應用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物的制作方法

            文檔序號:565493閱讀:1084來源:國知局
            專利名稱:應用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物的制作方法
            1.概述本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA克隆和亞克隆的方法和組合物。在一個具體實施方案中,應用RecE/T或Redα/β重組酶,或任何功能等價系統啟動細菌同源重組,如來自噬菌體P22的erf。具體地說,本發明涉及克隆方法,診斷方法,含有用作克隆載體的多核苷酸的組合物,含有所述多核苷酸組合物的細胞,以及由RecE/T和Redα/β介導的克隆試劑盒。
            2.發明背景在大腸桿菌中進行DNA克隆和亞克隆是分子生物學的基礎。DNA克隆是指一個過程,其中一個復制起點操作性連接于雙鏈DNA片段,并在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴增。DNA亞克隆也是指一個過程,其中雙鏈DNA片段取自一個業已擴增的DNA分子,所述擴增可以在體外進行,如通過PCR,也可在體內進行,如在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴增,然后將該DNA片段操作性連接于復制起點。在大腸桿菌中進行的典型克隆和亞克隆是將DNA片段的末端與線性化載體末端連接,所述載體包括大腸桿菌的復制起點和可選擇標記。載體包括的可選擇標記可以確保新克隆的產物、含有插入片段的質粒在導入其宿主細胞大腸桿菌時,可以保留并擴增。
            傳統的克隆方法具有某些局限性。例如,因為傳統的克隆方法需要應用限制性酶,因此DNA片段的選擇就受到一定限制,即目標DNA區域內必須有限制性酶的識別位點。限制性位點必須使酶切位于所需DNA片段之外,而不能存在其中。由于絕大多數有用的限制性酶發揮作用相當頻繁,因此所得線性DNA片段的大小也受到限制。
            應用聚合酶鏈反應(PCR)產生DNA片段是傳統亞克隆的第二個主要缺陷。PCR產物的末端不能用于連接反應,因為耐熱聚合酶在擴增的PCR產物3’末端添加了非模板核苷酸。而且,應用PCR還具有突變的高風險。因此,分子生物學家正在尋求新的更加有效的克隆DNA片段的方法,特別是當這些片段比通過傳統的限制性酶或PCR方法所能獲得的片段長時。
            同源重組是克隆和亞克隆DNA片段的另一種替代方法。在含有宿主同源重組系統的大腸桿菌中亞克隆PCR產物的方法業已有述(Olineret al.,1993,Nucleic Acids Res.215192-97;Bubeck et al.,1993,Nucl.Acids.Res.213601-3602)。在這些方法中,用于擴增目標DNA片段的PCR引物,被設計為含有的末端序列與線性化的載體末端序列同源。然后將PCR產物和線性化載體導入大腸桿菌。在大腸桿菌宿主細胞中進行的同源重組使PCR產物序列插入到質粒載體中。盡管這些方法業已顯示可以用于亞克隆PCR片段,但它們還沒有用于亞克隆較長的DNA片段,或者克隆任何大小的DNA片段。
            另一種描述的體內亞克隆方法是應用兩個線性DNA分子轉化大腸桿菌sbcBC宿主細胞,這兩個DNA分子中的一個具有復制起點,兩個分子在其末端都有較長的同源區域。同源重組在體內發生,導致新形成的質粒的環化和增殖(Degryse,1996,Gene 17045)。然后,大腸桿菌sbcBC宿主細胞介導同源重組的這種能力,又用于亞克隆來自腺病毒和皰疹病毒基因組DNAs的大型DNA片段(Chartier et al.,1996,J.Virol.704805;Messerle,et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,14759-14763;He,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 952509-2514)。如其所述,通過在大腸桿菌sbcBC宿主細胞中進行同源重組需要至少兩個預先準備的亞克隆步驟,使較長的同源區域位于大腸桿菌復制起點的兩側。而且,還沒有文獻表明可以在大腸桿菌sbcBC菌株中進行DNA克隆。
            最近,由RecE/RecT(RecE/T)或Redα/Redβ(Redα/β)介導的同源重組業已顯示可以用于在大腸桿菌中制備DNA分子(Zhang et al.,1998,Nature Genetics,20,123-128;Muyrers et al.,1999,Nucleic AcidsRes.271555-1557)。這些文獻顯示,在大腸桿菌中,任何完整獨立的復制,環狀DNA分子都可通過RecE/T或Redα/β介導的重組來改變,該重組應用線性DNA,該線性DNA分子的側翼短區域序列與環狀分子的對應區域一致。通過同源重組技術將線性DNA分子整合到環狀分子中,使其側翼序列間的序列置換環狀DNA分子的相應序列。
            本文引用的文獻不應理解為這就是本發明的現有技術。
            3.發明概述本發明提供應用細菌重組酶介導的同源重組進行DNA克隆和亞克隆的方法和組合物。細菌重組酶優選RecE/T和/或Redα/β。這些方法可以用來克隆、亞克隆、增殖和擴增目標多核苷酸或多核苷酸混合物,使用包括與目標指定靶DNA序列側翼序列同源的DNA短區域和一個復制起點的載體。
            在一個實施方案中,本發明提供了一種將雙鏈靶DNA導入載體的方法,包括培養表達功能性重組酶的細菌,所述細菌包括(a)靶DNA,含有第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端,以及(b)載體DNA,在載體DNA鏈上以下述順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)復制起點,以及(iii)第二個雙鏈同源臂,這樣,載體DNA鏈的第一個同源臂序列與靶DNA鏈的第一個末端序列同源,載體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第二個末端序列同源,這樣,靶DNA可以在同源臂之間插入載體DNA中。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體導入細胞,所述細胞含有雙鏈靶DNA,并表達細菌重組酶,所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點的一條鏈,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端,這樣載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞,所述細胞含有雙鏈靶DNA,并表達細菌重組酶,所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈靶DNA分子導入細胞,所述細胞含有一個載體,并表達細菌重組酶,所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈靶DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞,所述細胞含有一個載體,并表達細菌重組酶,所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體和雙鏈靶DNA導入表達細菌重組酶的細胞,所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;這樣載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在該方法的一個特定實施方案中,宿主細胞還包括一個核苷酸序列,該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶,載體還包括位點特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點,第一個識別位點位于第一個和第二個同源臂外部,第二個位點特異性重組酶識別位點位于第一個和第二個同源臂內部;在步驟b)進行期間或之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            在該方法的另一個特定實施方案中,宿主細胞還包括一個核苷酸序列,該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶,載體還包括一個位點特異性重組酶識別位點,該位點位于第一個和第二個同源臂內部;在步驟b)進行期間或之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            在另一個實施方案中,提供了制備同源DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體,雙鏈靶DNA分子,以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入表達細菌重組酶的細胞,所述載體含有一個復制起點和兩個雙鏈同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            在該方法的一個特定實施方案中,宿主細胞還包括一個核苷酸序列,該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶,載體還包括位點特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點,第一個識別位點位于第一個和第二個同源臂外部,第二個位點特異性重組酶識別位點位于第一個和第二個同源臂內部;在步驟b)進行期間或之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            在該方法的另一個特定實施方案中,其中,宿主細胞還包括一個核苷酸序列,該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點特異性重組酶,載體還包括一個位點特異性重組酶識別位點,該位點位于第一個和第二個同源臂內部;在步驟b)進行期間或之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            在特定實施方案中,載體還包括一個位于同源臂外部的可選擇標記,這樣,在載體DNA鏈上,從5’到3’,載體可以下述兩種順序含有i)第一個同源臂,可選擇標記,復制起點和第二個同源臂,或ii)第一個同源臂,復制起點,可選擇標記和第二個同源臂。在一個特定實施方案中,可選擇標記使含有該載體的細胞呈現抗生素耐藥性。
            在多個特定實施方案中,細菌重組酶是RecE/T或Redα/β重組酶,或者同時應用RecE/T和Redα/β。在另一些特定實施方案中,細胞是細菌細胞。在另一些特定實施方案中,細胞是大腸桿菌細胞。在另一些特定實施方案中,細胞是真核細胞,并重組表達RecE/T和/或Redα/β蛋白。在另一些特定實施方案中,該方法還包括分離重組DNA分子,該分子含有插入到載體中的靶DNA。
            在另一個實施方案中,本發明還提供了用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源。在有關載體的一個特定實施方案中,復制起點是細菌復制起點。在另一個特定實施方案中,復制起點在大腸桿菌中發揮作用。在另一個特定實施方案中,復制起點在哺乳動物細胞中發揮作用。
            本發明還提供了含有雙鏈DNA載體的細胞,該載體可用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子,包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源。在一個特定實施方案中,細胞是細菌細胞。
            本發明還提供了可用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)含有細菌重組酶的細胞。在一個有關試劑盒的特定實施方案中,同源臂的序列與基于BAC,PAC,λ,質粒或YAC的克隆載體同源。在另一個有關試劑盒的特定實施方案中,第一個和第二個雙鏈寡核苷酸具有的核苷酸序列與基于BAC,PAC,λ,質粒或YAC的克隆載體同源。
            在另一個實施方案中,提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;c)第二個寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及d)含有細菌重組酶的細胞。在一個有關試劑盒的特定實施方案中,細胞是大腸桿菌細胞。在另一個有關試劑盒的特定實施方案中,細胞是具有攝取DNA能力的凍存細胞。
            在另一個實施方案中,本發明提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;以及c)第二個寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源。在一個有關試劑盒的特定實施方案中,DNA載體經純化處理。在另一個有關試劑盒的特定實施方案中,DNA載體、第一個雙鏈寡核苷酸和第二個雙鏈寡核苷酸均經純化處理。
            在本發明提供的另一個有關試劑盒的特定實施方案中,靶DNA分子包括細菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。在另一個特定實施方案中,靶DNA分子包括已知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關的基因突變或多態性。在另一個特定實施方案中,細菌重組酶是RecE/T或Redα/β重組酶,或者是RecE/T和Redα/β兩種重組酶。
            本發明的方法還可用于診斷。例如,可以將質粒或線性DNA片段設計成能夠俘獲特異性靶DNA,以檢測該DNA是否存在于受試者樣本中,如,病毒DNA存在于患者樣本中。在一個實施方案中,本發明提供了檢測當發生基因突變時,已知或疑與功能紊亂或疾病相關的靶DNA的方法。在特定實施方案中,該靶DNA是細菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。在一個特定實施方案中,提供了一種方法,該方法進一步包括探測含有插入到載體中的靶DNA的重組DNA分子。在另一個實施方案中,該方法還包括探測含有插入到載體中的靶DNA的重組DNA分子。
            在另一個實施方案中,本發明還提供了一種探測感染性物質存在的方法,其中,靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者,而且,第一個和第二個同源臂與感染性物質中存在的DNA序列同源。在一個特定實施方案中,靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者,而且,所述第二個和第四個核苷酸序列與感染性物質中存在的DNA序列同源。在另一個特定實施方案中,感染性物質是病毒、細菌、原生動物、真菌或寄生蟲。
            在另一個實施方案中,本發明還提供了一種探測遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征存在的方法,其中,靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征的患者,而且,第一個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征相關的位點上游序列同源,第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征相關的位點下游序列同源。在一個特定實施方案中,提供了一種探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征存在的方法,其中,靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征的患者,而且,第一個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征相關的位點上游序列同源,第二個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征相關的位點下游序列同源。在一個特定實施方案中,遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征使患者患有或易感腫瘤,哮喘,關節炎,耐藥,藥物毒性,或神經系統、神經精神、代謝、肌肉、心血管或皮膚病況、疾病或功能紊亂。
            4.附圖簡述


            圖1A-C。同源重組克隆和亞克隆方法的構成。
            A.載體,包括一個復制起點(起點),一個可選擇標記(Sm),和兩個同源臂(以A和B代表)。
            B.備選雙鏈寡核苷酸銜接子(adaptor)。每個銜接子包括與同源臂(分別為A和B)同源的區域(以A’和B’代表);與靶DNA末端(分別以C和D代表)同源的第二個區域(以C’和D’代表)。
            C.靶DNA。靶DNA末端核苷酸序列(C和D)可以與載體的一個同源臂(分別為A和B)的核苷酸序列同源,也可以與備選銜接子寡核苷酸(分別以C’和D’代表)的核苷酸序列同源。
            圖2。方法1的實驗要點。通過同源重組技術進行亞克隆的載體可以,例如通過轉化,導入大腸桿菌宿主,該宿主中已經存在靶DNA以及RecE/T或Redα/β蛋白。該圖示意了攜帶大腸桿菌復制起點和可選擇標記基因(Sm)的線性DNA分子,并有“同源臂”側翼,所述Sm優選其產物具有抗生素耐藥性的基因。圖中所示的同源臂是位于線性DNA分子兩端的灰色方框,同源臂是與靶DNA中位于亞克隆DNA區側翼的兩個區域同源的短區域,該亞克隆DNA區側翼又稱為靶DNA末端,在圖中是被同源臂側翼包繞的粗線。轉化后,Sm基因的選擇性表達可用來鑒定含有同源重組產物的細胞,所述同源重組位于線性DNA分子的同源臂與靶DNA之間。
            圖3。以繪圖的方式代表方法2。該方法與用于
            圖1的方法類似,不同點在于在該方法中,靶DNA分子沒有事先存在于大腸桿菌宿主中,而是與線性DNA載體分子一起,共同導入。靶DNA可以是任何來源的,也可以是一種混合物,源自需要克隆的目標DNA區域,或者是富含DNA的分子,源自需要亞克隆的DNA區域。如
            圖1所示,同源臂以灰色方框代表。
            圖4。以繪圖的方式代表方法3。克隆或亞克隆載體包括一個大腸桿菌復制起點和一個可選擇標記基因(Sm),其側翼是兩個同源短臂,以灰色方框顯示。此外,載體還包括兩個重組靶位點(SSRTs),其中一個位于起點和可選擇標記基因之間。最為簡單的是,首先將載體構建為如圖所示的線性DNA片段。在環化基礎上,使第二個SSRT位于兩個同源臂之間,定向成為相對于第一個SSRT的直接重復,這樣,在兩個SSRTs之間的位點特異性重組就會產生兩個不同的環狀分子,從而將起點和可選擇標記基因分開。將環化載體轉化到表達RecE/T或Redα/β蛋白或可以表達RecE/T或Redα/β蛋白的大腸桿菌菌株中。大腸桿菌菌株還攜帶一個可誘導位點特異性重組酶(SSR)基因,該基因產物可以識別載體中的SSRTs,這樣,除非位點特異性重組酶基因被誘導或表達,SSRTs間的位點特異性重組才會發生。制備攜帶載體和調控位點特異性重組酶基因的大腸桿菌細胞,使它們攜帶RecE/T或Redα/β蛋白,并可用于轉化。然后將含有預克隆區域的DNA分子導入宿主細胞。在同源臂間進行同源重組后,誘導位點特異性重組酶蛋白的表達,并篩選可選擇標記基因的表達。在位點特異性重組前,細胞或者包括攜帶兩個SSRTs的未重組載體,或者包括所需同源重組產物,該產物僅攜帶一個SSRT,因為同源重組將去除位于兩個同源臂之間的SSRT。位點特異性重組酶誘導表達后,篩選可選擇標記的表達,這樣,包括同源重組產物的細胞將獲得生存能力,因為該產物不再是位點特異性重組的底物。
            圖5。通過RecE/T或Redα/β同源重組,應用銜接子寡核苷酸克隆或亞克隆。本示了上圖3所示方法2的變異。兩個銜接子寡核苷酸,每個都包括兩個同源區,其中一個同源區與載體的一個同源臂同源,第二個同源區與目標靶DNA區域兩個末端的一個同源。載體的環化和目標DNA區域的克隆可通過載體和銜接子之間、以及銜接子和靶DNA之間的同源重組完成。在該實施方案中,載體和靶DNA之間沒有序列同源性。因此,通過應用相對于每個靶DNA的靶特異性銜接子寡核苷酸,可以應用相同的載體克隆或亞克隆不同的靶DNA。銜接子寡核苷酸還可用于方法1和3,如上
            圖1和3所示。
            圖6。溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠,顯示應用EcoRI消化DNA后的結果。消化的DNA來自mAF4 BAC實驗的9個獨立克隆(泳道1-9)。泳道M是1kb DNA標準物(BRL,Bethesda,MD)。泳道10,EcoRI消化的起始載體。該實驗在部分6的實施例中將有詳細描述。
            圖7A-B。從總酵母基因組DNA中克隆DNA區。
            A.圖示了一個擴增了p15A起點的PCR片段,其側翼是兩個98或102bp的同源臂,其任一側整合了98或102bp的酵母菌株MGD 353-13D中的氨芐青霉素耐藥基因。將PCR產物(0.5mg)和總酵母基因組DNA(4.0mg)混和,電轉化到JC5519大腸桿菌中,該菌株含有來自pBADαβγ的Redα/β表達。通過篩選氨芐青霉素耐藥來鑒定克隆。
            B.溴化乙啶染色的凝膠,確認10個備選克隆中的正確克隆。
            圖8A-C。在ET亞克隆中,線性載體末端出現的重復序列或5’磷酸的作用。
            A.顯示了用于PCR擴增線性載體的寡核苷酸序列。斜體序列表示PCR擴增線性載體所必需的寡核苷酸部分,其他核苷酸構成大腸桿菌lacZ基因的同源臂。黑體序列在線性載體的兩端都有出現,這樣可以形成末端重復。線性載體構建物a-x具有不同長度的重復序列。該線性載體包括p15A復制起點,加上氯霉素耐藥基因Cm’,側翼是兩個同源臂,以及圖示的末端重復序列。B.圖示了用于檢測載體構建物在ET亞克隆大腸桿菌lacZ基因效率的策略,所示載體構建物含有A中所示的不同重復序列。C.列表顯示了重復序列長度和磷酸化對ET亞克隆效率的作用。應用含有A中所示重復序列的載體得到的測試結果如表所示。圖9A-B。應用pBAD-αβγ(tet)進行ET重組亞克隆。A.圖示pR6K/BADαβγ質粒,包括R6K起點,pir-116復制子,來自pBR322(tet’)的四環素耐藥基因,以及阿拉伯糖抑制子(araC)。B.比較應用pBAD-αβγ(tet)(ColE1 ori)和pR6K/BADαβγ進行ET重組亞克隆。
            圖10A-B。在BAC上亞克隆AF-4基因的19kb片段。A.質粒構建物和亞克隆策略,tet’,四環素耐藥基因。AraC,阿拉伯糖抑制子。B.分析5個獨立克隆。溴化乙啶染色HindIII消化DNA凝膠,該DNA來自5個獨立正確克隆和線性載體。膠質亞克隆經DNA序列分析確認。M,1kb DNA階梯。
            圖11A-B。應用基因組DNA作為靶DNA源進行ET亞克隆。A.來自大腸桿菌的基因組DNA通過XhoI消化預線性化。該線性載體包括ColE1起點和卡那霉素耐藥基因kan,其側翼為同源臂,可以將重組定位于大腸桿菌染色體的lacI/lacZ位點。B.對16個獨立克隆的限制性分析。泳道17代表線性載體。M,1kb DNA階梯。
            圖12A-B。亞克隆來自鼠ES細胞基因組DNA的新霉素基因neo。A.亞克隆策略圖。B.卡那霉素耐藥克隆的限制性分析。
            圖13。ET克隆和亞克隆的組合。
            5.發明詳述本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA克隆和亞克隆的方法和組合物。本發明發明人發現,細菌重組酶可以某種特定方式,用來獲得高效靶克隆或亞克隆。
            細菌重組酶優選應用RecE/T和/或Redα/β。在大腸桿菌中,RecE/T途徑以前業已有所描述,其組分也已被部分認識(Hall and Kolodner,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913205-3209;Gillen et al.,1981,J.Bacteriol.145521-532)。通過RecE/T途徑的重組需要兩個基因的表達,rec E和rec T,其DNA序列已經公開(Hall et al.,1993,J.Bacteriol.175277-278)。Rec E蛋白的功能與λ外顯子相似,后者又被稱為Redα,Rec T蛋白的功能與Redβ以及噬菌體P22的erf相似(Gillen et al.,1977,J.Mol.Biol.11327-41;Little,1967,J.Biol.Chem.242679-686;Radding and Carter,1971,J.Biol.Chem.2462513-2518;Joseph andKolodner,1983,Biol.Chem.25810411-17;Joseph and Kolodner,1983,Biol.Chem.25810418-24;Muniyappa and Radding,1986,J.Biol. Chem.2617472-7478;Kmiec and Hollomon,198l,J.Biol.Chem.25612636-12639;Poteete and Fenton,1983,J.Mol.Biol.163257-275;Passy et al.,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 964279-4284,以及這些文獻引用的參考文獻)。
            本文描述的是涉及應用細菌重組酶指導DNA克隆和亞克隆的方法和組合物。本文應用的術語“DNA克隆”是指將任何來源的DNA插入到自治復制載體的過程,這樣,該DNA可以在宿主細胞中增殖。術語“DNA亞克隆”是指將業已存在于自治復制載體的DNA片段穿梭于另一自治復制載體的過程,或者將來自富含DNA分子如純化病毒基因組的DNA片段或經PCR擴增的DNA片段穿梭于另一自治復制載體的過程。術語“定向”或“靶”克隆和亞克隆是指應用同源臂以及(在很多實施方案中是)銜接子寡核苷酸來選擇靶DNA,并通過同源臂的選擇和定向作用,指導或定向靶DNA的插入。應該指出,本發明所有申請方法適用于克隆和亞克隆DNA。
            本發明組合物和方法的構建將在這里給予詳盡闡述。具體地說,部分5.1描述了本發明應用同源重組技術靶向克隆DNA片段的介導重組克隆方法。下面的部分5.2描述了本發明組合物,包括設計用來定位、俘獲和克隆目標靶DNA片段的DNA構建物。該部分還描述了編碼細菌重組酶如RecE/T和/或Redα/β蛋白的核酸分子,含有這些組合物的細胞,以及構建這些核酸和細胞的方法。下面的部分5.3描述了細菌重組酶靶向克隆方法的應用,以及探測基因表達和診斷疾病狀態的試劑盒。
            5.1 通過同源重組技術克隆和亞克隆的方法通過細菌重組酶介導的同源重組技術,可以應用本文描述的不同方法,高效靶向克隆任何目標DNA。本文描述的3種方法所需的常見組分是一種表達細菌重組酶重組蛋白的細胞,和一個載體。該載體的一個示例見
            圖1A。載體包括3個必需元素一個復制起點和兩個雙鏈DNA短區,本文又稱為“同源臂”。
            同源臂被特意設計成可以通過同源重組技術,允許載體在兩個同源臂之間“俘獲”目標靶DNA。同源臂的序列、位置和定向性對于靶DNA在兩臂之間的正確插入至關重要。在一個實施方案中,同源臂序列與靶DNA的末端同源,兩個同源臂的DNA序列位于目標靶DNA的側翼,其中一個臂(在
            圖1中以A代表)對應于靶DNA(在
            圖1中以C代表)的上游DNA序列,第二個臂(在
            圖1中以B代表)對應于靶DNA(在
            圖1中以D代表)的下游序列。兩個臂相對于所需插入的定向性必須與同源序列相對于靶DNA的定向性相同(見
            圖1),這樣,同源臂與靶DNA之間的重組才會導致靶DNA被插入到兩個同源臂之間或“內部”(見
            圖1)。在這里,一個位置被定義為同源臂“內部”是指,如果該位置位于兩個同源臂之間,這樣,在一個方向上,第一個同源臂位于復制起點和其本身之間,在另一個方向上,第二個同源臂位于復制起點和其本身之間。反之,一個位置被定義為同源臂“外部”是指,如果在一個方向上,沒有同源臂可以將其本身與復制起點分開。因此,通過該定義,復制起點和可選擇標記位于載體同源臂的“外部”(見
            圖1),這樣,靶序列的插入不會影響質粒上的復制起點和可選擇標記。相反,通過該定義,靶DNA是插入到同源臂的“內部”。
            圖1A形象地描繪出同源臂的“內部”和“外部”。
            在另一個實施方案中,同源臂序列與一套雙鏈銜接子寡核苷酸同源。這些銜接子寡核苷酸如
            圖1B所示。每個銜接子寡核苷酸序列都包括載體一個同源臂的序列,以及與目標靶基因側翼序列同源的序列(見
            圖1C)。因此,一個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在
            圖1中以A’代表),以及靶DNA的上游核苷酸序列(在
            圖1中以C’代表)。第二個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在
            圖1中以B’代表),以及位于靶DNA下游的核苷酸序列(在
            圖1中以D’代表)。以這種方式,銜接子寡核苷酸可以通過改變其序列,用來使普通的同源克隆載體適應目標特異靶基因序列(見圖5)。可以用來進行本發明多種實施方案的方法和組合物將在這里給予詳盡描述。
            下面描述的方法包括三種不同方法,通過同源重組技術進行定向克隆。如下詳述,這三種方法的每一種都具有它們自己的優勢,可以優選用來進行具體的克隆應用。這些方法和應用將在下面給予詳述。在一個方法中,如圖2所示,克隆載體被導入含有目標靶DNA的細胞。該方法可用來將插入方便地從一個復制子穿梭于另一個復制子,而無需進行累人的限制性分析和體外操作。該方法可用于靶DNA業已存在于大腸桿菌復制子的情況,它的進一步應用需要對選擇部分進行亞克隆。例如,分離自粘粒、噬菌體或BAC庫的DNA克隆可以通過將所選部分亞克隆到新載體中而方便地應用,所述亞克隆是為了對插入序列進行序列分析或表達基因編碼的蛋白。在第二種方法中,如圖3所示,先制備克隆載體和目標靶DNA,然后一起導入細胞。此外,如圖4所示,目標DNA被加入到已經包括克隆載體的細胞中。后兩種方法可用于靶DNA來自外源的情況,例如,DNA來自腫瘤細胞。
            5.1.1 方法1將載體導入含有靶DNA的宿主細胞在一個實施方案中,如圖2所示,靶DNA業已存在于表達細菌重組酶的宿主細胞中。例如,靶DNA可能位于獨立復制的DNA分子上,例如但不限于質粒、噬菌體、細菌人工染色體(BAC)或大腸桿菌宿主細胞中的大腸桿菌染色體。構建表達細菌重組酶的宿主細胞的方法在部分5.2.2中將給予詳述,所示細菌重組酶如RecE/T或Redα/β。
            將載體DNA導入宿主細胞。所示載體DNA包括一個復制起點和兩個同源臂,這兩個同源臂可以位于起點和標記的任一側。優選地,載體是線性分子,同源臂位于線性分子的兩端,盡管它們可以在內部。進入細胞后,發生在載體DNA同源臂和靶序列之間的同源重組使靶DNA插入到同源臂之間,并形成環狀游離體。然后將細胞轉移到選擇性培養基中,篩選載體上存在選擇標記的細胞。由于只有環狀分子才能夠復制,并在宿主細胞中被選擇,在選擇培養基中能夠生長的很多細胞都含有包括靶DNA的重組分子。
            在一個實施方案中,線性載體DNA片段的末端通過修飾核苷酸進行阻斷,以降低除了同源重組之外的其他方法導致的線性片段末端的連接事件數量,即非法重組。這些修飾核苷酸,如磷酸硫代核苷酸,可以整合到同源臂的5’末端核苷酸中。修飾核苷酸可以在用于構建載體的寡核苷酸引物合成過程中(見以下部分5.2.1)導入,或者,也可以在合成后,對線性載體DNA的寡核苷酸進行酶或化學修飾來添加。對寡核苷酸和線性DNA片段進行這些修飾的方法是本領域眾所周知的,并在以下部分5.2.2中有詳述。
            5.1.2 方法2將載體和靶DNA共同導入宿主細胞在另一個實施方案中,如圖3所示,體外混和載體DNA和靶DNA,然后共同導入含有RecE/T或Redα/β重組酶的細胞中。靶DNA可以是任意來源的。例如,靶DNA可以來自生物樣本,例如但不限于全血,血漿,血清,皮膚,唾液,尿液,淋巴液,活檢細胞,組織培養細胞,培養基,也可以來自非生物樣本,如食物,水,或其他材料。從這些材料中制備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見,如CurrentProtocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,1987-1994 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
            體外制備并混和載體和靶DNA,然后共同導入表達細菌重組酶蛋白的細胞中,優選通過共同電轉化轉化大腸桿菌。載體DNA可以是線性DNA形式,也可以是環狀質粒DNA的形式。在一個優選實施方案中,載體是線性DNA分子。靶DNA來源在重量上超過或多于,相對于載體DNA,這樣導入細胞中的目標靶DNA區域的拷貝數可以盡量多,從而使重組產物的產量最大化。使細胞在選擇培養基中生長,以篩選環狀產物。在一個優選實施方案中,載體包括一個抗生素耐藥標記,細胞生長于含有這種抗生素的培養基中。在這種選擇培養基中能夠生長的集落含有環化、重組形式的線性片段。
            在一個實施方案中,如以下部分5.2.1所述,線性載體DNA片段的末端應用修飾核苷酸阻斷。這些修飾寡核苷酸的方法是本領域眾所周知的,如以下部分5.2.2所述。
            這種方法對于靶DNA不是源于大腸桿菌的情況特別有用,例如,靶DNA來源于酵母或真核細胞。在一個實施方案中,該方法可以用于診斷目的,探測在任意生物樣本中特定DNA的存在。例如,該方法可用來探測乳腺癌患者活檢樣本中特異性雌激素受體或BRCA1等位基因的存在。
            在另一個實施方案中,該方法可以作為聚合酶鏈反應(PCR)技術擴增的替代方法,用來擴增DNA區域。通過同源重組、克隆和在大腸桿菌中增殖的擴增方法,相對于基于PCR的技術,存在一些優勢。首先,PCR誤差對于很多應用目的來說是本質障礙。聯合應用PCR引物對可能產生一些假反應產物。而且,在一個誤差引入DNA樣本后,該誤差在最終反應產物中的數量隨著PCR擴增的每一輪,以指數級上升。相反,通過同源重組克隆技術擴增在大腸桿菌中具有細胞閱讀前機制的優勢,這樣,至少更可靠1000倍。第二,應用本方法,對待擴增DNA區域的大小限制較少。應用PCR技術,擴增長度超過幾千堿基對(超過5-10kb)的DNA區域就相當困難。而本方法適用于克隆更大的區域,至少大約10萬堿基對。目前,克隆基因組包括創建大型隨機庫的冗長過程,隨后還要進行每個克隆的分類和排序。應用本方法,可以設計同源臂,構建載體,將基因組定向克隆到大型、非冗余、鄰近克隆中,即所謂的“contigs”。第三,通過PCR技術制備DNA后,甚至還需要額外的過程,進行PCR產物的克隆。同源重組克隆技術則避免了進行額外亞克隆步驟的需要。只需要將待擴增的DNA區域插入到同源臂之間,然后與載體DNA一起轉化大腸桿菌宿主。
            在該實施方案中的同源重組在將DNA加入細胞之前,可以體外進行。例如,分離的RecE和RecT,或者含有RecE/T的細胞提取物可以加入DNAs混合物中。當重組在體外發生時,DNA分子的篩選可以通過應用重組混合物轉化適宜宿主細胞并如前所述篩選陽性克隆來實現。
            5.1.3 方法3將靶DNA導入含有載體DNA的宿主細胞在另一個實施方案中,靶DNA被導入已經含有載體DNA的細胞中。靶DNA可以是任意來源的,如上5.1.2所述,其形式可以是線性,也可以是環狀。如上所述,靶DNA一旦進入細胞,在同源臂和靶DNA之間進行的同源重組就會使靶DNA插入到同源臂之間。但是,在這種情況下,用來選擇未重組載體的反選擇是必需進行的,因為所需產物和未重組載體都表達可選擇標記基因。本文將詳細描述多種進行該反選擇過程的實施方案。例如,在一個實施方案中,應用了位點特異性重組和切除反應的方法。該方法在圖5給予了描述。在另一個實施方案中,可誘導核酸酶被誘導,裂解未重組載體。在兩個實施方案中,不含重組產物的載體均被消除。
            載體首先被構建成質粒,然后導入宿主細胞,并在宿主細胞中增殖。如圖5所示,載體含有(i)復制起點(任意起點);(ii)可選擇標記(Sm);(iii)兩個同源臂;以及(iv)可選擇的反標記,例如但不限于一對位點特異性重組酶的識別位點,第一個識別位點位于同源臂外部,第二個識別位點位于同源臂之內,或者核酸內切酶的識別位點,該酶可用于篩選起始質粒載體。在這里,一個位置被定義為同源臂“內部”是指,如果該位置位于兩個同源臂之間,這樣,在一個方向上,第一個同源臂位于復制起點和其本身之間,在另一個方向上,第二個同源臂位于復制起點和其本身之間。反之,一個位置被定義為同源臂“外部”是指,如果在一個方向上,沒有同源臂可以將其本身與復制起點分開。(見
            圖1,圖示了同源臂“內部”和“外部”含意)。復制起點和可選擇標記必須位于同源臂的外部,如上部分5.1所述,這樣,靶序列的插入才不會影響質粒上的復制起點和可選擇標記。可選擇反標記、核酸內切酶位點或兩個位點特異性重組酶靶位點的其中一個優選位于同源臂的“內部”(見圖5),在復制起點和可選擇標記的另一側。
            可以應用任何本領域已知的方法進行反選擇非重組載體。例如,在一個實施方案中,反選擇可以通過一個可誘導位點特異性重組酶(SSR)來實現。位點特異性重組酶是可以識別兩個靶位點的酶,這兩個靶位點又稱為位點特異性重組酶靶位點(SSRTs),該酶通過這兩個位點發揮作用,介導DNA鏈的交換和切除反應(Hallet et al.,FEMSMicrobiol.Rev.,1997,21157-78;Sauer,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5521-7;Stark et al.,1992,Trends Genet.,8432-9)。位點特異性重組酶的示例是本領域眾所周知的,包括但不限于Cre,Flp,Kw或R重組酶(Nunes-Duby et al.,1998,Nucleic Acids Res.26391-406;Ringrose et al.,1997,Eur.J.Biochem.248903-912;Utatsu et al.,1987,J.Bacteriol.1695537-5545)。當兩個直接重復SSRTs位于環狀質粒上時,兩個SSRTs之間的位點特異性重組就會形成兩個環狀質粒。只有含有復制起點的產物保留在細胞中。因此,位于環狀質粒兩個直接重復SSRTs之間的位點特異性重組,可以去除位于兩個SSRTs之間、不包括復制起點的DNA序列。
            DNA載體可以構建包括兩個SSRTs,定向如直接重復,其中一個位于同源臂的內部,第二個位于同源臂的外部,在可選擇標記(SM)和復制起點之間。以這種方式定位的SSRTs間發生的重組,可以導致復制起點與可選擇標記的分離(見圖5)。因此,SSR可以作用于含有兩個SSRTs的非重組DNA載體,導致該質粒在宿主細胞中的消失。
            然后通過標準方法,應用載體DNA轉化宿主細胞。在該實施方案中,宿主細胞必須包括1)RecE/T和/或Redα/β基因,以及2)編碼SSR的基因。優選地,RecE/T和/或Redα/β基因的表達是可以誘導的,但固定表達也是可以的。編碼能夠識別SSRTs的位點特異性重組酶(SSR)的基因必須是可誘導的。可誘導和固定啟動子在本領域是眾所周知的;它們在重組基因構建和表達過程中的應用方法將在以下部分5.2.3中給予描述。如果RecE/T和/或Redα/β基因需要誘導表達,在制備功能細胞之前,含有載體的細胞必須在可以誘導表達的條件下生長。含有載體DNA的宿主細胞可以通過接種、生長于選擇培養基來篩選、維持。
            然后從含有載體的宿主細胞中制備功能細胞。應用靶DNA轉化細胞,所述靶DNA可以是任意來源的,如從任何細胞中制備的總基因組DNA。細胞短暫培養,使同源重組可以發生。同源重組可以去除含有一個SSRT的同源臂之間的序列,并插入靶基因序列。然后誘導SSR的表達。SSR會作用于未重組載體的直接重復SSRTs,使可選擇標記與質粒復制起點分開。含有插入靶序列的質粒只有一個SSRT,因此會保持完整。在進行該步驟時,可以進行篩選,也可以不進行篩選,但在SSR誘導后,即在位點特異性重組發生后,必須很快進行篩選步驟。以這種方式,SSR的誘導可以篩選含有插入靶基因的質粒。
            在另一個實施方案中,可以在同源重組發生之前、期間或之后,體內應用核酸內切酶在兩個同源臂之間使載體線性化。在重組之前進行載體線性化可以選擇正確重組產物,因為除非線性質粒發生環化,否則在細胞中不能存活。重組后,核酸內切酶的持續活性將有助于篩選含有插入序列的質粒,因為在重組期間,SSR去除了核酸內切酶識別位點,并在該位置插入靶DNA。因為核酸內切酶只裂解非重組載體,而使含有插入靶序列的質粒保持完整,因此重組后核酸內切酶的持續活性可以篩選非重組產物。在該實施方案中,必須應用識別位點非常少見的核酸內切酶,這樣,在宿主細胞DNA中沒有其他識別位點存在。這些“少見切割者”的示例在本領域是眾所周知的,包括但不限于λcos,酵母HO或內含子編碼的核酸內切酶如PI-Scel。核酸內切酶的識別位點應該克隆在兩個同源臂之間,這樣,核酸內切酶的酶切消化就會在同源臂之間形成線性化載體。核酸內切酶基因的表達必須是可誘導的。可誘導蛋白表達的構建和方法將在下面部分5.2.3加以探討。
            在另一個實施方案中,可以應用SSR,例如Cre重組酶來代替核酸內切酶,體內線性化未重組載體(見Mullins et al.,1997,Nucleic AcidsRes.252539-40)。在這種情況下,構建的載體只有一個位于同源臂內部的SSRT位點。含有相同SSRT拷貝的超量寡核苷酸與靶DNA混和,并與靶DNA一起,共轉化宿主。優選地,寡核苷酸是雙鏈短DNA分子。當一個重組分子含有位于短寡核苷酸上的SSRT時,位點特異性重組酶將在SSRT位點線性化載體(Mullins et al.,1997,supra)。
            在另一個實施方案中,可以將上述位點特異性重組和核酸內切酶方法聯合應用。在這種情況下,未重組載體在同源臂內部含有SSRT和核酸內切酶位點。在該方法的一個實施方案中,SSR和核酸內切酶可以在一個單獨的可誘導啟動子控制下共同調節。這些蛋白質共同調節、可誘導表達的構建和方法將在以下部分5.2.3中加以探討。
            在另一個實施方案中,可以聯合采用這些位點特異性重組技術進行反篩選。在該實施方案中,采用兩對SSR/SSRTs,例如Cre/lox和Flp/FRT。載體包括針對第一個SSR,SSR1的兩個位點,一個位于同源臂內部,第二個位于同源臂外部,復制起點與可選擇標記之間。此外,該載體還包括針對第二個SSR,SSR2的一個位點,位于同源臂內部。SSR2的另一個位點位于雙鏈短寡核苷酸上,并在細胞轉化期間,以超過靶DNA的量,與靶DNA一起添加。在一個特定實施方案中,例如,線性化步驟的一個SSR/SSRT對是Cre/loxP,去除步驟的第二對是Flp/FRT。
            在另一個實施方案中,可以直接應用細胞反篩選。在這種情況下,質粒復制起點在大腸桿菌中只有單一拷貝(或者拷貝數量非常低)。這種類型的復制起點包括iteron型起點,如噬菌體P1起點,以及基于大腸桿菌染色體的質粒起點,oriC。選擇適宜的復制起點,見Helinski,D.R.,Toukdarian,A.E.,Novick,R.P.Chapter 122,pp 2295-2324 in“Escherichiacoli and Salmonella,Cellular and Molecular Biology”2ndedition FrederickC.Niedhardt,Ed.ASM Press,Washington,1996,ISBN 1-55581-084-5。在這種情況下,構建的載體可以沒有任何SSRTs,但在同源臂之間不能不包括反篩選基因。這些反篩選標記基因是本領域眾所周知的,例如,可應用sacB,ccdB或四環素耐藥基因(適宜的反篩選基因和方法列表還見,Reyrat et al.,1998,Infect.Immun.664011-7)。預期的同源重組反應將去除反篩選基因,這樣,攜帶預期重組產物的細胞將在反篩選壓力下存活,而攜帶未重組載體的細胞將死亡。
            5.2 通過同源重組技術進行克隆和亞克隆的組合物本文描述了在多種實施方案中,通過同源重組技術進行克隆的組合物。在以下部分5.2描述的每一種克隆方法,在一個單一細胞中都必須同時存在以下三種組分第一,攜帶兩個DNA短區域(本文稱為“同源臂”)的載體,該DNA短區域的序列與靶序列同源;第二,RecE/T和/或Redα/β蛋白對,或其他細菌重組酶;第三,靶DNA序列。由細菌重組酶介導的,在同源臂與靶基因側翼區域存在的同源序列間發生的重組,可以將靶DNA插入或“俘獲”到兩個同源臂之間。這里將詳細描述它們構建的組合物和方法。
            5.2.1 同源克隆載體同源克隆載體可以是線性或環狀DNA載體,包括一個復制起點,一個可選擇標記和兩個被設計成可以俘獲目標靶DNA的DNA短區域。可以根據所用手段或方法,選擇數種形式的克隆載體。它們構建的優選形式和方法如
            圖1-5所示,并將在這里給予詳細描述。
            5.2.1.1 復制起點載體需要一個復制起點,使質粒復制、增殖。如果在大腸桿菌中克隆和增殖,可以應用任何大腸桿菌復制起點,這些復制起點的示例是本領域眾所周知的(見Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,及其引用參考文獻)。目前可以獲得的非限制性質粒復制起點的示例是ColE1衍生性復制起點(Bolivar et al.,1977,Gene 295-113;見Sambrook et al.,1989,supra),在如pACYCl84質粒上存在的p15A起點(Chang and Cohen,1978,J.Bacteriol.1341141-56;還見Miller,1992,p.10.4-10.11),以及適用于低拷貝質粒表達的pSC101起點,它們都是本領域眾所周知的。
            例如,在一個實施方案中,應用了從高拷貝質粒中獲得的復制起點,如含有ColE1衍生性復制起點的質粒,這些質粒的示例是本領域眾所周知的(見Sambrook et al.,1989,supra;還見Miller,1992,A ShortCourse in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,及其引用參考文獻)。一個示例是來自pUC19的起點及其衍生物(Yanisch-Perron et al.,1985,Gene 33103-119)。pUC載體的存在水平是每個細胞300-500拷貝,并具有插入異源基因的便利克隆位點。為了極高水平表達,可以應用λ載體,如λgt11(Huynh et al.,1984,in“DNACloning TechniquesVol IA Practical Approach”,D.Glover,ed.,pp 49-78,IRL Press,Oxfbrd),或在含有T7和Sp6聚合酶表達系統的細胞中應用T7或SP6噬菌體啟動子(Srudier et al.,1990,Methods Enzymol.18560-89)。
            在需要低水平表達時,可以應用中等或低拷貝的復制起點。中等拷貝質粒在本領域是眾所周知的,如pBR322,具有ColE1衍生性復制起點,每個細胞中有20-100拷貝(Bolivar et al.,1977,Gene 295-113;見Sambrook et al.,1989,supra),或pACYC100質粒系列中的pACYC184質粒,具有p15A起點,每個細胞中有10-12拷貝(Chang and Cohen,1978,J.Bacteriol.1341141-56;還見Miller,1992,p.10.4-10.11)。低拷貝質粒在本領域也是眾所周知的,例如,pSC101,具有pSC101起點,每個細胞中大約有5個拷貝。與pBR和pUC質粒一樣,pACYC和pSC101質粒載體都具有便利的克隆位點,并可在同一細胞中共同存在,因為它們具有可兼容的復制起點和獨特的選擇性抗生素標記。其他適宜的質粒復制起點包括基于質粒的λ或噬菌體P1復制子,例如Lorist系列(Gibson et al.,1987,Gene 53283-286)。
            當所需表達水平更低時,可以應用來自細菌染色體的復制起點(見Miller,1992,supra;Niedhardt,F.C.,ed.,1987,Escherichia coli andSalmonella typhimurium,American Society for Microbiology,WashingtonD.C.;Yarmolinsky,M.B.and Sternberg,N.,1988,pp.291-438,in Vol.1 ofThe Bacteriophages,R.Calendar,ed.,Plenum Press,New York)。此外,還可應用合成復制起點。
            5.2.1.2 可選擇標記為了在細胞中維持質粒載體,典型的載體還包括一個可選擇標記。可以應用任何本領域已知的可選擇標記。在構建大腸桿菌載體時,可以應用任何使大腸桿菌有效產生抗生素耐藥的基因,以及任何使大腸桿菌產生穩定的可鑒別或可篩選表型變化的基因。優選應用抗生素耐藥標記,如來自TN903的卡那霉素耐藥基因(Friedrich and Soriano,1991,Genes.Dev.51513-1523),或其他氨基糖甙類抗生素耐藥基因(所述其他氨基糖甙類抗生素包括但不限于雙氫鏈霉素,慶大霉素,新霉素,巴龍霉素和鏈霉素),來自IS1的β-內酰胺酶,使大腸桿菌產生青霉素類耐藥(包括但不限于氨芐青霉素,羧芐青霉素,甲氧西林,青霉素N,青霉素O和青霉素V)。其他可選擇基因序列包括但不限于編碼多肽的基因序列,該多肽可以產生zeocin耐藥(Hegedus et al.,1998,Gene 207241-249)。其他可以應用的抗生素是可以產生amphenicols如chloramphenicol耐藥的基因,例如,可以應用chloramphenicol轉酰酶(CAT)的編碼序列(Eikmanns et al.,1991,Gene 10293-98)。對于本領域技術人員,應該指出,也可應用其他非抗生素方法,用來篩選質粒在細胞中的維持,例如,可以應用多種營養缺陷性標記(見Sambrook etal.,1989,supra;Ausubel et al.,supra)。
            5.2.1.3 同源臂載體的一個必需組分是兩個雙鏈DNA短區,這里又稱為“同源臂”。在一個實施方案中,如
            圖1所示,兩個同源臂(以“A”和“B”代表)與目標靶DNA的側翼DNA序列(以“A’”和“B’”代表)同源,其中一個臂與靶DNA上游DNA序列同源,第二個臂與位于靶DNA下游的序列同源。如這里所用,如果兩個雙鏈DNA分子具有相同的恒定區,可以任選插入一個或多個差異堿基對,并能夠作為同源重組的底物,那么它們是“同源的”。在一個優選實施方案中,同源臂包括大約22-100個堿基對或更多的連續堿基對,與目標靶DNA的雙鏈側翼區相同。同源區還可以插入一個或多個不同殘基,只要同源臂仍然能夠成為同源重組的有效底物。在一個優選實施方案中,為了使重組效率最優化,同源臂的長度大約為50個核苷酸,其中20-30(如25)個連續堿基對序列相同,沒有插入。盡管連續相同的區域可以更短(如,至少6,8或10個堿基對),但應用這種較短的連續相同區域,可以預見,重組效率可能較低。例如,在一個實施方案中,連續相同區域的長度是6bp(Keim and Lark,1990,J.Structural Biology 10497-106)。同源臂的長度或其與靶DNA側翼序列連續相同的長度沒有上限。
            靶DNA側翼核苷酸序列在這里又稱為靶DNA“末端”。因此,一個靶DNA有兩個末端,第一個末端和第二個末端。兩個同源臂相對于所需插入序列的定向性必須與同源序列相對于靶DNA的定向性一致(見
            圖1),這樣,在同源臂和第一個、第二個靶DNA末端之間的重組,可以將靶DNA插入到兩個同源臂之間。
            兩個同源臂的序列可以根據實驗設計來選擇。在選擇同源臂時的唯一限制是,該序列不應在靶DNA內出現超過一次,而且在同源重組反應期間,不應在宿主細胞的其他地方出現。在這種情況下,在其他同源重組事件的背景中,仍然可以獲得所需同源重組產物。在一個實施方案中,同源臂序列是常用克隆載體的多接頭側翼序列,所述常用克隆載體如BAC,PAC,YAC(酵母人工染色體),噬菌體克隆載體如λEMBL或λGT序列,phagemid,粘粒,pBR322,pGEM,pGEX,pET,桿狀病毒載體,病毒載體如腺病毒載體和腺病毒相關病毒載體。因此,可以應用單一載體亞克隆任何在這些載體中克隆的插入序列。含有這些同源臂的載體對于亞克隆插入序列特別有用,所述插入序列來自DNA文庫的陽性克隆,該DNA文庫如BAC,PAC,YAC,粘粒或λ庫。
            在多個實施方案中,如下所述,同源臂位于線性DNA分子的末端,或者位于線性DNA分子之內,或者位于環狀DNA質粒載體內。
            同源臂的定向性相對于它們與靶核苷酸序列的定向性一致。換句話說,同源臂的方向,使所需DNA序列在重組發生后,插入到同源臂之間。當同源臂位于線性DNA末端時,插入DNA序列俘獲或插入到兩個同源臂之間,并進而形成一個環狀可復制質粒。
            5.2.1.4 銜接子寡核苷酸同源臂在另一個實施方案中,同源臂的核苷酸序列與銜接子寡核苷酸的核苷酸序列同源。兩個銜接子寡核苷酸的每一個都包括一個與一個同源臂核苷酸序列同源的核苷酸序列,以及第二個與靶DNA兩個末端中的一個同源的同源區域。銜接子寡核苷酸如
            圖1所示。載體的同源臂以“A”和“B”代表,與這些序列同源的銜接子寡核苷酸區域以“A’”和“B’”代表。靶DNA的兩個末端以“C”和“D”代表,在銜接子寡核苷酸上與之相應的同源序列以“C’”和“D’”代表。在該實施方案中,由RecE/T或Redα/β介導的在載體同源臂、銜接子寡核苷酸同源區與靶基因側翼末端之間發生的重組,使靶DNA插入或“俘獲”到載體同源臂之間。
            5.2.1.5 構建載體可以應用本領域已知的標準方法構建線性片段或環狀載體(見Sambrook et al.,1989,supra;Ausubel et al.,supra)。例如,可以應用合成或重組DNA技術。在一個實施方案中,線性片段是通過PCR擴增技術制備的。在該方法中,合成的寡核苷酸在它們的5’端包括同源臂序列,在它們的3’端包括PCR引物序列。然后應用這些寡核苷酸作為PCR擴增反應的引物,擴增包括復制起點和可選擇基因標記的DNA區域。在另一個實施方案中,可以通過標準重組DNA技術構建質粒,使之包括兩個適宜定向的同源臂,側翼包圍一個復制起點和一個可選擇基因標記(見,例如Methods in Enzymology,1987,Volume 154,Academic Press;Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Press,New York;and Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,New York)。然后,例如,通過限制性核酸內切酶消化,使質粒線性化。
            在另一個實施方案中,例如,可以應用下述方法構建用于上面部分5.1.3的載體DNA。合成兩個寡核苷酸,其中一個包括,從5’到3’,一個載體特異性限制性位點,一個左側同源臂和一個PCR引物。另一個寡核苷酸包括,從5’到3’,相同的載體特異性限制性位點,一個SSRT,一個右側同源臂和一個PCR引物。選擇兩個同源臂側翼包圍靶DNA。SSRT是可以被任何位點特異性重組酶(SSR)如Cre,Flp,Kw或R重組酶識別的位點。設計的合成寡核苷酸必須使兩個SSRTs在載體中定向為直接重復序列。兩個PCR引物被用來擴增DNA模板,該模板包括一個質粒起點,一個可選擇基因和在起點和可選擇基因間的相同SSRT。然后應用限制性酶酶切PCR反應產物,并通過連接有效環化,所述限制性酶可以識別寡核苷酸5’末端包括的位點。然后應用環狀產物轉化大腸桿菌,以擴增、產生大量載體。
            在另一個實施方案中,線性片段可以通過采用具有可選擇標記、起點和兩個克隆位點的質粒來構建,然后將寡核苷酸同源臂克隆到每個克隆位點中。然后應用限制性酶酶切質粒DNA,以產生由同源臂限定的線性片段。該方法優選用于構建更復雜的質粒——例如,為了包括真核表達元件,含有真核增強子和啟動子元件的質粒。此外,其他序列元件也可亞克隆到載體上。
            載體還可以包括蛋白表達、操作或維持插入靶DNA所需的其他目標核苷酸序列。例如,在載體的適宜位置,還可以包括啟動子序列,增強子序列,翻譯序列如Shine和Dalgarno序列,轉錄因子識別位點,Kozak共識序列,以及終止信號。在非細菌細胞,如在植物、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞中重組克隆,必須有其他序列元件,如種特異性復制起點,轉錄、過程和翻譯信號。這些元件包括但不限于真核復制起點,增強子,轉錄因子識別位點,CAT盒,或Pribnow盒。
            在一個實施方案中,RecE/T和/或Redα/β或其他細菌重組酶是從細胞的表達質粒中重組制備的,所選載體必須與下面部分5.2.3中所述的細菌重組酶表達質粒兼容。本領域技術人員非常清楚,在單一細胞中多個質粒表達所必須的兼容性需求。在原核細胞中增殖兩個或多個構建物的方法是本領域技術人員眾所周知的。例如,含有多個復制子的細胞,可以應用含有適宜兼容復制起點的載體和獨立篩選系統來選擇并維持(見Miller et al.,1992,supra;Sambrook et al.,1989,supra)。
            5.2.2 細菌重組酶本發明主要描述了關于RecE/T和/或Redα/β的應用。但是,經驗豐富的技術人員應該很清楚,本發明同樣適用于其他細菌重組酶的應用,采用一對同源雙鏈DNA分子作為底物,所述其他細菌重組酶具有介導同源重組的能力。這里應用的細菌重組酶是一種在細菌、或噬菌體或細菌起點中內源表達的重組酶,并具有介導同源重組的能力。在多個實施方案中,細菌重組酶是RecE/T和/或Redα/β重組酶。在另一個特定實施方案中,啟動同源重組的功能等價系統包括來自噬菌體P22的erf蛋白。而且,在本發明的應用中,細菌重組酶的各別蛋白組分可以由其他功能組分來取代。
            這里應用的“RecE”和“RecT”首先指大腸桿菌,如大腸桿菌K12,中的RecE或RecT。大腸桿菌RecE和RecT的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的(RecE,GenBank Accession No.M24905和SWISS-PROTAccession No.P15033;RecT,GenBank Accession No.L23927和SWISS-PROT Accession No.P33228)。“Redα”和“Redβ”指噬菌體λ編碼蛋白。Redα具有與RecE 5’到3’核酸外切酶相似的5’到3’核酸外切酶活性,Redβ具有與RecT相似的DNA退火活性。這兩種λ蛋白的核苷酸和氨基酸序列也是眾所周知的(見GenBank Accession Nos.J02459;M17233)。
            經驗豐富的技術人員應該很清楚,涉及RecE/T和/或Redα/β的參考文獻也適用于RecE/T和Redα/β聯合應用的情況,除非有特別說明或有上下文指示。在一個特定實施方案中,聯合應用兩種酶復合物對于重組效率具有協同作用。
            可以應用的重組酶還包括重組酶組分的等位基因變異體。例如,在本發明RecE/T和Redα/β重組系統中應用的氨基酸序列還可以包括由RecE,RecT,Redα或Redβ的任何等位基因變異體編碼的氨基酸序列,只要這些等位基因變異體是功能變異體,并至少在一定程度上具有同源重組活性。這些等位基因變異體可以應用標準重組DNA技術(見,例如Methods in Enzymology,1987,volume 154,Academic Press;Sambrooket al.,1989,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2ndEdition,ColdSpring Harbor Press,New York;and Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,New York)或蛋白進化方法(Jermutus et al.,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9534-548)進行常規鑒定、制備。
            通常情況下,編碼這些等位基因變異體的核苷酸應該可以在中度嚴格條件下(應用,例如標準Southem印跡雜交條件,最后在42℃用0.2×SSC/0.1%SDS清洗;Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.,and John Wiley & sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)或高度嚴格條件下(應用,例如標準Southern印跡雜交條件,最后在68℃用0.1×SSC/0.1%SDS清洗;Ausubel et al.,supra),與編碼RecE,RecT,Redα或Redβ的互補序列雜交。
            這里應用的RecE,RecT,Redα或Redβ還包括從噬菌體或細胞中衍生的RecE,RecT,Redα或Redβ的同系化合物,所述噬菌體的宿主和所述細胞均是腸桿菌科的原核細胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限于埃希氏菌屬,沙門氏菌屬,檸檬酸細菌屬,克雷白桿菌屬以及變性菌屬。這些RecE,RecT,Redα或Redβ的同系化合物通常由噬菌體基因組中的基因編碼,該基因產物參與噬菌體生命周期中重組酶介導的過程,如在λ噬菌體生命周期中的Redα和Redβ。
            RecE/T同系化合物可以應用標準原核基因和重組DNA技術進行常規鑒定、制備(見如,Sambrook et al.,supra,and Ausubel et al.,supra)。重組DNA可以通過克隆基因組或cDNA文庫,或通過PCR擴增技術獲得。例如,基因組文庫可以通過標準分子生物學技術獲得,也可通過商業渠道或非商業渠道獲得。然后應用能夠與大腸桿菌recE或recT探針雜交的核酸進行篩檢(Grunstein and Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.723961),分離陽性克隆,并進行序列分析。
            在一個特定實施例中,RecE或RecT的同系化合物在鼠沙門氏傷寒桿菌中常規鑒定。RecE和recT基因在大腸桿菌K-12中的性質已經非常清楚,RecE(GenBank Accession No.M24905和SWISS-PROTAccession No.P15033)和RecT(GenBank Accession No.L23927和SWISS-PROT Accession No.P33228)的核苷酸和蛋白序列也已知(還見Bachmann,1990,Microbiol.Rev.54130-197;Rudd,1992,in Miller,1992,supra,pp.2.3-2.43)。可以應用鼠沙門氏傷寒桿菌的完整基因組粘粒或λ文庫。然后在如上所述的雜交條件下,通過與大腸桿菌RecE或RecT探針雜交來篩檢鼠沙門氏傷寒桿菌文庫。例如,由于兩個基因的同源性預期非常高,因此優選標準中等嚴格的雜交條件。
            在一個實施方案中,這樣的條件包括含有DNA的濾器在含有6XSSC,5X Denhart’s溶液,0.5%SDS和100ug/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中,55℃預處理6小時。雜交在相同溶液中進行,應用的探針是5-20×106cpm32P標記的。濾器在55℃的雜交混合物中孵育18-20小時,然后用含有1X SSC和0.1% SDS的溶液,60℃清洗2次,30分鐘。然后將濾器印跡干燥,暴露于X線片,放射自顯影。可以應用的其他中等嚴格條件是本領域眾所周知的。濾器的清洗是在37℃,應用含有2X SSC,0.1% SDS的溶液,進行1小時。隨后進行的含有鼠沙門氏傷寒桿菌克隆的分離、純化和特征分析可以按照本領域眾所周知的方法進行(見Ausubel et al.,supra)。這些序列可以用來構建本發明鼠沙門氏傷寒桿菌RecE/Ts。
            此外,鼠沙門氏傷寒桿菌基因還可從鼠沙門氏傷寒桿菌mRNA中分離。mRNA可以從表達RecE或RecT蛋白的細胞中分離。通過逆轉錄mRNA可以制備cDNA,然后應用本領域已知的方法進行篩檢,如上述篩檢基因組文庫的方法(見Ausubel et al.,supra)。此外,recE或recT cDNA還可應用PCR技術進行鑒定,如RACE(cDNA末端的快速擴增,Ausubel et al.,supra),在該技術中,應用兩個根據大腸桿菌recE或recT序列設計的引物“前導”引物的序列與大腸桿菌recE或recTmRNA的5’端相同,“反向”引物與其3’端互補。PCR產物可以通過序列分析進行校正,然后亞克隆,用于構建本發明的RecE/T。這些cDNA序列也可應用本領域眾所周知的方法,用于分離鼠沙門氏傷寒桿菌基因組recE或recT序列(Sambrook et al.,1989,supra;Ausubel et al.,supra)。
            編碼本發明RecE/T重組酶的核酸分子還可根據本領域技術人員眾所周知的重組和合成方法,進行合成和/或構建(見如,Sambrook et al.,supra and Ausubel et al.,supra)。
            如下所述,控制序列表達的能力對于應用本發明方法是非常有益的,這種序列表達的控制可以使表達能夠調節(如可誘導),并使表達水平范圍非常寬。
            核酸分子可以,例如在染色體外維持,如在質粒、粘粒或噬菌體上。此外,核酸分子還可以應用,例如噬菌體轉導或轉位,整合到染色體上,如大腸桿菌染色體上。這樣,RecE/T編碼序列就可以通過標準技術,經工程學手段以高拷貝、低拷貝或單一拷貝存在于每個細胞中。也可應用多種不同的調控序列來驅動重組蛋白的表達。表達/菌株構建的每一方面都可操作,用以制備重組蛋白表達水平各異的細胞。應該指出,重組蛋白編碼序列在染色體上的單一拷貝還有其他優勢,即這樣的配制使菌株的構建更加容易。
            5.2.2.1 蛋白表達細菌重組酶在細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中的表達或者是固定的,或者是可誘導的。在一個優選實施方案中,重組蛋白在細菌中表達,最優選在大腸桿菌中表達。例如,宿主細胞可以在其染色體上包括recE和recT基因。內源性表達RecE/T的大腸桿菌示例是已知的,例如大腸桿菌sbcA菌株(Zhang et al.,1998,supra)。此外,RecE/T還可從非染色體DNA中重組表達,優選在質粒載體上,如pBADETγ(Zhanget al.,1998,supra)或pGETrec(Narayanan et al.,1999,Gene Ther.6442-447)。同樣,Redα/β對于整合了λ前噬菌體的菌株可以是內源性的,也可以由質粒表達,如pBADαβγ(Muyrers et al.,1999,supra)。可以根據標準重組DNA技術構建RecE/T和/或Redα/β表達構建物(見,例如Methods in Enzymology,1987,volume 154,Academic Press;Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Press,New York;and Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,New York,每部文獻在此全文引入,作為參考)。
            在一個實施方案中,RecE/T和/或Redα/β在大腸桿菌中由高拷貝質粒表達,所述高拷貝質粒如含有ColE1衍生性復制起點的質粒,其示例是本領域眾所周知的(見Sambrook et al.,1989,supra;還見Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,及其引用的參考文獻),如pUC19及其衍生物(Yanisch-Perron et al.,1985,Gene 33103-119)。
            關于在不同表達水平進行表達(調節的或固定的)調控的問題,本領域技術人員知道很多這樣的調控序列。如下所述,產生寬范圍表達水平的能力對于應用本發明方法是有益的。這種表達可以通過固定以及調控或誘導的形式實現。
            通過應用多種可誘導調控序列,可以實現不同表達水平的誘導表達。在一個實施方案中,例如,這些多肽的編碼序列通過lacOP調控序列轉錄時,應用lacI基因及其誘導子IPTG可以產生RecE/T的可誘導、高水平表達。
            RecE和RecT可以通過不同啟動子表達,或者,recE和recT基因可以在多順反子mRNA中通過單一啟動子表達。這些異源啟動子可以是可誘導的,也可以是固定的。該表達優選通過可誘導啟動子調控。不同表達水平的可誘導表達可以通過多種可誘導調控序列實現。在一個實施方案中,例如,這些多肽的編碼序列通過lacOP調控序列轉錄時,應用lacI基因及其誘導子IPTG可以產生RecE/T的可誘導、高水平表達。大量其他可誘導啟動子系統也可應用,它們對于本領域技術人員來說是眾所周知的。通過應用不同強度的啟動子,RecE/T或Redα/β構建物的表達水平也可不同。
            其他可以應用的表達調控系統包括但不限于可通過阿拉伯糖(AraC)誘導的araC啟動子,TET系統(Geissendorfer and Hillen,1990,Appl.Microbiol.Biotechnol.33657-663),噬菌體λ溫度的PL啟動子和可誘導λ抑制子CI857(Pirrotta,1975,Nature 254114-117;Petrenko et al.,1989,Gene 7885-91),trp啟動子和trp抑制子系統(Bennett et al.,1976,Proc.Natl.Acad.Sci USA 732351-55;Wame et al.,1986,Gene 46103-112),lacUV5啟動子(Gilbert and Maxam,1973,Proc.Natl.Acad.SciUSA 701559-63),lpp(Nokamura et al.,1982,J.Mol.Appl.Gen.1289-299),T7基因-10啟動子,phoA(堿性磷酸酶),recA(Horii et al.,1980)以及tac啟動子,可以通過色氨酸誘導的trp-lac融合啟動子(Amann et al.,1983,Gene 25167-78),例如,都是常用的強啟動子,每種啟動子控制的蛋白水平,都可累積達到細胞總蛋白的大約1-10%。如果需要更強的啟動子,tac啟動子的強度大約比lacUV5強10倍,但會導致高水平基線表達,因此,應只用于需要過量表達的情況。如果需要更弱的啟動子,其他細菌啟動子是本領域眾所周知的,例如,麥芽糖、半乳糖或其他所需啟動子(這些啟動子的序列可以通過Genbank獲得,(Burks et al.,1991,Nucl.Acids Res.192227-2230)用于本文描述方法的細胞可以是含有RecE/T和/或Redα/β重組酶的任何細胞。優選地,宿主細胞是革蘭陰性細菌細胞。更優選,宿主細胞是腸細菌屬細胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限于埃希氏菌屬,沙門氏菌屬,檸檬酸細菌屬,克雷白桿菌屬以及變性菌屬。最優選的宿主細胞是大腸桿菌細胞。細胞可以來自任何生物體,包括但不限于酵母、蠅類、鼠或人類細胞,只要這些細胞能夠經工程學修飾表達適宜的重組酶。重組酶優選來自大腸桿菌的RecE/T重組酶,或者來自噬菌體λ的Redα/β重組酶,或者是來自腸桿菌屬或腸桿菌屬噬菌體的RecE/T或Redα/β重組酶系統的功能等價物,這些系統可以介導同源序列區域之間的重組。
            表達RecE/T和/或Redα/β蛋白的細胞可以通過事先電賦能制備,并儲存于-70℃。
            此外,本發明方法還可在其他任何能夠表達RecE/T和/或Redα/β的細胞中進行。例如,多種宿主載體系統可以用來表達蛋白編碼序列。這些包括但不限于病毒(如牛痘表達,腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統,病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統,微生物,例如含有酵母載體的酵母,或者噬菌體、DNA、質粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌。載體的表達元件在其強度和特異性方面各不相同。根據應用的宿主載體系統,可以選擇應用任何一種適宜的轉錄、翻譯元件。在特定實施方案中,表達RecE/T和/或Redα/β基因,或者編碼RecE/T和/或Redα/β功能活性部分的序列。在另一個實施方案中,表達含有RecE/T和/或Redα/β蛋白功能區的RecE/T和/或Redα/β片段。
            將DNA片段插入載體的任一種上述方法都可用于構建含有嵌合基因的表達載體,所述嵌合基因包括適宜的轉錄/翻譯調控信號和蛋白編碼序列。這些方法包括體外重組DNA和合成技術,以及體內重組技術(基因重組)。編碼RecE/T或Redα/β蛋白或多肽片段的核酸序列的表達,可以通過第二個核酸序列調控,這樣,RecE/T或Redα/β蛋白或多肽可以在轉化了重組DNA分子的宿主細胞中表達。例如,RecE/T或Redα/β蛋白的表達可以通過任何本領域已知的啟動子/增強子元件來調控。可用于調控RecE/T或Redα/β表達的啟動子包括但不限于SV40早啟動子區域(Bernoist and Chambon,1981,Nature 290304-310),Rous肉瘤病毒3’端長末端重復序列包括的啟動子(Yamamoto et al.,1980,Cell 22787-797),皰疹病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(Wagner etal.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781441-1445),金屬硫因基因調控序列(Brinster et al.,1982,Nature 29639-42);植物表達載體包括nopaline合成酶啟動子區域(Herrera-Estrella et al.,1984,Nature 303209-213)或花椰菜嵌合病毒35S RNA啟動子(Gardner et al.,1981,Nucl.Acids Res.92871),以及光合成酶二磷酸核酮糖羧化酶啟動子(Herrera-Estrella et al.,1984,Nature 310115-120);來自酵母或其他真菌的啟動子元件,如Gal 4啟動子,ADC(乙醇脫氫酶)啟動子,PGK(磷酸甘油激酶)啟動子,堿性磷酸酶啟動子,以及下述具有組織特異性并已用于轉基因動物的動物轉錄調控區域在胰腺腺泡細胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因調控區域(Swift et al.,1984,Cell 38639-646;Ornitz et al.,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409;MacDonald,1987,Hepatology 7425-515);在胰腺β細胞中具有活性的胰島素基因調控區域(Hanahan,1985,Nature 315115-122),在淋巴細胞中具有活性的免疫球蛋白基因調控區域(Grosschedl et al.,1984,Cell38647-658;Adames et al.,1985,Nature 318533-538;Alexander et al.,1987,Mol.Cell.Biol.71436-1444),在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中具有活性的鼠哺乳動物腫瘤病毒調控區域(Leder et al.,1986,Cell 45485-495),在肝臟細胞中具有活性的白蛋白基因調控區域(Pinkert et al.,1987,Genes and Devel.1268-276),在肝臟細胞中具有活性的甲胎蛋白基因調控區域(Krumlauf et al.,1985,Mol.Cell.Biol.51639-1648;Hammer et al.,1987,Science 23553-58);在肝臟細胞中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因調控區域(Kelsey et al.,1987,Genes and Devel.1161-171),在髓細胞中具有活性的β球蛋白基因調控區域(Mogram et al.,1985,Nature 315338-340;Kollias et al.,1986,Cell 4689-94);在腦少突細胞中具有活性的髓磷脂堿性蛋白基因調控區域(Readhead et al.,1987,Cell 48703-712);在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調控區域(Sani,1985,Nature 314283-286),以及在下丘腦具有活性的促性腺激素釋放激素基因調控區域(Mason et al.,1986,Science 2341372-1378)。
            在一個特定實施方案中,應用的載體包括一個與細菌重組酶(如RecE或RecT)編碼核酸操作性相連的啟動子,一個或多個復制起點,并可任選一個或多個可選擇標記(如抗生素耐藥基因)。
            所選載體必須與上面部分5.2.1所述的載體質粒兼容。本領域技術人員非常清楚,在單一細胞中維持多個質粒所必須的兼容性需求。在原核細胞中增殖兩個或多個構建物的方法是本領域技術人員眾所周知的。例如,含有多個復制子的細胞,可以應用含有適宜兼容復制起點的載體和獨立篩選系統來常規選擇并維持(見Miller et al.,1992,supra;Sambrook et al.,1989,supra)。
            5.2.3 宿主細胞用于本發明的克隆方法和克隆DNA增殖的宿主細胞可以是表達recE和recT和/或redα和redβ基因產物的任何細胞,也可以是這些基因能夠異源表達的任何細胞。可以應用的可能細胞類型示例包括但不限于原核真核細胞,如細菌、酵母、植物、嚙齒類動物、鼠、人類、昆蟲或哺乳動物細胞。在一個優選實施方案中,宿主細胞是細菌細胞。在最優選實施方案中,宿主細胞是大腸桿菌細胞。可以應用的特定大腸桿菌菌株示例是JC 8679和JC 9604。JC 8679和JC 9604的基因型是Sex(Hfr,F+,F-,或F)F-JC 8679包括的變異recBC 21,recC 22,sbcA 23,thr-1,ara-14,leu B6,DE(gpt-proA)62,lacYl,tsx-33,gluV44(AS),galK2(Oc),LAM-his-60,relA 1,rps L 31(strR),xyl A5,mtl-1,argE3(Oc)和thi-1。JC 9604包括相同的變異,以及recA 56變異。
            在另一個實施方案中,應用真核細胞作為本文描述的克隆和亞克隆方法的宿主細胞。可以應用任何表達或經工程學修飾可以表達細菌重組酶或其功能等價物的細胞。可以應用來自人類、鼠、猴子或其他任何生物體的細胞系。例如,用于本發明方法的非限制性細胞系示例包括CHO,VERO,BHK,HeLa,COS,MDCK,293,3T3以及WI38細胞。
            多種宿主載體系統都可用于導入或表達RecE/T,Redα/β或其功能等價系統的蛋白編碼序列。這些方法是本領域眾所周知的(見Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,New York)。這些包括但不限于病毒(如牛痘表達,腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統,病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統,微生物,例如含有酵母載體的酵母,或者噬菌體、DNA、質粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌。蛋白表達的方法也在上面部分5.2.2中給予探討。
            5.2.4 靶DNA應根據實驗設計選擇靶DNA,靶DNA可以是任意雙鏈DNA,其長度可以只有1個堿基對,也可以超過10萬個堿基對。在一個特定實施方案中,靶DNA長度高達100,125,200或300kb。在另一個特定實施方案中,靶DNA含有25-100千堿基對,例如,與BAC載體中存在的相似。靶DNAs的其他特定實施方案將在部分6的實施例中給予說明。靶DNA可以存在于任何獨立復制的DNA分子上,例如但不限于質粒,BAC或大腸桿菌染色體。靶DNA還可位于任意來源的DNA分子是,包括但不限于來源于原核細胞、古細菌或真核細胞的DNA,或者來源于病毒、噬菌體或合成體的DNA。例如,可以從下述來源獲得核酸序列人類,豬,牛,貓,禽類,馬,犬,昆蟲(如果蠅),無脊椎動物(如C.elegans),植物等。DNA可以通過本領域已知的標準方法來制備(見,例如Sambrook,et al,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York;Glover(ed.),1985,DNA CloningA PracticalApproach,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.K.Vol.I,II)。
            5.3 本發明的應用方法5.3.1 將DNA導入宿主細胞任何已知將含有靶DNA的DNA制劑導入宿主細胞的方法,均適用于上述方法。這些方法在本領域已知,包括但不限于細胞的電轉化,應用氯化鈣或銣制備功能細胞,應用包裹于病毒顆粒中的靶DNA轉化DNA。對于真核細胞,方法包括但不限于電轉化、轉染磷酸鈣沉淀的DNA和病毒包裹。在一個優選實施方案中,應用電轉化。處理含有RecE/T或Redα/β蛋白的細胞,使之適用于標準方法的電轉化(見Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,New York)。優選地,大約50ul標準電轉化功能細胞制劑用于標準方法的電轉化。在需要轉化線性或環狀載體的實驗中,優選應用≥0.3ug的載體。在需要轉化含有靶DNA的DNA制劑的實驗中,優選應用≥0.3ug。對于共轉化實驗,優選在電轉化前混和DNAs。電轉化后,優選將細胞在培養基中稀釋,并在條件培養前孵育大約1.5小時,作為復蘇期,所述條件能夠鑒別由可選擇標記基因導致的表型改變。
            在應用位點特異性重組或核酸內切酶酶切載體的實驗中,在制備電轉化功能細胞之前,或者在電轉化后的復蘇期間,或者在鑒定可選擇標記的培養期間,可以誘導SSR或核酸內切酶的表達,或者誘導SSR和核酸內切酶的聯合表達,或者誘導兩個SSR的聯合表達。
            任選的表型改變是對一種抗生素的耐藥性,將細胞培養于含有相應抗生素的平板上。在這種情況下,過夜培養后顯示抗生素耐藥性的集落主要含有所需亞克隆產物。
            在另一個實施方案中,DNA通過轉導導入宿主細胞,轉導的DNA業已包裝在噬菌體顆粒中。本領域已知P1或λ噬菌體的轉導和包裝過程。λ包裝提取物可以通過商業渠道購買(例如,通過Promega,Madison,WI)。
            5.3.2 寡核苷酸與本發明方法聯合應用的寡核苷酸同源臂、引物和銜接子寡核苷酸通常長度大約為10-100個核苷酸。在某些特定方面,寡核苷酸長度是10個核苷酸,15個核苷酸,20個核苷酸,50個核苷酸,或者100個核苷酸,或者高達200個核苷酸。在優選實施方案中,寡核苷酸長度大約為90個核苷酸。
            寡核苷酸可以通過本領域已知的任何方法進行合成(例如,在Applied Biosystems 392/394 DNA合成儀上進行標準亞磷酸胺化學合成)。而且,合成試劑可以通過任一家供應商獲得。
            與本發明方法聯合應用的寡核苷酸或其衍生物可以通過本領域已知的任何方法合成,例如,應用自動DNA合成儀(如可以通過商業渠道從Biosearch,Applied Biosystems等購買)。作為示例,硫代磷酸寡核苷酸可以通過Stein等的方法合成(1988,Nucl.Acids Res.16,3209),甲基磷酸化寡核苷酸可以通過應用控制孔玻璃多聚體支持物來制備(Sarin et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7448-7451)等。
            一個寡核苷酸可以包括至少一個修飾堿基,只要這種修飾不會干擾同源重組。例如,這些修飾包括但不限于5-氟尿嘧啶,5-溴尿嘧啶,5-氯尿嘧啶,5-碘尿嘧啶,次黃嘌呤,黃嘌呤,4-乙酰胞嘧啶,5-(羧羥甲基)尿嘧啶,5-羧甲氨甲基-2-硫尿嘧啶核苷,5-羧甲氨甲基尿嘧啶,雙氫尿嘧啶,β-D-galactosylqueosine,次黃嘌呤核苷,N6-異戊烯腺嘌呤,1-甲基鳥嘌呤,1-甲基次黃嘌呤核苷,2,2-二甲基鳥嘌呤,2-甲基腺嘌呤,2-甲基鳥嘌呤,3-甲基胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,N6-腺嘌呤,7-甲基鳥嘌呤,5-甲氨甲基尿嘧啶,5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶,β-D-mannosylqueosine,5’-甲氧羧甲基尿嘧啶,5-甲氧尿嘧啶,2-甲硫-N6-異戊烯腺嘌呤,尿嘧啶-5-氧乙酸(v),甲尿嘧啶,queosine,2-硫胞嘧啶,5-甲基-2-硫尿嘧啶,2-硫尿嘧啶,4-硫尿嘧啶,5-甲基尿嘧啶,尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯,尿嘧啶-5-氧乙酸(v),5-甲基-2-硫尿嘧啶,3-(3-氨-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶,以及2,6-二氨基嘌呤。
            寡核苷酸包括至少一個修飾的磷酸主干,只要這種修飾不會干擾同源重組。這些修飾包括但不限于硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,硫代亞磷酰胺,亞磷酰胺,亞磷酰二胺,甲基碳磷酸化合物,烷基磷酸三酯,以及甲縮醛或其類似物。
            5.3.3 DNA擴增可以應用聚合酶鏈反應(PCR)連同本發明,從某一來源(如,組織樣本,基因組或cDNA文庫)擴增所需序列。代表已知序列的寡核苷酸引物可以用作PCR引物。進行典型的PCR需要應用熱循環儀(如來自Perkin-Elmer Cetus)和熱穩定聚合酶(如Gene AmpTM牌的Taq聚合酶)。待擴增核酸模板包括但不限于任何物種的mRNA,cDNA或基因組DNA。PCR擴增方法是本領域眾所周知的(見,例如美國專利號4,683,202,4,683,195和4.889.818;Gyllenstein et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7652-7656;Ochman et al.,1988,Genetics 120,621-623;Loh,et al.,1989,Science 243,217-220)。
            5.4 診斷應用的方法本發明方法可用于探測、預后、診斷或監測多種與異源或變異DNA相關的感染、病況、疾病和功能紊亂,或監測其治療情況。例如,如下部分5.4.1所述,這些方法可以用于探測、預后、診斷或監測多種感染和疾病,如與病毒感染、細菌感染或原生動物、寄生蟲或其他已知病原體感染有關的疾病。如下部分5.4.2所述,這些方法可以用于探測、預后、診斷或監測多種與變異DNA存在相關的感染、病況、疾病和功能紊亂,如基因突變或單核苷酸多態性(SNP)。以診斷為目的的方法將在這里給予詳盡闡述。
            5.4.1 探測異源DNA上面描述的本發明方法還可用于探測異源DNA,如在暴露于病原體的患者中,探測源于病原體暴露而產生的病毒或細菌DNA。患者可能出現也可能沒出現病原體感染癥狀,或與病原體存在相關的疾病或功能紊亂。例如,在一個實施方案中,靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有這種疾病或感染的患者DNA中制備。設計并制備具有與異源靶DNA同源序列的同源臂。然后應用上面部分5.1所述任一方法,將樣本DNA導入表達細菌重組酶并含有載體DNA的大腸桿菌宿主細胞中。在另一個實施方案中,銜接子寡核苷酸可以設計包括與載體序列同源的第一個序列,以及與異源靶DNA同源的第二個序列,其定向性細節如上面部分5.1所述。這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA和載體DNA一起,共同轉染表達RecE/T或Redα/β的大腸桿菌宿主細胞,也可以直接轉染已經包括載體DNA和樣本DNA的細胞。然后如上面部分5.1所述,將細胞在選擇培養基中培養,呈現選擇抗性的細胞可以用來分析適宜大小插入序列的存在。
            靶DNA可以從患者或受試者的生物樣本中分離,例如但不限于全血,血漿,血清,皮膚,唾液,尿液,淋巴液,活檢細胞,組織培養細胞,培養基,也可以從非生物樣本中分離,如食物,水或其他材料。從這些材料中制備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見,如CurrentProtocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,1987-1994 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
            例如,在一個實施方案中,需要探測或診斷一種病毒感染或疾病,同源臂包括與已知病毒DNA的DNA序列同源的DNA序列。這些方法可以用來探測、分離病毒DNA,其形式可以是病毒DNA鏈,也可以是DNA或RNA病毒的DNA復制中間產物。
            例如,在一個實施方案中,可以應用同源臂直接確定DNA基因組或DNA病毒的復制中間產物,所述同源臂序列被設計成與病毒序列同源,這些DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒,細小病毒如腺相關病毒和巨細胞病毒,Papova病毒如乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒和SV40,腺病毒,皰疹病毒如I型單純皰疹病毒(HSV-I)、II型單純皰疹病毒(HSV-II)和EB病毒,以及痘病毒如痘癥(天花)和牛痘病毒。在另一個實施方案中,可以應用同源臂直接確定從DNA中間產物復制獲得的逆病毒RNA病毒的復制中間產物,所述同源臂序列被設計成與病毒序列同源,這些RNA病毒包括但不限于I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I),II型人類免疫缺陷病毒(HIV-II),I型嗜人類T淋巴細胞病毒(HTLV-I),II型嗜人類T淋巴細胞病毒(HTLV-II)。在另一個實施方案中,為了探測、分離從RNA中間產物復制獲得的RNA病毒的基因組或復制中間產物,可以根據本領域眾所周知的方法,分離RNA,并應用逆轉錄酶將其轉錄成RNA的cDNA拷貝。這些cDNA拷貝就可作為靶DNA來探測RNA病毒的存在,所述RNA病毒如流感病毒,麻疹病毒,狂犬病病毒,Sendai病毒,細小核糖核酸病毒如脊髓灰質炎病毒,柯薩奇病毒,鼻病毒,呼腸病毒,披膜病毒如風疹病毒(德國麻疹)和Semliki森林病毒,蟲媒病毒,以及甲型肝炎病毒。
            在另一個優選實施方案中,需要診斷或探測細菌感染,同源臂包括與已知細菌DNA序列同源的DNA序列。例如,在一個實施方案中,同源臂DNA序列可以與病原細菌的cDNA或基因組DNA同源,所述細菌包括但不限于釀膿鏈球菌,肺炎鏈球菌,淋病奈瑟球菌,腦膜炎奈瑟球菌,白喉棒狀桿菌,肉毒梭狀芽胞桿菌,產氣莢膜梭狀芽胞桿菌,破傷風梭狀芽胞桿菌,流感嗜血桿菌,肺炎克雷白桿菌,臭鼻克雷白桿菌,鼻硬結克雷白桿菌,金黃色葡萄球菌,霍亂弧菌,大腸桿菌,綠膿桿菌,胚胎彎曲桿菌,空腸彎曲桿菌,嗜水氣單胞菌,cereus桿菌,遲鈍愛德華菌,小腸結腸炎耶爾森氏菌,鼠疫耶爾森氏菌,假結核耶爾森氏菌,志賀痢疾桿菌,弗氏志賀菌,宋內志賀菌,鼠傷寒沙門氏菌,梅毒螺旋體,極細密螺旋體,品他病密螺旋體,奮森氏疏螺旋體,出血性黃疽鉤端螺旋體,結核分支桿菌,鼠弓形體,卡氏肺囊蟲,土拉弗朗西斯菌,流產布魯氏菌,豬布魯氏菌,馬爾他布魯氏菌,Mycoplasma spp.,恙蟲熱立克次體,Chlamydia spp.,以及幽門螺旋桿菌。
            在另一個實施方案中,同源臂DNA序列可以與病原性真菌的cDNA或基因組DNA同源,所述真菌包括但不限于Coccidioidesimmitis,煙曲霉,白色念珠菌,皮炎芽生菌,新型隱球菌,以及莢膜組織胞漿菌。
            在另一個優選實施方案中,需要診斷或探測原生動物感染,同源臂可以包括與已知原生動物DNA序列同源的DNA序列。例如,這些同源臂DNA序列可以與任何已知原生動物的cDNA或基因組DNA同源。特別感興趣的病原性原生動物如Entomoeba histolytica,口腔毛滴蟲,人毛滴蟲,陰道毛滴蟲,岡比亞錐蟲,羅德西亞錐蟲,克氏錐蟲,熱帶利什曼原蟲,巴西利什曼原蟲,肺炎肺囊蟲,間日瘧原蟲,惡性瘧原蟲,以及三日瘧原蟲。
            在另一個優選實施方案中,需要診斷或探測寄生蟲感染,同源臂可以包括與已知寄生蟲DNA序列同源的DNA序列。例如,這些同源臂DNA序列可以與任何已知寄生蟲的cDNA或基因組DNA同源,這些寄生蟲包括,例如蠕蟲,包括蟯蟲,毛首鞭蟲,蛔蟲,旋毛蟲,糞類圓線蟲, 日本血吸蟲,曼氏血吸蟲,埃及血吸蟲以及鉤蟲。
            5.4.2 在細胞DNA中診斷突變和多態性本發明方法還可用于在患者樣本中分離、探測遺傳紊亂,并預后、診斷或監測與變異DNA相關的多種病況、疾病和功能紊亂,所述變異DNA如基因突變或單核苷酸多態性(SNP),以及探測罹患某種疾病或功能紊亂的遺傳傾向性。
            例如,在一個實施方案中,靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有某種遺傳性疾病或功能紊亂的患者樣本DNA中分離制備。在一個優選實施方案中,設計并制備含有同源臂的載體,并導入表達細菌重組酶如RecE/T和/或Redα/β的大腸桿菌宿主細胞中,所述同源臂的序列與特定目標基因或目標基因組區域同源。然后將樣本DNA導入宿主細胞。在另一個實施方案中,設計的銜接子寡核苷酸包括與載體序列同源的第一個序列,以及與目標靶基因DNA同源的第二個序列,其定向性細節如上面部分5.1所述。在一個優選實施方案中,這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA一起,共同轉染表達RecE/T和/或Redα/β并含有載體DNA的大腸桿菌宿主細胞。此外,還可應用上面部分5.1詳細描述的任何其他用于同源重組克隆的方法。然后如上面部分5.1所述,在選擇培養基中培養細胞,分析抗選擇細胞中適宜大小插入序列的存在。然后通過本領域眾所周知的限制性分析或序列分析技術,分析DNA中目標突變或DNA變異體的存在(見,例如Current Protocols in Molecular Biologyseries of laboratory technique manuals,1987-1994 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
            在另一個實施方案中,同源臂或銜接子寡核苷酸可以包括目標基因突變或DNA多態性序列。在該實施方案中,只有樣本DNA包括該突變時,重組才會發生。該方法可用于診斷性篩檢大規模樣本中的特定突變或DNA多態性,因為只有包括這一特定突變的細胞才會對選擇具有抗性。
            靶DNA可以從任何DNA樣本中獲得,如基因組DNA,cDNA或線粒體DNA。例如,在一個實施方案中,靶DNA可以是人類染色體的一個區域。在另一個實施方案中,靶DNA是混和形式,例如從眾多目標受試者中獲得的基因組DNA混和物,所述目標受試者如罹患某一特定功能紊亂的患者。這樣的靶DNA可以從生物樣本中分離,例如但不限于全血,血漿,血清,皮膚,唾液,尿液,淋巴液,活檢細胞,組織培養細胞,培養基,也可以從非生物樣本中分離,如食物,水或其他材料。從這些材料中制備DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見,如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniquemanuals,1987-1994 Current Protocols,1994-1997 John Wiley and Sons,Inc.)。
            可以應用該方法檢測的遺傳性功能紊亂的非限制性示例包括與遺傳性疾病相關的突變和SNPs,如與乳腺癌相關的Brca-1,與囊性纖維化、Tay-Sachs病、鐮狀細胞性貧血、血友病、動脈硬化、糖尿病、白血病、前列腺癌及其他腫瘤、以及肥胖相關的突變。這些遺傳性疾病還包括退行性、非退行性神經系統疾病如阿爾茨海默病,帕金森氏病,肌萎縮性脊髓側索硬化,Huntington’s病,Wilson’s病,脊髓小腦性共濟失調,Friedreich’s共濟失調和其他共濟失調,(月元)病毒性疾病包括Creutzfeldt-Jakob病,齒狀核紅核pallidoluysian萎縮,海綿腦病,肌強直性萎縮,抑郁,精神分裂以及癲癇。遺傳性疾病還可能包括代謝性疾病,例如,低血糖或苯丙酮尿癥。還包括心血管疾病和病況,這些疾病的非限制性示例包括動脈硬化,心肌梗塞和高血壓。本發明還可用來探測、診斷萊姆病,結核和性傳播疾病。
            在另一個實施方案中,本發明同源重組克隆方法可用于檢測一種疾病或功能紊亂的遺傳學基礎。例如,靶DNA可以從罹患某種功能紊亂的患者樣本中分離,所述功能紊亂的遺傳學基礎尚不知曉。在另一個實施方案中,該克隆方法可用于在一群已知或懷疑患有某種功能紊亂的患者中,分離已知或懷疑與該疾病或功能紊亂相關的染色體區域。然后,應用本領域眾所周知的變異DNA繪圖技術,如限制性片段長度多態性或其他SNP探測技術,可以進一步分離、分析獲得的DNA,探測基因突變或多態性的存在(見如,Nikiforov et al.,1997年10月21日授予的美國專利號5,679,524;McIntosh et al.,1998年12月30日備案的PCTpublication WO 98/59066;Goelet et al.,1995年5月11日備案的PCTpublication WO 95/12607;Wang et al.,1998,Science 2801077-1082;Tyagi et al.,1998,Nature Biotechnol.1649-53;Chen et al.,1998,Genome Res.8549-556;Pastinen et al.,1996,Clin.Chem.421391-1397;Chen et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.9410756-10761;Shuber et al.,l997,Hum.Mol.Gen.6337-347;Liu et al.,1997,Genome Res.7389-398;Livak et al.,1995,Nature Genet.9341-342;Day and Humphries,1994,Annal.Biochem.222389-395)。
            目標化學物質相關性靶功能紊亂的非限制性示例包括哮喘,關節炎,銀屑病,excema,過敏,耐藥,藥物毒性以及腫瘤,例如但不限于人類肉瘤和癌癥,如纖維肉瘤,粘液肉瘤,脂肪肉瘤,軟骨肉瘤,骨肉瘤,脊索瘤,血管肉瘤,內皮肉瘤,淋巴血管肉瘤,淋巴血管內皮肉瘤,滑膜瘤,間皮瘤,Ewing’s腫瘤,平滑肌肉瘤,橫紋肌肉瘤,結腸癌,胰腺癌,乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,鱗狀上皮細胞癌,基底細胞癌,腺癌,汗腺癌,脂肪腺癌,乳頭癌,乳頭腺癌,囊腺癌,髓樣癌,支氣管癌,腎癌,肝細胞瘤,膽管癌,絨毛膜癌,精原細胞瘤,胚胎性癌,Wilm’s腫瘤,宮頸癌,睪丸腫瘤,肺癌,小細胞肺癌,膀胱癌,表皮癌,神經膠質瘤,星型細胞瘤,成神經管細胞瘤,顱咽管瘤,室鼓膜瘤,松果體瘤,成血管細胞瘤,聽神經瘤,少突神經膠質細胞瘤,腦膜瘤,黑色素瘤,成神經細胞瘤,視網膜母細胞瘤;白血病,如急性淋巴細胞白血病和急性髓細胞白血病(成髓細胞白血病,前髓細胞白血病,髓單核細胞白血病,單核細胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(慢性髓細胞(粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病),多發性骨髓瘤,Waldenstrom’s巨球蛋白血癥,以及重鏈病。該同源重組克隆方法還可進一步用于診斷、探測異常差異,以及診斷罹患自身免疫性疾病的患者,所述自身免疫性疾病包括但不限于胰島素依賴性糖尿病,多發性硬化,系統性紅斑狼瘡,Siogren’s綜合征,硬皮病,多肌炎,慢性活動性肝炎,混和性結締組織病,原發性膽汁性肝硬化,有害的貧血,自身免疫性甲狀腺炎,特發性Addison’s病,白癜風,麩質敏感性腸病,Graves病,重癥肌無力,自身免疫性中性粒細胞減少癥,特發性血小板減少性紫癜,類風濕關節炎,肝硬化,尋常性天皰瘡,自身免疫性不育,Goodpasture’s病,大皰性類天皰瘡,盤狀狼瘡,潰瘍性結腸炎,以及dense deposit病。
            同源重組克隆方法還可用于分離、診斷、探測與疾病無關的DNA突變、改變、變異和SNPs。非限制性示例包括在非編碼基因組序列中出現的DNA突變、改變、變異和SNPs,或者與人類不同血型相關的DNA突變、改變、變異和SNPs。
            在本發明一個優選方面中,本發明方法可以具體用于分離、探測、診斷、預后或監測人類DNA突變、改變、變異和SNPs。但是,應該理解,這里描述的方法還可用于分離、探測、診斷、預后或監測其他哺乳動物疾病,例如,農用動物包括牛、馬、羊、山羊和豬,居家寵物包括貓和狗,以及植物包括農作物和園藝植物。
            5.5 試劑盒本發明還提供了可以使本文描述的同源重組克隆和亞克隆方法更易于應用的試劑盒。在一個實施方案中,提供的試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)含有細菌重組酶的細胞。該細胞可以內源性表達該重組酶,也可以重組表達該重組酶。
            在另一個實施方案中,提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂,這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源;b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個序列和第二個序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;c)第二個寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及d)含有細菌重組酶蛋白,如RecE/T和/或Redα/β蛋白的細胞。在一個特定實施方案中,細胞是大腸桿菌細胞。
            在另一個實施方案中,本發明提供的試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂,這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源;b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;以及c)第二個寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源。
            在多個特定實施方案中,試劑盒的靶DNA可以是細菌、病毒、寄生蟲、原生動物或病原DNA。在其他特定實施方案中,試劑盒靶DNA可以包括已知或懷疑與某一功能紊亂或疾病相關的基因突變或多態性。在另一個特定實施方案中,銜接子寡核苷酸序列或載體同源臂序列與基于BAC,PAC,λ,質粒或YAC的克隆載體同源。
            6.實施例克隆和亞克隆RecE/T和Redα/β在本部分給出的實施例描述了應用本發明同源重組方法,成功克隆、亞克隆的多個實驗。還顯示了亞克隆方法的不同手段。特別需要指出的是,一個實施例成功克隆了比前述任何插入片段都大的片段——從大約150kb的BAC載體中定向亞克隆了25kb的DNA片段。
            6.1.方法和材料制備線性片段應用標準PCR反應條件擴增線性DNA片段。從pACYCl77擴增1972bp的p15A起點和卡那霉素耐藥基因(來自Tn903)。p15A起點允許該質粒或重組體可以在細胞中與攜帶ColE1兼容組起點的質粒共同存在。從pACYC184擴增1934bp的氯霉素(來自Tn9)耐藥基因和p15A起點。
            用于PCR反應的寡核苷酸包括,在其3’端,作為pACYC質粒引物的18-30核苷酸序列,以及5’端,與靶DNA側翼區同源的50-60個核苷酸延伸序列。對于較長的寡核苷酸,應用的PCR反應退火溫度是62℃。通過應用QIAGEN PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產物,并用dH2O洗脫。通過應用Dpn I消化PCR產物,去除模板DNA。消化后,應用乙醇沉淀PCR產物,然后再次懸浮于dH2O中,濃度為0.5ug/ul。制備功能細胞通過標準方法制備電轉化功能細胞。簡而言之,過夜培養的細胞應用含有適宜抗生素的LB培養基稀釋100倍。生長到最佳密度,OD600=0.25-0.4的大腸桿菌細胞在冰上冷凍15分鐘。然后在-5℃以7,000rpm離心細菌細胞10分鐘。用10%的冰凍甘油再懸沉淀的細菌細胞,然后在-5℃以7,000rpm離心10分鐘,以產生沉淀。以冰凍10%甘油清洗、再離心3次后,以等細胞體積的冰凍10%甘油懸浮細胞沉淀。將功能細胞以50ul等分存于eppendorf管,放入液氮冷凍,存于-70℃。
            應用質粒pBAD-ETγ或pBAD-αβγ的實驗包括應用標準方法將這些質粒轉化到大腸桿菌宿主中,然后在添加了0.2%葡萄糖、50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜,直至生長到飽和,然后應用添加了50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基稀釋培養物100倍,并繼續生長到OD600為0.15。然后添加L-阿拉伯糖至終濃度為0.1%。在細胞生長到OD600為0.25-0.4后,在冰上冷凍15分鐘。電轉化將1ul的DNA溶液(包括大約≥0.5ug的共轉化DNA,或者大約≥0.3ug的載體DNA,為細胞提供錨定靶,或者大約≥0.5ug的DNA,含有細胞錨定載體的靶基因)與功能細胞混和。將細胞、DNA混合物轉移到冰凍小杯中。應用Bio-Rad基因脈沖儀進行電轉化,設置為25uFD,2.3kV,脈沖對照設置為200ohms。電轉化后,加入LB培養基(1ml)。細胞在37℃搖動孵育1-1.5小時,然后接種到含有與載體可選擇標記基因相應的抗生素平板上。6.2 結果表1總結了6個實驗的結果,在這6個實驗中,應用不同來源的RecE/T或Redα/β表達亞克隆了不同目標靶DNA區域。第一列以“ET”表達開頭,是指RecE/T或Redα/β來源,如表所示,其來源可以是大腸桿菌宿主JC8679或JC9604的內源性RecE/T,也可以是源于質粒pBADαβγ的pBAD-recE/T。第二列指示所用大腸桿菌宿主。第三列指示靶基因。
            在第一個實驗中,大腸桿菌染色體上的recE/T基因在大腸桿菌菌株JC8679中亞克隆,該菌株中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2概括的策略實現。設計、合成的寡核苷酸具有以下序列5’-TTCCTCTGTATTAACCGGGGAATACAGTGTAATCGATAATTCAGAGGAATAGCTCGAGTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’(序列1)和5’-CAGCAATGTCATCGAGCTGAGACTTACTGATACCGGGACCCGCGTGGTAATTCTCGAGTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’(序列2)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因。該實驗結果概括于表1的第一行。
            表1.ET表達 大腸桿菌宿主 靶基因 集落總數 正確%(18)內源性 JC8679 大腸桿菌染色 540 89recE/T 體上的recE/T內源性 JC8679 大腸桿菌染色 760 94recE/T 體上的lacZ內源性 JC9604 大腸桿菌染色 290 100recE/T 體上的lacZpBAD- JC5519 高拷貝質粒上 >3,000 100recE/T 的慶大霉素pBAD-αβγ HB101 大腸桿菌染色 370 94體上的lacZpBAD-αβγ HS996 BAC中mAF4 160 83的內含子3在第二個實驗中,大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌株JC8679中亞克隆,該菌株中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2概括的策略實現。載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAGT-3’(序列3)和5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’(序列4)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因。該實驗結果概括于表1的第二行。
            在第三個實驗中,大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌株JC9604中亞克隆,該菌株中RecE/T的表達是固定的。這可以通過圖2概括的策略實現。載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’(序列5)和5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’(序列6)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因。該實驗結果概括于表1的第三行。
            在第四個實驗中,位于高拷貝質粒pFastBAC1(Gibco)上的慶大霉素基因通過圖3概括的策略,在大腸桿菌菌株JC5519中亞克隆。在pBAD-recE/T質粒轉化JC5519后,通過該質粒表達RecE/T,并在制備功能細胞前,應用阿拉伯糖誘導。載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGGATCCTTAATAAGATCATCTTCTGAGATCGTTTTGG-3’(序列7)和5’-TGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCAGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’(序列8)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因,將PCR產物與BamHI消化的pFastBAC1混和,共轉化,并接種于含有慶大霉素和卡那霉素的平板上。
            在第五個實驗中,位于大腸桿菌染色體上的lacZ基因通過圖2概括的策略,在大腸桿菌菌株HB101中亞克隆。在pBAD-recE/T質粒轉化HB101后,通過該質粒表達RecE/T,并在制備功能細胞前,應用阿拉伯糖誘導。載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCTTATTCTCCGTGGGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’(序列9)和5’-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3’(序列10)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因。該實驗結果概括于表1的第五行。
            在第六個實驗中,攜帶鼠AF4基因的大約150kb BAC克隆的25kb區域通過圖3概括的策略,在大腸桿菌菌株HS996中亞克隆。在pBAD-recE/T質粒轉化HS996后,通過該質粒表達RecE/T,并在制備功能細胞前,應用阿拉伯糖誘導。載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TGTAGCTGAGCCCAGGGGCAAGGCTGCTTTGTACCAGCCTGCTGTCTGCGGGGGCATCACCTGGAATTCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3’(序列11)和5’-TGGGTGTCAACCTCAGGCTTTCTCACACGCAATACAGGTAGGGACTTGCACCCCTACACACCGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’(序列12)來擴增pACYC177上的p15A復制起點和Tn903卡那霉素耐藥基因。PCR產物與0.5ug純化BAC DNA混和,然后共轉化。該實驗結果概括于表1的第六行。圖6顯示的是溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠,顯示了應用EcoRI消化的DNA,該DNA分離自9個來自mAF4 BAC實驗的獨立集落(泳道1-9),對照是應用EcoRI消化的起始載體(泳道10)。
            在第七個實驗中,應用圖7概括的策略,克隆了含有來自酵母菌株MGD 353-13D的氨芐青霉素耐藥基因的基因組DNA區域。如圖A所示,含有p15A復制起點的DNA片段,其側翼是98或102bp的同源臂,所述同源臂指向酵母菌株MGD 353-13D中的氨芐青霉素耐藥基因側翼區域的98或102bps。應用大腸桿菌菌株JC5519,Redα/β的表達由質粒pBADαβγ-TET提供,然后,在制備功能細胞前,應用阿拉伯糖誘導。pBADαβγ-TET是pBADαβγ的衍生物,其中,氨芐青霉素耐藥基因被四環素耐藥基因所取代。克隆載體通過PCR技術進行制備,PCR中所用寡核苷酸具有如下序列5’-TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAG-3’(序列13)和5’-TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3’(序列14)來擴增pACYC177上的p15A復制起點。PCR產物與4ug NcoI消化的MGD 353-13D酵母基因組DNA混和,然后共轉化包括Redα/β表達的JC5519,Redα/β表達來自pBADαβγ,在37℃、L-肉湯中培養90分鐘復蘇期后,接種于含有氨芐青霉素的平板。通過氨芐青霉素耐藥選擇鑒定克隆。共有18個克隆進行了DNA分析。圖7B顯示了10個正確克隆的溴化乙啶染色凝膠。
            這里描述的實施例說明,RecE/T和Redα/β同源重組克隆方法可以將多種環狀靶基因成功克隆到大腸桿菌染色體上,所述環狀靶基因從高拷貝質粒到低拷貝較大靶基因(BAC)。
            7.載體重復序列和磷酸化對克隆效率的影響本部分給予的實施例描述了應用RecE/T或Redα/β介導的同源重組(“ET克隆”)技術進行高效克隆和亞克隆的最佳條件。特別是如圖8所示,去除載體中的重復序列可以改善克隆效率。相反,在線性載體末端出現的5’磷酸化對ET克隆的效率影響卻很小。
            首先,在下述實驗中檢測了重復序列對克隆效率的影響。如圖8所示,作為克隆載體的線性載體包括p15A復制起點,氯霉素耐藥基因(Cm’),PCR擴增線性載體所需的核苷酸序列(圖8中以斜體代表),大腸桿菌lacZ基因的側翼同源臂,以及在線性載體兩端存在的不同長度的末端重復序列(以黑體代表)。將線性載體轉化到表達pBADRedα/β(Zhang et al.,1998,Nat.Genet.20123-128)的JC8679(內源性ET;Clark,1974,Genetics,78,259-271)或JC5519(Willetts and Clark,1969,J.Bacteril.100231-239)中。圖8表中顯示了應用指示寡核苷酸PCR擴增線性載體后,在ET亞克隆后,LB平板(含有50ug/ml的氯霉素)上含有的集落數量。其中18個集落進行了限制性消化。用正確重組體數量除以總集落數量得出重組效率。因此,末端重復>6個核苷酸可以顯著降低ET亞克隆效率。所有背景集落都含有再連接的線性載體。
            還檢測了磷酸化對重組效率的影響,結果如圖8所示。應用T4 DNA激酶和γ-ATP使線性載體末端磷酸化。如圖8最后一列所示,沒有觀察到對ET亞克隆或載體再連接的影響。
            該實施例顯示,在線性載體末端或在同源臂與載體必需元件之間存在的重復序列,導致的重組可以顯著降低ET克隆和亞克隆效率,所示必需元件即復制起點和可選擇標記。因此,在一個優選實施方案中,同源克隆載體序列在編碼復制起點和可選擇標記序列的外部,不包括任何≥5個堿基的直接重復序列。
            8.RecE/T和Redα/β克隆和亞克隆的其他實施例本部分給出的實施例描述了其他實驗,這些實驗顯示應用RecE/T或Redα/β介導的同源重組技術,成功進行克隆和亞克隆的方法。大腸桿菌宿主如上所述,“ET功能宿主”是指能夠表達RecE/T和/或Redα/β的任何大腸桿菌細胞。這可以通過多種途經實現,如(i)內源性表達RecE/T或Redα/β的菌株,或者(ii)通過外源導入質粒表達RecE/T或Redα/β的菌株。該實施例描述了基于JC9604和JC8679及其衍生物(主要是YZ2000和YZ2001)的質粒表達載體的構建。ET功能宿主的其他變異體和示例見Murphy et al.,2000,Gene 246321-330;Yu et al.,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.975978-5983;and Datsenko and Wanner,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6645。
            在第一類中,應用的兩個菌株攜帶sbcA突變,因此在RecA-(JC9604;Gillen et al.,1981,J.Bacteriology 145521-532)或RecA+(JC8679;Gillen et al.,supra)背景下內源性表達RecE/RecT。應用這些菌株的優勢在于,它們可以直接應用,不必為使該菌株具有ET克隆功能而首先導入一個質粒。缺點在于RecE和RecT在克隆全過程中始終固定表達,特別是在RecA+背景下,增加了分子內不欲重組的風險。第二個缺點在于,這些JC菌株未經修飾用于克隆和增殖宿主。它們包括完整的活性限制/修飾系統,因此大大降低了大分子如BACs導入這些宿主的效率。
            選擇內源性表達RecE/T或Redα/β的宿主菌株,還是導入質粒表達RecE/T或Redα/β的宿主菌株,有賴于環狀靶序列的性質。無論選擇哪種策略,制備品質優良的功能細胞都是至關重要的。如果宿主菌株缺乏內源性ET克隆潛能,該菌株必須首先轉化pBAD-αβγ或pBAD-ETγ。獲得的菌株必須應用終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖誘導生長,然后準備電轉化。依據經驗,細胞的最佳收獲點是OD600大約為0.35,特別是當靶序列是大DNA底物時。如果細胞的OD600大于0.5,就不應該應用了。最佳導入時間大約為1小時。必須應用電轉化,因為沒有發現其他DNA導入方法能發揮作用。制備品質良好的電轉化細胞對于獲得ET重組體是至關重要的。在制備電轉化功能細胞期間,所有步驟均需在冰上或預冷的小桶、轉子上進行。將電轉化功能細胞高度濃縮對于OD600=0.35時收獲的250ml培養物,我們常規制備成不超過10等分的功能細胞,每等分50ul。獲得的轉化效率大大依賴于所用宿主菌株,但典型的變異大約為109cfu/ug。關于如何制備電轉化功能細胞和如何進行電轉化的詳細實驗流程可以從以下網址獲得http//WWW.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/stewart/index.html。
            如圖9A所示,構建質粒pR6K/BAD-αβγ(tet),使BAC宿主菌株HS996(Invitrogen)具有進行ET重組的能力。該質粒基于pBAD24骨架(Guzman et al.,1995,J Bacteriol 1774121-4130)。Redα(或RecE)由L-阿拉伯糖可誘導pBAD啟動子誘導表達,Redβ(或RecT)由固定EM-7啟動子誘導表達。RecT相對于RecE,或Redβ相對于Redα的過量表達,可以增加ET克隆的效率(以選擇平板上的集落數量為標準)。最后,該質粒固定表達Redγ蛋白,在這種情況下,該蛋白的表達由固定Tn5啟動子誘導,所述啟動子對于抑制最常應用的宿主菌株中存在的RecBCD酶活性是必須的(Murphy,1991,J.Bacteriology 1735808-5821)。如果不使其失活,RecBAD會完全抑制ET克隆,其原因可能是該酶的核酸外切酶活性使線性DNA在有機會重組前就被降解。因此,pBAD-αβγ(tet)組成了一個移動系統,可以將可調節ET克隆特性通過轉化傳遞到接受宿主菌株中。假設RecE或Redα的表達具有誘導性,為使重組發生,RecE/T和Redo/β系統中兩個組分同時表達的絕對需求也得到滿足,重組窗的限制就是阿拉伯糖誘導時間和最不穩定組分的半衰期。將這些因素綜合考慮,并結合最常用的宿主是recA,當然宿主也可以是recBC或recBC-的擬表型(取決于Redγ的表達),這意味著不欲分子內重組發生的風險顯著降低。pBAD-αβγ(tet)的另一個有用特征是當這些質粒在培養期間沒有被選擇時,它們傾向于迅速消失。這可能是由于Redγ的固定表達,也會依賴宿主細胞的其他因素發生變化,例如RecBCD的存在。
            pR6K/BAD-αβγ的復制需要R6K起點和Pir-116蛋白(Metcalf et al.,1994,Gene 138,1-7)。pR6K/BAD/αβγ攜帶來自pJP5603的R6K起點(Penfold and Pemberton,1992,Gene 118145-6),在細菌中控制R6K ori質粒復制的pir-116復制子基因,以及來自pBR322的四環素耐藥基因tet。Pir-116是一個拷貝突變體,允許含有R6K起點的質粒在大腸桿菌菌株中以超過每細胞200拷貝的量存在。pir-116基因來從大腸桿菌菌株BW3647,通過PCR擴增,并在lacZ啟動子后克隆。
            為了制備pR6K/BAD/αβγ,將R6K起點、pir-116和tet通過ET重組導入pBAD-αβγ(Muyrers et al.,1999,Nucleic Acids Research,271555-1557),置換原來存在于pBAD-αβγ上的ColE1起點和氨芐青霉素耐藥基因。同樣制備pR6K/BAD/ETγ和pR6K/BAD/recT。基于R6K的任何質粒相較于基于ColE1的親本質粒,拷貝數大約高2倍。在標準BAC亞克隆練習中并行比較pR6K/BAD/αβγ和pBAD-αβγ,結果發現基于R6K的質粒工作效率更高(見圖9B)。在這些pR6K質粒中存在的R6K復制系統不含任何與其他復制起點顯著同源的序列,所述其他復制起點包括p15a和ColE1。而且,基于R6K的質粒與其他任何復制起點兼容。因此,如ColE1和p15A的復制起點可以包括在用于ET亞克隆的線性載體中。ET亞克隆
            圖10顯示了亞克隆一個19kb的片段,該片段包括BAC上AF-4基因的外顯子2和3。首先,將pR6K/BAD-αβγ轉化到攜帶BAC的菌株中。隨后,在含有15ug/ml四環素和12.5ug/ml氯霉素的LB培養基中培養這些轉化菌株。應用L-阿拉伯糖誘導生長細胞1小時,然后制備電轉化功能細胞。這些細胞通過電轉化導入線性載體,所示載體包括p15A復制起點和氨芐青霉素耐藥基因,β-內酰胺酶(bla),其側翼為兩個長度為50個核苷酸的同源臂,可以指導AF-4 BAC上的靶DNA同源重組。在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上生長后,收獲重組體。

            圖10B所示,選擇5個獨立集落進行分析。從5個獨立集落中制備DNA,然后應用HindII消化,并在溴化乙啶染色凝膠上進行分析。HindIII消化的正確集落和線性載體以及1kb DNA階梯(Gibco BRL)作為標記。正確亞克隆通過DNA序列分析進行確認。ET克隆如
            圖11實驗所示,基因組DNA還可作為靶DNA的直接來源。在該實驗中,線性載體包括ColE1起點和卡那霉素耐藥基因(kan),其側翼為同源臂,可以指導發生于大腸桿菌染色體上lacI/lacZ位點的重組(見
            圖11A)。基因組DNA分離自大腸桿菌,并經XhoI消化,預先線性化。混和線性載體和預線性化的基因組DNA,共同電轉化導入內源性表達RecE/RecT的YZ2000。通過在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板上選擇,獲得含有lacI和lacZ基因、ColE1起點和kan的所需亞克隆。如
            圖11B所示,16個獨立集落的限制性分析發現,含有正確產物(泳道1-16)。泳道17為線性載體,泳道M是作為標記的1kb DNA階梯(Gibco BRL)。
            另一個成功ET重組克隆示例如
            圖12所示。在該實驗中,通過應用同源臂克隆載體,在鼠ES細胞基因組DNA中直接克隆片段。如概括了克隆策略的
            圖12A所示,來自鼠ES細胞基因組DNA的新霉素耐藥基因(neo)作為靶DNA。線性載體包括ColE1復制起點和氯霉素耐藥基因Cm’,其側翼為兩個臂,與Tn5-neo基因同源。所需鼠ES細胞系可以通過轉染包括Tn5-neo的片段制備,所述片段在PGK啟動子控制下,并加polyA尾。從G418耐藥集落中分離基因組DNA,并用針剪切,通過苯酚/氯仿抽提,創建大約20-40kb的線性片段。
            通過共同電轉化線性載體和剪切的基因組DNA,將其導入JC8679的衍生物YZ2000(Clark,supra),進行ET克隆,在YZ2000中,降解異源甲基化DNA的限制性系統由于去除了mcrA,mcrBC,hsdRMS和mrr基因而部分削弱。由于過量表達RecT可以顯著增加整體ET重組效率,因此應用pR6K/BAD/recT質粒轉化YZ2000。攜帶pR6K/BAD/recT的YZ2000,在收獲前1小時應用L-阿拉伯糖誘導,然后應用0.5ug線性載體和5.0ug剪切鼠ES細胞基因組DNA共同電轉化。在含有50ug/ml氯霉素的LB平板上平均收獲25-35個集落。在含有50ug/ml卡那霉素的平板上再次增殖這些集落,通過Tn5-neo表達法測試的30個集落中發現有6個生長。在
            圖12部分B中,對卡那霉素耐藥集落的限制性分析顯示,所有6個測試集落都是正確的(泳道2-7)。假陽性限制性圖譜如泳道1所示,該集落在有氯霉素的情況下可以生長,但在卡那霉素存在的情況下無法生長。所有這些假陽性集落都包括再連接的載體。
            圖13顯示了一個聯合ET亞克隆和克隆的實驗。線性載體包括ColE1復制起點和卡那霉素耐藥基因Km’。線性載體的每個末端都包括BstZl7I位點和2個同源臂。在線性載體末端存在的同源臂(在
            圖13中以小方框表示)與λ噬菌體靶DNA同源。第二套同源臂(在
            圖13中以大方框表示)與大腸桿菌染色體上的lacI-lacZ基因同源。
            在第一步亞克隆中,線性載體與線性化λ噬菌體靶DNA共同電轉化到具有ET特性的大腸桿菌菌株JC8679ΔlacZ中。該步驟導致6.7kb的λDNA片段亞克隆到線性載體上,該片段包括exo,bet,gam,rexA和cI857基因,進而產生pYZN/λ-PR。下一步ET重組應用一個新的線性載體,該載體包括由突變laxP位點(laxP*,Araki et al.,1997,NucleicAcids Research,25868-872)側翼包繞的氯霉素耐藥基因cat,以及與pYZN/λ-PR上λDNA同源的末端臂。該線性載體與pYZN/λ-PR一起,共同電轉化到具有ET特性的大腸桿菌菌株JC8679ΔlacZ中,導致pYZN/λ-PR/Cm的形成。通過BstZl7I消化,該質粒釋放含有cat的λDNA片段,該片段由與lacI-lacZ同源的兩個末端臂側翼包繞。該片段用于定位大腸桿菌菌株JC5519(Willetts and Clark,1969,J Bacteriol,100231-239)的染色體,該菌株表達來自pBADRecE/T的RecE和RecT(Zhang et al.,1998,Nature Genetics 20123-128)。ET重組后,在存在20ug/ml氯霉素的情況下選擇生長,產生YZ2001/Cm菌株。通過應用706-Cre質粒,去除cat基因,產生YZ2001,所述質粒與705-Cre不同的是,它攜帶四環素耐藥基因(tet)而非氯霉素耐藥基因,如文獻所述(Buchholz et al.,1996,Nucleic Acids Research,243118-3119)。因此,YZ2001攜帶6.7kb的λDNA片段(exo----cI857),以及染色體上的突變laxP位點。由于YZ2001/Cm允許λ基因exo,bet和gam的熱誘導表達,因此具有條件ET特性。例如,可以應用相似的策略制備敲除構建物或進行BAC修飾。
            因此,上面給予的實施例顯示了幾種應用RecE/T和Redα/β介導的同源重組技術成功克隆和亞克隆的方法。
            這里公開的特定實施方案不應限制本發明和權利要求的范圍,因為這些實施方案是為了舉例說明本發明的幾個方面。任何等價實施方案都應該屬于本發明范疇。實際上,通過前面的描述,除了本文已經顯示或描述的修飾,本領域技術人員可以輕而易舉地對本發明進行多種其他修飾。這些修飾也應該屬于后面權利要求的范疇。在本申請文件中,引用了很多參考文獻,每篇文獻的內容均在此全文引入,作為本申請文件的參考。
            權利要求
            1.一種將雙鏈靶DNA導入載體的方法,包括培養表達功能性重組酶的細菌,所述細菌細胞包括(a)靶DNA,含有第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端,以及(b)載體DNA,在載體DNA鏈上以下述順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)復制起點,以及(iii)第二個雙鏈同源臂,這樣,載體DNA鏈的第一個同源臂序列與靶DNA鏈的第一個末端序列同源,載體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第二個末端序列同源,這樣,靶DNA可以在同源臂之間插入載體DNA中。
            2.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體導入細胞,所述細胞含有雙鏈靶DNA,并表達細菌重組酶,所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點的一條鏈,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;這樣,載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            3.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞,所述細胞含有雙鏈靶DNA,并表達細菌重組酶,所述載體含有一個復制起點和兩個雙鏈同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下列順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            4.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈靶DNA分子導入細胞,所述細胞含有一個載體,并表達細菌重組酶,所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            5.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈靶DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入細胞,所述細胞含有一個載體,并表達細菌重組酶,所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;并且所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            6.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體和雙鏈靶DNA導入表達細菌重組酶的細胞,所述載體含有一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;這樣載體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個末端核苷酸序列同源,載體DNA鏈上的第二個同源臂核苷酸序列與靶DNA鏈上的第二個末端序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            7.制備重組DNA分子的方法,包括a)將雙鏈載體,雙鏈靶DNA分子,以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導入表達細菌重組酶的細胞,所述載體含有一個復制起點和兩個雙鏈同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端,在靶DNA鏈上,從3’到5’,以下述順序存在第一個末端,靶DNA序列,以及第二個末端;所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端序列同源;所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)將細胞置于可以發生細胞內同源重組的條件下。
            8.權利要求6的方法,其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相連的編碼位點特異性重組酶的核苷酸序列,載體進一步包括位點特異性重組酶識別的第一個和第二個識別位點,第一個識別位點位于第一個和第二個同源臂的外部,第二個位點特異性重組酶識別位點位于第一個和第二個同源臂的內部;在步驟b)進行期間或進行之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            9.權利要求7的方法,其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相連的編碼位點特異性重組酶的核苷酸序列,載體進一步包括位點特異性重組酶識別的第一個和第二個識別位點,第一個識別位點位于第一個和第二個同源臂的外部,第二個位點特異性重組酶識別位點位于第一個和第二個同源臂的內部;在步驟b)進行期間或進行之后,誘導位點特異性重組酶的表達。
            10.權利要求6的方法,其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相連的編碼位點特異性核酸內切酶的核苷酸序列,載體進一步包括位點特異性核酸內切酶的識別位點,該位點位于第一個和第二個同源臂的內部;在步驟b)進行期間或進行之后,誘導位點特異性核苷內切酶的表達。
            11.權利要求7的方法,其中宿主細胞進一步包括一個與啟動子操作性相連的編碼位點特異性核酸內切酶的核苷酸序列,載體進一步包括位點特異性核酸內切酶的識別位點,該位點位于第一個和第二個同源臂的內部;在步驟b)進行期間或進行之后,誘導位點特異性核苷內切酶的表達。
            12.權利要求2-11任一項的方法,其中載體還進一步包括一個可選擇標記,位于第一個和第二個同源臂的外部,這樣,在載體DNA鏈上,從5’到3’,載體可以下述兩種順序含有i)第一個同源臂,可選擇標記,復制起點和第二個同源臂,或ii)第一個同源臂,復制起點,可選擇標記和第二個同源臂。
            13.權利要求12的方法,其中可選擇標記可以將抗生素耐藥性傳遞給含有該載體的細胞。
            14.權利要求2-11任一項的方法,其中細菌重組酶是RecE/T或Redα/β重組酶,或RecE/T和Redα/β兩種重組酶。
            15.權利要求2-11任一項的方法,其中細胞是細菌細胞。
            16.權利要求2-11任一項的方法,其中細胞是大腸桿菌細胞。
            17.權利要求2-11任一項的方法,其中細胞是重組表達RecE/T和/或Redα/β重組酶的真核細胞。
            18.權利要求2-11任一項的方法,該方法還進一步包括分離重組DNA分子,所述重組DNA分子含有插入到載體中的靶DNA。
            19.用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,所述載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點和第二個同源臂;這樣第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
            20.權利要求19的載體,其中復制起點是細菌的復制起點。
            21.權利要求19的載體,其中復制起點在大腸桿菌中發揮作用。
            22.權利要求19的載體,其中復制起點在哺乳動物細胞中發揮作用。
            23.含有雙鏈DNA載體的細胞,該載體用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子,包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點和第二個同源臂;這樣第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
            24.權利要求23的細胞,所述細胞是細菌細胞。
            25.用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;這樣,第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第一個末端序列同源,第一條載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源;以及b)含有細菌重組酶的細胞。
            26.權利要求25的試劑盒,其中同源臂的序列與基于BAC,PAC,λ,質粒或YAC的克隆載體同源。
            27.權利要求25的試劑盒,其中第一個和第二個雙鏈寡核苷酸具有的核苷酸序列與基于BAC,PAC,λ,質粒或YAC的克隆載體同源。
            28.用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;和b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個序列和第二個序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;c)第二個雙鏈寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源;以及d)含有細菌重組酶的細胞。
            29.權利要求25或28的試劑盒,其中細胞是大腸桿菌細胞。
            30.權利要求25或28的試劑盒,其中細胞是具有攝取DNA能力的凍存細胞。
            31.用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒,包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標靶DNA分子的雙鏈DNA載體,該載體包括一個復制起點和兩個同源臂,在載體DNA鏈上,從5’到3’,以下述順序存在第一個同源臂,復制起點,以及第二個同源臂;b)第一個雙鏈寡核苷酸,含有第一個寡核苷酸DNA鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列,所述第一個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源,第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源;以及c)第二個雙鏈寡核苷酸,含有第二個寡核苷酸鏈,該鏈以下述順序,從3’到5’含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列,所述第三個核苷酸序列與載體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源,第四個序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源。
            32.權利要求25,28或31的試劑盒,其中DNA載體是經純化處理的。
            33.權利要求28或31的試劑盒,其中DNA載體、第一個雙鏈寡核苷酸和第二個雙鏈寡核苷酸均是經純化處理的。
            34.權利要求25,28或31的試劑盒,其中靶DNA分子包括細菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。
            35.權利要求25,28或31的試劑盒,其中靶DNA分子包括已知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關的基因突變或多態性。
            36.權利要求25-29任一項的試劑盒,其中細菌重組酶是RecE/T或Redα/β重組酶,或者是RecE/T和Redα/β兩種重組酶。
            37.權利要求2-11任一項的方法,其中靶DNA在發生基因突變時,已知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關。
            38.權利要求2-11任一項的方法,其中靶DNA是細菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。
            39.權利要求2,4,6,8或10的方法,該方法還進一步包括探測重組DNA分子,所述重組DNA分子包括插入到載體中的靶DNA。
            40.權利要求3,5,7,9或11的方法,該方法還進一步包括探測重組DNA分子,所述重組DNA分子包括插入到載體中的靶DNA。
            41.探測感染物質存在的方法,包括實施權利要求39的方法,其中靶DNA來自懷疑罹患感染性疾病的患者,并且,第二個和第四個核苷酸序列與感染物質DNA中存在的序列同源。
            42.探測感染物質存在的方法,包括實施權利要求40的方法,其中靶DNA來自懷疑罹患感染性疾病的患者,并且,第一個和第二個同源臂序列與感染物質DNA中存在的序列同源。
            43.權利要求41或42的方法,其中感染物質是病毒、細菌、原生動物、真菌或寄生蟲。
            44.探測遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征存在的方法,包括實施權利要求39的方法,其中,靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征的患者,而且,第一個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征相關的位點上游序列同源,第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態性特征相關的位點下游序列同源。
            45.探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征存在的方法,包括實施權利要求40的方法,其中,靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征的患者,而且,第一個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征相關的位點上游序列同源,第二個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征相關的位點下游序列同源。
            46.權利要求44或45的方法,其中遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態性特征使患者具有罹患腫瘤,哮喘,關節炎,耐藥,藥物毒性,或神經系統、神經精神、代謝、肌肉、心血管或皮膚病況、疾病或功能紊亂的傾向性。
            47.權利要求19的載體,其中載體還進一步包括一個位于第一個和第二個同源臂外部的可選擇標記,這樣,在載體DNA鏈上,從5’到3’,載體可以下述兩種順序含有i)第一個同源臂,可選擇標記,復制起點和第二個同源臂,或ii)第一個同源臂,復制起點,可選擇標記和第二個同源臂。
            48.權利要求47的載體,其中載體序列在復制起點和可選擇標記的5’端或3’端均不包括一個或多個直接重復序列,所述直接重復序列包括至少≥5個核苷酸堿基對。
            全文摘要
            本發明涉及應用細菌重組酶介導的同源重組技術進行DNA亞克隆的方法和組合物。本發明涉及克隆的方法,含有用作克隆載體的多核苷酸的組合物,含有所述多核苷酸組合物的細胞,以及由細菌重組酶介導的克隆試劑盒,所述重組酶如RecE/T和Redα/β。
            文檔編號C12N1/21GK1373803SQ00812739
            公開日2002年10月9日 申請日期2000年7月10日 優先權日1999年7月9日
            發明者F·A·斯圖爾特, Y·張, J·P·P·穆伊雷爾斯 申請人:歐洲分子生物學實驗室
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