相同分子量的分泌的轉谷氨酰胺酶。實施例3利用與谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質的信號肽相連的源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶原的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)進行轉谷氨酰胺酶的分泌生產(1)具有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)的構建參考谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列號18、序列號19、序列號20以及序列號21所示的引物。使用序列號14和序列號18、或序列號14和序列號19、或序列號14與序列號20、或者序列號14與序列號21的組合通過PCR法從實施例1(2)方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴增出分別編碼相當于PS2蛋白質的N末端一側的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的編碼區域(含有信號肽30個氨基酸殘基)和含有啟動子的5’-上游區。
為了構建與帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因，序列號18、19、20和21給出的引物含有編碼轉谷氨酰胺酶的N末端一側的氨基酸序列的堿基序列。(序列號18)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3(序列號19)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3(序列號20)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3(序列號21)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3<序列表說明>序列號18～21PCR引物以實施例1(1)中測定的轉谷氨酰胺酶基因序列為基礎，合成序列號22和9所示的引物，利用PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG中擴增轉谷氨酰胺酶原基因區。(序列號22)5’-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3’<序列表說明>序列號22PCR引物接下來，將擴增的含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的堿基序列的PCR反應液各1μl，與已擴增的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，分別擴增含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的各個堿基序列區相連的轉谷氨酰胺酶原的融合基因，即與谷氨酸棒桿菌ATCC13869表面蛋白質基因的啟動子結合的外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出從大約1.8kb到1.9kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收這些片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，分別得到pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。
通過用KpnI和XbaI消化pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4，切出從大約1.8kb到1.9kb的含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的各個序列區相連的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收，然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點，構建pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4。(2)利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質的信號序列分泌轉谷氨酰胺酶原用構建的質粒pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養基于30℃分別培養48小時。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Westernblot。結果可以確認無論pVC7，還是pPK4載體都有大致等量的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的分泌，但相當于PS2蛋白質的成熟蛋白質的N末端一側氨基酸殘基的長度不同，可看出相應的分泌量存在明顯的差別。表1給出了有代表性的分泌量。表1.利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質的信號序列獲得的轉谷氨酰胺酶原的分泌生產量
(3)通過分散酶消化來切斷轉谷氨酰胺酶原和檢測活性向攜有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4的谷氨酸棒桿菌ATCC13869培養上清加入作為蛋白酶的分散酶(Boeringer Manheim公司制)，添加的比例為底物∶酶＝1∶1，于pH7.5、37℃下反應1小時。分散酶消化反應后，通過SDS-PAGE確認轉谷氨酰胺酶原被切情況，再經氧肟酸酯(hydroxamate)法[J.Biol.chem.，241，5518-5525(1966)]確認轉谷氨酰胺酶活性，可確認具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。實施例4利用具有產氨棒桿菌(C.ammoniagenes)的細胞表面蛋白質的信號肽編碼序列和源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶編碼序列的融合基因進行轉谷氨酰胺酶原的分泌生產(1)具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原)的構建參考產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)的基因序列[特開平10-108675]，合成序列號23和序列號24所示的引物，利用PCR法從常規方法制備的產氨棒桿菌的柒色體DNA中擴增含有相當于細胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側的25個氨基酸殘基(信號肽)的區域。為了構建與轉谷氨酰胺酶的融合基因，序列號24給出的引物含有編碼轉谷氨酰胺酶原的N末端一側的氨基酸序列的堿基序列。(序列號23)5’-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3’(序列號24)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3<序列表說明>序列號23、24PCR引物接下來，將擴增的含有相當于產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區的5’-上游區與編碼N末端一側的25個氨基酸殘基的區域的PCR反應液1μl，與在實施例3(1)中擴增的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號23和序列號9進行交叉PCR，擴增含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區的5’-上游區和編碼N末端一側25氨基酸殘基的區域相連的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原)。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.7kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到pVC7的SmaI位點，得到pVSPTG1。(2)啟動子區域的轉換；與谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表面蛋白質基因的啟動子的結合參考谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列號14、序列號25所示的引物。通過PCR法從實施例1(2)制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴增含有相當于PS2蛋白質基因的啟動子區的5’-上游區。為了構建與具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)基因的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)，序列號25給出的引物含有編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的N末端一側的氨基酸序列的堿基序列。(序列號25)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3<序列表說明>序列號25PCR引物另外，以具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因的融合基因序列為基礎，合成序列號26和9所示的引物，利用PCR法從實施例4(1)中得到的pVSPTG1中擴增具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的基因區。(序列號26)5’-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3’<序列表說明>序列號26PCR引物接下來，將擴增的含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質基因的啟動子區的5’-上游區的PCR反應液1μl，與已擴增的具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，擴增具有含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白基因的啟動子區的5’-上游區的、帶有與編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)N末端一側25個氨基酸殘基的區域相連的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，得到pVKSPTG1。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。
另外，通過用KpnI和XbaI消化pVKSPTG1，切出大約1.8kb的具有含有相當于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2細胞表面蛋白基因的啟動子區的5’-上游區的、帶有與編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)N末端一側25個氨基酸殘基(信號肽)區域相連的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后通過將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點，構建pPKSPTG1。質粒pVKSPTG1和pPKSPTG1都是由源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子、源自產氨棒桿菌的S1pA的信號肽和源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶原基因構成的。(3)轉換為E.coli的tac啟動子參考E.coli的tac啟動子被克隆的質粒pKK223-3(AmershamPharmacia公司制)的序列，合成序列號27和28所示的引物。通過PCR法從pKK223-3的DNA擴增相當于tac啟動子的區域。為了構建具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)，序列號28給出的引物含有編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的N末端一側的氨基酸序列的堿基序列。(序列號27)5’-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3’(序列號28)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3<序列表說明>序列號27、28PCR引物接下來，將擴增的相當于tac啟動子區的PCR反應液1μl，和在實施例4(2)擴增的具有產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的基因區的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號27和序列號9進行交叉PCR，擴增具有tac啟動子的、帶有與編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)N末端一側的25個氨基酸殘基的區域相連的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因)。通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出大約1.5kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點，得到pVTSPTG1。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。
另外，通過用KpnI和XbaI消化pVTSPTG1，切出大約1.5kb的具有tac啟動子的、帶有與編碼產氨棒桿菌細胞表面蛋白(S1pA)N末端一側25個氨基酸殘基的區域相連的前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點，構建pPTSPTG1。質粒pVTSPTG1和pPTSPTG1都是由源自于E.coli的tac啟動子，源自于產氨棒桿菌的S1pA的信號肽，源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶原基因構成的。(4)利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列分泌轉谷氨酰胺酶原用構建的質粒pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養基于30℃下分別培養48小時。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Westernblot。結果無論pVC7，還是pPK4載體都可以確認有大致等量的轉谷氨酰胺酶的分泌。表2給出了有代表性的分泌量。表2.利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列獲得的轉谷氨酰胺酶原的分泌生產量
(5)通過分散酶消化來切斷轉谷氨酰胺酶原和檢測活性向攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869培養上清加入作為蛋白酶的分散酶(BoeringerManheim公司制)，添加的比例為底物∶酶＝1∶1，于pH7.5、37℃下反應1小時。分散酶消化反應后，通過SDS-PAGE確認轉谷氨酰胺酶原被切情況，再經氧肟酸酯(hydroxamate)法確認轉谷氨酰胺酶活性，可確認具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。實施例5通過茂原鏈輪絲菌的培養液和菌體切斷轉谷氨酰胺酶原和檢測活性(1)通過茂原鏈輪絲菌IFO13819株的培養液切斷轉谷氨酰胺酶原和檢測活性茂原鏈輪絲菌IFO13819菌株用ISP2液體培養基(將酵母提取物4g、麥芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH調節為7.3)于30℃下培養24小時。向10ml該培養液中添加在實施例4(5)中也應用過的蓄積了轉谷氨酰胺酶原的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的經膜過濾器過濾的培養上清10ml，于30℃下保持6小時。然后進行SDS-PAGE，確認帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶被切情況，再經氧肟酸酯法確認具有與天然型大致一樣的比活性(約20U/mg)的轉谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，經半干轉移將蛋白從膠上轉移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上(用于基因克隆的蛋白質結構解析，東京化學同人(1993))。蛋白轉移后，可以用考馬斯亮藍對膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀(Model 476A，Perkin Elmer Co.Ltd制)解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認具有與序列號5所示的天然型成熟轉谷氨酰胺酶一樣的N末端氨基酸序列。(2)通過茂原鏈輪絲菌IFO13819株的菌體切斷帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶和檢測活性茂原鏈輪絲菌IFO13819菌株用ISP2液體培養基于30℃下培養24小時。將10ml該培養液經離心分離收集菌體，用生理鹽水洗2次。將最后收集的菌體懸浮于10ml的生理鹽水中，然后添加在實施例4(5)中也應用過的蓄積了轉谷氨酰胺酶原的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的經膜過濾器過濾的培養上清10ml，于30℃下保持6小時。然后進行SDS-PAGE，確認帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶被切情況，再經氧肟酸酯法確認具有與天然型大致一樣比活性(約20U/mg)的轉谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，經半干轉移將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上(用于基因克隆的蛋白質結構解析，東京化學同人(1993))。蛋白轉移后，可以用考馬斯亮藍對PVDF膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認具有與序列號5所示的天然型成熟轉谷氨酰胺酶一樣的N末端氨基酸序列。實施例6利用具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的編碼序列的融合基因進行轉谷氨酰胺酶原的分泌生產(1)具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的編碼序列的融合基因的構建肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶基因序列已經確定(特原平11-295649)。人們推定第1位到第32位的氨基酸序列為酶的前導(pre)部分的序列，而33到86位的氨基酸序列為前體(pro)部分的序列，而87到416位的氨基酸序列為成熟型轉谷氨酰胺酶的序列。推定的前體結構和成熟蛋白質的氨基酸序列分別如序列號4和43所示。而用含有該基因的質粒pUJ-MTG轉化的大腸桿菌AJ13669于1999年1O月14日以FERM P-17602寄存于通商產業省工業技術院生命工程工業技術研究所(日本國 305-8566茨城縣筑波市東1丁目1-3)，根據布達佩斯條約于2000年8月28日進行移交，寄存號為FERM BP-7287。
首先用限制酶BamHI從pUI-MTG中切出覆蓋前轉谷氨酰胺酶原基因的全長的約3.5kb片段的區域，然后將它插入pUCl9的BamHI位點，制作pUCSCTG。
以pUCSCTG為模板，合成序列號44和序列號45所示的引物，通過同樣的PCR法使含有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶原的基因區域擴增。(序列號44)5’-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3’(序列虧45)5’-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3’<序列表說明)序列號44、45PCR引物接下來，以實施例4(2)構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號46和序列號47組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列的區域擴增。
為了構建與源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的融合基因，序列號47給出的引物含有編碼源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶原的N末端一側的氨基酸的堿基序列。(序列號46)5’-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3’(序列號47)5’-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GG C C-3’<序列表說明>序列號46、47PCR引物接下來，將擴增的編碼含有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶原的基因區域的PCR反應液1μl，與擴增的含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區和含有產氨棒桿菌細胞表面蛋白S1pA的信號序列的區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號46和序列號45進行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌細胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前轉谷氨酰胺酶原基因片段擴增。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴增片段。該片段用EcoRI和BamHI消化后，從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到pUC19的EcoRI-BamHI位點，得到pUKSPTG2’。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認構建了象預想那樣的融合基因。用EcoRI消化該pUKSPTG2’，使用Blunting kit(寶酒造公司制)進行平端化，插入帶有5’-末端磷酸化的5’-CTCTAGAG-3’序列的XbaI接頭(寶酒造公司制)，再環化構建pUKSPTG2。通過用XbaI消化pUKSPTG2，切出大約1.8kb的融合前轉谷氨酰胺酶原基因(轉谷氨酰胺酶原基因源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852)，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后通過將該片段插入到上述pPK4的XbaI位點，構建pPKSPTG2。
然后構建帶有前體結構部分的N末端的一部分被茂原鏈輪絲菌的前體結構部分替換的嵌合前體結構部分的前轉谷氨酰胺酶原基因(成熟型轉谷氨酰胺酶基因和前體結構部分的一部分源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852)。
首先從實施例4(2)構建的質粒pPKSPTG1(用于表達茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶原)切出EcoRI-BamHI的含有大約1.8kb的前轉谷氨酰胺酶原基因的片段，然后插入到pUC19的EcoRI-BamHI位點(pUKSPTG1)。pUKSPTG1用AatII消化，切出大約1.2kb的片段，同時pUKSPTG2’也用AatII消化，制備除去大約1.2kb片段后的約3.3kb片段。將該約3.3kb片段與源自pUKSPTG1的約1.2kb片段連接，按照常規的基因操作法篩選插入了AatII片段的克隆。為了了解其中AatII片段插入的方向，依次進行測序，篩選按目的方向(編碼前轉谷氨酰胺酶原)插入的克隆(pUKSPTG3’)。而對pUKSPTG3’也要象對pUKSPTG2’操作那樣使其EcoRI位點平端化，插入XbaI接頭，構建pUKSPTG3。通過從pUKSPTG3切出XbaI的大約1.8kb片段，插入到pPK4的XbaI位點，構建pPKSPTG3。(2)利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列分泌源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶原用構建的質粒pPKSPTG2和pPKSPTG3轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG2和pPKSPTG3的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分別用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液體培養基(將葡萄糖60g、硫酸鎂7水合物0.4g、硫酸銨30g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鐵7水合物0.01g、硫酸錳5水合物0.01g、硫胺素鹽酸鹽450μg、生物素450μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸鈣50g用水配成1L溶液，pH調節為7.5)分別于30℃條件下培養3天。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。該抗體雖然是抗源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶的抗體，但對源自肉桂鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶也有反應性。結果可以確認，分泌了約30～50mg/L的帶有前體結構部分的源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶。實施例7通過將源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分替換為源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的前體結構部分(制作雜化體)進行轉谷氨酰胺酶原的分泌生產合成序列號14和序列號48所示的引物，利用PCR法分別從pPKSPTG2或pPKSPTG3擴增含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區的5’-上游區和編碼產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分序列的區域的堿基序列。
為了構建含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區的5’-上游區和具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的成熟轉谷氨酰胺酶基因(源自茂原鏈輪絲菌IFO13819)的融合基因(外源融合前轉谷氨酰胺酶原)，序列號48給出的引物含有編碼源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的成熟轉谷氨酰胺酶的N末端一側氨基酸的堿基序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號48)5’-GGG GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GCG CTG G-3’<序列表說明>序列號48PCR引物另外，以實施例1(1)測定的源自茂原鏈輪絲菌的轉谷氨酰胺酶基因序列為基礎，合成序列號8和序列號9所示的引物，利用PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG擴增源自茂原鏈輪絲菌的成熟轉谷氨酰胺酶基因區域。(序列號8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’(序列號9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號8、9PCR引物接下來，將分別擴增的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區的5’-上游區和編碼產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分序列的區域的PCR反應液1μl，與已擴增的源自茂原鏈輪絲菌的成熟轉谷氨酰胺酶基因編碼區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區的5’-上游區和具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分的成熟轉谷氨酰胺酶基因(源自茂原鏈輪絲菌IFO13819)的融合基因片段擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴增片段。使用ScaI和EcoO65I消化該擴增片段，從瓊脂糖凝膠中回收生成的約800bp的片段，通過與從實施例4(2)構建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構建pPKSPTG4和pPKSPTG5。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’(2)利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列和源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的前體結構部分分泌源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶用構建的質粒pPKSPTG4和pPKSPTG5轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG4和pPKSPTG5的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分別用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液體培養基于30℃條件下培養3天。培養結束后，取上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Westernblot解析。結果可以確認帶有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852前體結構部分的源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶的分泌。表3給出了轉谷氨酰胺酶原的產量。用pPKSPTG1作對照，其基因構成上的特點是前體結構部分源自茂原鏈輪絲菌。pPKSPTG4具有其前體結構部分源自肉桂鏈輪絲菌的基因結構上的特點。pPKSPTG5具有其前體結構部分的N末端開始的16個氨基酸源自茂原鏈輪絲菌，而C末端的40個氨基酸源自肉桂鏈輪絲菌的嵌合前體結構的基因結構上的特點。除此之外，其他方面三者是共同的。結果可以看出由于前體結構的氨基酸序列的不同其分泌量存在著明顯的差異。具有嵌合前體結構的分泌量最高。表3.由于前體結構部分的不同對轉谷氨酰胺酶原分泌產量的影響
實施例8絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因的克隆和表達質粒的構建評價(1)具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號序列的帶有前體結構部分的絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因(外源融合絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因)的構建作為白灰淺鏈霉菌產生的絲氨酸蛋白酶SAMP45的基因序列已經確定[J.Baceriol.，179，430-438(1997)]。參考該序列，合成序列號49和序列號50所示的引物，按照先前敘述的方法利用PCR法擴增含有SAMP45的N末端前體結構、成熟SAMP45以及C末端前體結構的基因區。(序列號49)5’-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3’(序列號50)5’-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3’<序列表說明>序列號49、50PCR引物接下來，以實施例4(2)構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號51和序列號52組合，利用相同PCR法擴增含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA基因的信號序列的區域。
為了構建帶有前體結構部分的絲氨酸蛋白酶的融合基因，序列號52含有編碼絲氨酸蛋白酶原的N末端一側的氨基酸的堿基序列。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號52)5’-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3’<序列表說明>序列號51、52用于構建融合前絲氨酸蛋白酶原基因的PCR引物接下來，將分別擴增的編碼SAMP45的N末端前體結構、成熟SAMP45以及含有C末端前體結構的基因區域的PCR反應液各1μl，與已擴增的含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區與含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA基因的信號序列的PCR反應液1μl混合作為模板，用序列號51和50進行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前絲氨酸蛋白酶原基因片段擴增。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約3.9kb的擴增片段。使用HindIII和EcoRI消化PCR產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中回收約3.9kb的片段，通過插入到上述的pVC7的HindIII-EcoRI位點，分別得到pVSS1。按照先前敘述的方法測定插入片段的堿基序列，可確認構建了預想那樣的融合基因。(2)利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白的信號序列分泌絲氨酸蛋白酶用構建的質粒pVSS1轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下培養70小時。該培養液1ml經離心分離，將培養上清與菌體分離。菌體懸浮于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中。絲氨酸蛋白酶活性測定按如下步驟進行。向含有0.25mM的Bz-Phe-Val-Arg-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中加入培養上清或菌體懸浮液50μl，總溶液量為0.6ml，于30℃下反應20分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA(對硝基酰替苯胺)的量確定活性。而一個酶單位為在一分鐘內使1μm的pNA游離所需的酶量。測定結果表明，在培養上清中沒有檢測出絲氨酸蛋白酶的活性，而在菌體懸浮液中可以檢測到活性。通過從檢測出的活性值和文獻[J.Bacteriol.，179，430-438(1997)]中記載的比活值計算的結果，可以確認有約相當于9mg/l的絲氨酸蛋白酶分泌在菌體表面。(3)通過在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達的絲氨酸蛋白酶切去帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分用構建的質粒pVSS1轉化攜有實施例4(2)所述的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的分泌表達質粒pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1、pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下培養70小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。結果表明SAMP正常分泌表達，而且分泌的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分被切去，并可確認分泌具有與天然的成熟轉谷氨酰胺酶大致相同分子量的轉谷氨酰胺酶。
對該培養上清用上述的氧肟酸酯法確認轉谷氨酰胺酶活性時，確認具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經半干轉移將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上。蛋白轉移后，用考馬斯亮藍對膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認，序列號5所示的源自茂原鏈輪絲菌的天然型的成熟轉谷氨酰胺酶帶有前體結構部分的C末端一側氨基酸的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸的結構。實施例9脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因的克隆和表達質粒構建評價(1)茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的純化將800ml的ISP2液體培養基(將酵母提取物4g、麥芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH調節為7.3)加到5L坂口燒瓶中，將茂原鏈輪絲菌IFO13819株從板上移植到培養基中，于30℃下，以120rpm速度振蕩培養48小時。
對培養液進行離心分離，去除培養上清回收菌體。用含有25mg/l的卡那霉素的20mM Tris-HCl緩沖液洗凈后，將得到的菌體懸浮于含有25mg/l的卡那霉素的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。于冰上振蕩4小時后，通過離心分離回收上清。用硝酸纖維素膜(孔徑0.22μm，Satrius公司制)過濾滅菌后，用FPLC(Amarsham Pharmacia公司制)通過用1.5M硫酸銨/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的丁基-瓊脂糖4FF(Amarsham Pharmacia公司制)柱(1.6φ×10cm)，用同一緩沖液中硫酸銨1.5-0M的線性濃度梯度進行洗脫。回收含有活性成分的組分，再于相同的條件通過苯基-瓊脂糖HP柱(1ml，AmarshamPharmacia公司制)，回收活性組分，然后對50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)于4℃下透析過夜。通過以上操作可獲得部分純化的酶液。
表4給出了上述各個階段的總蛋白量、總活性、比活性、收率以及純化程度。而各個階段的酶活性的測定按照芳本等人的方法(鶴·船津編；生物化學實驗法31蛋白質分解酶II，學會出版中心(1993)，p187)按如下步驟進行。
向含有0.25mM的Ala-Ala-Pro-pNA(Bachem公司制)的20mM磷酸鈉緩沖液中加入酶溶液，總溶液量為0.6ml，于30℃下反應5分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA的量確定活性。一個酶活性單位為在1分鐘內使1μmol的pNA游離所需的酶量。表4.茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的純化純化步驟體積總活性 總蛋白量比活性收率 純化度(ml)(單位)(mg) (單位/mg) (％) (倍)粗酶提取液 550 308 385 0.80 100 1丁基-瓊脂糖 45.6 213 8.9823.7 69 304FF苯基-瓊脂糖 5.8 136 3.8335.5 44 44HP(2)茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的N末端氨基酸序列的解析部分純化的酶液用反相柱色譜進一步純化。反相柱色譜的條件如下。HPLC裝置泵HITACHI L-6300，檢測器L-4000H柱子PROTEIN C4 214TP5410(VYDAC公司制)洗脫條件24-40％乙腈線性梯度/0.1％三氟乙酸(20分鐘)，于室溫下進行洗脫流速1.0ml/min檢測波長280nm將上述條件下純化的酶樣品用Membrane Cartridge(PerkinElmer公司制)轉移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上，利用氣相蛋白測序儀PPSQ-10(島津制作所制)解析N末端氨基酸序列。結果可得到序列號53所示的N末端的20個氨基酸殘基序列。(序列號53)Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile leu Lys Ile Pro1 5 10Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys15 20(3)茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的特性評價就以下特性對茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶進行了評價(i)底物特異性(a)以帶有發色基團pNA的肽為底物時向含有附加了pNA的各種肽(濃度都是0.25mM)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)加入純化的酶溶液，總溶液量為0.6ml，于37℃下反應5分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應。測定410nm的吸光度，求出酶切活性。(b)以帶有發色基團βNA(β-萘甲酰胺)的肽為底物時向含有各種肽(濃度都是0.3mM)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)加入純化的酶溶液，總溶液量為1.0ml，于37℃下反應5分鐘后，加0.4ml的Fastgarnet GBC溶液(用10％Triton X-100/1M乙酸鈉(pH4.0)溶解，使濃度為0.1％)終止反應。測定550nm的吸光度，求出酶切活性。(c)以肽為底物時以配成1mg/ml的肽溶液為底物，加酶液，于30℃下反應1小時。通過以下條件的HPLC確認酶切活性。柱子YMC-PACK ODS-A 4.6×150mm(YMC)洗脫液0.1％三氟乙酸(TFA)-乙腈流速1ml/min檢測波長UV220nm結果表明，該酶是特異切斷脯氨酸的羧基側肽鍵的酶，能很好地依次識別Ala-Ala-Pro-pNA、Pro-Arg-Ala-Xaa(序列號68)(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA代表對硝基酰替苯胺)、Ala-Phe-Pro-pNA，對含有從N末端開始的第3位或第4位脯氨酸的肽有很高的反應性。但對含有從N末端開始的第2位或第5位脯氨酸的肽沒有作用(表5)。
表5.svPEP的特異性P52
PNA對硝基酰替苯胺，βNAβ-萘甲酰胺<序列表說明>序列號68svPEP用底物(ii)最適pHpH4～620mM乙酸鈉緩沖液pH5.5～820mM磷酸鈉緩沖液pH6.5～9.520mM Tris-HCl緩沖液分別使用以上3種緩沖液，以Ala-Ala-Pro-pNA為底物，于30℃下反應5分鐘。以20mM磷酸鈉緩沖液pH6.5時的活性為100％，算出使用各種緩沖液時的相對活性。結果表明，最適pH為6～6.5。(iii)pH穩定性使用pH3至10的0.15M GTA緩沖液(由3，3-二甲基戊二酸、三(羥甲基)氨基甲烷、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇配成的緩沖液)，向20μl純化的酶液中加入各種pH的緩沖液40μl，于4℃下放置過夜后，將pH調到7.0，溶液量調到120μl。取出其中的50μl加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反應5分鐘。以pH為7.0、以及在與上述相同條件下保存時的活性為100％，各個pH下的相對底物分解量為殘余活性。結果表明在pH4～9范圍內穩定。(iv)最適溫度向50μl純化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其終濃度為0.25mM，從20℃到60℃進行5分鐘的分解反應。以25℃下的底物分解量為100％時的各個溫度的相對分解量作為相對活性。結果表明最適溫度為25～30℃。(v)溫度穩定性向50μl純化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，于4℃或20℃到60℃處理15分鐘，冰冷后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其終濃度為0.25mM，于30℃下反應5分鐘。以上述4℃下處理時的活性為100％算出殘余活性。結果表明20℃以下時穩定。(vi)抑制劑向含有如表6所示濃度的各種化合物的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中加入純化的酶溶液，于室溫下放置10分鐘。然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反應5分鐘。以對沒有添加化合物時的Ala-Ala-Pro-pNA的活性為100％，以添加各種化合物時的相對底物分解量為相對活性。結果表明，雖然也受到作為SH酶抑制劑的對氯汞苯甲酸等的一些抑制，但受到作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的苯基甲基磺酰氟(Nakaraitesk公司制)和氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽(BoeringerManheim公司制)的抑制作用比較強。表6.抑制劑對茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶活性的影響
(3)源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因的獲得在從測定的svPEP的N末端20個氨基酸序列中推定的堿基序列中選出簡并少的部位Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-G1u-Glu-Lys，制備序列號54所示的合成寡核苷酸。以該合成寡核苷酸為探針，用識別6堿基序列的各種限制酶消化按照常規方法制備的茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA，通過Southern blot雜交進行解析，可檢測出經SacI剪切的約6kb的單一帶。于是再用SacI消化按照前面方法制備的茂原鏈輪絲茵IFO13819的染色體DNA，利用EASYTRAPVer.2(寶酒造公司制)通過瓊脂糖凝膠電泳回收約6kb片段。將回收的片段插入到pUC18的SacI位點后，導入大腸桿菌IM109(寶酒造公司制)的感受態細胞，制備文庫。通過用32P標記的序列號54所示的合成寡核苷酸作為探針，對制備的文庫用茵落雜交來進行文庫的篩選，篩選攜有svPEP基因片段被克隆的質粒的菌株，獲得目的基因。從該菌株回收的質粒命名為pUMP1。(序列號54)5’-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3’<序列表說明>序列號54用于篩選svPEP的探針測定以pUMP1克隆的片段的堿基序列。序列號41給出了對應于svPEP的svPEP基因序列。推定該基因編碼的氨基酸序列時，發現了由先前純化的酶蛋白測定的N末端部分氨基酸序列(20個殘基)，進而確定了序列號40所示的成熟型svPEP的氨基酸一級序列。另外也確定了含有序列號42所示的svPEP的信號序列以及估計為前體結構的區域的整個氨基酸一級序列。
用pUMP1轉化的大腸桿菌AJ13691以FERM BP-7160編號于2000年5月15日按照布達佩斯條約寄存于通商產業省工業技術院生命工程工業技術研究所(日本國 305-8566茨城縣筑波市東1丁目1-3)。(4)具有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白的信號序列的帶有前體結構部分的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因(外源融合前脯氨酸特異性肽酶(svPEP)原基因)的構建以實施例9(3)測定的svPEP的序列為參考，以實施例9(3)構建的pUMP1為模板，合成序列號55和序列號56所示的引物，按照前面同樣的方法利用PCR法擴增含有svPEP的前體結構以及成熟svPEP的基因區域。(序列號55)5’-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3’(序列號56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’<序列表說明>序列號55、56PCR引物接下來，用實施例4(2)中構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號51和序列號57的組合，利用PCR法擴增含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA基因的信號序列的區域。
為了構建與帶有前體結構部分的svPEP的融合基因，序列號57所示的引物含有編碼svPEP的N末端一側的氨基酸的序列。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號57)5’-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3’<序列表說明>序列號57PCR引物接下來，將分別擴增的含有svPEP的前體結構以及成熟svPEP的基因區域的PCR反應液各1μl，與已擴增的含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列的區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號51和序列號56進行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前svPEP原基因片段擴增。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約2.1kb的擴增片段。使用HindIII消化PCR產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中回收約2.1kb的片段，通過插入到實施例8(1)所述的pVSS1的HindIII位點，分別得到pVSSSP1。按照常規方法測定插入片段的堿基序列，可確認構建了預想那樣的融合基因。(5)利用產氨棒桿菌的細胞表面蛋白的信號序列分泌脯氨酸特異性肽酶用構建的質粒pVSSSP1轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSSSP1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下培養70小時。該培養液1ml經離心分離，將培養上清與菌體分離。菌體懸浮于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。svPEP的活性按下述步驟測定。向含有0.25mM的Ala-Ala-Prp-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中加入培養上清或菌體懸浮液50μl，總溶液量為0.6ml，于30℃下反應20分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA的量確定活性。而一個酶單位為在一分鐘內使1μm的pNA游離所需的酶量。測定結果表明，在培養上清中沒有檢測出svPEP的活性，而在菌體懸浮液中可以檢測到活性。通過從檢測出的活性值和實施例9(1)的比活性值計算的結果可以確認有約相當于50mg/l的svPEP分泌在菌體表面。(6)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達的絲氨酸蛋白酶和脯氨酸特異性肽酶切去帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分用構建的質粒pVSSSP1轉化攜有實施例4(2)所述的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的分泌表達質粒pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSSSP1、pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下培養70小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。結果表明SAMP45和svPEP正常分泌表達，而且分泌的帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分被切去，能夠確認與天然的成熟轉谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的轉谷氨酰胺酶的分泌。
對該培養上清用上述的氧肟酸酯法確認轉谷氨酰胺酶活性時，確認具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經半干轉移將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上。蛋白轉移后，用考馬斯亮藍對膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認獲得了與序列號5所示的源自茂原鏈輪絲菌的天然型成熟轉谷氨酰胺酶一樣的，N末端的氨基酸為Asp的序列。實施例10源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分的部分缺失體構建和轉谷氨酰胺酶的分泌生產(1)前體結構部分的部分缺失型轉谷氨酰胺酶基因的構建首先為了構建前體結構部分的C末端一側的氨基酸殘基的部分缺失型，以實施例1(1)測定的轉谷氨酰胺酶的基因序列為基礎，合成如序列號8和9所示的引物，利用與前面相同的PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG中擴增成熟轉谷氨酰胺酶的基因區域。
接下來，用實施例4(2)中構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號58的組合，或者序列號14與序列號59的組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列以及轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的基因區域擴增。
為了構建與成熟轉谷氨酰胺酶的融合基因，序列號58所示的引物含有缺失了轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的C末端2個氨基酸殘基序列Ala-Pro的基因序列，序列號59所示的引物具有缺失了轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的C末端4個氨基酸殘基序列Phe-Arg-Ala-Pro的基因序列，同時還都含有編碼成熟轉谷氨酰胺酶的N末端一側的氨基酸的序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTCATTTAG-3’(序列號58)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CCG GCG C-3’(序列號59)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’<序列表的說明>序列號58、59PCR引物接下來，將分別擴增的含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和編碼含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列以及各個變異前體結構部分的區域的基因區域的PCR反應液各1μl，與已擴增的編碼成熟轉谷氨酰胺酶的區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列以及轉谷氨酰胺酶的部分缺失型前體結構部分相連的成熟轉谷氨酰胺酶基因片段分別擴增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的各個擴增片段。從瓊脂糖凝膠中回收使用ScaI和EcoO65I消化這些片段生成的約800bp的片段，通過與從實施例4(2)構建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構建pPKSPTG1ΔAP(Ala-Pro缺失型)和pPKSPTG1ΔFRAP(Phe-Arg-Ala-Pro缺失型)。
為了構建前體結構部分的N末端一側的氨基酸殘基的部分缺失型，以實施例1(1)測定的轉谷氨酰胺酶的基因序列為基礎，合成如序列號60和61所示的引物，通過序列號60和序列號9的組合，或者序列號61和序列號9的組合，利用PCR法從實施例1(1)中得到的pUITG中擴增轉谷氨酰胺酶原的基因區域。(序列號60)5’-AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T-3’(序列號61)5’-GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號60、61PCR引物接下來，用實施例4(2)中構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號62的組合，或者序列號14與序列號63的組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列的區域擴增。
為了構建與產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列的融合基因，序列號62所示的引物具有缺失了轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的N末端1個氨基酸殘基Asp的基因序列，序列號63所示的引物具有缺失了轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的N末端6個氨基酸殘基的序列Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu的基因序列，同時還都含有編碼產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列的C末端一側的氨基酸的序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號62)5’-GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’(序列號63)5’-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’<序列表說明>序列號62、63PCR引物接下來，將分別擴增的含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和編碼含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列的區域的基因區域的PCR反應液各1μl，與已擴增的編碼前體結構部分的N末端部分缺失的轉谷氨酰胺酶原的區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列以及轉谷氨酰胺酶的部分缺失型前體結構部分相連的成熟轉谷氨酰胺酶基因片段擴增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出大約1.8kb的各個擴增片段。從瓊脂糖凝膠中回收用ScaI和EcoO65I消化這些片段生成的約800bp的片段，通過與從實施例4(2)構建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構建pPKSPTG1ΔD(Asp缺失型)以及pPKSPTG1ΔDNGAGE(Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu缺失型)。(2)前體結構部分缺失型轉谷氨酰胺酶的分泌用構建的質粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE轉化的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下分別培養48小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。結果可以確認前體結構部分部分缺失的轉谷氨酰胺酶的分泌。雖然帶有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD的重組體分別都表現出與天然型(pPKSPTG1)同等的分泌性，但帶有pPKSPTG1ΔDNGAGE的重組體的分泌量只是天然型(pPKSPTG1)分泌量的一半。(3)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達的絲氨酸蛋白酶切去前體結構部分缺失型轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分用實施例8(1)構建的質粒pVSSSP1轉化攜有實施例10(2)所述的前體結構部分缺失型轉谷氨酰胺酶原的分泌表達質粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1和pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下分別培養70小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。
結果表明SAMP45正常分泌表達，而且分泌的前體結構部分缺失型轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分被切去，能夠確認與天然的成熟轉谷氨酰胺酶具有大致相同的分子量的轉谷氨酰胺酶的分泌。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經半干轉移將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上。蛋白轉移后，用考馬斯亮藍對膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認，攜有pPKSPTG1△AP的重組體在序列號5所示的天然成熟型轉谷氨酰胺酶的N末端附加了Phe-Arg；攜有pPKsPTG1△FRAP的重組體在成熟型轉谷氨酰胺酶的N末端附力口了Ser-Ala-Gly-Pro-Ser；攜有pPKSPTG1△D及pPKSPTG1△DNGAGE重組體在成熟轉谷氨酰胺酶中附加了Phe-Arg-Ala-Pro。實施例11源白茂原鏈輪絲茵IFO13819的轉谷氨酰胺酶原的前體結構部分的變異體構建和轉谷氨酰胺酶的分泌生產(1)前體結構部分變異型轉谷氨酰胺酶原基因的構建以實施例1(1)測定的轉谷氨酰胺酶的基因序列為基礎，合成如序列號8和9所示的引物，利用PcR法從實施例1(1)中得到的puITG中擴增成熟轉谷氨酰胺酶的基因區域。
接下來，用實施例4(2)中構建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號64的組合，或者序列號14與序列號65的組合，或者序列號14與序列號66的組合，序列號14與序列號67的組合，利用PcR法使含有谷氨酸棒桿茵的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區域的5’-上游區和含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白質S1pA的信號序列以及轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的區域擴增。
序列號64所示的引物含有將轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的C末端3個氨基酸殘基序列Arg-Ala-Pro轉換為Gly-Pro-Lys的基因序列，而序列號65所示的引物含有將轉谷氨酰胺酶的前體結構部分的C末端3個氨基酸殘基序列Arg-Ala-Pro轉換為Gly-Pro-Arg的基因序列。序列號66所示的引物含有將前體結構部分的C末端5個氨基酸殘基序列Ser-Phe-Arg-Ala—Pro僅轉換為Lys的基因序列，而序列號67所示的引物具有將Ser-Phe-Arg-Ala-Pro僅轉換為Arg的基因序列。
為了構建與成熟轉谷氨酰胺酶的融合基因，還都舍有編碼成熟轉谷氨酰胺酶的N末端一側的氨基酸序列的序列。(序列號14) 5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號64) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’(序列號65) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’(序列號66) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’(序列號67) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’<序列表說明>序列號64～67PCR引物接下來，將分別擴增的含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和編碼含有產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列以及變異型前體結構部分的區域的基因區域的PCR反應液各1μl，與已擴增的編碼成熟轉谷氨酰胺酶的區域的PCR反應液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細胞表面蛋白質PS2基因的啟動子區的5’-上游區和產氨棒桿菌的細胞表面蛋白S1pA的信號序列以及變異型轉谷氨酰胺酶的前體結構部分相連的成熟轉谷氨酰胺酶基因片段擴增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的0000擴增片段。從瓊脂糖凝膠中回收用ScaI和EcoO65I消化該片段后生成的約800bp的片段，通過與從實施例4(2)構建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構建pPKSPTG11(Gly-Pro-Lys變異型)和pPKSPTG12(Gly-Pro-Arg變異型)，pPKSPTG13(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Lys插入變異型)和pPKSPTG14(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Arg插入變異型)。(2)前體結構部分變異型轉谷氨酰胺酶的分泌用構建的質粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14轉化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下分別培養48小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。結果可以確認帶有前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的分泌。(3)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達的絲氨酸蛋白酶切去帶有變異型前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分用實施例8(1)構建的質粒pVSS1轉化攜有實施例11(2)所述的帶有改造的前體結構部分轉谷氨酰胺酶的分泌表達質粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1和pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/ml的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養基于30℃下分別培養70小時。取培養結束后的上清液10μl進行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉谷氨酰胺酶抗體，按照常規方法進行Western blot解析。結果表明SAMP45正常分泌表達，而且分泌的帶有變異型前體結構部分的轉谷氨酰胺酶的變異型前體結構部分被切去，能夠確認與天然的成熟轉谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的轉谷氨酰胺酶的分泌。
另外，在SDS-PAGE后，按照常規方法經半干轉移將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上。蛋白轉移后，用考馬斯亮藍對膜進行染色、脫色、風干。將成熟轉谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結果可以確認攜有pVSS1和pPKSPTG11、或者pVSS1和pPKSPTG12的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分泌的轉谷氨酰胺酶的序列是與序列號5所示的天然型成熟轉谷氨酰胺酶一樣的，N末端為Asp的序列。另外攜有pVSS1和pPKSPTG13、或者pVSS1和pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分泌的轉谷氨酰胺酶序列是在天然型成熟轉谷氨酰胺酶附加了Ser-Ala-Gly-Pro-Lys(序列號69)，或者Ser-Ala-Gly-Pro-Arg(序列號70)的序列。
前者具有與天然型轉谷氨酰胺酶一樣氨基酸序列的培養上清用氧肟酸酯法確認有轉谷氨酰胺酶活性，而且具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。<序列表說明>序列號69、70附加在天然的轉谷氨酰胺酶的序列利用本發明可以通過棒桿菌屬細菌使有用的外源蛋白、特別是轉谷氨酰胺酶大量生成，并有效地分泌到菌體外。由于通過本發明生成的蛋白質可釋放到培養基中，所以利用已知的適當的方法可以簡便而且大規模地從培養基中直接回收蛋白質。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>轉谷氨酰胺酶的制備方法<130>Y1H0862<140><141><150>JP 11-280098<151>1999-09-30<150>JP 2000-194043<151>2000-06-28<160>70<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<400>1Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala20 25 30<210>2<211>25<212>PRT<213>產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)<400>2Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala1 5 10 15Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala
20 25<210>3<211>45<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>3Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg1 5 10 15Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala20 25 30Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro35 40 45<210>4<211>54<212>PRT<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>4Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr20 25 30Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser35 40 45Ala Pro Ser Arg Ala Pro50<210>5<211>331<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>5Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn20 25 30Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg35 40 45Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys50 55 60Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn 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Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp290 295 300Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro325 330<210>6<211>782<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(579)..(782)<400>6aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttcggaggt gtctattctt accaaatcgt 60caagttgtgg gtagagtcac ctgaatatta attgcaccgc acgggtgata tatgcttatt 120tgctcaagta gttcgaggtt aagtgtattt taggtgaaca aatttcagct tcgggtagaa 180gactttcgat gcgcttcaga gcttctattg ggaaatctga caccacttga ttaaatagcc 240tacccccgaa ttgggggatt ggtcattttt tgctgtgaag gtagttttga tgcatatgac 300ctgcgtttat aaagaaatgt aaacgtgatc agatcgatat aaaagaaaca gtttgtactc 360aggtttgaag cattttctcc gattcgcctg gcaaaaatct caattgtcgc ttacagtttt 420tctcaacgac aggctgctaa gctgctagtt cggtggccta gtgagtggcg tttacttgga 480taaaagtaat cccatgtcgt gatcagccat tttgggttgt ttccatagca atccaaaggt 540ttcgtctttc gatacctatt caaggagcct tcgcctct atg ttt aac aac cgt atc 596Met Phe Asn Asn Arg Ile1 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Tyr Phe Arg Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Met Asn Gly Thr Val180 185 190Ala Tyr Val Ala Pro Asn Asp Val Asn Asp Lys Glu Asp Ser Ala Tyr195 200 205Asp Lys Phe Phe Gln Asn Val Gly Asp Lys Ala Cys Arg Thr Gln Leu210 215 220Asn Ser Val Gln Arg Glu Ala Leu Val Arg Arg Asp Glu Ile Val Ala225 230 235 240Arg Tyr Glu Lys Trp Ala Lys Glu Asn Gly Lys Thr Phe Lys Val Val245 250 255Gly Ser Ala Asp Lys Ala Tyr Glu Asn Val Val Leu Asp Leu Val Trp260 265 270Ser Phe Trp Gln Tyr His Leu Gln Ser Asp Cys Ala Ser Val Pro Ala275 280 285Thr Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Asp Asp Ile Ser290 295 300Gly Phe Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gly Leu Glu Ara Phe Thr Pro Tyr305 310 315 320Tyr Tyr Gln Ala Gly Thr Gln Leu Gly Ala Pro Thr Val Lys Asn Pro325 330 335His Leu Lys Gly Val Leu Arg Tyr Pro Gly Ile Asn Gln Pro Arg Ser340 345 350Tyr Val Pro Arg Asp Ile Pro Met Thr Phe Arg Pro Gly Ala Met Ala355 360 365Asp Val Asp Arg Trp Val Arg Glu Asp Ser Arg Asn Met Leu Phe Val370 375 380Tyr Gly Gln Asn Asp Pro Trp Ser Gly Glu Pro Phe Arg Leu Gly Lys385 390 395 400Gly Ala Ala Ala Arg His Asp Tyr Arg Phe Tyr Ala Pro Gly Gly Asn405 410 415His Gly Ser Asn Ile Ala Gln Leu Val Ala Asp Glu Arg Ala Lys Ala420 425 430Thr Ala Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Val Ala Pro Gln Ala Val Gln435 440 445Lys Asp Glu Lys Ala Ala Lys Pro Leu Ala Pro Phe Asp Ala Lys Leu450 455 460Asp Arg Val Lys Asn Asp Lys Gln Ser Ala Leu Arg Pro465 470 475<210>43<211>330<212>PRT<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>43Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro1 5 10 15Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn20 25 30Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys35 40 45Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val50 55 60Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala65 70 75 80Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr85 90 95Ser Pro Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala100 105 110Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val115 120 125Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr130 135 140Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn Asp Ala Leu145 150 155 160Leu Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr165 170 175Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met180 185 190Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg195 200 205Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro210 215 220Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser Ile Pro225 230 235 240Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly245 250 255Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr260 265 270His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His275 280 285Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe290 295 300Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr305 310 315 320Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro325 330<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>44ggcgatgggg aagagaaggg g 21<210>45<21l>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>45ggcggatcct cgcgtcgaga ggcgtggact ga 32<210>46<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>46tacgaattcg agctcggtac c 21<210>47<211>43<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>47ccccttctct tccccatcgc ctgccgttgc cacaggtgcg gcc 43<210>48<211>46<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>48ggggtgaccc tgtcgtcgga gtcgggggcc cgggagggcg cgctgg 46<210>49<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>49aacggggaga acagcacggc cgccgg 26<210>50<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>50ggcgaattct ccggcgggcc gtcaccggt 29<210>51<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>51ggcaagctta aattcctgtg aattagctga 30<210>52<211>44<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>52cggccgtgct gttctccccg tttgccgttg ccacaggtgc ggcc 44<210>53<211>20<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>53Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe1 5 10 15Val Glu Glu Lys20<210>54<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述svPEP的探針<400>54aagatccccg ggatgaagtt cgtcgaggag aag 33<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>55gaggcggcgt cgatcaccgc ccc23<210>56<211>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>56gccaagcttg aagcaccggc ggcggcaccc gg 32<210>57<211>46<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>57ggggcggtga tcgacgccgc ctctgccgtt gccacaggtg cggcca46<210>58<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>58gtgaccctgt cgtcggagtc ccggaacgac gggccggcgc 40<210>59<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PGR引物<400>59gtgaccctgt cgtcggagtc cgacgggccg gcgctcgaag 40<210>60<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>60aatggcgcgg gggaagagac gaagtcctac gccgaaacct 40<210>61<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>61gagacgaagt cctacgccga aacctaccgc ctcacggcgg 40<210>62<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>62gtctcttccc ccgcgccatt tgccgttgcc acaggtgcgg40<210>63<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>63tcggcgtagg acttcgtctc tgccgttgcc acaggtgcgg 40<210>64<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>64gtgaccctgt cgtcggagtc cttggggccg aacgacgggc 40<210>65<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>65gtgaccctgt cgtcggagtc gcgggggccg aacgacgggc 40<210>66<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>66gtgaccctgt cgtcggagtc cttcgggccg gcgctcgaag 40<210>67<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>67gtgaccctgt cgtcggagtc 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1.一種外源分泌型蛋白質的制備方法，其特征在于，對攜有在棒桿菌中發揮功能的啟動子的下游連接編碼源自棒桿菌的信號肽區的核酸序列、再在編碼上述信號肽區的核酸序列的下游連接編碼含有前體結構部分的外源分泌型蛋白質的核酸序列的表達基因重組體的棒桿菌進行培養，使上述外源分泌型蛋白質在上述棒桿菌中生成并分泌、然后從上述外源分泌型蛋白質中切除前體結構部分。
2.權利要求1所述的方法，其中，外源分泌型蛋白質是轉谷氨酰胺酶。
3.權利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自棒桿菌的細胞表面蛋白質的信號肽。
4.權利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的細胞表面蛋白質的信號肽。
5.權利要求4所述的方法，其中，信號肽具有序列號1或29所示的氨基酸序列。
6.權利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的細胞表面蛋白質的信號肽。
7.權利要求6所述的方法，其中，信號肽具有序列號2所示的氨基酸序列。
8.權利要求1～7任一項所述的方法，其中，前體結構部分相當于源自放線菌的轉谷氨酰胺酶的前體結構部分。
9.權利要求8所述的方法，其中，前體結構部分具有序列號3或4所示的序列。
10.權利要求8所述的方法，其中，前體結構部分包括序列號3或4所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸發生置換、或缺失、或插入、或添加、或它們的組合。
11.權利要求10所述的方法，其中，前體結構部分的氨基酸序列為序列號30～38所示的氨基酸序列中任意一種。
12.權利要求1或2所述的方法，其中，前體結構部分的切除是通過蛋白酶實施的。
13.權利要求12所述的方法，其特征在于，生成和分泌外源分泌型蛋白質的棒桿菌還生成蛋白酶。
14.權利要求13所述的方法，其中，前體結構部分的切除是通過蛋白酶和肽酶實施的。
15.權利要求14所述的方法，其特征在于，生成和分泌外源分泌型蛋白質的棒桿菌還生成蛋白酶和肽酶。
16.權利要求12或14所述的方法，其中，蛋白酶源自放線菌。
17.權利要求12或14所述的方法，其中，蛋白酶源自白灰淺鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
18.權利要求14所述的方法，其中，肽酶源自放線菌。
19.權利要求14所述的方法，其中，肽酶源自茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)。
20.權利要求2～11任一項所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶是源自放線菌的轉谷氨酰胺酶。
21.權利要求20所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶是源自茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)的轉谷氨酰胺酶。
22.權利要求21所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶具有序列號5所示的氨基酸序列。
23.權利要求20所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶是源自肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)的轉谷氨酰胺酶。
24.權利要求23所述的方法，其中，轉谷氨酰胺酶具有序列號43所示的氨基酸序列。
25.一種分泌生產成熟型轉谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，在棒桿菌中生成和分泌在源自棒桿菌的信號肽的下游連接成熟型轉谷氨酰胺酶的融合蛋白。
26.具有以下性質的脯氨酸特異性肽酶，(1)可作用于以下含脯氨酸的肽中的至少一個肽，并可在脯氨酸的羧基側切斷該肽、Ala-Ala-Pro-pNA、Ala-Phe-Pro-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-pNA(式中，pNA表示對硝基酰替苯胺)(2)最適pH為6.0～6.5、(3)pH4～9時穩定、(4)最適溫度為25～30℃、(5)20℃以下時穩定、(6)活性可被苯基甲基磺酰氟、氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽抑制、(7)等電點為10.2、(8)分子量大約為50,000。
27.權利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶，它源自放線菌。
28.一種多肽，它含有序列號40所示的氨基酸序列，并具有權利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶活性。
29.一種多肽，它包括序列號40所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸發生置換、或缺失、或插入、或添加、或它們的組合，并具有權利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶活性。
30.一種核酸分子，它編碼權利要求28或29所述的多肽。
全文摘要
本發明涉及在棒桿菌中分泌生產外源蛋白,特別是轉谷氨酰胺酶的方法。本發明提供通過使工業生產上有用的外源蛋白,特別是轉谷氨酰胺酶在棒桿菌中生成,并有效地釋放到菌體外(分泌生產)來制備外源蛋白,特別是轉谷氨酰胺酶的方法。使用編碼源自棒桿菌的信號肽區的序列下游結合含有前體結構部分的目的外源蛋白質基因序列,特別是轉谷氨酰胺酶原基因序列的表達重組體,將該表達型基因重組體導入棒桿菌,培養轉化的棒桿菌,釋放到菌體外的蛋白質通過用蛋白酶等進行處理切去前體結構部分,制備目的外源蛋白質,特別是轉谷氨酰胺酶。
文檔編號C12N9/52GK1377413SQ00813733
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月29日 優先權日1999年9月30日
發明者菊池慶實, 伊達雅代, 梅澤有希子, 橫山敬一, 松井裕 申請人:味之素株式會社