豬環(huán)狀病毒重組痘病毒疫苗的制作方法

專利名稱：豬環(huán)狀病毒重組痘病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及載體(例如重組載體，如重組病毒；例如痘病毒，如修飾的痘病毒)和制備及使用該載體的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組禽痘病毒例如金絲雀痘病毒，如ALVAC。此外本發(fā)明涉及一種載體，如表達(dá)豬環(huán)狀病毒(circovirus)2(PCV2)的基因產(chǎn)物如抗原、ORF、和/或其目的表位的痘病毒；并涉及免疫組合物或疫苗。此外本發(fā)明還涉及這種載體，如誘導(dǎo)針對(duì)PCV2基因產(chǎn)物和/或PCV2的免疫應(yīng)答的痘病毒；并涉及有利的組合物，它們是免疫的、免疫原性和/或賦予抵抗PCV2感染的保護(hù)性免疫的組合物或疫苗組合物。此外本發(fā)明還涉及這類載體和組合物的應(yīng)用與制備和使用它們的方法，以及它們的中間體和所述中間體。并且，本發(fā)明涉及它們的產(chǎn)物，例如來(lái)自涉及本發(fā)明重組體或痘病毒的應(yīng)用和方法的產(chǎn)物，如表達(dá)的抗體。
背景技術(shù)：
斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征(PMWS)是近來(lái)在仔豬中發(fā)現(xiàn)的一種疾病。PMWS的臨床癥狀為體重逐漸降低和其它癥狀如呼吸急促、呼吸困難和黃疸。病理上可觀察到淋巴細(xì)胞和肉芽腫性浸潤(rùn)液、淋巴結(jié)病，和更罕見(jiàn)的淋巴細(xì)胞和肉芽腫性肝炎及腎炎(Clark，1997；Harding，1997)。
在不同歐洲國(guó)家以及北美都描述了該疾病。目前該疾病還不能得到預(yù)防和治療。
有幾條證據(jù)指出豬環(huán)狀病毒是PMWS的病原體(Ellis等，1998)。已從患有PMWS的豬身上獲得了環(huán)狀病毒，而且已經(jīng)證明患有該疾病的豬有豬環(huán)狀病毒的抗體。
環(huán)狀病毒是在某些動(dòng)物和植物種屬中發(fā)現(xiàn)的單鏈環(huán)狀DNA病毒。豬環(huán)狀病毒最初作為污染因子從豬腎傳代細(xì)胞系分離。該細(xì)胞培養(yǎng)分離株曾被命名為PK-15(Meehan等，1997)。最近，比較了獲自患有PMSW的豬的豬環(huán)狀病毒與PK-15。這類病毒與PK-15在核苷酸和蛋白序列水平上有實(shí)質(zhì)性不同，曾被命名為PCV2(Meehan等，1998；Hamel等，1998)。
在PCV2基因組中鑒定了多達(dá)13個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)(法國(guó)專利申請(qǐng)9803707中的COL1-COL13)。這些ORF中的四個(gè)與PK-15基因組的類似ORF基本同源。含有nt 398-1342(GenBank登錄號(hào)AF055392)的ORF1(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國(guó)專利申請(qǐng)98 03707中的COL4)，可能編碼預(yù)期分子量為37.7kD的蛋白。含有nt 1381-1768且與1-314連接(GenBank登錄號(hào)AF055392)的ORF2(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國(guó)專利申請(qǐng)98 03707中的COL13)，可能編碼預(yù)期分子量為27.8kD的蛋白。含有nt 1018-704(GenBank登錄號(hào)AF055392)的ORF3(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國(guó)專利申請(qǐng)98 03707中的COL7)，可能編碼預(yù)期分子量為11.9kD的蛋白。含有nt 912-733(GenBank登錄號(hào)AF055392)的ORF4(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國(guó)專利申請(qǐng)98 03707中的COL10)可能編碼預(yù)期分子量為6.5kD的蛋白。
PCV2的ORF1與PK-15分離株的ORF1(Meehan等，1998)高度同源(86％的一致性)。已部分表征了PK-15的ORF1蛋白((Meehan等，1997；Mankertz等，1998a)。已知它是病毒復(fù)制所必需的，并且可能參與病毒DNA的復(fù)制。
各個(gè)ORF2的蛋白序列一致性比ORF1要低，但，每個(gè)ORF2共有一個(gè)高度保守的堿性N末端區(qū)，與禽環(huán)狀病毒雞白血病病毒(CAV)(Meehan等，1998)的主要結(jié)構(gòu)蛋白的N末端區(qū)相似。近來(lái)，Mankertz等(1998b)提出PK-15分離株的ORF2(在Mankertz等，1998b中命名為ORF1)編碼衣殼蛋白。
在PK-15分離株和PCV2各自的ORF3和ORF4中觀察到了更大差別。在每種情況下，與PK-15分離株基因組中存在的相應(yīng)ORF相比，PCV2ORF4和ORF3的C末端區(qū)有缺失。在ORF3和ORF4的N末端區(qū)都觀察到了最高的蛋白序列一致性(Meehan等，1998)。
還沒(méi)有發(fā)表對(duì)PCV2基因組的轉(zhuǎn)錄分析。從PK-15分離株獲得的近期數(shù)據(jù)表明ORF2轉(zhuǎn)錄物被剪接(在Mankertz等，1998b)。
痘苗病毒已成功用于免疫預(yù)防天花，在1980年的世界根除天花運(yùn)動(dòng)中達(dá)到極點(diǎn)。隨著天花的根除，痘病毒用于表達(dá)外源基因(Panicali和Paoletti，1982；Paoletti等，1984)的基因修飾載體的的新作用變得很重要。編碼異源性抗原的基因已在痘苗中表達(dá)，常常導(dǎo)致抵抗相應(yīng)病原體攻擊的保護(hù)性免疫(綜述Tartaglia等，1990)。命名為MVA的高度減毒疫苗株也已被作為基于痘病毒的疫苗載體。美國(guó)專利號(hào)5185146中描述了MVA的應(yīng)用。
另外兩個(gè)疫苗載體系統(tǒng)涉及天然宿主限制的痘病毒禽痘病毒的應(yīng)用。家禽痘病毒(FPV；Taylor等，1998a，b)和金絲雀痘病毒(CPV；Taylor等，1991 & 1992)都已被改造用來(lái)表達(dá)外源基因產(chǎn)物。家禽痘病毒(FPV)是痘病毒家族禽痘病毒屬的原型病毒。該病毒引發(fā)經(jīng)濟(jì)上重要的家禽患疾病，該疾病自從1920年以來(lái)通過(guò)減毒活疫苗的使用得到了很好控制。禽痘病毒的復(fù)制僅限于禽類(Matthews，1982)，文獻(xiàn)中沒(méi)有關(guān)于禽痘病毒在任何非禽類(包括人類)中引起繁殖性感染的報(bào)道。這種宿主局限性提供了一道固有的安全屏障，防止該病毒傳播到其它物種，并使得在脊椎動(dòng)物和人類應(yīng)用中使用基于禽痘病毒的疫苗的建議很吸引人。
已利用FPV作為載體表達(dá)來(lái)自禽病原體的抗原。在FPV重組體中表達(dá)了強(qiáng)致病性禽流感病毒的血凝素蛋白(Taylor等，1988c)。重組體接種小雞和火雞后，誘導(dǎo)了抵抗同源或異源的強(qiáng)致病性流感病毒攻擊的保護(hù)性免疫應(yīng)答(Taylor等，1988c)。也已建立了表達(dá)新城疫病毒表面糖蛋白的FPV重組體(Taylor等，1990；等，1990)。
通過(guò)基因修飾野生型病毒株制備了其它減毒的痘病毒載體。已經(jīng)證明，通過(guò)缺失痘苗病毒哥本哈根株(Tartaglia等，1992)的特異性毒力基因和宿主范圍基因而衍生的NYVAC載體可作為重組載體，引發(fā)針對(duì)所表達(dá)外源抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
另一個(gè)改造的痘病毒載體為ALVAC，來(lái)自金絲雀痘病毒。ALVAC在非禽類宿主中沒(méi)有繁殖性復(fù)制，據(jù)信該特征改進(jìn)了其安全譜(Taylor等，1991 & 1992)。ALVAC和NYVAC都是BSL-1載體。
發(fā)展亞單位PCV2疫苗的一種方法是使用活病毒載體來(lái)表達(dá)相關(guān)的PCV2 ORF。可用本領(lǐng)域熟知的兩個(gè)步驟和美國(guó)專利號(hào)4769330、4722848、46003112、5110587、5174993、5494807和5505941(這些專利的公開(kāi)并入本文作為參考)所描述的產(chǎn)生痘病毒(如痘苗病毒和禽痘病毒)的合成重組體的類似方法構(gòu)建重組痘病毒。因此提供PCV2重組痘病毒及其組合物和產(chǎn)物，特別是基于ALVAC的PCV2重組體及其組合物和產(chǎn)物，尤其是含有PCV2的ORF1和/或2的重組體及其組合物和產(chǎn)物，將是本領(lǐng)域技術(shù)現(xiàn)狀期望的進(jìn)展。
發(fā)明目的和概述因此本發(fā)明一個(gè)目的是提供治療和預(yù)防PCV2感染的組合物和方法。另一個(gè)目的是提供治療和預(yù)防PMWS的工具。
本發(fā)明一方面涉及用于在接種了該組合物的宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)抗原性、免疫原性或免疫應(yīng)答的抗原性、免疫性、免疫原性組合物或疫苗組合物或治療性組合物。該組合物有利地包括載體或稀釋物和重組病毒(如重組痘病毒)。重組病毒或痘病毒含有并表達(dá)外源核酸分子，其編碼ORF、抗原、免疫原或來(lái)自PCV2的目的表位、或引發(fā)針對(duì)PCV2或PCV2引起的疾病(如PMWS)的免疫應(yīng)答的蛋白。例如，重組病毒可為修飾的重組病毒或痘病毒；例如具有滅活的病毒編碼遺傳功能(如非必需的病毒編碼遺傳功能)的病毒或痘病毒，所以重組病毒毒性降低而安全性提高。此外，本發(fā)明提供了在組合物中使用的病毒及制備和使用組合物和病毒的方法。
在根據(jù)本發(fā)明的組合物中使用的病毒有利地為痘病毒、特別是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒和金絲雀痘病毒)，更有利地為ALVAC。修飾的重組病毒可包括例如在病毒基因組的非必需區(qū)編碼抗原性蛋白(如來(lái)自PCV2的ORF如PCV2 ORF1和/或2)的異源DNA序列。
另一方面，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其含有的修飾重組病毒具有滅活的非必需的病毒編碼的遺傳功能，所以重組病毒毒性降低而安全性提高。修飾的重組病毒包括例如在病毒基因組非必需區(qū)內(nèi)編碼抗原性蛋白(如來(lái)自PCV2的ORF尤其是ORF1和/或2)的異源DNA序列，其中該組合物給予宿主后能夠誘導(dǎo)抗原特異的免疫應(yīng)答。
再一方面，本發(fā)明涉及修飾的重組病毒，該病毒具有滅活的非必需的病毒編碼的遺傳功能，所以該病毒的毒性降低，并且其中修飾的重組病毒還在如該病毒基因組非必需區(qū)內(nèi)含有異源DNA。該DNA可編碼PCV2基因如任一個(gè)或所有的PCV2 ORF1、ORF2、ORF3或ORF4(Meehan等，1998)、或其目的表位。通過(guò)缺失編碼毒力因子的開(kāi)放讀碼框或通過(guò)利用天然宿主限制性病毒可滅活遺傳功能。根據(jù)本發(fā)明使用的病毒有利地為痘病毒(如痘苗病毒)或禽痘病毒(如家禽痘病毒或金絲雀痘病毒)。
有利地，從痘病毒或病毒基因組缺失的開(kāi)放讀碼框選自J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L(Goebel等報(bào)道的術(shù)語(yǔ)學(xué)，1990)及其組合。在這一方面，該開(kāi)放讀碼框含有一個(gè)胸腺嘧啶激酶基因、一個(gè)出血性區(qū)域、一個(gè)A型包涵體區(qū)、一個(gè)血凝素基因、一個(gè)宿主范圍基因區(qū)或一個(gè)大的亞單位、核糖核苷酸還原酶；或它們的組合。
一個(gè)適當(dāng)修飾的痘苗病毒哥本哈根株被鑒定為NYVAC(Tartaglia等，1992)，或一種痘苗病毒，其中缺失了J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L或一個(gè)胸腺嘧啶激酶基因、一個(gè)出血性區(qū)域、一個(gè)A型包涵體區(qū)、一個(gè)血凝素基因、一個(gè)宿主范圍基因區(qū)和一個(gè)大的亞單位、核糖核苷酸還原酶(關(guān)于NYVAC和來(lái)自NYVAC的在實(shí)施本發(fā)明時(shí)也有用的具有額外缺失或滅活的載體，也見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5364773、5494807和5762938)。
優(yōu)選地，痘病毒載體為ALVAC或金絲雀痘病毒，金絲雀痘病毒為減毒的，例如通過(guò)在雞胚成纖維細(xì)胞(Rentschler疫苗株)上連續(xù)傳200代以上，它們的主種子經(jīng)過(guò)瓊脂糖連續(xù)四次噬斑純化，其中一個(gè)克隆通過(guò)5次額外傳代來(lái)擴(kuò)增。(關(guān)于ALVAC和TROVAC(在實(shí)施本發(fā)明時(shí)有用的減毒家禽痘病毒)見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5756103和5766599；關(guān)于在實(shí)施本發(fā)明時(shí)也有用的載體，例如表達(dá)提高了的載體、其功能缺失的載體和對(duì)于豬宿主有用的載體(例如，對(duì)豬宿主有用的載體可包括痘病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒)，和關(guān)于本文使用的術(shù)語(yǔ)和教導(dǎo)如“免疫原性組合物”、“免疫組合物”、“疫苗”和“目的表位”，以及劑量、給藥途徑、程序、佐劑和對(duì)重組病毒的使用及其表達(dá)產(chǎn)物，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6004777、599091、5770212、6033904、5869312、5382425和WO95/30018。
本發(fā)明再一方面還涉及發(fā)明的重組痘病毒的表達(dá)產(chǎn)物及其用途，例如形成用于治療、預(yù)防、診斷或測(cè)試的抗原性、免疫的或疫苗的組合物；和來(lái)自重組痘病毒，在構(gòu)建DNA探針和PCR引物時(shí)有用的DNA。
這些和其它實(shí)施方案由下面的詳細(xì)描述公開(kāi)或變得顯而易見(jiàn)并包含于其中。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)查閱所附圖表將更好地理解本發(fā)明，在此并入本文作為參考，其中
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圖1(SEQ ID NO1)顯示了ALVAC DNA含有C6開(kāi)放讀碼框的3.7千堿基對(duì)片段的核苷酸序列。
●圖2顯示了pJP102供體質(zhì)粒圖。
●圖3(SEQ ID NO8)顯示了pJP102供體質(zhì)粒從KpnI(653位)到SacI(3166位)限制酶位點(diǎn)的2.5千堿基對(duì)片段的核苷酸序列。
●圖4顯示了pJP105供體質(zhì)粒圖。
●圖5顯示了pJP107供體質(zhì)粒圖。
●圖6(SEQ ID NO11)顯示了pJP107供體質(zhì)粒從KpnI(653位)到SacI(4255位)限制酶位點(diǎn)的3.6千堿基對(duì)片段的核苷酸序列。
發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明涉及重組病毒，例如重組痘病毒，其中含有來(lái)自PCV2的一段DNA序列，例如在痘病毒基因組的非必需區(qū)。痘病毒有利地為禽痘病毒，例如家禽痘病毒，尤其是減毒家禽痘病毒，或金絲雀痘病毒，尤其是減毒金絲雀痘病毒如ALVAC。
根據(jù)本發(fā)明，重組痘病毒表達(dá)外源PCV2基因的基因產(chǎn)物。PCV2的特定ORF插入到痘病毒載體，產(chǎn)生的重組痘病毒用來(lái)感染動(dòng)物。在動(dòng)物中PCV2基因產(chǎn)物的表達(dá)導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)PCV2的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的重組痘病毒可能用于免疫組合物或疫苗，來(lái)提供誘導(dǎo)可能(但不需要)是保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。
重組痘病毒PCV2或其表達(dá)產(chǎn)物即本發(fā)明的組合物如免疫的、抗原性組合物或疫苗組合物或治療性組合物的給藥方式可以是經(jīng)腸胃外的途徑(皮內(nèi)、肌肉或皮下)。這種免疫方式可引起系統(tǒng)性免疫應(yīng)答、或體液或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
更通常地，本發(fā)明的痘病毒PCV重組體、抗原性、免疫組合物或疫苗痘病毒組合物或治療性組合物，可按照藥學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備。這些組合物可由醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之后，按其熟知的劑量和技術(shù)給藥。這些組合物可單獨(dú)給藥，或可以與組合物，例如“與”其它免疫的、抗原性或疫苗或治療性組合物共同施用或順序施用，由此提供本發(fā)明的多價(jià)或“雞尾酒”或聯(lián)合組合物和使用它們的方法。同樣，可在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之后來(lái)確定給藥的成分、方式和劑量。在這一方面，請(qǐng)參考并入本文作為參考的關(guān)于狂犬病毒組合物和聯(lián)合組合物及其使用的美國(guó)專利號(hào)5843456。
本發(fā)明組合物的實(shí)施例包括用于各入口的液體制品，如口的、鼻的、肛門的、陰道的、經(jīng)口的、胃內(nèi)的等，給藥方式如懸液、糖漿或酏劑；和用于腸胃外的、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或血管內(nèi)(如可注射的給藥)的制品如無(wú)菌懸液或乳劑。在這些組合物中，重組痘病毒或抗原可能與合適的載體、稀釋物或賦形劑如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖等形成混合物。這些組合物也可被凍干。這些組合物根據(jù)給藥途徑和預(yù)期的制品可含有輔助物質(zhì)如保濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、膠凝劑或粘性促進(jìn)添加劑、防腐劑、香精、色素等?？蓞⒖紭?biāo)準(zhǔn)原文如“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCICNCE”第17版，1985(在此并入本文作為參考)，來(lái)制備適當(dāng)?shù)闹破?，以避免不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。合適的劑量也可根據(jù)下面的實(shí)施例。
這些組合物可含有選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體和順丁烯二酸酐與鏈烯衍生物的共聚體的至少一種佐劑化合物。
優(yōu)選的佐劑化合物為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體，尤其與糖或多元醇的多聚鏈烯基醚交聯(lián)。這些化合物稱為術(shù)語(yǔ)carbomer(Phameuropa第8卷第二期，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國(guó)專利號(hào)2909462(在此并入本文作為參考)，該專利描述了與多羥基化合物交聯(lián)的這類丙烯酸聚合體，該多羥基化合物含有至少3個(gè)羥基優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)羥基、其中至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的非飽和脂肪酸基團(tuán)所取代。優(yōu)選基團(tuán)是那些含有2-4個(gè)碳原子的，如乙烯基、丙烯基和其它乙烯基非飽和基團(tuán)。這些非飽和基團(tuán)可含有其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(BF Goodrich，俄亥俄州，美國(guó))出售的產(chǎn)品特別好。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基戊赤蘚糖醇交聯(lián)。其中可能提及Carbopol974P、934P和971P。
在順丁烯二酸酐和鏈烯衍生物的共聚體中，優(yōu)選順丁烯二酸酐和乙烯線性或交聯(lián)的共聚體EMA(Monsanto)，例如與二乙烯醚交聯(lián)的共聚體。可參考并入本文的文獻(xiàn)J.Fields等，自然(Nature)，186778-780，1960.6.4。
從其結(jié)構(gòu)來(lái)看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體和共聚體EMA優(yōu)選由下面公式中的基本單位形成 其中- R1和R2相同或不同，代表H或CH3- x＝0或1，優(yōu)選x＝1- y＝1或2，且x+y＝2對(duì)于共聚體EMA，x＝0，y＝2。對(duì)于carbomer，x＝y(tǒng)＝1。
這些聚合體溶解于水產(chǎn)生酸性溶液，其將被中和，優(yōu)選中和至生理pH，以便制備將要摻入疫苗的佐劑溶液。聚合體的羧基部分為COO-形式。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的佐劑溶液，尤其是carbomer溶液，用蒸餾水制備，優(yōu)選有NaCl的蒸餾水時(shí)制備，獲得的溶液為酸性pH。該儲(chǔ)備液加入到預(yù)定量(用來(lái)獲得預(yù)定終濃度)或其實(shí)際比例的含有NaCl的水中、優(yōu)選生理鹽水(NaCl 9g/l)來(lái)稀釋，幾步中都立刻同時(shí)或隨后中和(pH7.3-7.4)，優(yōu)選用NaOH中和。將生理pH的該溶液與疫苗混合，特別可以凍干、液體或冰凍的形式貯藏。
在最后的疫苗組合物中聚合體濃度為0.01％-2％w/v，更特別為0.06-1％w/v，優(yōu)選0.1-0.6％w/v。根據(jù)本發(fā)明的免疫組合物可與至少一種減毒活疫苗、滅活疫苗、或亞單位疫苗、或表達(dá)至少一種其它豬病原體免疫原的重組疫苗(如痘病毒作為載體或DNA質(zhì)粒)關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明包括編碼并表達(dá)等同核苷酸序列的載體，也就是說(shuō)，該序列在所考慮的基因或該基因編碼多肽的功能和菌株特異性(指1型和2型菌株)上都沒(méi)有改變。當(dāng)然包括密碼子簡(jiǎn)并性不同的序列。
實(shí)施例中使用的PCV-2序列來(lái)自Meehan等(毒株Imp 1010；ORF1核苷酸398-1342；ORF2核苷酸1381-314；以及分別相應(yīng)于1998年9月25日的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/161092和WO-A-9918214的COL4和COL13的序列)。其它PCV-2毒株及其序列已發(fā)表于WO-A-9918214，被稱為Imp999、Imp1011-48285和Imp1011-48121，和發(fā)表于A.L.Hamel等，J.Virol.1998年6月，第72卷，65262-5267(GenBank AF027217)和I.Morozov等J.Clinical Microb.1998年9月，第36卷，92535-2541，和GenBank AF086834、AF086835、AF086836，并可獲得等同ORF序列。這些序列或其ORF，或其編碼抗原或目的表位的區(qū)域也可用于實(shí)施本發(fā)明。
本發(fā)明也包括那些本文使用的和本文引用文獻(xiàn)使用的序列的等同序列；例如，能夠在高嚴(yán)格條件下與該核苷酸序列雜交的序列(見(jiàn)，如，Sambrook等，1989)。在這些等同序列中，也可提及保留了完整序列免疫原性的基因片段，如目的表位。
PCV 1型和2型的全基因組之間同源性大約為75％。對(duì)于ORF1，同源性大約為86％，對(duì)于ORF2，大約為66％。相反，2型內(nèi)的基因組和ORF同源性通常高于95％。
同樣，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)有用的等同序列，對(duì)于ORF1，是那些與Imp1010毒株ORF1的同源性等于或大于88％，有利地為90％或更高，優(yōu)選92％或95％或更高的序列，對(duì)于ORF2，是那些與Imp1010毒株ORF2的同源性等于或大于80％，有利地為85％或更高，優(yōu)選90％或95％或更高的序列。
根據(jù)Meehan 1998，ORF1和ORF2可能編碼預(yù)期分子量分別為37.7kD和27.8kD的蛋白質(zhì)。ORF3和ORF4(根據(jù)Meehan等，1998，分別相應(yīng)于WO-A9918214的ORF7和ORF10)可能編碼預(yù)期分子量分別為11.9kD和6.5kD的蛋白質(zhì)。GenBank AF 055392中也有這些ORF的序列。也可將它們引入質(zhì)粒并根據(jù)本發(fā)明單獨(dú)使用或聯(lián)合使用，如ORF1和/或ORF2。
在1998年9月25日的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/161、092中發(fā)表的其它ORF1-3、5、6、8-9、11-12(WO-A-99182 14中的COL1-3和5、6、8-9、11-12)，或其編碼抗原或目的表位的區(qū)域，可用于本發(fā)明的實(shí)施，如單獨(dú)使用或互相聯(lián)合或與它們編碼的抗原或表位聯(lián)合使用。
本發(fā)明也包括等同序列的使用；例如，來(lái)自本文引用的各種毒株的ORF的序列。對(duì)于同源性，可測(cè)定那些來(lái)自含有ORF2和/或ORF1的PCV毒株的等同序列，其讀碼框與1010毒株的相應(yīng)ORF具有上面限定的同源性。
根據(jù)Meehan，對(duì)于ORF3，等同序列與Imp1010毒株ORF3的同源性有利地為例如等于或大于80％，如85％或更高，優(yōu)選90％或95％或更高。根據(jù)Meehan(1998)，對(duì)于ORF4，有利地是等同序列與Imp1010毒株ORF4的同源性等于或高于86％，有利地為90％或更高，優(yōu)選95％或更高。
使用標(biāo)準(zhǔn)軟件如MacVector，從基因組核苷酸序列例如在WO-A-9918214中發(fā)表的那些序列來(lái)測(cè)定ORF是常規(guī)技術(shù)。同樣，與1010毒株進(jìn)行的基因組比對(duì)和與1010毒株ORF進(jìn)行的比較，可使本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易測(cè)定另一種毒株基因組的ORF(如在WO-A-9918214或本文引用的其它文獻(xiàn)中公開(kāi)的其它毒株)。
使用軟件或進(jìn)行序列比對(duì)不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)，提供了發(fā)現(xiàn)等同ORF或核酸分子的捷徑。
核苷酸序列同源性可利用Myers和Miller(“線性空間的最佳比對(duì)”，CABIO 4，11-17，1988，并入本文作為參考)和NCBI提供的“比對(duì)”程序來(lái)測(cè)定?；蛘?，術(shù)語(yǔ)“同源性”或“一致性”例如關(guān)于核苷酸序列或氨基酸序列，可指兩個(gè)序列間同源性的量的測(cè)量。序列同源百分率可用(Nref-Ndif)*100/Nref來(lái)計(jì)算，其中Ndif是比對(duì)的兩序列中非相同序列的總數(shù)，其中Nref是其中一個(gè)序列的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC的序列相似性為75％(Nref＝8；Ndif＝2)。
或者，關(guān)于序列的“同源性”或“一致性”可指相同核苷酸或氨基酸位數(shù)除以兩序列中較短序列的核苷酸或氨基酸數(shù)，其中兩序列的比對(duì)可按照Wilbur和Lipman的算法(Vilbur和Lipman，1983 PNAS美國(guó)80726，并入本文作為參考)來(lái)確定，例如，使用20個(gè)核苷酸的窗口大小、4個(gè)核苷酸的字長(zhǎng)、缺口罰分為4，并且計(jì)算機(jī)輔助分析及包括比對(duì)的序列數(shù)據(jù)的解釋，可以使用商業(yè)化程序方便地進(jìn)行(如IntelligeneticsTMSuite，Intelligenetics Inc.加拿大)。當(dāng)假定RNA序列與DNA序列相似、或有一定程度的序列一致性或同源性時(shí)，那么認(rèn)為DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的RNA序列可由DNA序列衍生而來(lái)，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。此外，氨基酸序列相似性或一致性或同源性可使用BlastP程序(并入本文作為參考的Altschul等，Nucl.Acids Res.25，3389-3402)和NCBI提供的程序來(lái)測(cè)定。后面的參考文獻(xiàn)(每篇都并入本文作為參考)提供了兩個(gè)蛋白氨基酸的相對(duì)一致性或同源性，此外關(guān)于前述問(wèn)題，這些文獻(xiàn)中的指導(dǎo)可用來(lái)測(cè)定同源性或一致性的百分率Needleman SB和Wunsch CD“適用于檢查兩個(gè)蛋白氨基酸相似性的普通方法”J.Mol.Biol.48444-453(1970)；Smith TF和WatermanMS，“生物序列比較，”應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in Applied Mathematics)2482-489(1981)；Smith TF，Waterman MS和Sadler JR，“核酸序列功能域的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征，”Nucleic Acids Res.，112205-2220(1983)；Feng DF和Dolittle RF，“作為修正進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)前提條件的漸進(jìn)的序列比對(duì)，”J.ofMolec.Evol.，25251-360(1987；)Higgins DG和Sharp PM，“在微型電子計(jì)上快速靈敏的多重序列比對(duì)，”CABIOS，5151-153(1989)；TompsonJD，Higgins DG和Gibson TJ，“Cluster W通過(guò)序列weighing、位置特異性gap penalties和weight matrix選擇提高進(jìn)化多重序列比對(duì)的靈敏度，Nucleic Acids Res.，224673-480(1994)；和Devereux J、Haeberlie P和Smithies O，“用于VAX的一套理解性序列分析程序，”Nucleic AcidsRes.，12387-395(1984)。
本發(fā)明不僅可對(duì)成年豬給藥，也可對(duì)仔豬或懷孕的母豬給藥；在后一種情況下，可以對(duì)新生豬特別提供被動(dòng)免疫(母體抗體)。優(yōu)選地，在母豬繁殖前；和/或在交配前，和/或在懷孕期間接種。有利地是，至少在交配前接種一針，并且優(yōu)選在懷孕期間接種一針，例如，大約在懷孕中期(大約懷孕6-8周)和/或懷孕末期(大約懷孕11-13周)。因此，有利的方案為在交配和/或配種前接種一針，并在懷孕期間加強(qiáng)一針。其后，可在每次交配前和/或懷孕中期和/或懷孕末期再次接種。優(yōu)選在懷孕期間再次接種。公豬也可接種，例如在交配前。
小豬，例如接種母豬的小豬(如此處討論的那樣接種)，在出生后第一周接種，例如在出生后第一、和/或第二、和/或第三、和/或第四、和/或第五周接種。優(yōu)選地，小豬在出生后第一周或第三周接種(如在喂奶期)。然后這些小豬在2-4周后加強(qiáng)是有利的。
此外本發(fā)明通過(guò)下面說(shuō)明性而非限制性的實(shí)施例來(lái)描述。
實(shí)施例在優(yōu)選實(shí)施方案中本發(fā)明涉及在痘病毒基因組的非必需區(qū)含有來(lái)自PCV2的DNA序列的重組痘病毒。重組痘病毒表達(dá)外源PCV2基因的基因產(chǎn)物。特別分離并表征了編碼PCV2蛋白的ORF1和ORF2基因，并將其插入ALVAC重組體(金絲雀痘病毒載體)。使用的分子生物學(xué)技術(shù)是Sambrook等所描述的那些(1989)。
細(xì)胞系和病毒株。命名為Imp.1010-Stoon的PCV2毒株先前已有描述(Meehan等，1998)。它從來(lái)自加拿大的一頭病豬的腸系膜淋巴結(jié)組織中分離。Meehan等(1998)描述了PCV2基因組的克隆。質(zhì)粒pGem 7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14含有作為EcoRI片段插入質(zhì)粒pGem-7Z(Promega，Madison，WI)EcoRI位點(diǎn)的PCV2基因組。Imp.1010-StoonPCV2毒株的全核苷酸序列已由Meehan等(1998)測(cè)定，并可由GenBank登錄號(hào)AF055392獲得。
親本金絲雀痘病毒(Rentschler毒株)是用于金絲雀的疫苗株。疫苗株獲自野生分離株，并通過(guò)在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳200代以上而減毒。主毒種用瓊脂經(jīng)連續(xù)四次噬斑純化，并且其中一個(gè)克隆再通過(guò)五次傳代，然后用該病毒庫(kù)作為體外重組試驗(yàn)的親本病毒。噬斑純化的金絲雀痘病毒分離株被命名為ALVAC。ALVAC于1996年12月14日按照布達(dá)佩斯條約保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC登錄號(hào)為VR-2547。
重組痘病毒的產(chǎn)生包括幾步(1)構(gòu)建一個(gè)插入質(zhì)粒，含有痘病毒基因組中插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列(“臂”)，和位于兩側(cè)臂之間的多克隆位點(diǎn)(MCS)(例如見(jiàn)實(shí)施例1)；(2)構(gòu)建供體質(zhì)粒，該質(zhì)粒由已將外源基因表達(dá)盒插入其MCS的插入質(zhì)粒組成(例如見(jiàn)實(shí)施例2-5)；(3)供體質(zhì)粒的兩臂和親本痘病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的體外重組，使外源基因表達(dá)盒插入痘病毒基因組的合適位點(diǎn)，和噬斑純化重組病毒(例如見(jiàn)實(shí)施例6)。
PCV2重組免疫原可能與PCV1免疫原聯(lián)合使用，用于免疫動(dòng)物預(yù)防PMWS。在最末優(yōu)選的方法中，可能單獨(dú)使用PCV1免疫原，而不與PCV2免疫原一起使用。實(shí)施例1-在C6位點(diǎn)構(gòu)建金絲雀痘病毒插入質(zhì)粒
圖1(SEQ ID NO1)為金絲雀痘病毒DNA的3.7kb片段的序列。序列分析表明存在一個(gè)從377位起始并在2254位終止的命名為C6L的ORF。下面描述了C6插入質(zhì)粒的構(gòu)建，通過(guò)缺失C6 ORF并用兩側(cè)為轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的多克隆位點(diǎn)(MCS)取代。使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6B1(SEQ ID NO3)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴(kuò)增了380bp的PCR片段。使用寡核苷酸引物C6C1(SEQ ID NO4)和C6D1(SEQ ID NO5)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴(kuò)增了1155bp的PCR片段。將380bp和1155bp的片段融合在一起，融合方法為將二者一起加入作為模板，使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6D1(SEQ IDNO5)擴(kuò)增了1613bp的PCR片段。該片段用SacI和KpnI消化，并連接到用SacI/KpnI消化的pBluescript SK+(Stratagen，La，Jolla，CA，美國(guó))中。產(chǎn)生的質(zhì)粒pC6L通過(guò)DNA序列分析證實(shí)。它由C6上游370bp的金絲雀痘病毒DNA(“C6左臂”)、痘苗病毒早期終止信號(hào)、6個(gè)讀碼框中的翻譯終止子、含有SmaI、PstI、XhoI和EcoRI位點(diǎn)的MCS、痘苗病毒早期終止信號(hào)、6個(gè)讀碼框中的翻譯終止子和1155bp的下游金絲雀痘病毒序列(“C6右臂”)組成。
質(zhì)粒pJP099由pC6L衍生而來(lái)，將含有連接了外源基因的痘苗病毒H6啟動(dòng)子(在Taylor等(1988c)、Guo等(1989)和Perkus等(1989)有描述)連接到pC6L的SmaI/EcoRI位點(diǎn)。質(zhì)粒pJP099在H6啟動(dòng)子3′端含有一個(gè)獨(dú)特的EcoRV位點(diǎn)和一個(gè)獨(dú)特的NruI位點(diǎn)，在外源基因的終止密碼和C6左臂之間有一個(gè)獨(dú)特的SalI位點(diǎn)。因此來(lái)自pJP099的～4.5kbEcoRV/SalI或NruI/SalI片段含有質(zhì)粒序列、兩個(gè)C6臂和H6啟動(dòng)子5′端到EcoRV和NruI位點(diǎn)的序列。引物序列引物 C6A1(SEQ ID NO2)ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT引物 C6B1(SEQ ID NO3)GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA引物 C6C1(SEQ ID NO4)CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA引物 C6D1(SEQ ID NO5)GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG實(shí)施例2-構(gòu)建PCV2 ORF2的ALVAC供體質(zhì)粒用EcoRI消化質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14(含有在質(zhì)粒pGem7Z中作為EcoRI片段的PCV2基因組)，分離1768bp的片段并連接。
為了將PCV2 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP760(SEQ ID NO6)和JP773(SEQ ID NO7)從1768bp連接的EcoRI片段(見(jiàn)上文)擴(kuò)增PCV2 ORF2，產(chǎn)生PCRJ1304。引物JP760(SEQ IDNO6)含有從EcoRV開(kāi)始的H6啟動(dòng)子3′端和PCV2 ORF2的5′端。引物JP773(SEQ ID NO7)含有PCV2 ORF2的3′端，后跟一個(gè)SalI位點(diǎn)。然后用EcoRV/SalI消化PCR產(chǎn)物J1304，并作為～750bp的片段克隆到來(lái)自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見(jiàn)上文實(shí)施例1)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過(guò)序列分析證實(shí)并命名為pJP102(見(jiàn)圖2的pJP102圖和圖3的序列(SEQ ID NO8))。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號(hào)為AF055392。供體質(zhì)粒pJP102(用NotI線性化)用于體外重組試驗(yàn)(IVR)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1614(見(jiàn)實(shí)施例6)。引物序列JP760(SEQ ID NO6)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-AGG-AGG-CGJP773(SEQ ID NO7)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC實(shí)施例3-構(gòu)建PCV2 ORF2和ORF1的ALVAC供體質(zhì)粒用引物JP774(SEQ ID NO9)和JP775(SEQ ID NO10)在質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14上通過(guò)PCR擴(kuò)增PCV2 ORF1，產(chǎn)生PCR J1311。引物JP774(SEQ ID NO9)含有從NruI到H6啟動(dòng)子的3′端和PCV2 ORF1的5′端。引物JP775(SEQ ID NO10)含有PCV2ORF1的3′端，后跟一個(gè)SalI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物J1311(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過(guò)序列分析證實(shí)并命名為pJP104。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號(hào)為AF055392。將從pJP104分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來(lái)自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見(jiàn)實(shí)施例1)，產(chǎn)生的質(zhì)粒用限制酶切分析并命名為pJP105(見(jiàn)圖4)。供體質(zhì)粒pJP105(用NotI線性化)用于體外重組試驗(yàn)(實(shí)施例6有描述)，產(chǎn)生表達(dá)PCV2 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來(lái)自pJP102的～838bp的BamHI/SalI片段，并克隆到Klenow削平的pJP105的EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)限制酶切分析檢查插入片段的方向并選擇頭對(duì)頭的方向。該質(zhì)粒用序列分析證實(shí)并命名為pJP107(見(jiàn)圖5的pJP107圖和圖6的序列(SEQ IDNO11))。供體質(zhì)粒pJP107(用NotI線性化)用于體外重組5(IVR)試驗(yàn)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1615(見(jiàn)實(shí)施例6)。引物序列JP774(SEQ ID NO9)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGGJP775(SEQ ID NO10)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG實(shí)施例4-構(gòu)建PCV1 ORF2的ALVAC供體質(zhì)粒質(zhì)粒pPCV1(B.Meehan等，J.Gen.Virol.1997.78.221-227)含有在質(zhì)粒pGem7Z中作為PstI片段的PCV1基因組，作為模板用來(lái)擴(kuò)增PCV1ORF2。
為了將PCV1 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP787(SEQ ID NO12)和JP788(SEQ ID NO13)從質(zhì)粒pCV1擴(kuò)增PCV1ORF2(見(jiàn)上文)，產(chǎn)生PCRJ1315。引物JP787(SEQ ID NO12)含有從EcoRV到H6啟動(dòng)子的3′端和ORF2，后跟一個(gè)SalI位點(diǎn)。然后用EcoRV/SalI消化PCR產(chǎn)物J1315并克隆到來(lái)自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見(jiàn)上文實(shí)施例1)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過(guò)序列分析證實(shí)并命名為pJP113。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號(hào)為U49186。供體質(zhì)粒pJP113(用NotI線性化)用于體外重組試驗(yàn)(IVR)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1621(見(jiàn)實(shí)施例7)。引物序列JP787(SEQ ID NO12)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CGJP788(SEQ ID NO13)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G實(shí)施例5-構(gòu)建PCV1 ORF2和ORF1的ALVAC供體質(zhì)粒用PstI消化質(zhì)粒pPCV1(見(jiàn)施例4)，該質(zhì)粒含有在質(zhì)粒pGem-7Z中作為PstI片段的PCV1基因組。分離1759bp的片段并連接。
使用引物JP789(SEQ ID NO14)和JP790(SEQ ID NO15)從連接了PstI片段的1759bp的片段擴(kuò)增PCV1 ORF1，產(chǎn)生PCR J1316。引物JP789(SEQ ID NO14)含有從NruI到H6啟動(dòng)子的3’端和PCV1 ORF1的5’端。引物JP790(SEQ ID NO15)含有PCV1 ORF1的3’端，后跟一個(gè)SalI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物J1316(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過(guò)序列分析證實(shí)并命名為pJP114。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號(hào)為U49186。從pJP114分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來(lái)自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見(jiàn)實(shí)施例1)，產(chǎn)生的質(zhì)粒用限制酶切分析并命名為pJP115。供體質(zhì)粒pJP105(用NotI線性化)用于體外重組試驗(yàn)(實(shí)施例6有描述)，產(chǎn)生表達(dá)PCV1 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來(lái)自pJP113的～838bp的BamHI/SalI片段，并克隆到Klenow削平的pJP115的EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)限制酶切分析檢查插入片段的方向，選擇頭對(duì)頭的方向。該質(zhì)粒通過(guò)序列分析證實(shí)并命名為pJP117。供體質(zhì)粒pJP117(用NotI線性化)用于體外重組(IVR)試驗(yàn)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1622(見(jiàn)實(shí)施例7)。引物序列JP789(SEQ ID NO14)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-AAG-CAA-GAA-AAG-CGGJP790(SEQ ID NO15)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG實(shí)施例6-ALVACPCV2重組體的產(chǎn)生質(zhì)粒pJP102(見(jiàn)實(shí)施例2和圖2)和pJp107(見(jiàn)實(shí)施例3和圖5)用NotI線性化，并使用先前描述的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染ALVAC感染的原代CEF細(xì)胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據(jù)與放射性標(biāo)記的特異性PCV2探針雜交選擇陽(yáng)性噬斑，進(jìn)行連續(xù)四輪噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然后擴(kuò)增每個(gè)IVR的代表性噬斑，產(chǎn)生的重組體命名為vCP1614和vCP1615。vCP1614病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP102重組的結(jié)果，它含有插入到ALVAC C6位點(diǎn)的PCF2 ORF2。vCP1615病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP107重組的結(jié)果，它含有以頭對(duì)頭方向插入到ALVAC C6位點(diǎn)的PCV2 ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實(shí)施例3描述的質(zhì)粒pJP105可產(chǎn)生表達(dá)PCV2ORF1的重組體ALVAC。
免疫熒光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細(xì)胞是否表達(dá)PCV2蛋白，進(jìn)行了免疫熒光分析(IF)。感染的Vero細(xì)胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時(shí)后用PBS洗滌，并用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。PCV2ORF1(PCV2 199 1D3GA&PCV2 210 7G5GD)或ORF2(PCV2 1904C7CF、PCV2 190 2B1BC&PCV2 190 3A8BC)特異的五種單克隆抗體(Mab)制品(雜交瘤上清)用作第一抗體。這些特異的單克隆抗體獲自Merial-Lyon。單克隆抗體也可按照此處引用文獻(xiàn)中的指導(dǎo)來(lái)獲得，例如并入本文作為參考的WO-A-99 18214，1998，法國(guó)申請(qǐng)?zhí)?7/12382、98/00873、98/03707，申請(qǐng)日期為1997年10月3日、1998年3月20日和WO99/29717。IF反應(yīng)按照Taylor等描述的進(jìn)行(1990)。
使用三個(gè)ORF2特異性抗體的PCV2特異的免疫熒光可以在感染了vCP1614的細(xì)胞和感染了vCP1614的細(xì)胞中檢查到。使用兩個(gè)ORF1特異性抗體的PCV2特異的免疫熒光只能在感染了vCP1615的細(xì)胞中檢查到。這些結(jié)果表明，如預(yù)料的那樣，vCP1614只表達(dá)ORF2，而vCP1615表達(dá)ORF1和ORF2。在親本ALVAC感染的Vero細(xì)胞和未感染的Vero細(xì)胞中都沒(méi)有檢查到熒光。實(shí)施例7-ALVAC-PCV1重組體的產(chǎn)生質(zhì)粒pJP113(見(jiàn)實(shí)施例4)和pJP117(見(jiàn)實(shí)施例5)用NotI線性化，并使用先前描述的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染ALVAC感染的原代CEF細(xì)胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據(jù)與放射性標(biāo)記的特異性PCV1探針雜交選擇陽(yáng)性噬斑，進(jìn)行四輪連續(xù)噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然后擴(kuò)增每個(gè)IVR的代表性噬斑，產(chǎn)生的重組體命名為vCP1621和vCP1622。vCP1621病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP113重組的結(jié)果，它含有插入到ALVAC C6位點(diǎn)的PCV1 ORF2。vCP1622病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP117重組的結(jié)果，它含有以頭對(duì)頭方向插入到ALVAC C6位點(diǎn)的PCV1 ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實(shí)施例5描述的質(zhì)粒pJP115可產(chǎn)生只表達(dá)PCV1ORF1的重組體ALVAC。
免疫熒光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細(xì)胞是否表達(dá)PCV1蛋白，進(jìn)行了免疫熒光分析(IF)。感染的Vero細(xì)胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時(shí)后用PBS洗滌，并用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。特異的抗PCV1的豬多克隆血清(Allan G等.Vet.Microbiol.1999，66115-123)用作第一抗體。IF反應(yīng)按照Taylor等描述的進(jìn)行(1990)。
PCV1特異的免疫熒光可以在感染了vCP1621的細(xì)胞和感染了vCP1622的細(xì)胞中檢查到。這些結(jié)果表明，如預(yù)料的那樣，vCP1621和vCP1622表達(dá)PCV1特異的產(chǎn)物，用PCV2特異的豬多克隆血清在vCP1621感染的Vero細(xì)胞和vCP1622感染的Vero細(xì)胞中都沒(méi)有檢查到熒光。在親本ALVAC感染的Vero細(xì)胞和未感染的Vero細(xì)胞中都沒(méi)有檢查到熒光。實(shí)施例8-用CarbopolTM974P形成重組金絲雀痘病毒為了制備疫苗，重組金絲雀痘病毒vCP1614和vCP1615(實(shí)施例6)可與carbomer溶液混合。以同樣的方式，重組金絲雀痘病毒vCP1621和vCP1622(實(shí)施例7)可與carbomer溶液混合。用于根據(jù)本發(fā)明來(lái)免疫豬的carbomer成分為BF Goodrich公司制造的CarbopolTM974P(分子量為3,000,000)。首先用含有1g/l氯化鈉的蒸餾水制備1.5％CarbopolTM974P儲(chǔ)備液。然后用該儲(chǔ)備液制備4mg/ml CarbopolTM974P的生理鹽水溶液。在一個(gè)步驟或幾個(gè)連續(xù)步驟中，儲(chǔ)備液與所需體積的生理鹽水混合，每一步用1N(或更濃的)氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值，使最終pH值為7.3-7.4。這種最終的CarbopolTM974P溶液可立即用于重新組成凍干重組病毒或用于稀釋濃縮的重組病毒儲(chǔ)備液。例如，為了獲得每2ml劑量含有10e8pfu的最終病毒懸液，可將0.1ml 10e9pfu/ml儲(chǔ)備液加入到立即可用的1.9ml上述4mg/mlCarbopolTM974P溶液中稀釋。以相同的方式，也可制備立即可用的2mg/ml CarbopolTM974P溶液。實(shí)施例9-免疫豬及以后的攻擊9.1.免疫1日齡小豬將一組來(lái)自caesarian的小豬在第0天放入隔離器。在第2天用各種疫苗溶液通過(guò)肌肉途徑接種小豬。用無(wú)菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲(chǔ)備液制備疫苗病毒懸液。病毒懸液的合適范圍可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，但通常范圍在106-1010，優(yōu)選大約1010pfu/劑量。疫苗溶液也可通過(guò)將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來(lái)制備，如實(shí)施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實(shí)施例2)；重組病毒vCP1615(實(shí)施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒VCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
每個(gè)劑量病毒懸液含有108噬斑形成單位(pfu)。通過(guò)肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射頸部肌肉。
在實(shí)驗(yàn)第2天和第14天注射2針病毒懸液。在第21天用PCV-2強(qiáng)毒株培養(yǎng)物制備的病毒懸液經(jīng)口鼻攻擊。攻擊后，監(jiān)視小豬斷奶后多系統(tǒng)綜合征的臨床體征3周。記錄以下體征直腸溫度攻擊后每天監(jiān)視持續(xù)2周，然后在第3周測(cè)量2次直腸溫度。體重臨攻擊前稱量小豬體重，然后在攻擊后前3周每周稱一次體重。在實(shí)驗(yàn)的第2、14、21、28、35和42天采集血樣，來(lái)監(jiān)測(cè)病毒血癥水平和抗-PCV-2特異性抗體滴度。
尸檢在第42天所有存活的小豬被處以人道安樂(lè)死并進(jìn)行尸檢，觀察PWMS肉眼損害。從肝臟、淋巴結(jié)、脾、腎和胸腺制備組織樣品以觀察特異性組織學(xué)損害。9.2-免疫5-7周齡小豬無(wú)抗PCV-2特異性母體抗體的5-7周齡小豬通過(guò)肌肉途徑接種各種疫苗溶液。用無(wú)菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲(chǔ)備液制備疫苗病毒懸液。疫苗溶液也可通過(guò)將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來(lái)制備，如實(shí)施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實(shí)施例2)；重組病毒vCP1615(實(shí)施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
病毒懸液每劑量含有108噬斑形成單位(pfu)。通過(guò)肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射到頸部肌肉。
在實(shí)驗(yàn)第0天和第21天注射2針病毒懸液。在第35天用PCV-2強(qiáng)毒株培養(yǎng)物制備的病毒懸液經(jīng)口鼻攻擊。攻擊后，監(jiān)視小豬斷奶后多系統(tǒng)綜合征的臨床體征8周。監(jiān)測(cè)的臨床體征與實(shí)施例9.1中描述的相同。只是總監(jiān)視時(shí)間為8周而非3周。
尸檢在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)攻擊后死亡的小豬及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第97天)所有存活的小豬進(jìn)行尸檢。組織樣品與實(shí)施例9.1中描述的相同。9.3.免疫新生小豬將來(lái)自caesarian的一組3-4頭小豬在第0天放入隔離器中。在第2天用1ml PBS中含有108pfu的vCP1614、vCP1615或親本ALVAC載體通過(guò)肌肉途徑在頸部接種小豬。在第14天注射第二針疫苗或安慰劑。小豬對(duì)接種ALVAC重組體可以很好耐受，沒(méi)有接種副反應(yīng)的證據(jù)。在第21天用PCV-2病毒懸液經(jīng)口鼻途徑(每鼻孔1ml)對(duì)小豬進(jìn)行攻擊。在第45天進(jìn)行尸檢，并收集組織樣品分離病毒。尸檢結(jié)果●PMWS通常特征為淋巴結(jié)病，較罕見(jiàn)的特征為肝炎或腎炎。按下列方式記錄每頭小豬的淋巴結(jié)中的肉眼發(fā)現(xiàn)0＝無(wú)肉眼可見(jiàn)的淋巴結(jié)增大；1＝輕度淋巴結(jié)增大，限于支氣管淋巴結(jié)；2＝中度淋巴結(jié)增大，限于支氣管淋巴結(jié)；3＝重度淋巴結(jié)增大，涉及支氣管的、下頜下肩甲骨上的和腹股溝的淋巴結(jié)。組 分值vCP1614 0.50.00.01.0平均值0.38標(biāo)準(zhǔn)差0.48vCP1615 0.00.50.51.0平均值0.5標(biāo)準(zhǔn)差0.41對(duì)照 2.02.5
2.52.5平均值2.38標(biāo)準(zhǔn)差0.25PCV-2的支氣管淋巴結(jié)病為顯著的肉眼發(fā)現(xiàn)。用vCP1614和vCP1615免疫后，與對(duì)照組相比，可觀察到淋巴結(jié)損害顯著降低(p≤0.05)。
在具體的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明應(yīng)理解為不限于上述闡明的特殊細(xì)節(jié)，因?yàn)樗鼈兛赡苡性S多明顯的變異并不脫離本發(fā)明范圍的精神。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Bublot，MichelPerez.Jennifer MCharreyre，Catherine E(ii)發(fā)明名稱豬環(huán)病毒2重組痘病毒(iii)序列數(shù)目13(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Frommer Lawrence Haug LLP(B)街道745 Fifth Avenue(C)城市NY(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼10151(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)(A)姓名Kowalski，Thomas J.
(B)登記號(hào)32147(C)文檔號(hào)454313-2511.1(ix)通訊信息(A)電話212-588-0800(B)傳真212-588-0500(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3701個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述AAGCTTCTAT CAAAAGTCTT AATGAGTTAG GTGTAGATAG TATAGATATT ACTACAAAGG60TATTCATATT TCCTATCAAT TCTAAAGTAG ATGATATTAA TAACTCAAAG ATGATGATAG120TAGATAATAG ATACGCTCAT ATAATGACTG CAAATTTGGA CGGTTCACAT TTTAATCATC180ACGCGTTCAT AAGTTTCAAC TGCATAGATC AAAATCTCAC TAAAAAGATA GCCGATGTAT240TTGAGAGAGA TTGGACATCT AACTACGCTA AAGAAATTAC AGTTATAAAT AATACATAAT300GGATTTTGTT ATCATCAGTT ATATTTAACA TAAGTACAAT AAAAAGTATT AAATAAAAAT360ACTTACTTAC GAAAAAATGT CATTATTACA AAAACTATAT TTTACAGAAC AATCTATAGT420AGAGTCCTTT AAGAGTTATA ATTTAAAAGA TAACCATAAT GTAATATTTA CCACATCAGA480TGATGATACT GTTGTAGTAA TAAATGAAGA TAATGTACTG TTATCTACAA GATTATTATC540ATTTGATAAA ATTCTGTTTT TTAACTCCTT TAATAACGGT TTATCAAAAT ACGAAACTAT600TAGTGATACA ATATTAGATA TAGATACTCA TAATTATTAT ATACCTAGTT CTTCTTCTTT660GTTAGATATT CTAAAAAAAA GAGCGTGTGA TTTAGAATTA GAAGATCTAA ATTATGCGTT720AATAGGAGAC AATAGTAACT TATATTATAA AGATATGACT TACATGAATA ATTGGTTATT780TACTAAAGGA TTATTAGATT ACAAGTTTGT ATTATTGCGC GATGTAGATA AATGTTACAA840ACAGTATAAT AAAAAGAATA CTATAATAGA TATAATACAT CGCGATAACA GACAGTATAA900CATATGGGTT AAAAATGTTA TAGAATACTG TTCTCCTGGC TATATATTAT GGTTACATGA960TCTAAAAGCC GCTGCTGAAG ATGATTGGTT AAGATACGAT AACCGTATAA ACGAATTATC1020TGCGGATAAA TTATACACTT TCGAGTTCAT AGTTATATTA GAAAATAATA TAAAACATTT1080ACGAGTAGGT ACAATAATTG TACATCCAAA CAAGATAATA GCTAATGGTA CATCTAATAA1140TATACTTACT GATTTTCTAT CTTACGTAGA AGAACTAATA TATCATCATA ATTCATCTAT1200AATATTGGCC GGATATTTTT TAGAATTCTT TGAGACCACT ATTTTATCAG AATTTATTTC1260TTCATCTTCT GAATGGGTAA TGAATAGTAA CTGTTTAGTA CACCTGAAAA CAGGGTATGA1320AGCTATACTC TTTGATGCTA GTTTATTTTT CCAACTCTCT ACTAAAAGCA ATTATGTAAA1380ATATTGGACA AAGAAAACTT TGCAGTATAA GAACTTTTTT AAAGACGGTA AACAGTTAGC1440AAAATATATA ATTAAGAAAG ATAGTCAGGT GATAGATAGA GTATGTTATT TACACGCAGC1500TGTATATAAT CACGTAACTT ACTTAATGGA TACGTTTAAA ATTCCTGGTT TTGATTTTAA1560ATTCTCCGGA ATGATAGATA TACTACTGTT TGGAATATTG CATAAGGATA ATGAGAATAT1620ATTTTATCCG AAACGTGTTT CTGTAACTAA TATAATATCA GAATCTATCT ATGCAGATTT1680TTACTTTATA TCAGATGTTA ATAAATTCAG TAAAAAGATA GAATATAAAA CTATGTTTCC1740TATACTCGCA GAAAACTACT ATCCAAAAGG AAGGCCCTAT TTTACACATA CATCTAACGA1800AGATCTTCTG TCTATCTGTT TATGCGAAGT AACAGTTTGT AAAGATATAA AAAATCCATT1860ATTATATTCT AAAAAGGATA TATCAGCAAA ACGATTCATA GGTTTATTTA CATCTGTCGA1920TATAAATACG GCTGTTGAGT TAAGAGGATA TAAAATAAGA GTAATAGGAT GTTTAGAATG1980GCCTGAAAAG ATAAAAATAT TTAATTCTAA TCCTACATAC ATTAGATTAT TACTAACAGA2040AAGACGTTTA GATATTCTAC ATTCCTATCT GCTTAAATTT AATATAACAG AGGATATAGC2100TACCAGAGAT GGAGTCAGAA ATAATTTACC TATAATTTCT TTTATCGTCA GTTATTGTAG2160ATCGTATACT TATAAATTAC TAAATTGCCA TATGTACAAT TCGTGTAAGA TAACAAAGTG2220TAAATATAAT CAGGTAATAT ATAATCCTAT ATAGGAGTAT ATATAATTGA AAAAGTAAAA2280TATAAATCAT ATAATAATGA AACGAAATAT CAGTAATAGA CAGGAACTGG CAGATTCTTC2340TTCTAATGAA GTAAGTACTG CTAAATCTCC AAAATTAGAT AAAAATGATA CAGCAAATAC2400AGCTTCATTC AACGAATTAC CTTTTAATTT TTTCAGACAC ACCTTATTAC AAACTAACTA2460AGTCAGATGA TGAGAAAGTA AATATAAATT TAACTTATGG GTATAATATA ATAAAGATTC2520ATGATATTAA TAATTTACTT AACGATGTTA ATAGACTTAT TCCATCAACC CCTTCAAACC2580TTTCTGGATA TTATAAAATA CCAGTTAATG ATATTAAAAT AGATTGTTTA AGAGATGTAA2640ATAATTATTT GGAGGTAAAG GATATAAAAT TAGTCTATCT TTCACATGGA AATGAATTAC2700CTAATATTAA TAATTATGAT AGGAATTTTT TAGGATTTAC AGCTGTTATA TGTATCAACA2760ATACAGGCAG ATCTATGGTT ATGGTAAAAC ACTGTAACGG GAAGCAGCAT TCTATGGTAA2820CTGGCCTATG TTTAATAGCC AGATCATTTT ACTCTATAAA CATTTTACCA CAAATAATAG2880GATCCTCTAG ATATTTAATA TTATATCTAA CAACAACAAA AAAATTTAAC GATGTATGGC2940CAGAAGTATT TTCTACTAAT AAAGATAAAG ATAGTCTATC TTATCTACAA GATATGAAAG3000AAGATAATCA TTTAGTAGTA GCTACTAATA TGGAAAGAAA TGTATACAAA AACGTGGAAG3060CTTTTATATT AAATAGCATA TTACTAGAAG ATTTAAAATC TAGACTTAGT ATAACAAAAC3120AGTTAAATGC CAATATCGAT TCTATATTTC ATCATAACAG TAGTACATTA ATCAGTGATA3180TACTGAAACG ATCTACAGAC TCAACTATGC AAGGAATAAG CAATATGCCA ATTATGTCTA3240ATATTTTAAC TTTAGAACTA AAACGTTCTA CCAATACTAA AAATAGGATA CGTGATAGGC3300TGTTAAAAGC TGCAATAAAT AGTAAGGATG TAGAAGAAAT ACTTTGTTCT ATACCTTCGG3360AGGAAAGAAC TTTAGAACAA CTTAAGTTTA ATCAAACTTG TATTTATGAA CACTATAAAA3420AAATTATGGA AGATACAAGT AAAAGAATGG ATGTTGAATG TCGTAGTTTA GAACATAACT3480ATACGGCTAA CTTATATAAA GTGTACGGAC AAAACGAATA TATGATTACT TATATACTAG3540CTCTCATAAG TAGGATTAAT AATATTATAG AAACTTTAAA ATATAATCTG GTGGGGCTAG3600ACGAATCTAC AATACGTAAT ATAAATTATA TAATTTCACA AAGAACAAAA AAAAATCAAG3660TTTCTAATAC CTTATAGATA AACTATATTT TTTACCACTG A3701(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述ATCATCGAGC TCGCGGCCGC CTATCAAAAG TCTTAATGAG TT42(2)SEQ.ID.NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度73個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述GAATTCCTCG AGCTGCAGCC CGGGTTTTTA TAGCTAATTA GTCATTTTTT CGTAAGTAAG60TATTTTTATT TAA73(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度72個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述CCCGGGCTGC AGCTCGAGGA ATTCTTTTTA TTGATTAACT AGTCAAATGA GTATATATAA60TTGAAAAAGT AA72(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述GATGATGGTA CCTTCATAAA TACAAGTTTG ATTAAACTTA AGTTG45(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述CATCATCATG ATATCCGTTA AGTTTGTATC GTAATGACGT ATCCAAGGAG GCG53(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述TACTACTACG TCGACTTAGG GTTTAAGTGG GGGGTC36(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2520個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述GGTACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTCCGA60AGGTATAGAA CAAAGTATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT120ATCACGTATC CTATTTTTAG TATTGGTAGA ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA180CATAATTGGC ATATTGCTTA TTCCTTGCAT AGTTGAGTCT GTAGATCGTT TCAGTATATC240ACTGATTAAT GTACTACTGT TATGATGAAA TATAGAATCG ATATTGGCAT TTAACTGTTT300TGTTATACTA AGTCTAGATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC360CACGTTTTTG TATACATTTC TTTCCATATT AGTAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT420CATATCTTGT AGATAAGATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTAGAAAATA CTTCTGGCCA480TACATCGTTA AATTTTTTTG TTGTTGTTAG ATATAATATT AAATATCTAG AGGATCCTAT540TATTTGTGGT 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GTTACCGCAG AAGAAGACAC1440CGCCCCCGCA GCCATCTTGG CCAGATCCTC CGCCGCCGCC CCTGGCTCGT CCACCCCCGC1500CACCGCTACC GTTGGAGAAG GAAAAATGGC ATCTTCAACA CCCGCCTCTC CCGCACCTTC1560GGATATACTG TCAAGCGTAC CACAGTCACA ACGCCCTCCT GGGCGGTGGA CATGATGAGA1620TTTAAAATTG ACGACTTTGT TCCCCCGGGA GGGGGGACCA ACAAAATCTC TATACCCTTT1680GAATACTACA GAATAAGAAA GGTTAAGGTT GAATTCTGGC CCTGCTCCCC CATCACCCAG1740GGTGATAGGG GAGTGGGCTC CACTGCTGTT ATTCTAGATG ATAACTTTGT AACAAAGGCC1800ACAGCCCTAA CCTATGACCC ATATGTAAAC TACTCCTCCC GCCATACAAT CCCCCAACCC1860TTCTCCTACC ACTCCCGTTA CTTCACACCC AAACCTGTTC TTGACTCCAC TATTGATTAC1920TTCCAACCAA ATAACAAAAG GAATCAGCTT TGGCTGAGAC TACAAACCTC TGGAAATGTG1980GACCACGTAG GCCTCGGCGC TGCGTTCGAA AACAGTAAAT ACGACCAGGA CTACAATATC2040CGTGTAACCA TGTATGTACA ATTCAGAGAA TTTAATCTTA AAGACCCCCC ACTTAAACCC2100TAAGTCGACC CCGGGTTTTT ATAGCTAATT AGTCATTTTT TCGTAAGTAA GTATTTTTAT2160TTAATACTTT TTATTGTACT TATGTTAAAT ATAACTGATG ATAACAAAAT CCATTATGTA2220TTATTTATAA CTGTAATTTC TTTAGCGTAG TTAGATGTCC AATCTCTCTC 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TCAGTATATC240ACTGATTAAT GTACTACTGT TATGATGAAA TATAGAATCG ATATTGGCAT TTAACTGTTT300TGTTATACTA AGTCTAGATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC360CACGTTTTTG TATACATTTC TTTCCATATT AGTAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT420CATATCTTGT AGATAAGATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTAGAAAATA CTTCTGGCCA480TACATCGTTA AATTTTTTTG TTGTTGTTAG ATATAATATT AAATATCTAG AGGATCCTAT540TATTTGTGGT AAAATGTTTA TAGAGTAAAA TGATCTGGCT ATTAAACATA GGCCAGTTAC600CATAGAATGC TGCTTCCCGT TACAGTGTTT TACCATAACC ATAGATCTGC CTGTATTGTT660GATACATATA ACAGCTGTAA ATCCTAAAAA ATTCCTATCA TAATTATTAA TATTAGGTAA720TTCATTTCCA TGTGAAAGAT AGACTAATTT TATATCCTTT ACCTCCAAAT AATTATTTAC780ATCTCTTAAA CAATCTATTT TAATATCATT AACTGGTATT TTATAATATC CAGAAAGGTT840TGAAGGGGTT GATGGAATAA GTCTATTAAC ATCGTTAAGT AAATTATTAA TATCATGAAT900CTTTATTATA TTATACCCAT AAGTTAAATT TATATTTACT TTCTCATCAT CTGACTTAGT960TAGTTTGTAA TAAGGTGTGT CTGAAAAAAT TAAAAGGTAA TTCGTTGAAT GAAGCTGTAT1020TTGCTGTATC ATTTTTATCT AATTTTGGAG ATTTAGCAGT ACTTACTTCA TTAGAAGAAG1080AATCTGCCAG TTCCTGTCTA TTACTGATAT TTCGTTTCAT TATTATATGA TTTATATTTT1140ACTTTTTCAA TTATATATAC TCATTTGACT AGTTAATCAA TAAAAAGAAT TTCGACTTAG1200GGTTTAAGTG GGGGGTCTTT AAGATTAAAT TCTCTGAATT GTACATACAT GGTTACACGG1260ATATTGTAGT CCTGGTCGTA TTTACTGTTT TCGAACGCAG CGCCGAGGCC TACGTGGTCC1320ACATTTCCAG AGGTTTGTAG TCTCAGCCAA AGCTGATTCC TTTTGTTATT TGGTTGGAAG1380TAATCAATAG TGGAGTCAAG AACAGGTTTG GGTGTGAAGT AACGGGAGTG GTAGGAGAAG1440GGTTGGGGGA TTGTATGGCG GGAGGAGTAG TTTACATATG GGTCATAGGT TAGGGCTGTG1500GCCTTTGTTA CAAAGTTATC ATCTAGAATA ACAGCAGTGG AGCCCACTCC CCTATCACCC1560TGGGTGATGG GGGAGCAGGG CCAGAATTCA ACCTTAACCT TTCTTATTCT GTAGTATTCA1620AAGGGTATAG AGATTTTGTT GGTCCCCCCT CCCGGGGGAA CAAAGTCGTC AATTTTAAAT1680CTCATCATGT CCACCGCCCA GGAGGGCGTT GTGACTGTGG TACGCTTGAC AGTATATCCG1740AAGGTGCGGG AGAGGCGGGT GTTGAAGATG CCATTTTTCC TTCTCCAACG GTAGCGGTGG1800CGGGGGTGGA CGAGCCAGGG GCGGCGGCGG AGGATCTGGC CAAGATGGCT GCGGGGGCGG1860TGTCTTCTTC TGCGGTAACG CCTCCTTGGA TACGTCATTA CGATACAAAC TTAACGGATA1920TCGCGATAAT GAAATAATTT ATGATTATTT CTCGCTTTCA ATTTAACACA 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權(quán)利要求
1.一種含有來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的DNA的重組病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒，其為痘病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組痘病毒，其為禽痘病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組禽痘病毒，其為ALVAC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的DNA編碼并表達(dá)為豬環(huán)狀病毒的主要衣殼蛋白或目的表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開(kāi)放讀碼框2(ORF2)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開(kāi)放讀碼框1(ORF1)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開(kāi)放讀碼框1和2(ORF1和2)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其為vCP1614和vCP1615。
10.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有一種載體和根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒。
11.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求5的重組病毒。
12.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求6的重組病毒。
13.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求7的重組病毒。
14.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求8的重組病毒。
15.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求9的重組病毒。
16.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求11的免疫組合物。
17.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求12的免疫組合物。
18.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求13的免疫組合物。
19.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求14的免疫組合物。
20.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求15的免疫組合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了含有來(lái)自豬環(huán)狀病毒2的外源DNA的重組痘病毒,例如禽痘病毒。也描述了含有該重組痘病毒的免疫組合物,用于誘導(dǎo)施用了該免疫組合物的宿主動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。還描述了通過(guò)將本發(fā)明的免疫組合物給予需要治療或?qū)ωi環(huán)狀病毒2的感染敏感的動(dòng)物,來(lái)治療或預(yù)防豬環(huán)狀病毒2引起的疾病的方法。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1361824SQ00810560
公開(kāi)日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月10日
發(fā)明者M·巴布洛特, J·M·佩里茲, C·E·查雷爾 申請(qǐng)人:梅瑞爾公司