專利名稱：使用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及采用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法。具體地說，本發明涉及采用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法，這種方法包括通過基因重組將人乳鐵蛋白基因轉導進入昆蟲細胞，以及在昆蟲細胞中克隆和表達人乳鐵蛋白基因，利用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白。
人乳鐵蛋白是離子結合的單體糖蛋白的鐵傳遞蛋白家族的一員，也稱作“乳鐵傳遞蛋白”。這種人乳鐵蛋白存在于哺乳動物的奶液包括人的乳液、淚液、唾液、粘膜分泌物和多形核白細胞的次級顆粒體中。1939年，Peter Sorenson首先發現，開始命名為人類乳液的“紅蛋白質”。
乳鐵蛋白(Lf)首先從牛奶中被分離和提純。自從第一次發現乳鐵蛋白后，已經從其他哺乳動物例如人、鼠、山羊、兔、狗等等的乳液中分離和提純Lf。人類的乳液有較高量的乳鐵蛋白，例如初乳中為6到8mg/ml。但是，在輸送乳液時人乳中的乳鐵蛋白含量下降到大約2mg/ml。如果人乳在輸送過程中被細菌污染，在被污染的奶中，乳鐵蛋白的量突然升高到比正常乳鐵蛋白的量高30倍以上。
人乳鐵蛋白(hLf)是一種分子量為78kDa的糖蛋白，由含有691個氨基酸的單個多肽鏈組成。這個單個多肽由一個2折內重復單元和兩個球狀葉片組成。即人乳鐵傳遞蛋白有C和N葉片分別構成了C端和N端。這兩個葉片有非常相同的結構，C端和N端之間具有高度同源性(高達大約40％以上)。采用近代先進的X射線晶體學測定了乳鐵蛋白的三維結構，每一個C端和N端有一個結合具有高親和性的鐵的位點，而且這樣的一個乳鐵蛋白分子可逆地結合兩個鐵離子(Fe+3)(Anderson等，1989)。這樣的一個乳鐵蛋白可以以無鐵狀態(apo型)或是飽和鐵狀態(holo型)存在，這取決于它是否結合了鐵，因而決定了乳鐵蛋白的生物學特性。Apo型乳鐵蛋白存在于正常的人乳汁中。在酸性條件下所有類型的乳鐵蛋白相對于鐵傳遞蛋白幾乎都是穩定的，并且在特定的pH值釋放鐵。
乳鐵蛋白是從外分泌腺分泌的非—免疫球蛋白保護蛋白質之一，直接或間接參與抗菌機制并且因此影響抗病毒作用。乳鐵蛋白具有抗體外和體內各種微生物的抗菌活性。特別是，無鐵狀態(apo型)的乳鐵蛋白有抗革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌、Kleabsiela pnumoni和產氣桿菌、產氣微生物的抗菌活性，因為它螯合了鐵離子，而這些鐵離子是這些微生物必需的，于是抑制了這些微生物的生長。體外實驗表明，乳鐵蛋白有一種如同抗生素一樣的在一個小時內抗99.99％的細菌例如桿狀菌、大腸桿菌和沙門氏菌的有效的抗菌活性。乳鐵蛋白也參與涉及鐵結合作用的機制，以抑制微生物的生長，并且迅速地破壞細菌的生存能力。在這種機制中，乳鐵蛋白不僅破壞革蘭氏陰性細菌的外膜，以大量釋放構成外膜的脂多糖，從而損壞膜的滲透屏障，而且增加微生物對疏水抗生素例如溶菌酶或利福平的敏感性，因而降低微生物對于抗菌素的抗性。盡管乳鐵蛋白具有抗病原性微生物的作用，據說它并不具有抗有益于人體的細菌例如乳酸菌或Bifidus的抗菌作用。因此乳鐵蛋白可保護新生嬰兒抵抗細菌的感染。而且，在血液中還發現有少量的乳鐵蛋白，由嗜中性粒細胞分泌。這種乳鐵蛋白是嗜中性粒細胞的次級顆粒體的主要組成，而且在炎性反應時大量分泌。有些情況下，在活體中抗感染的病原微生物時，乳鐵蛋白直接對溶菌酶或IgA具有增效作用。由于乳鐵蛋白在抗感染的保護機制中起著重要的作用，不能在體內產生乳鐵蛋白的患者在抗各種疾病的能力上嚴重惡化，增加感染細菌或真菌的可能。另外，乳鐵蛋白在細胞增殖或鐵的傳送吸收方面起著中間介質的作用。技術背景盡管乳鐵蛋白有各種前述功能，但是因為血液或其他體液中只含有少量的乳鐵傳遞蛋白以及含有大量乳鐵蛋白的初乳試樣太少，許多研究都沒有研究人乳鐵蛋白。由于人乳是非常重要的，對乳鐵蛋白進行仔細研究以利用基因工程方法建立關于在微生物中克隆和表達人乳鐵蛋白(hLf)DNA的微生物的工業應用基礎。但是，如上所述，除非制備出針對大腸桿菌的專門的重組質粒，在基因工程中，廣泛使用大腸桿菌作為表達菌株來提取人乳鐵蛋白(hLf)仍舊是困難的。
鑒定所制備的重組乳鐵蛋白的生物活性也是十分重要的，由于乳鐵蛋白本身的抗菌活性，因此將一般的細菌或酵母作為宿主是非常不合適的，即使將它們作為宿主，由于可用的量太少對于工業生產也是不合適的。為了解決這個問題，Ward等(1992年)成功地采用真菌例如曲霉屬Aspergillus indulans或米曲霉制備了重組乳鐵蛋白。但是，依然存在很大的局限性，因為與在昆蟲細胞中表達的乳鐵蛋白相比，在真菌中表達的乳鐵蛋白的量很少，只有5到25mg/l。況且，因為對于從真菌中產生的重組乳鐵蛋白，僅僅在親和性方面用Fe58標記的放射性同位素分析了其生物學活性，因此，重組乳鐵蛋白是否實際上具有抗病原性微生物活性還存在疑問。
同時，應用更高等動物的細胞來制備人乳鐵蛋白的相關研究已被嘗試，但因為涉及到培養過程的高額費用，其在這方面的應用是困難的。
這樣，在該領域內的研究者已經顯示出通過應用昆蟲細胞來大規模的生產人乳鐵蛋白，從而將成本降為最低的興趣。例如，應用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白的已有的報道(Salmon et al.，“Characterization of HumanLactoferrin Produced in the Baculovirus Expression System”inProtein Expr.Purif.，vol.9(2)，203-210，1997)然而，使用這種方法獲得的人乳鐵蛋白的量很少，只有15mg/l。據估計是由于人乳鐵蛋白不能在昆蟲細胞內連續分泌。而且，該方法中使用了5％的小牛血清，導致人乳鐵蛋白的純化質量低劣。
為了克服上述問題，本發明提出了一種通過簡單的途徑大量制備人類乳鐵蛋白的新方法以及重組人乳鐵蛋白的生物活性的鑒定方法。
因此，本發明的一個目的是提供一種采用昆蟲細胞大規模制備人乳鐵蛋白的方法本發明的另一個目的是提供一種用于制備人乳鐵蛋白的重組昆蟲細胞。
本發明的另一個目的是提供一種從昆蟲細胞制備的重組乳鐵蛋白的生物學鑒定方法。
按照本發明使用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白的方法如
圖1、2的資料所示。
采用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白的新方法包括如下步驟(a)將一個轉移載體1與重組質粒phLf-82結合以制備重組表達載體pBacLf 3，該重組表達載體用載體pBacPAK中的多角體蛋白啟動子修飾以實現對乳鐵蛋白基因的調節；(b)在培養基中將該重組表達載體和一幫助載體pBacPAK6 4共轉染進入昆蟲細胞Sf95，以制備重組昆蟲細胞Sf-Lf 6，并從重組昆蟲細胞制備重組昆蟲病毒；以及(c)從重組昆蟲細胞Sf-Lf 6中制備人乳鐵蛋白。
在產生重組昆蟲細胞的步驟中，將培養重組昆蟲細胞的培養基離心分離，獲得來自昆蟲細胞的子代病毒。
為了制備重組昆蟲病毒，首先將轉移載體1與重組質粒2結合以制備重組表達載體pBacLf 3，該重組表達載體被載體pBacPAK中的多角體蛋白啟動子修飾以實現對乳鐵蛋白的調節，并且在培養基中將重組表達載體與幫助載體pBacPAK 4共轉染進昆蟲細胞Sf9，從而制備重組昆蟲細胞Sf-Lf6，從該細胞中制備重組昆蟲病毒。
最廣泛使用的昆蟲細胞是從軍隊蠕蟲起源的秋粘蟲(Sf9)。Sf9細胞系也作為本發明的宿主細胞來使用。Sf9細胞系如果被昆蟲病毒例如桿狀病毒感染，將促進稱為多角體蛋白的黏液蛋白的合成。這意味著在桿狀病毒中合成多角體蛋白的多角體蛋白啟動子具有很高的活性。有關報告(Kaplan等，1990；Davidson等，1990；Kaplan等，1991)指出多角體蛋白在昆蟲細胞中以1到500mg/l的量產生并且表達的外源蛋白的濃度取決于蛋白或基因的類型。這種昆蟲細胞在如下幾方面與高等動物例如哺乳動物的細胞高度類似糖蛋白、磷酸化、脂肪酸酰基化、酰胺化、蛋白水解過程。因此，在昆蟲細胞中表達的大多數高等動物細胞蛋白具有生物活性。在這里使用的人乳鐵蛋白也被證明具有生物活性。
用于本發明的表達載體是一種昆蟲病毒DNA，而且最廣泛使用的表達載體是被稱為苜蓿銀紋夜蛾的多重多面體病毒AcMNPV。桿狀病毒的生命周期和感染周期已經在有關文獻中(King L. A和R.D.Possee，桿狀病毒表達系統，實驗室指導，HAPMAN和HALL)進行了報道。如上所述，本發明使用的表達載體(pBacPAK，Clontech)起源于桿狀病毒。
為了檢測從昆蟲細胞中制備的人乳鐵蛋白，本發明采用了各種生物化學和分子生物學方法。例如，使用PCR、DNA印跡分析和蛋白印跡分析以支持在分子水平制備基因重組乳鐵蛋白的基礎研究。
本發明采用一種新的方法從生物學上檢測從昆蟲細胞中產生的重組乳鐵蛋白。即，從昆蟲細胞中提取重組乳鐵蛋白并與病原性細菌例如洋蔥假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌混合，然后觀察在一個小時內被消滅的病原性細菌的最大數。
另一方面，本發明使用的重組昆蟲細胞被認為是一種理想的大規模制備人乳鐵蛋白的系統，由于它可以懸浮在培養液中，既不象高等動物細胞那樣需要CO2也不需要在培養物中加入胎牛血清(FBS)，因此它可以在燒瓶中培養。
圖1是一流程圖，示出了本發明采用昆蟲細胞制備重組人乳鐵蛋白的方法。
圖2是本發明制備重組表達載體pBacLf的流程圖。
圖3是本發明重組表達載體pBacLf在限制性酶消化后的電泳圖譜照片。
圖4是本發明的瓊脂凝膠電泳圖譜的照片，它顯示已從重組昆蟲細胞Sf-Lf分離的重組桿狀病毒DNA中克隆了人乳鐵蛋白cDNA。
圖5是DNA印跡照片，顯示從在圖4中獲得的重組病毒DNA中克隆了人乳鐵蛋白DNA。
圖6是蛋白印跡照片和SDS-PAGE照片，顯示重組昆蟲細胞Sf-Lf表達和產生人乳鐵蛋白。
實現本發明的最佳的方式實施例1昆蟲細胞的培養和重組表達載體pBacLf的制備將秋粘蟲卵巢細胞作為昆蟲細胞并且在28℃下低溫培養。該昆蟲細胞Sf9用苜蓿銀紋夜蛾核型多面體病毒(AcMNPV)(pBacPAK6)感染，并且在含有10％的FBS、乳白蛋白、水解產物和抗真菌抗菌素的Grace培養基中培養。這種昆蟲細胞可以從Invitrogen Inc.公司購買(P O Box2312，9704CH Groningen，Netherlands)。病毒ACMNPV(pBacPAK6)由Clontechlaboratories Inc.公司提供(1020 East Meadow Circle，Palo Alto，C.A.94303-4230，USA)。
為了將乳鐵蛋白基因導入桿狀病毒基因，用于克隆包含多角體蛋白啟動子位點(5.5kb)的轉移載體(pBacPAK8，Clontech Co.)，包括乳鐵蛋白起始密碼子和信號序列的2.1kb完全基因由現有的重組質粒制備，，然后在多角體蛋白啟動子的相同方向插入大腸桿菌，以制備重組表達載體。轉移載體(pBacPAK8)可以方便地從Clontech laboratories Inc.公司(1020East Meadow Circle，Palo Alto，C.A.94303-4230，USA)購買。獲得的這種稱為“pBacLf”的重組表達載體采用限制性酶進行處理以檢驗乳鐵蛋白基因，制備表達載體pBacLf的方法如圖2所示。
圖3是一幅在采用限制性酶切割篩選重組表達載體pBacLf后的電泳圖案的照片，其中泳道1是分子量標準(λ/BstE I)，泳道2是重組表達載體pBacLf超螺旋；泳道3是用限制性酶BamHI和Not I切割的重組表達載體pBacLf，證實按照乳鐵蛋白的全長，該切下的乳鐵蛋白基因為2.1kb；泳道4是采用限制性酶Eco RV處理的重組表達載體，用于證實該乳鐵蛋白基因；泳道5是采用限制性酶Sma I處理的重組表達載體，用于證實該乳鐵蛋白基因；泳道6是采用限制性酶Bgl II處理的重組表達載體，用于證實該乳鐵蛋白基因；泳道7是采用限制性酶Pst I處理的重組表達載體，用于證實該乳鐵蛋白基因；泳道8是分子量標準。如圖3所示當重組表達載體采用限制性酶BamH I和Not I處理成片段時，顯示人乳鐵蛋白基因為2.1Kb。
實施例2重組昆蟲細胞Sf-Lf的選擇和重組病毒的鑒定在含有10％FBS的Grace s堿性培養基中以大約1.0×106細胞的量接種并培養Sf9細胞4小時。用Grace s堿性培養基洗昆蟲細胞兩次，并在室溫保持30分鐘。病毒DNA(BacPAK 6，Clontech Co.)和為介質脂質體轉染制備的重組載體的混合物，和脂質轉染試劑一起滴在細胞單層上。然后將該混合物加入含有血清和抗生素的Grace’s培養基中，在28℃培養5天。上清液分十步用培養基溶液稀釋3到5倍并且接種在昆蟲細胞Sf9中，該昆蟲細胞以單層培養在60毫米直徑的培養皿上。當病毒被吸收時，將溶解的含瓊脂的培養基在昆蟲細胞上固化。在6到7天后，將昆蟲細胞和含瓊脂的培養基用中性紅染色，中性紅可將死的細胞染色區分并且形成菌斑。用顯微鏡篩選其中用重組病毒感染的多角體蛋白沒有形成的菌斑。將菌斑和瓊脂一起用巴斯德移液管吸起，然后懸浮在1毫升培養基中。為了證實重組病毒中是否含有乳鐵蛋白基因，將另外的在新的Grace’培養基中培養的昆蟲細胞Sf9用重組病毒感染并且分離重組病毒DNA，然后通過瓊脂糖凝膠電泳比較分離的DNA的電泳圖譜。通過采用能擴增乳鐵蛋白基因的引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定乳鐵蛋白基因，并用限制性酶處理后，采用DNA印跡分析鑒定乳鐵蛋白基因(2.1Kb)。
圖4顯示從重組昆蟲細胞Sf-Lf分離的重組病毒DNA中克隆乳鐵蛋白cDNA(2.1kb)，其中泳道1是分子量標準(λ/BstE II)；泳道2是陰性對照(pBacPAK8)；泳道3和4是重組病毒DNA。從泳道3可見用專門擴增人乳鐵蛋白的引物從重組病毒DNA中擴增了人乳鐵蛋白cDNA(2.1kb).。
圖5證實對于用限制性酶例如BamH I，Not I和Ace I處理的重組病毒DNA，借助DNA印跡分析檢驗該乳鐵傳遞蛋白DNA(2.1Kb)，泳道1為重組病毒完整的DNA；泳道2是重組病毒DNA(用BamH I/Not I處理過)；泳道3是重組病毒DNA(用Acc I處理過)；泳道4是重組病毒DNA(用BamH I/Not I/Bgl II處理過)；泳道5是從病毒DNA產生的PCR擴增乳鐵蛋白基因；泳道6是DIG-標記的分子量標準；泳道7是重組質粒(pBacPAK8)的超螺旋DNA；和泳道8是陰性對照(pGEMLf)(用BamHI/Not I處理)。
陰性對照是pBacPAK8而陽性對照是含采用限制性酶BamH I/Not I處理的含乳鐵蛋白基因的pGEMLf。這里使用的探針是DIG-標記的乳鐵蛋白cDNA的N-葉的一部分。如圖5所示，在重組桿狀病毒中，在陽性對照的相同位置(2.1kb)觀察到這個譜帶。它表明本發明篩選出了含有人乳鐵蛋白DNA的重組病毒。
實施例3從重組昆蟲細胞(Sf-Lf)產生的人乳鐵蛋白的表達和鑒定為了檢測蛋白表達，將重組細胞用細胞裂解緩沖液((50mM Tris-HCI，pH 8.0，5％2-巰基乙醇，0.4％w/v SDS，10mM10mM EDTA)勻漿并進行考馬斯蘭聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后使用抗乳鐵蛋白(anti-Lf)進行蛋白印跡分析。
如圖6所示，將重組病毒原種接種到昆蟲細胞Sf9并且在第四天和昆蟲宿主細胞Sf9一起勻漿。收集上清液與抗乳鐵蛋白(anti-Lf)抗體和SDS-PAGE進行蛋白印跡分析，結果表明著色帶和作為陽性對照的含有純化的乳鐵蛋白的初乳處于相同的位置(80kDa)。這表明在重組昆蟲細胞(Sf-Lf)中產生了人乳鐵蛋白。泳道1為蛋白質的分子量標準，泳道2為初乳液，泳道3是昆蟲細胞Sf9，泳道4和泳道5是重組昆蟲細胞。密度計顯示表達的乳鐵蛋白的量大于800mg/l。這個表達量高于從曲霉屬Aspergillus Nidulans或米曲酶中產生的乳鐵蛋白的量而且表明有高的商業生產率。
實施例4重組乳鐵蛋白的抗菌活性測定為了檢測重組昆蟲細胞(Sf-Lf)抗病原性微生物的抗菌活性，采用凍融方法將昆蟲細胞(Sf-Lf)碾碎，然后將上清液以大約250 ug/ml的乳鐵蛋白濃度與病原性微生物混合。這個混合物以0、15、30、45和60分鐘的時間間隔涂在瓊脂計數板上。
從表1的細胞計數可知，含乳鐵蛋白的上清液在一個小時內單獨消滅了病原性微生物。作為陰性對照，將昆蟲細胞(Sf)勻漿并以與重組昆蟲細胞(Sf-Lf)一樣的方法進行病原性微生物檢驗，在這種情況下，細胞數目沒有減少。
上述結果表明從重組昆蟲細胞(Sf-Lf)產生的乳鐵蛋白具有抗菌活性。工業應用本發明采用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白的方法制備的重組昆蟲細胞(Sf-Lf)的優點在于，由于它在懸浮培養基中的懸浮性，不象高等動物細胞，它既不需要二氧化碳(CO2)培養基中也不需要胎牛血清(FBS)，能夠在燒瓶中培養，從而采用重組昆蟲細胞能夠以簡單的方法低廉的成本大批量制備人乳鐵蛋白。
表1
注*表示動物病原性細菌；@表示食物污染細菌；+表示有乳鐵蛋白的培養物；-表示無乳鐵蛋白的培養物
權利要求
1.一種通過使用昆蟲細胞來制備人乳鐵蛋白的方法，包括下列步驟(a)將轉移載體(1)和重組質粒phLf-8(2)結合以制備重組表達載體pBacLf(3)，該重組表達載體用載體pBacPAK中的多角體蛋白啟動子修飾以實現對乳鐵蛋白基因的調節；(b)在培養基中將所述重組表達載體與一幫助載體pBacPAK6(4)共轉染進入昆蟲細胞Sf9(5)以制備重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)，并從所述重組昆蟲細胞中制備重組昆蟲病毒；以及(c)從所述重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)中制備人乳鐵蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述制備重組昆蟲病毒的步驟還包括將步驟(b)培養的含有重組昆蟲細胞的培養基進行離心分離的步驟，該培養基包含步驟(b)中培養的重組昆蟲細胞，以從包含于最上層的昆蟲細胞中得到子代病毒。
3.一種通過包括下述步驟的方法制備的人乳鐵蛋白(a)將轉移載體(1)和重組質粒phLf-8(2)結合以制備重組表達載體pBacLf(3)，該重組表達載體用載體pBacPAK中的多角體蛋白啟動子修飾以實現對乳鐵蛋白基因的調節；(b)在培養基中將所述重組表達載體與一幫助載體pBacPAK6(4)共轉染進入昆蟲細胞Sf9(5)以制備重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)，并從所述重組昆蟲細胞中制備重組昆蟲病毒；以及(d)從所述重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)中制備人乳鐵蛋白。
4.通過包括如下步驟的方法制備的重組昆蟲病毒(a)將轉移載體(1)和重組質粒phLf-8(2)結合以制備重組表達載體pBacLf(3)，該重組表達載體用載體pBacPAK中的多角體蛋白啟動子修飾以實現對乳鐵蛋白基因的調節；(b)在培養基中將所述重組表達載體與一幫助載體pBacPAK6(4)共轉染進入昆蟲細胞Sf9(5)以制備重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)，并從所述重組昆蟲細胞中制備重組昆蟲病毒；以及(e)從所述重組昆蟲細胞Sf-Lf(6)中制備人乳鐵蛋白。
5.用于重組人乳鐵蛋白的生物學檢測方法，包括下述步驟將通過權利要求1所述的方法制備的人乳鐵蛋白產物與病原性微生物混合；以及檢測所述混合物抑制病原性微生物的抗菌活性。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述的病原性微生物選自洋蔥假單胞菌、惡臭假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌。
全文摘要
制備工藝包括在載體(pBacPAK)中合成轉移載體和再混合質粒調節多角體蛋白啟動子,乳鐵蛋白基因制備重組表達載體(pBacLf)(3);在培養基介質中的昆蟲細胞借助載體(pBacPAK)(6)共轉移重組揭示載體制備重組昆蟲細胞(Sf－Lf)(6),從重組昆蟲細胞制備重組昆蟲病毒;從重組昆蟲細胞制備人乳鐵傳遞蛋白;本發明的重組人乳鐵蛋白的生物檢驗方法是觀察在從重組昆蟲細胞提取重組人類乳鐵傳遞蛋白并將它和致病細菌如洋蔥假單胞菌,惡臭假單胞菌,熒光假單胞菌,鼠傷寒沙門氏菌,大腸桿菌混合后,殺滅致病細菌的速率。
文檔編號C12N15/866GK1365390SQ00810913
公開日2002年8月21日 申請日期2000年7月26日 優先權日1999年7月27日
發明者李運萬, 常云喜, 郭常喜 申請人:數位生物技術株式會社, 韓晟化學株式會社