專利名稱：用于確定抑制性rna分子的體內選擇方法
技術領域：
本發明涉及用于選擇最佳抑制性RNA分子的體內方法。
背景技術：
利用抑制性RNA分子抑制靶核酸序列的轉錄和/或翻譯是相當重要的。抑制性RNA分子可以直接或間接地結合核酸序列或其轉錄產物并實現其切割。這樣的例子包括核酶(能直接切割靶序列)、外部指導序列(EGSs)及反義或有義RNA(能通過其它因子引起切割)。
不利的是，由于mRNA復雜的二級結構，上述技術的應用遇到了許多的困難。除非試圖定向于每一個位置，通常不可能預計mRNA中開放或易接近的位點的位置。
用于搜尋這些開放區域的一個方法是Southern(1997)和Milner(1997)所述的體外“寡核苷酸排列”方法。不過，這些方法包括費時地產生各個特殊靶mRNA的獨特排列。另外，異源雙螺旋是在非生理條件下形成的。由于考慮到mRNA在5’和3’末端均結合有許多蛋白質，這一點尤其成問題。
因此使用“體內”選擇方法發現正常生理條件下開放的mRNA位點是有利的。另外，此方法一般來說都是有用的，因為所有RNA分子都可用此方法檢測，而無需每次憑借特殊的選擇方法。
因此，本發明的目的是提供確定有效定向于所給RNA序列的抑制性RNA分子的體內選擇方法。
本發明還顯示，有可能使用表達靶序列的細胞在體內選擇抑制性RNA分子，此靶序列與可檢測的標記有效連接，從而使靶序列及可檢測標記作為鄰接的RNA分子在細胞中表達。
靶序列/可檢測標記mRNA將包含正常的5’帽和3’polyA尾。如果5’帽和3’polyA尾被去除(例如，通過抑制性RNA分子從靶序列上切割下來)，mRNA將不穩定而被降解。這將預防可檢測標記基因的翻譯。
例如，如果可檢測標記是能將前體藥物轉變成細胞毒性化合物的酶，靶序列的切割將使得細胞對前體藥物不敏感。
表達可檢測標記/靶基因的細胞可用于篩選許多抑制性RNA分子。尤其是，本發明的發明者已利用這樣的細胞來篩選核酶表達載體的文庫，其中的各核酶具有不同的特異性區域。對前體藥物具抗性的細胞包含有活性核酶，然后可用聚合酶鏈式反應(PCR)之類的技術確定其序列。
為此，本發明提供了適于體內使用的選擇系統，該系統包含(i)第一核苷酸序列群，這些序列編碼的基因產物能直接或間接地與核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割；其中結合所說核苷酸序列所需之第一核苷酸序列的區域在第一核苷酸序列群間是異質的；(ii)第二核苷酸序列，其含有(a)編碼與mRNA穩定及/或翻譯所需序列有效連接之可檢測標記的編碼區；以及(b)第三核苷酸序列，其位于編碼區及mRNA穩定和/或翻譯所需序列中至少一種之間；其中(a)和(b)與調控序列有效連接，此調控序列能指導(a)和(b)作為毗鄰的分子在宿主細胞中表達。
本發明提供了載體系統，該系統包含(i)載體群，這些載體獨立地含有所編碼的基因產物能直接或間接地與核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列；其中結合所說核苷酸序列所需的第一核苷酸序列中的區域在載體群內是異質的；(ii)第二核苷酸序列，含有(a)編碼與mRNA穩定及/或翻譯所需序列有效連接之可檢測標記的編碼區；以及(b)第三核苷酸序列，其位于編碼區及至少mRNA穩定和/或翻譯所需序列中至少一種之間；其中(a)和(b)與調控序列有效連接，此調控序列能指導(a)和(b)作為毗鄰的分子在宿主細胞中表達，其中第二核苷酸序列存在于載體群中或作為另外載體的一部分。
優選基因產物選自核酶、反義核糖核酸和外部指導序列。
優選該載體是病毒載體，更優選逆轉錄病毒載體。
優選的可檢測標記是選擇標記，更優選能將前體藥物轉變成細胞毒性化合物的酶。在特別優選的實施方案中，該酶是胸苷激酶，而前體藥物是丙氧鳥苷(gancyclovir)。
本發明進一步提供了病毒顆粒群，各病毒顆粒含有上述第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列。
本發明還提供了產生上述病毒顆粒群的方法，該方法包括將以下成分引入生產者細胞(i)上述第一核苷酸序列群，和(ii)上述第二核苷酸序列。還提供了此方法產生的病毒顆粒群。
此外，本發明提供了從上述第一核苷酸序列群中選擇所編碼基因產物能直接或間接地與第三核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列的方法；該方法包括(i)將一種或多種第一核苷酸序列引入含上述第二核苷酸序列的宿主細胞中；并(ii)選擇可檢測標記在其中不以活性形式表達的宿主細胞；并任意地，(iii)分離該第一核苷酸序列并測定其核苷酸序列。
優選在步驟(ii)中，可檢測標記是選擇標記，且宿主細胞與前體藥物之類的化合物接觸，該前體藥物在選擇標記存在時具有細胞毒性。更優選地，選擇標記是胸苷激酶，前體藥物是丙氧鳥苷。
在優選的實施方案中，所說的第一核苷酸序列群中的各第一核苷酸序列均位于編碼可檢測標記無活性變體之第四核苷酸序列的下游，從而去除所編碼基因產物能與可檢測標記編碼區結合并實現其切割的任何第一核苷酸序列。
在本發明優選的方面，第一核苷酸序列群存在于病毒載體群中，所說的病毒載體包含編碼可檢測標記無活性變體的第四核苷酸序列，且作為預備步驟，載體群被引入一種或多種生產者細胞中，產生的用于步驟(i)中將第一核苷酸序列引入生產者細胞中的任何感染性病毒顆粒含第二核苷酸序列。
另一方面，本發明提供了用本發明上述方法獲得的第一核苷酸序列。這些第一核苷酸序列可用于治療。
此外，本發明提供了利用本發明的第一方面的選擇系統鑒定mRNA分子上開放位點的方法。
發明詳述A.選擇系統的組成(i)編碼抑制性RNA分子的第一核苷酸序列群本發明選擇系統的第一組分是編碼抑制性RNA分子的核苷酸序列群。抑制性RNA分子定義為，能通過與核酸序列結合而抑制其轉錄和/或翻譯的核糖核酸。通常，抑制性RNA分子能直接或間接地與核酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割。例如核酶(直接切割)、外部指導序列(EGSs)和反義或有義RNA(通過其它因子引起切割)。
編碼抑制性RNA分子的第一核苷酸序列群基本上是異質的，從而為選擇過程產生了多樣性序列。因此，至少結合靶核苷酸序列所需的抑制性分子部分將有變化。優選地，催化活性、結構整體性和與降解靶核苷酸序列之細胞組分的相互作用所需的序列是不變化的。不過用誘變技術產生文庫可能是方便的，這樣可以在整個抑制性RNA分子序列中進行隨機改變。在反義和有義RNA構建體中，任何狀態下這種情況通常都是合乎需要的。至于核酶和EGS序列，優選使用隨機合成的寡核苷酸來產生文庫，這些寡核苷酸在合適的位置連接入核酶或EGS構建體。如此產生了核酶/EGS構建體文庫，其中與其特異性相關的區域有變化，而其它功能結構域通常是恒定的。
舉例說來，通過構建下述寡核苷酸可產生隨機核酶文庫，此寡核苷酸包含兩側有隨機核苷酸之錘頭狀核酶的保守酶促螺旋。兩側序列提供了核酶的識別區。盡管8個核苷酸是合適的長度，但各個側翼序列的長度可以有所變化。這就造成了有約164(65536)個不同分子的復雜性。
按照本發明適用的第一核苷酸序列編碼導致靶核苷酸序列(通常是核糖核苷酸)切割和/或酶促降解的基因產物。舉例說來，核酶、外部指導序列和反義序列都有可能。
核酶是在特異位點切割RNA的RNA酶。可將核酶改造使其特異于含核酶切割位點的任何所選序列。因此，核酶可構建為在被轉錄的病毒序列中具有選擇好的識別位點。舉例說來，由第一核苷酸序列編碼的核酶識別和切割產生病毒顆粒所需之病毒基因組的基本元件，如包裝成分和mRNA基因組。因此，對于逆轉錄病毒基因組，這樣的基本元件包括gag、pol和env基因產物以及病毒mRNA基因組。至少識別gag、pol和env基因序列之一，或更通常地自這些基因轉錄時RNA序列的合適核酶能結合并切割所說的序列。在合適的情況下，這將減少或防止gal、pol或env蛋白質以及mRNA基因組的產生，從而減少或防止逆轉錄病毒顆粒的產生。
核酶可以有多種形式，包括錘頭狀、發卡狀和肝炎δ反基因組核酶。此處優選的是錘頭狀核酶，部分原因是由于它們相對較小，它們的靶切割位點所需的序列是最小的，且對它們的性質研究也比較清楚。目前研究中最常使用的核酶是錘頭狀和發卡狀核酶。
各核酶均具有識別和結合靶RNA中識別位點的基元。基元采取一個或多個“結合臂”的形式，通常是兩個結合臂。錘頭狀核酶的結合臂是側翼序列Helix I和Helix III，它們在Helix II的兩側。這些序列長度是可變的，通常在6-10個核苷酸之間，但也可以更短或更長。側翼序列的長度可影響切割的速率。例如，已發現將側翼序列的總核苷酸數從20降低到12，可10倍提高核酶切割HIV序列的轉換率。在錘頭狀核酶中，核酶Helix II的催化基元于稱作切割位點的位點處切割靶RNA。核酶是否切割任何給定的RNA取決于含有合適切割位點的核酶識別位點的存在與否。
各類型的核酶識別其自身的切割位點。錘頭狀核酶的切割位點上游緊接著核苷酸堿基三聯體GUX，其中G是鳥嘌呤，U是尿嘧啶，而X是任何核苷酸堿基。發卡狀核酶具有切割位點BCUGNYR，其中B是除腺嘌呤之外的任何核苷酸堿基，N是任何核苷酸，Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶，而R是鳥嘌呤或腺嘌呤。發卡狀核酶的切割發生在切割位點的G和N之間。
反義技術是本領域眾所周知的。反義序列發生作用的一個機制是將細胞蛋白RNAseH募集到靶序列/反義構建體異源雙螺旋中，導致此異源雙螺旋的切割和降解。與核酶相反，據說這樣的反義構建體可間接導致靶序列的切割/降解。因此，按照本發明，第一核苷酸序列可編碼反義RNA，此反義RNA可與編碼基本/包裝組分的基因或自所說基因轉錄的RNA結合，從而使該基因的表達被抑制，例如是因為產生的異源雙螺旋的RnaseP降解作用。反義構建體不必編碼基本/包裝組分編碼基因的全長互補序列，其中一部分就足夠了。本領域技術熟練人員很容易就能確定如何設計合適的反義構建體。
外部指導序列(EGSs)是與互補靶序列結合從而在靶RNA序列中形成環的RNA序列，整個結構是RNaseP介導的靶RNA序列切割的底物。EGS與靶RNA退火形成的結構與tRNA前體中發現的非常相似。通過設計合適的EGS，可將RNaseP的天然活性導向切割靶RNA。設計EGS的通常原則如下，參照
圖13所示的一般性EGS。
哺乳動物細胞中EGS設計的原則(見
圖13)靶序列-所有tRNA前體分子在RNaseP切割位點3’之后緊接著G(即G與ACCA序列前受體莖頂端的C形成堿基對)。另外，在所有tRNA中，在8個核苷酸下游處有一U(即，G在第一位，U在第八位)。切割位點的5’端優選嘧啶。通常無需其他特異的靶序列。
EGS序列-7個核苷酸長的“受體莖”類似物是最理想的(5’雜交臂)。優選4個核苷酸長的‘D-莖’類似物(3’雜交臂)。此長度變化可能改變反應動力學。這將特異于各靶位點。共有的“T-莖和環”類似物是必需的。優選最小的5’和3’非配對序列以降低EGS RNA非所需折疊的可能性。
刪除“反密碼子莖和環”類似物可能是有益的。在體外可耐受可變環的刪除，但在體內對二者刪除的最適取代環仍未有詳細說明。進一步的指導可獲自文獻，例如，Werner等(1997)；Werner等(1998)；Ma等(1998)和Kawa等(1998)。
核苷酸序列通常是載體構建體的一部分，因此所說的載體構建體包含編碼與調控序列有效連接之抑制性RNA分子的第一核苷酸序列，該調控序列允許抑制性RNA分子在宿主細胞中表達。包括病毒載體構建體在內的載體構建體的進一步細節見下文B部分。
ii含報道構建體的第二核苷酸序列系統中第二核苷酸序列的基本功能是作為報道構建體。因此第二核苷酸序列包含編碼可檢測標記的編碼區。可檢測標記是其表達可被檢測的任何基因產物。例子包括lacZ綠色熒光蛋白和選擇標記。優選的可檢測標記是利用熒光激活細胞分揀術(FACS)可分揀的。
選擇標記通常是其表達或缺乏會影響細胞生存力的基因產物。這樣的例子包括抗諸如新霉素之類抗生素的抗性基因。尤其優選的例子包括直接或通過前體藥物轉換成毒性化合物而對細胞有毒的基因產物。后者的一個例子是將丙氧鳥苷之類的化合物轉變成細胞毒性化合物的胸苷激酶。因此優選第二核苷酸序列編碼在表達時能直接或于存在外來添加化合物的條件下降低細胞的生存力(包括引起細胞死亡)的基因產物。
第二核苷酸構建體的重要特征是，除編碼區外，還有至少一種第三核苷酸序列存在于編碼序列的上游或下游，這第三核苷酸序列預期用于檢測抑制性RNA分子的文庫。例如，第三核苷酸序列可能是病毒的一個組分，諸如逆轉錄病毒的組分，諸如編碼全部或部分gag.pol序列的序列。第三核苷酸序列在可檢測標記編碼序列上游或下游的存在意指，當由第一核苷酸序列編碼的一種抑制性RNA分子與第三核苷酸序列或其轉錄產物結合時，產生的相互作用可防止第二核苷酸序列的轉錄并/或引起第二核苷酸序列所產生之mRNA的穩定性降低，從而可檢測標記的表達減少或受到抑制。在胸苷激酶的例子里，TK表達的抑制消除了細胞對丙氧鳥苷的敏感性。因此，任何生存的細胞均不表達在丙氧鳥苷存在時足以引起細胞死亡的TK。在使用Tk/丙氧鳥苷時，優選同時施用狄氏劑以使由于細胞毒性化合物通過間隙連接進入鄰近細胞所產生的副作用最小化。類似的考慮也適用于具有副作用的其他細胞毒性化合物。
因此，第三核苷酸序列相對于編碼序列來定位，從而使其位于編碼序列及mRNA穩定性和/或翻譯所需序列之間。例如，第三核苷酸序列在轉錄mRNA中可以恰好位于5’帽的下游或3’polyA尾的上游。與其結合并引起5’帽和/或3’polyA尾切割的抑制性RNA分子將增強mRNA剩余部分的降解作用。因此，第三核苷酸序列通常將位于編碼可檢測標記之mRNA的5’和/或3’非翻譯區(UTR)內。
第三核苷酸序列可以是預期識別與其有效作用之抑制性RNA分子的任何核苷酸序列。因此，它可以編碼期望其表達被抑制或減少的基因產物全長或部分。這樣的基因產物可以包括其表達與疾病相關的哺乳動物細胞基因產物。或者，第三核苷酸序列可以編碼病原生物的組分，尤其是諸如逆轉錄病毒之類的病毒病原體，包括HIV。這樣的組分可以包括，例如，gag、pol或env或附屬因子。
至于第一核苷酸序列、含一個或多個第三核苷酸序列的第二核苷酸序列通常是B部分所述的核酸載體的一部分。
B.核酸載體第一和第二核苷酸序列通常存在于核酸載體中，它們可以是相同或不同的核酸載體，所說的第一類或第二核苷酸序列與允許其在宿主細胞中表達的調控序列有效連接。
術語“有效連接”意指所說組分之間處于允許其按各自預期方式發揮功能的關系之中。與編碼序列“有效連接”的調控序列是以這樣的方式與其連接的，即在與調控序列相容的條件下達到編碼序列的表達。
控制序列可以被修飾，例如添加額外的轉錄調節元件以使控制序列指導的轉錄水平更易受轉錄調節子的影響。
本發明的載體可被轉化或轉染進入下述合適宿主細胞中供抑制性RNA分子表達。選擇與所用宿主細胞相容的載體。
與抑制性RNA分子編碼序列有效連接的控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調節信號。選擇與表達載體預期使用的宿主細胞相容的控制序列。術語啟動子在本領域是眾所周知的，包括大小和復雜性在最小啟動子到含上游元件及增強子的啟動子之間變化的核酸區。
盡管也可使用在諸如昆蟲細胞之類其它真核細胞內有功能的啟動子，但通常選擇于哺乳動物細胞內有功能的啟動子。啟動子通常來源于病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是來自欲在其中進行表達的細胞的基因組。也可使用病毒啟動子，例如莫羅尼鼠白血病病毒長末端重復(MMLV LTR)啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人病毒(CMV)IE啟動子。
本發明方法中所用的載體可以是非病毒的，例如，質粒、染色體或人工染色體。典型的轉染方法包括電穿孔、DNA biolistics、脂質介導轉染、緊縮DNA介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂轉染、陽離子物質介導的轉染、陽離子表面兩性分子(cationic facialamphiphile，CFA)(自然生物技術(Nature Biotechnology)199614；556)及其它們的聯合使用。
或者，載體可以是病毒載體。病毒載體包括但不局限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。術語“病毒載體”指含有能在宿主細胞中轉錄之病毒基因組的核苷酸構建體，該基因組包含足夠的病毒遺傳信息，以允許病毒RNA基因組在包裝組分存在的條件下進行包裝，成為能感染靶細胞的病毒顆粒。靶細胞的感染包括逆轉錄并在對特殊病毒合適的位置整合進入靶細胞基因組。使用中的病毒載體通常攜帶將由載體運送至靶細胞的異源編碼序列(目的核苷酸)，例如編碼抑制性核酶的第一核苷酸序列。在最終的靶細胞內病毒載體不能獨立復制產生感染性的病毒顆粒。
術語“病毒載體系統”的意思是指一試劑盒，它可與產生病毒顆粒的其它必需組分聯合使用從而在宿主細胞內產生病毒顆粒。例如，第一核苷酸序列群通常可存在于適于將第一核苷酸序列克隆入病毒基因組載體構建體的質粒載體構建體中。當它們與第二核苷酸序列(報道構建體，可存在于另外的質粒載體構建體中)結合起來使用時，含第一核苷酸序列之質粒群與含第二核苷酸序列之質粒間的聯合包括本發明的基本元件。然后本領域的技術熟練人員可將這樣的試劑盒用于合適的病毒載體基因組構建體的生產中，該構建體在與質粒及任選的編碼病毒裝配所需其它組分的核酸構建體一起轉染進入宿主細胞時，將導致產生感染性病毒顆粒。
第二核苷酸序列也可作為與第一核苷酸構建體相同的載體構建體的一部分存在。以這種方式，可確保第一核苷酸序列和報道構建體(如TK基因)在任何個體細胞中的共表達。同樣的，病毒載體也可同時包含第一和第二核苷酸序列。
或者，第二核苷酸序列可以穩定存在于試劑盒所含之包裝細胞系中。
試劑盒可以包括產生病毒顆粒所需的其它組分，諸如宿主細胞和編碼病毒裝配所需之基本病毒多肽的其它質粒。舉例說來，試劑盒可以包含質粒群，這些質粒中含有編碼抗HIV核酶的第一核苷酸序列及編碼TK的第二核苷酸序列，以及與之有效連接并置于其5’和/或3’UTR內的第三核苷酸序列。任選的組分將是(a)具有合適限制性酶識別位點的HIV病毒基因組構建體，用于將第一和第二核苷酸序列克隆入病毒基因組中；(b)編碼VSV-G env蛋白質的質粒以及(c)編碼gag.pol的質粒。或者，編碼病毒顆粒裝配所需之病毒多肽的核苷酸序列可作為含這些核苷酸序列之包裝細胞系提供于試劑盒中，例如VSV-G表達細胞系。
病毒載體通常是逆轉錄病毒載體，尤其是諸如HIV載體之類的慢病毒載體。本發明的逆轉錄病毒載體可能來自或可以來自任何合適的逆轉錄病毒。許多不同的逆轉錄病毒已被鑒定。這樣的例子包括鼠白血病病毒(MLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T-細胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血癥病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓細胞瘤病毒-29(MC29)和禽成紅細胞增多癥病毒(AEV)。逆轉錄病毒的詳細名單可見文獻Coffin等，1997，“逆轉錄病毒(Retrovirus)”，冷泉港實驗室出版社，編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763頁。
本領域中可找到一些逆轉錄病毒詳細的遺傳結構。舉例說來，HIV和Mo-MLV的詳細結構可從NCBI基因庫中找到(基因組接受號分別為AF033819和AF033811)。
慢病毒組可進一步分為“靈長類”和“非靈長類”。靈長類慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)這種引起人自身免疫缺陷綜合癥(AIDS)的物質及猿免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒組包括原型“慢病毒”綿羊髓鞘脫落病毒(visna/maedi virus，VMV)，以及相關的山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)，馬傳染性貧血病毒(EIAV)，和最近所述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
逆轉錄病毒基因組的基本結構是5’LTR和3’LTR，在兩者之間或其中定位有包裝信號以使基因組可被包裝、引物結合位點、整合位點以使其能整合入宿主細胞基因組以及編碼包裝組分的gag、pol和env基因-這些都是病毒顆粒裝配所需的多肽。更復雜的逆轉錄病毒具有另外的特征，諸如在HIV中有rev和RRE序列，它們能使整合原病毒的RNA轉錄產物從所感染靶細胞的核中有效輸出到細胞質內。
在原病毒中，這些基因兩端是被稱為長末端重復片段(LTR)的區域。LTR負責原病毒的整合和轉錄。LTR還可用作增強子-啟動子序列并能控制病毒基因的表達。逆轉錄病毒RNA的衣殼化依賴于定位在病毒基因組5’端的psi序列。
LTR自身是可分為三個元件的相同序列，這些元件分別被稱為U3、R和U5。U3來自RNA 3’端獨特的序列。R來自RNA兩端重復的序列片段，而U5來自RNA 5’端的獨特序列。在不同的逆轉錄病毒之間這三個元件的大小可以有相當的變化。
在缺陷型逆轉錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可以缺失或無功能。RNA兩端的R區域是重復序列。U5和U3分別代表RNA基因組5’和3’末端的獨特序列。
在用于基因治療及/或分子生物學其它技術的典型逆轉錄病毒載體里，復制所必需的gag、pol和env蛋白編碼區中至少一個或多個部分可以從病毒中去除。這使得逆轉錄病毒載體成為復制缺陷型。甚至可用諸如第一核苷酸之類的目的核苷酸序列(NOI)替代被去除的部分，從而產生能將其基因組整合入宿主基因組的病毒，其中被修飾的病毒基因組由于缺乏結構蛋白質而不能增殖自身。在整合入宿主基因組時發生NOI表達-產生例如治療和/或診斷作用。因此，通常通過以下步驟將NOI轉移到目的位點將NOI整合入重組病毒載體；將被修飾的病毒載體包裝入病毒體衣殼中；轉導至目的位點-諸如靶細胞或靶細胞群中。
因此本發明所用的最小逆轉錄病毒基因組包含(5’)R-U5-第一核苷酸序列及/或第二核苷酸序列-U3-R(3’)。不過，用于在宿主細胞/包裝細胞內產生逆轉錄病毒基因組的質粒載體還包括與逆轉錄病毒基因組有效連接的轉錄調控序列，指導基因組在宿主細胞/包裝細胞中的轉錄。這些調控序列可以是與被轉錄的逆轉錄病毒序列相關的天然序列，即5’U3區域，或者它們可以是諸如另一病毒啟動子之類的異源啟動子，如CMV啟動子。
一些逆轉錄病毒基因組需要附加序列來有效產生病毒。例如，在HIV中，優選包含rev和RRE序列。不過對rev和RRE的需要可以通過密碼最優化被降低或消除。
一旦逆轉錄病毒載體基因組作為原病毒DNA整合入其靶細胞的基因組中，核酶序列就需要表達。在逆轉錄病毒中，啟動子定位于原病毒的5’LTR U3區。在逆轉錄病毒載體中，驅動異源基因表達的啟動子可以是在5’U3區的天然逆轉錄病毒啟動子，或者是通過基因工程引入載體的其它啟動子。此其它啟動子可以取代逆轉錄病毒自身的5’U3啟動子，或者它可以在載體基因組中的不同位置摻入，諸如在LTRs之間。
通過包裝或輔助細胞系與重組載體聯合使用，通常可增殖復制缺陷型逆轉錄病毒載體，從而例如制備合適滴度的逆轉錄病毒載體用于隨后的轉導。也就是說，三種包裝蛋白可反式提供。
“包裝細胞系”包含逆轉錄病毒gag、pol和env基因中的一個或多個。包裝細胞系產生包裝逆轉錄病毒DNA所需的蛋白質，但由于缺乏psi區，它不會引起衣殼化。不過，當攜帶NOI和psi區的重組載體被引入包裝細胞系時，輔助蛋白質可包裝psi陽性的重組載體以產生重組病毒原種。此病毒原種可用于轉導細胞以將NOI引入靶細胞的基因組中。因為已顯示這樣做提高了病毒的滴度，所以優選使用psi包裝信號，被稱為psi+，它包含從剪接供體上游延伸到gag起始密碼子下游的附加序列(Bender等，1987)。
基因組中缺乏所有制備病毒蛋白質所需基因的重組病毒只能轉導一次且不能遺傳。這些只能轉導靶細胞一個循環的病毒載體即為已知的復制缺陷型載體。因此，NOI被引入宿主/靶細胞基因組而不會產生潛在的有害逆轉錄病毒。關于可獲得的包裝細胞系的總結參閱文獻Coffin等，1997(同上)。
優選使用這樣的逆轉錄病毒包裝細胞系，其中gag、pol和env病毒編碼區攜帶于不同的表達質粒上，這些質粒被獨立轉染入包裝細胞系中。這一策略有時候被稱為三質粒轉染方法(Soneoka等，1995)，由于野生型病毒的產生需要進行三次重組，所以這一策略減少了產生能復制的病毒的可能性。因為同源性可大大促進重組，所以還可降低或消除載體基因組與輔助病毒基因組間的同源性來緩解能復制的輔助病毒產生的問題。
穩定轉染包裝細胞系的一個可選擇方案是使用瞬時轉染細胞系。在生產載體的時候，瞬時轉染可利于檢測載體產生的水平。在這一方面，瞬時轉染避免了產生穩定載體生產者細胞系所需的較長時間，且如果載體或逆轉錄病毒包裝組分對細胞有毒性，還可使用瞬時轉染的方法。通常用于產生逆轉錄病毒載體的組分包括編碼gal/pol蛋白質的質粒、編碼env蛋白質的質粒以及含NOI的質粒。載體的生產包括將這些組分中的一個或多個瞬時轉染入含其它必需組分的細胞。若載體編碼毒性基因或諸如細胞周期抑制物之類干擾宿主細胞復制的基因或誘發細胞凋亡的基因，就有可能難于產生穩定的載體生產者細胞系，但可使用瞬時轉染在細胞死亡前產生載體。此外，已利用瞬時轉染開發出了生產載體的滴度水平與穩定載體生產者細胞系的水平相似的細胞系。
生產者細胞/包裝細胞可以是任何合適的細胞類型。最通常使用的是哺乳動物生產者細胞，但也不排除使用諸如昆蟲細胞之類的其它細胞。明確的說，需要能有效翻譯env和gag、pol mRNA的生產者細胞。許多合適的生產者/包裝細胞系是本領域所已知的。本領域技術熟練人員還能通過，例如將編碼包裝組分的核苷酸構建體引入細胞系中而制備合適的包裝細胞系。
若逆轉錄病毒基因組中的第一核苷酸序列編碼欲檢測其完成gag、pol和/或env RNA轉錄產物切割的能力的抑制性RNA分子，則通過整合或質粒攜帶的方式存在于包裝細胞系或瞬時轉染的生產者細胞系中的gag、pol和/或env蛋白質編碼核苷酸序列可被修飾以減少或防止抑制性RNA分子的結合。以這種方式，抑制性RNA分子將不會阻止病毒顆粒包裝所必需的病毒多肽在包裝細胞系中的表達。明顯地，由于文庫的隨機特性，文庫中的一些序列仍然有可能切割被修飾的包裝組分，但因存在第三核苷酸序列及編碼相應包裝組分的序列之間的不同，影響被修飾包裝組分的抑制性分子不大可能也同時影響第三核苷酸序列，因此在許多情況下細胞將產生可檢測的標記并從篩選中被排除。
術語“病毒顆粒包裝所必需的病毒多肽”指通常由待包裝成病毒顆粒的病毒基因組編碼的多肽，缺乏它的時候病毒基因組不能包裝。例如，在逆轉錄病毒中這樣的多肽包括gag、pol和env。術語“包裝組分”和“必需組分”也包括在此定義范圍內。
以核酶為例，抗性通常是由于序列中消除了核酶識別位點的改變造成的。同時，仍保留必需/包裝組分的氨基酸編碼序列以便由此序列編碼的病毒組分保持相同或至少足夠的相似，從而使必需/包裝組分的功能不被損害。此外，由于第一核苷酸序列群常常隨機化的特性，可能需要對編碼包裝組分的核苷酸序列進行大量修飾。
在反義序列的情況下，第三核苷酸序列與編碼病毒包裝組分的核苷酸序列有一定程度的區別，以致盡管反義序列可與第三核苷酸序列或其轉錄本結合，但反義序列不能與編碼所需包裝組分的核苷酸序列或從其轉錄而來的RNA有效結合。盡管如上所述，在必需/包裝組分的功能不被顯著破壞的前提下，少數氨基酸的改變是可以容忍的，但第三核苷酸序列與編碼所需包裝組分的核苷酸序列之間的差異通常為保守的變化。
更通常的是，一種合適的方法可能為改變所需包裝組分的核苷酸序列以使與第三核苷酸序列相應區域的核苷酸同源性低于95％，優選少于90、80或70％，而氨基酸的同源性優選至少95％。
優選地，除了消除抑制性RNA的識別位點，病毒組分編碼序列的改變還可改善序列在哺乳動物細胞或其它細胞中的密碼子用法，所說的細胞用作產生逆轉錄病毒載體顆粒的生產者細胞。這種密碼子用法上的改善被稱為“密碼子優化”。包括HIV和其它慢病毒在內的許多病毒使用大量稀有密碼子，通過改變它們使其與通常使用的哺乳動物密碼子一致，可提高包裝組分在哺乳動物生產者細胞中的表達。哺乳動物及多種其它生物體中密碼子的使用表在本領域中是已知的。
因此優選的，編碼包裝組分的序列是經密碼子優化的。更優選的是該序列全部都經密碼子優化。密碼子優化后，發現在野生型gag、pol和env序列中有許多位點可用作抑制性RNA的識別位點且不再存在于編碼包裝組分的序列中。
密碼子優化HIV包裝組分的另一優點是，它可以提高基因的表達。尤其是，它可以使gag、pol的表達不依賴于Rev，從而rev和RRE無需包含在基因組中(Haas等，1996)。因此Rev非依賴型載體是有可能的。這又使得能夠在逆轉錄病毒載體中使用抗-rev或RRE因子。
在實驗和實際應用中都極希望使用高滴度的病毒制備品。提高病毒滴度的技術包括使用如上所述的psi+包裝信號及病毒原種的濃縮物。此外，使用不同的包膜蛋白質，諸如來自水泡性口炎病毒的G蛋白，已將濃縮之后的滴度提高至109/ml。不過，包膜蛋白通常經過選擇以使病毒顆粒優選感染被預期治療之病毒感染的細胞。例如，在HIV載體用于治療HIV感染的情況下，所用的env蛋白將是HIV env蛋白。
C.選擇方法本發明的選擇方法包括在第二核苷酸序列存在的情況下將一或多種第一核苷酸序列引入宿主細胞。將核酸引入宿主細胞的方法是本領域眾所周知的，例如轉染。一般說來，核苷酸序列是載體的一部分。第一和第二核苷酸序列可以是同一載體的部分或存在于不同的核酸分子上。第二核苷酸序列甚至可以穩定的引入宿主細胞基因組中。
若由第一核苷酸序列編碼的抑制性RNA分子抑制或減少可檢測標記的表達，那么就有可能將含這種分子的細胞與含有不能導致可檢測標記的表達被抑制或減少之第一核苷酸序列的細胞區分開。含有效的抑制性RNA分子的細胞可用于，例如，PCR反應中，以鑒定抑制性RNA分子的序列以及靶分子區域的序列。
如果可檢測標記是FACS可分揀的，那么就可從剩余細胞中選擇出含有效抑制性RNA分子的細胞。若可選擇標記是能將前體藥物轉變成細胞毒性化合物的酶，那么可基于它們對前體藥物的不敏感性將含有效抑制性RNA分子的細胞選擇出來。更具體地說，含有效抑制性RNA分子的細胞在用前體藥物篩選時能更好地存活。
在優選的實施方案中，用含第一核苷酸序列的病毒載體文庫方便地完成上述后一種選擇過程。病毒載體文庫被轉染入含編碼例如TK的第二核苷酸序列的生產者細胞中。通過施用前體藥物(例如，丙氧鳥苷)后仍存活而選擇出來的細胞通常含至少一種編碼有效抑制性RNA分子的第一核苷酸序列。進一步的可選步驟是從所說的細胞中收獲病毒顆粒并使用感染性的病毒顆粒來轉導更多的細胞。此額外步驟的好處在于，通常只有不切割必需病毒序列/包裝組分的第一核苷酸序列能成功地進行到此第二階段。此外，通過對獲自可生存細胞的病毒上清液進行一系列稀釋，有可能產生只含一種第一抑制性序列的生產者細胞，這將簡化通過PCR的鑒定。
應當指出的是，一些抑制性分子可能是由于其它原因引起細胞死亡，而非不能定向于第三核苷酸序列。例如，抑制分子可能引起細胞生存所必需的mRNA的降解。大體上，因為含所說分子的細胞將死亡，不需要針對隨機文庫中的這些元件進行選擇。
若第一核苷酸序列能結合并影響編碼可檢測標記之編碼區的切割，也有可能獲得假陽性。例如，若選擇過程取決于含有效抑制性RNA分子在用前體藥物選擇時的生存能力，如果抑制分子直接靶向于所編碼酶將前體藥物轉變成細胞毒性化合物的mRNA，就可能獲得假陽性。在尤其優選的實施方案中，選擇步驟包括去除編碼靶向于第二核酸中所用可檢測標記的序列的抑制分子的載體。
這可以，通過例如將第一核苷酸序列插入含編碼可檢測標記之非功能性核苷酸序列且缺少第三核苷酸序列的構建體中(“第四核苷酸序列”)中而完成。優選的，其它載體序列與含第二核苷酸序列之載體的序列是相同的。通常，已通過插入或刪除修飾編碼可檢測標記的核苷酸序列以阻止功能性可檢測標記的表達。除了使其無功能的突變外，無活性的可檢測標記其序列與第二類核酸中所用的可檢測標記序列是相同的。
然后可用此構建體產生病毒載體文庫以供初始的篩選階段使用。編碼具有以下特性的抑制分子的基因組將不能包裝成病毒顆粒(i)能與可檢測標記結合并引起其切割；(ii)影響含有它的病毒基因組；(iii)影響病毒包裝；或(iv)殺死細胞。因此可產生含預選第一核苷酸序列群的病毒庫，所選第一核苷酸序列群不會(i)引起可檢測標記的切割；(ii)對細胞生存有害，或(iii)抑制在選擇試驗中病毒的產生。
然后可如上所述在選擇循環中將此病毒庫用于轉導含第二核苷酸序列的細胞。
D.優化后的抑制性RNA分子的使用用本發明選擇方法鑒定的優化抑制性RNA分子，諸如核酶，可用于抑制其靶核苷酸序列或其轉錄產物在靶細胞中的表達。
例如，可將此用于消除體外或體內細胞中基因的表達，以研究通過諸如“敲除”實驗阻斷基因表達的效果。這樣的實驗是有用的，例如，用于目標確認、篩選或模型構建。
或者，由本發明選擇方法鑒定的優化抑制性RNA分子可用于治療應用中，諸如基因治療及RNA的直接施用。尤其是，定向于編碼病原基本組分之靶核苷酸序列的優化抑制性RNA分子可用于治療由所說病原體引起的疾病。因此定向于HIV組分的優化抑制性RNA分子可用于減輕或防止HIV感染或相關癥狀。
因此含編碼優化抑制性RNA分子之核苷酸序列的核酸載體可用于治療或防止病毒感染，優選逆轉錄病毒感染，特別是慢病毒，尤其是HIV的感染。特別是，可將所說的核酸載體用于運送抑制性RNA分子至需要治療病毒感染的人或動物中。核酸載體包括病毒載體和由此獲得的傳染性病毒顆粒。若病毒載體包含選定的靶向于病原性病毒組分的第一核苷酸序列，所說的組分也是含所選第一核苷酸序列之傳染性病毒顆粒產生所需要的，則在包裝/生產者細胞中此組分的核苷酸序列通常將如上所述被修飾。尤其是，在參考實施例中給出了關于核酶及被修飾逆轉錄病毒env和gag.pol序列的使用指導。
HIV-1為開發抵抗HIV-1感染的策略提供了理想的載體。這是因為可利用除去了開放閱讀框架并由反式生產的病毒顆粒包裝的基因組(因此是非病原性的，但仍然具免疫原性)運送抗HIV分子，如核酶、intra-bodies、intra-kines、RNA decoys和/或反式顯性突變蛋白質(trans-dominant mutated Protein).
若保留剪接供體和剪接受體位點，則可用一個病毒構建體產生8個以上獨特的抗HIV因子。例如，可用定向于Tat的核酶取代Tat閱讀框架，用tat反式顯性突變體取代nef閱讀框架。
諸如核酶之類的抑制性RNA分子將是這一系統的重要組分。
優選將核酸載體/病毒顆粒與藥用可接受載體或稀釋液結合以產生藥物組合物。因此，本發明還提供了用于治療個體的藥用混合物，其中該混合物含治療有效量的本發明核酸載體/病毒顆粒以及藥用可接受載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。此藥用混合物可用于人或動物。
可按用藥的預期路徑及標準的制藥實踐選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽水。藥物組合物可包括載體、賦形劑或稀釋劑，或除此之外還有任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被物質、增溶劑及其它能幫助或提高病毒進入靶位點的載體試劑(例如脂質送遞系統)。
藥物組合物可配制成非腸道、肌肉內、靜脈內、顱內、皮下、眼內或穿皮施用的藥物。
在合適的情況下，藥物組合物可通過以下形式中的任一種或多種施用吸入劑；栓劑或子宮托的形式；通過洗劑、溶液、乳霜、油膏或粉劑而從表面施用的形式；利用皮膚貼片；以含淀粉或乳糖之類賦形劑的藥片形式口服，單獨或與賦形劑混合含于膠囊或卵形小體中；或以含香料或色素的酏劑、溶液或懸浮液形式施用；或它們可通過非腸道的形式注射用藥，例如海綿體內(intra cavernosally)、靜脈內、肌肉內或皮下注射。對于非腸道用藥來說，組合物最好以無菌水溶液的形式施用，其中可以包含其它物質，例如足夠的鹽或單糖以使溶液與血液等滲。對于經頰或舌下用藥來說，組合物可以片劑或錠劑的形式施用，它們可按傳統方法配制。
施用病毒的量一般在103-1010pfu的范圍內，優選105-108pfu，更優選106-107pfu。注射時，通常施用1-10μl在藥用可接受載體或稀釋液中的病毒。
當多核苷酸/載體以裸核酸形式施用時，施用核酸的量通常在1μg-10mg的范圍內，優選100μg-1mg。
當用本發明方法所選的第一核苷酸序列(或其它治療性序列)在可誘導調控序列控制下時，可能只需在治療的持續期間誘導基因表達。一旦疾病治愈了，誘導劑被去除，核苷酸序列的表達終止。這一點具有明顯的臨床優勢。這樣的系統可以包括例如施用抗生素類的四環素，通過其在tet阻遏子/VP16融合蛋白上的作用激活基因表達。
E.體內選擇的方法一方面，本發明提供了鑒定mRNA分子上開放位點的方法。
術語“開放”是指mRNA處于其生理學構象時，核酶、反義RNA或EGS之類抑制性RNA分子容易接近的位點。
利用本發明的選擇系統，mRNA由第三核苷酸序列編碼。例如，若此第三核苷酸序列是完整的基因，則選擇系統可用于鑒定相應mRNA分子上的一個或多個開放位點。一旦抑制性RNA分子(諸如核酶、反義RNA或EGS)已用該選擇系統鑒定為能與第三核苷酸序列結合，則利用標準技術就可推斷出靶位點。例如，若抑制分子是反義序列，則此反義序列之“最適”互補序列和mRNA序列之間的序列比較可揭示反義序列與mRNA結合的位點。
下文將通過實施例對本發明進行進一步的描述，這是為了幫助本領域的常規技術人員進行本發明的操作，絕非對本發明范圍的限制。實施例參照圖示。在附圖中
圖1.前體藥物劑量應答-生存百分率對前體藥物濃度的曲線圖A.大腸桿菌硝基還原酶(nitroreductase，NTR)/滅滴靈(MTZ)；B.HSV-1胸苷激酶(TK)/丙氧鳥苷(GCV)。圖2.副作用-生存百分率對前體藥物濃度的曲線圖A.NTR/MTZ；B.TK/GCV。圖3顯示含CTKtatSN的HeLa細胞系存活百分率的柱形圖，所述細胞系已用pH4Z(tat-4Z)、催化活性位點去除的抗tat核酶(tat-RzM)或抗tat核酶(tat-Rz)轉導。細胞已與GCV或GCV和狄氏劑溫育。圖4顯示載體基因組的圖示說明。圖5示意性的顯示插入四個不同HIV載體的核酶。圖6示意性的顯示如何通過PCR構建合適的3’LTR。圖7顯示HXB2菌株(接收號K03455)的野生型HIVgag、pol的密碼子使用表。圖8顯示指定為gag、pol-SYNgp的密碼子最優化序列的密碼子使用表。圖9顯示被稱為env-mn的野生型HIV env的密碼子使用表。
圖10顯示指定為SYNgp160mn的HIV env密碼子最優化序列的密碼子使用表。
圖11顯示本發明所用的三種質粒構建體。
圖12顯示用于生產逆轉錄病毒載體顆粒的兩系統的原理。
圖13A、B-外部指導序列的設計。
本發明將通過以下實施例得到進一步的描述，但這只作為說明而非對本發明范圍的限制。
實施例本發明的發明者已開發了一種以核酶文庫產生為基礎的方法，其中的核酶均含有錘頭狀核酶的催化結構域。步驟包括產生這樣的病毒，其基因組含編碼自殺基因(優選胸苷激酶(TK))的核苷酸序列。靶序列插入其下游。或者，或另外，若內部核糖體進入位點(IRES)插入TK序列的上游，那么靶序列可插入它的上游。用此載體轉導的細胞將對丙氧鳥苷敏感。
不過，當病毒基因組被轉錄時，mRNA不僅含TK基因，還含有靶序列。此mRNA將包含正常的5’帽和3’polyA尾。如果用核酶切割去除5’帽和polyA尾，mRNA就不穩定并被降解。這就防止了TK基因的翻譯，使得表達活性核酶的細胞對丙氧鳥苷不敏感。實施例1-前體藥物系統的選擇(可選擇標記)本發明的第二核苷酸編碼可檢測標記。我們已選擇用酶-前體藥物選擇系統對本發明進行舉例說明。檢測兩個著名的酶-前體藥物組合的劑量應答來選擇有效的前體藥物系統。
A.大腸桿菌硝基還原酶(NTR)/滅滴靈(MTZ)聯合作用將HT1080細胞(NTR-)和HT1080 NTR陽性細胞(NTR+)與各種不同濃度的MTZ一起保溫，檢測存活細胞的百分數(
圖1A)。
B.HSV-1胸苷激酶(TK)/丙氧鳥苷(GCV)的聯合作用用GCV處理以多種病毒載體轉導的HeLa細胞系72小時，檢測存活細胞的百分數(見
圖1B)。CXSN＝空病毒載體，CTKSN＝TK陽性病毒，CTKmSN＝TK突變病毒，CTKtatSN＝活性TK基因下游含HIV-1 tat基因ORF的載體(圖4D)。CTKenvSN＝活性TK基因下游含HIV-1 env基因ORF的載體。從pHIT111.C中去除lacZ基因制備成CXSN。C＝代替5’U3的CMV啟動子，X＝克隆位點，用于基因插入，S＝SV40啟動子，而N＝新霉素抗性基因。Tk＝胸苷激酶。TKm＝胸苷激酶突變體。
這些結果顯示，用TK/GCV系統可以獲得更好的敏感性。不過，TK/GCV系統產生了一定的副作用。一般說來，所用藥物應不具有副作用，即引起在表達可激活前體藥物的酶的細胞周圍的細胞死亡。副作用是由于活性形式的前體藥物或穿過原生質膜進入周圍細胞或通過縫隙連接進入其它細胞造成的。以GCV為例，副作用是由于藥物通過縫隙連接穿過所引起的。幸運的是，這些縫隙連接可用藥物狄氏劑阻斷并因而限制了副作用(Touraine等，1998)。
圖2顯示了上述兩個酶/前體藥物系統的副作用。在圖2A中，將HT1080 NTR陽性穩定細胞系與HT1080細胞在10mM MTZ中共培養24小時。在圖2B中，將HeLa TK穩定細胞系與HeLa細胞同GCV在狄氏劑(16μg/ml)存在或缺乏的情況下共培養72小時。
從此數據明顯可知，用狄氏劑可將TK/GCV的副作用降低到最低。
因此，我們選擇使用HSV-1 TK/GCV/狄氏劑，而不優先選擇不具有副作用的NTR/滅滴靈(MTZ)，因為TK/GCV在辨別細胞有無此酶上更敏感(
圖1A、1B)。研究中所用GCV的量是如
圖1所確定的3μg/ml。實施例2-利用錘頭狀核酶進行體內選擇用隨機寡核苷酸合成產生錘頭狀核酶的文庫。然后將它們插入失活Tk編碼序列下游的CTKmSN(圖4B)中，得到許多酶(CTKmRzLB-圖4C)。
通過去除pHIT111的lacZ(Soneoka等，1995)得到中間構建體CKSN(圖4A)，然后在其中插入由移碼突變(在BsP EI位點切除并重新填入)構建的失活TK編碼序列，從而構建成CTKmSN(圖4B)。在文獻Wagner等，1981(基因庫接受號V00467)中提供了人皰疹病毒1的序列。
必需在失活形式的酶下游插入文庫以保證在載體文庫中不含可切割含TK之RNA的核酶(由此會在選擇中導致假陽性)。通過三質粒共轉染系統(Soneoka等，1995)產生病毒并用于轉導HeLa細胞。在暴露于GCV中后檢測存活細胞以評估突變體的活性。
在病毒載體CTKSN(圖4B)中活性形式酶的下游插入靶RNA序列，制備CTKXSN，其中X＝靶序列(圖4C)。在CXSN(圖4A)中插入TK序列制備CTKSN。三質粒共轉染后將病毒用于轉導細胞，諸如NIH3T3、HeLa之類的細胞或其它細胞。選擇HeLa細胞使副作用降低到最低程度(HeLa細胞具有低百分率的縫隙-連接聯系，而GCV的副作用是由于單磷酸鳥苷類似物穿過縫隙連接的傳送造成的)。狄氏劑也可用于減少副作用。
通過新霉素選擇(G418，1mg/ml，10天)產生穩定的細胞系。這些細胞系現可用含核酶文庫(CTKmRxLB)的載體轉導，隨后進行GCV選擇。任何切割HIV序列的核酶都將防止TK的翻譯，從而細胞可存活。所有的其它細胞將由于保留了功能性TK而死亡。然后可用PCR方法得到核酶序列。實施例3-用最優化的核酶進行體內檢測按實施例1得到的最優化核糖體可用于治療疾病。尤其是，這些核酶中有許多可串聯使用，從而定向于多個位點。此外，在HIV的治療中，可用HIV載體運送核酶，因為這將引起對野生型基因組包裝的干擾作用。
為了檢測此方法的可行性，我們對tat穩定細胞系檢測了抗tat核酶。如圖3所示，有可能選擇出含功能型核酶的細胞。同時清楚的表明需消除副作用才能進行這樣的選擇。
此技術可用于尋找對HIV基因組的全部或部分具特異性的核酶。此外，該方法提供了體內分離任何靶RNA相關核酶的途徑。
參考實施例1-攜帶核酶的基因組的構建
HIVgag.pol序列經密碼子最優化(圖8和SEQ I.D.No.1)并用約40個核苷酸左右的重疊寡核苷酸合成。這有三個優點。首先，它允許基于HIV的載體攜帶核酶及其他治療因子。其次，密碼子最優化可由于較高水平的基因表達而產生較高水平的載體滴度。第三，gag.pol表達變成于rev非依賴型的，這樣就允許使用抗rev或RRE因子。
參照洛斯阿莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory)的HIV序列數據庫(http//hiv-web.lanl.gov)鑒別gag.pol中的保守序列并用于設計核酶。由于HIV-1亞型之間的可變性，核酶被設計成可切割北美、拉丁美洲和加勒比、歐洲、日本及澳大利亞中的主要亞型，即亞型B。所選序列與合成的gagpol序列前后對照以保證切斷密碼子最優化的gagpolmRNA的可能性較低。核酶的5’和3’末端分別設計成XhoI和SalI位點。這樣就允許進行分離和串聯的核酶的構建。
核酶為錘頭狀結構，大體結構如下螺旋I 螺旋II 螺旋III5′-NNNNNNNN～CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA～NNNNNNNN～核酶的催化結構域(螺旋II)可耐受一些改變而不降低其催化轉換數。
具有基本GUX三聯體、定向于gag和pol的切割位點如下(其中X是任何核苷酸堿基)GAG 1 5′ UAGUAAGAAUGUAUAGCCCUACGAG 2 5′ AACCCAGAUUGUAAGACUAUUUGAG 3 5′ UGUUUCAAUUGUGGCAAAGAAGGAG 4 5′ AAAAAGGGCUGUUGGAAAUGUGPOL 1 5′ ACGACCCCUCGUCACAAUAAAGPOL 2 5′ GGAAUUGGAGGUUUUAUCAAAGPOL 3 5′ AUAUUUUUCAGUUCCCUUAGAUPOL 4 5′ UGGAUGAUUUGUAUGUAGGAUCPOL 5 5′ CUUUGGAUGGGUUAUGAACUCCPOL 6 5′ CAGCUGGACUGUCAAUGACAUAPOL 7 5′ AACUUUCUAUGUAGAUGGGGCAPOL 8 5′ AAGGCCGCCUGUUGGUGGGCAG
POL 9 5′ UAAGACAGCAGUACAAAUGGCA將核酶插入4種不同的HIV載體中(pH4(Gervaix等，1997)、pH6、pH4.1.或pH6.1)(圖5)。在pH4和pH6中，由內部HCMV啟動子驅動核酶的轉錄(Foecking和Hofstetter，1986)。對于pH4.1和pH6.1，核酶自5’LTR表達。pH4和pH6(及pH4.1和pH6.1)之間的主要不同在于生產質粒的3’LTR中。pH4和pH4.1在3’LTR中具有HIV U3。pH6和pH6.1在3’LTR中具有HCMV。HCMV啟動子取代大部分U3，將驅動高水平的組成型表達，而HIV-1 U3只在Tat存在時才支持高水平的表達。
用三個PCR引物進行重組PCR建立HCMV/HIV-1雜合3’LTR(圖6)。用RIB1和RIB2進行第一輪PCR，以pH4(Kim等，1998)為模板擴增HIV-1HXB2序列8900-9123。第二輪PCR循環通過從pH4中擴增雜合5’LTR造成了HIV-1 U3 5’末端和HCMV啟動子之間的連接。第一輪PCR反應的產物及RIB3分別用作5’和3’引物。
RIB1 5′-CAGCTGCTCGAGCAGCTGAAGCTTGCATGC-3′RIB2 5′-GTAAGTTATGTAACGGACGATATCTTGTCTTCTT-3′RIB3 5′-CGCATAGTCGACGGGCCCGCCACTGCTAGAGATTTTC-3′然后用SphI和SalI切割PCR產物并插入pH4中，從而取代3’LTR。產生的質粒稱為pH6。為了構建pH4.1和pH6.1，用Bluescript II KS+(Stratagene)的多克隆位點(SpeI-XhoI)取代pH4和pH6中的內在HCMV啟動子(SpeI-XhoI)。
核酶被插入基因組載體骨架中的XhoI位點。任何形狀的任何核酶都可以相似方式使用。
參照實施例2-包裝系統的構建包裝系統可采用多種形式。在第一種形式的包裝系統中，HIVgag、pol組分與HIV env編碼序列共表達。這種情況下，gag.pol和env編碼序列都被改變以便它們耐受插入基因組的抗HIV核酶。改變密碼子用法獲得耐受性的同時，可以選擇與哺乳動物基因最高表達使用模式相配的密碼子。這顯著提高了表達水平(Schneider等，1997；Schwartz等，1992)，并因此提高了滴度。經密碼子最優化的HIV env編碼序列參見文獻Haas等(1996)。在本實施例中，使用了修飾后的密碼子最優化HIV env序列(SEQ I.D.No.3)。相應的env表達質粒命名為pSYNgp160mn。修飾后的序列包含Haas等沒有使用的附加基元。附加序列來自MN株的HIV env序列并經密碼子最優化。只要使用相應于豐富tRNA的密碼子(Zolotukhin等，1996)，核酸序列的任何類似修飾都將具有類似功能，并導致對基因組中核酶的抗性。
在具最優化密碼子用法的gag.pol編碼序列的一個例子中，合成重疊寡核苷酸，隨后連接在一起，從而產生合成的編碼序列。野生型序列(基因庫接收號K03455)和合成(gagpol-SYNgp)gagpol序列分別如SEQ I.D.No.1和2所示，它們的密碼子用法分別見圖7和8。野生型env編碼序列的序列(基因庫接收號M17449)見SEQ I.D.No.3，合成的密碼子最優化序列見SEQ I.D.No.4，它們的密碼子用法表分別見圖9和10。與env編碼序列一樣，任何可獲得核酶抗性的gag.pol序列均可使用。所示的合成序列被稱為gag.pol-SYNgp，其在5’末端具有EcoRI位點，在3’末端具有NotI位點。它被插入pClneo(Promega)，產生質粒pSYNgp。
在第二種形式的包裝系統中，合成的gag.pol盒與產生假HIV表面蛋白質的非HIV包膜編碼序列共表達。這可以是，例如VSV-G(Ory等，1996；Zhu等，1990)、兼嗜性MLV env(Chesebro等，1990；Spector等，1990)或任何可摻入HIV顆粒的其它蛋白質(Valsesia Wittmann等，1994)。這包括能將載體靶向于特異組織的分子。非HIV包膜蛋白質的編碼序列不被核酶切割，因此無需序列修飾(盡管由于其它原因可能期望有一些序列修飾，諸如哺乳動物細胞中密碼子使用的最優化)。
參照實施例3-載體顆粒生產載體顆粒可由與Soneoka等(1995)所述相似的瞬時三質粒轉染系統或與其它逆轉錄病毒載體所用相似的生產者細胞系(Ory等，1996；Srinivasakumar等，1997；Yu等，1996)生產。這些原理如
圖11和12所述。例如，如Soneoka等(1995)所述，用pH6Rz、pSYNgp和pRV67(VSV-G表達質粒)在293T細胞的三質粒轉染(
圖12)中產生被命名為H6Rz-VSV的載體顆粒。這樣將H6Rz基因組轉導至諸如C1866或Jurkat之類的CD4+細胞中，產生多目標核酶。在這些細胞中的HIV復制從此時起被嚴格限制了。
所有以上說明書中所提及的文獻在此均引入作為參考。在不背離本發明范圍和精神的原則下，本發明所述方法和系統的多種修飾和變化對本領域技術熟練人員是顯而易見的。盡管用特別優選的實施例對本發明進行了描述，但應當理解為要求專利保護的本發明不應只局限于所說的實施方案。事實上，為進行本發明而做的所述模式的多種修飾對分子生物學或相關領域內的技術熟練人員是顯而易見的，它們也在以下權利要求的范圍內。
說明的序列表部分SEQ.ID.NO.1-HXB2株的野生型gagpol序列(接收號K03455)ATGGGTGCGA GAGCGTCAGT ATTAAGCGGG GGAGAATTAG ATCGATGGGA AAAAATTCGG 60TTAAGGCCAG GGGGAAAGAA AAAATATAAA TTAAAACATA TAGTATGGGC AAGCAGGGAG 120CTAGAACGAT TCGCAGTTAA TCCTGGCCTG TTAGAAACAT CAGAAGGCTG TAGACAAATA 180CTGGGACAGC TACAACCATC CCTTCAGACA GGATCAGAAG AACTTAGATC ATTATATAAT 240ACAGTAGCAA CCCTCTATTG TGTGCATCAA AGGATAGAGA TAAAAGACAC CAAGGAAGCT 300TTAGACAAGA TAGAGGAAGA GCAAAACAAA AGTAAGAAAA AAGCACAGCA AGCAGCAGCT 360GACACAGGAC ACAGCAATCA GGTCAGCCAA AATTACCCTA TAGTGCAGAA CATCCAGGGG 420CAAATGGTAC ATCAGGCCAT ATCACCTAGA ACTTTAAATG CATGGGTAAA AGTAGTAGAA 480GAGAAGGCTT TCAGCCCAGA AGTGATACCC ATGTTTTCAG CATTATCAGA AGGAGCCACC 540CCACAAGATT TAAACACCAT GCTAAACACA GTGGGGGGAC ATCAAGCAGC CATGCAAATG 600TTAAAAGAGA CCATCAATGA GGAAGCTGCA GAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATGCA 660GGGCCTATTG CACCAGGCCA GATGAGAGAA CCAAGGGGAA GTGACATAGC AGGAACTACT 720AGTACCCTTC AGGAACAAAT AGGATGGATG ACAAATAATC CACCTATCCC AGTAGGAGAA 780ATTTATAAAA GATGGATAAT CCTGGGATTA AATAAAATAG TAAGAATGTA TAGCCCTACC 840AGCATTCTGG ACATAAGACA AGGACCAAAG GAACCCTTTA GAGACTATGT AGACCGGTTC 900TATAAAACTC TAAGAGCCGA GCAAGCTTCA CAGGAGGTAA AAAATTGGAT GACAGAAACC 960TTGTTGGTCC AAAATGCGAA CCCAGATTGT AAGACTATTT TAAAAGCATT GGGACCAGCG 1020GCTACACTAG AAGAAATGAT GACAGCATGT CAGGGAGTAG GAGGACCCGG CCATAAGGCA 1080AGAGTTTTGG CTGAAGCAAT GAGCCAAGTA ACAAATTCAG CTACCATAAT GATGCAGAGA 1140GGCAATTTTA GGAACCAAAG AAAGATTGTT AAGTGTTTCA ATTGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200ACAGCCAGAA ATTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGTT GGAAATGTGG AAAGGAAGGA 1260CACCAAATGA AAGATTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440AAGGAACTGT ATCCTTTAAC TTCCCTCAGG TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500TAAAGATAGG GGGGCAACTA AAGGAAGCTC TATTAGATAC AGGAGCAGAT GATACAGTAT 1560TAGAAGAAAT GAGTTTGCCA GGAAGATGGA AACCAAAAAT GATAGGGGGA ATTGGAGGTT 1620TTATCAAAGT AAGACAGTAT GATCAGATAC TCATAGAAAT CTGTGGACAT AAAGCTATAG 1680GTACAGTATT AGTAGGACCT ACACCTGTCA ACATAATTGG AAGAAATCTG TTGACTCAGA 1740TTGGTTGCAC TTTAAATTTT CCCATTAGCC CTATTGAGAC TGTACCAGTA AAATTAAAGC 1800CAGGAATGGA TGGCCCAAAA GTTAAACAAT GGCCATTGAC AGAAGAAAAA ATAAAAGCAT 1860TAGTAGAAAT TTGTACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT TTCAAAAATT GGGCCTGAAA 1920ATCCATACAA TACTCCAGTA TTTGCCATAA AGAAAAAAGA CAGTACTAAA TGGAGAAAAT 1980TAGTAGATTT CAGAGAACTT AATAAGAGAA CTCAAGACTT CTGGGAAGTT CAATTAGGAA 2040TACCACATCC CGCAGGGTTA AAAAAGAAAA AATCAGTAAC AGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100CATATTTTTC AGTTCCCTTA GATGAAGACT TCAGGAAGTA TACTGCATTT ACCATACCTA 2160GTATAAACAA TGAGACACCA GGGATTAGAT ATCAGTACAA TGTGCTTCCA CAGGGATGGA 2220AAGGATCACC AGCAATATTC CAAAGTAGCA TGACAAAAAT CTTAGAGCCT TTTAGAAAAC 2280AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACA TGGATGATTT GTATGTAGGA TCTGACTTAG 2340AAATAGGGCA GCATAGAACA AAAATAGAGG AGCTGAGACA ACATCTGTTG AGGTGGGGAC 2400TTACCACACC AGACAAAAAA CATCAGAAAG AACCTCCATT CCTTTGGATG GGTTATGAAC 2460TCCATCCTGA TAAATGGACA GTACAGCCTA TAGTGCTGCC AGAAAAAGAC AGCTGGACTG 2520TCAATGACAT ACAGAAGTTA GTGGGGAAAT TGAATTGGGC AAGTCAGATT TACCCAGGGA 2580TTAAAGTAAG GCAATTATGT AAACTCCTTA GAGGAACCAA AGCACTAACA GAAGTAATAC 2640CACTAACAGA AGAAGCAGAG CTAGAACTGG CAGAAAACAG AGAGATTCTA AAAGAACCAG 2700TACATGGAGT GTATTATGAC CCATCAAAAG ACTTAATAGC AGAAATACAG AAGCAGGGGC 2760AAGGCCAATG GACATATCAA ATTTATCAAG AGCCATTTAA AAATCTGAAA ACAGGAAAAT 2820ATGCAAGAAT GAGGGGTGCC CACACTAATG ATGTAAAACA ATTAACAGAG GCAGTGCAAA 2880AAATAACCAC AGAAAGCATA GTAATATGGG GAAAGACTCC TAAATTTAAA CTGCCCATAC 2940AAAAGGAAAC ATGGGAAACA TGGTGGACAG AGTATTGGCA AGCCACCTGG ATTCCTGAGT 3000GGGAGTTTGT TAATACCCCT CCCTTAGTGA AATTATGGTA CCAGTTAGAG AAAGAACCCA 3060TAGTAGGAGC AGAAACCTTC TATGTAGATG GGGCAGCTAA CAGGGAGACT AAATTAGGAA 3120AAGCAGGATA TGTTACTAAT AGAGGAAGAC AAAAAGTTGT CACCCTAACT GACACAACAA 3180ATCAGAAGAC TGAGTTACAA GCAATTTATC TAGCTTTGCA GGATTCGGGA TTAGAAGTAA 3240ACATAGTAAC AGACTCACAA TATGCATTAG GAATCATTCA AGCACAACCA GATCAAAGTG 3300AATCAGAGTT AGTCAATCAA ATAATAGAGC AGTTAATAAA AAAGGAAAAG GTCTATCTGG 3360CATGGGTACC AGCACACAAA GGAATTGGAG GAAATGAACA AGTAGATAAA TTAGTCAGTG 3420CTGGAATCAG GAAAGTACTA TTTTTAGATG GAATAGATAA GGCCCAAGAT GAACATGAGA 3480AATATCACAG TAATTGGAGA GCAATGGCTA GTGATTTTAA CCTGCCACCT GTAGTAGCAA 3540AAGAAATAGT AGCCAGCTGT GATAAATGTC AGCTAAAAGG AGAAGCCATG CATGGACAAG 3600TAGACTGTAG TCCAGGAATA TGGCAACTAG ATTGTACACA TTTAGAAGGA AAAGTTATCC 3660TGGTAGCAGT TCATGTAGCC AGTGGATATA TAGAAGCAGA AGTTATTCCA GCAGAAACAG 3720GGCAGGAAAC AGCATATTTT CTTTTAAAAT TAGCAGGAAG ATGGCCAGTA AAAACAATAC 3780ATACTGACAA TGGCAGCAAT TTCACCGGTG CTACGGTTAG GGCCGCCTGT TGGTGGGCGG 3840GAATCAAGCA GGAATTTGGA ATTCCCTACA ATCCCCAAAG TCAAGGAGTA GTAGAATCTA 3900TGAATAAAGA ATTAAAGAAA ATTATAGGAC AGGTAAGAGA TCAGGCTGAA CATCTTAAGA 3960CAGCAGTACA AATGGCAGTA TTCATCCACA ATTTTAAAAG AAAAGGGGGG ATTGGGGGGT 4020ACAGTGCAGG GGAAAGAATA GTAGACATAA TAGCAACAGA CATACAAACT AAAGAATTAC 4080AAAAACAAAT TACAAAAATT CAAAATTTTC GGGTTTATTA CAGGGACAGC AGAAATTCAC 4140TTTGGAAAGG ACCAGCAAAG CTCCTCTGGA AAGGTGAAGG GGCAGTAGTA ATACAAGATA 4200ATAGTGACAT AAAAGTAGTG CCAAGAAGAA AAGCAAAGAT CATTAGGGAT TATGGAAAAC 4260AGATGGCAGG TGATGATTGT GTGGCAAGTA GACAGGATGA GGATTAG 4307SEQ.ID.NO.2-gagpol-SYNgp-密碼子最優化的gagpol序列ATGGGCGCCC GCGCCAGCGT GCTGTCGGGC GGCGAGCTGG ACCGCTGGGA GAAGATCCGC 60CTGCGCCCCG GCGGCAAAAA GAAGTACAAG CTGAAGCACA TCGTGTGGGC CAGCCGCGAA 120CTGGAGCGCT TCGCCGTGAA CCCCGGGCTC CTGGAGACCA GCGAGGGGTG CCGCCAGATC 180CTCGGCCAAC TGCAGCCCAG CCTGCAAACC GGCAGCGAGG AGCTGCGCAG CCTGTACAAC 240ACCGTGGCCA CGCTGTACTG CGTCCACCAG CGCATCGAAA TCAAGGATAC GAAAGAGGCC 300CTGGATAAAA TCGAAGAGGA ACAGAATAAG AGCAAAAAGA AGGCCCAACA GGCCGCCGCG 360GACACCGGAC ACAGCAACCA GGTCAGCCAG AACTACCCCA TCGTGCAGAA CATCCAGGGG 420CAGATGGTGC ACCAGGCCAT CTCCCCCCGC ACGCTGAACG CCTGGGTGAA GGTGGTGGAA 480GAGAAGGCTT TTAGCCCGGA GGTGATACCC ATGTTCTCAG CCCTGTCAGA GGGAGCCACC 540CCCCAAGATC TGAACACCAT GCTCAACACA GTGGGGGGAC ACCAGGCCGC CATGCAGATG 600CTGAAGGAGA CCATCAATGA GGAGGCTGCC GAATGGGATC GTGTGCATCC GGTGCACGCA 660GGGCCCATCG CACCGGGCCA GATGCGTGAG CCACGGGGCT CAGACATCGC CGGAACGACT 720AGTACCCTTC AGGAACAGAT CGGCTGGATG ACCAACAACC CACCCATCCC GGTGGGAGAA 780ATCTACAAAC GCTGGATCAT CCTGGGCCTG AACAAGATCG TGCGCATGTA TAGCCCTACC 840AGCATCCTGG ACATCCGCCA AGGCCCGAAG GAACCCTTTC GCGACTACGT GGACCGGTTC 900TACAAAACGC TCCGCGCCGA GCAGGCTAGC CAGGAGGTGA AGAACTGGAT GACCGAAACC 960CTGCTGGTCC AGAACGCGAA CCCGGACTGC AAGACGATCC TGAAGGCCCT GGGCCCAGCG 1020GCTACCCTAG AGGAAATGAT GACCGCCTGT CAGGGAGTGG GCGGACCCGG CCACAAGGCA 1080CGCGTCCTGG CTGAGGCCAT GAGCCAGGTG ACCAACTCCG CTACCATCAT GATGCAGCGC 1140GGCAACTTTC GGAACCAACG CAAGATCGTC AAGTGCTTCA ACTGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200ACAGCCCGCA ACTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGCT GGAAATGCGG CAAGGAAGGC 1260CACCAGATGA AAGACTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440AAGGAACTGT ATCCTTTAAC TTCCCTCAGA TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500TAAAGATAGG GGGGCAGCTC AAGGAGGCTC TCCTGGACAC CGGAGCAGAC GACACCGTGC 1560TGGAGGAGAT GTCGTTGCCA GGCCGCTGGA AGCCGAAGAT GATCGGGGGA ATCGGCGGTT 1620TCATCAAGGT GCGCCAGTAT GACCAGATCC TCATCGAAAT CTGCGGCCAC AAGGCTATCG 1680GTACCGTGCT GGTGGGCCCC ACACCCGTCA ACATCATCGG ACGCAACCTG TTGACGCAGA 1740TCGGTTGCAT GCTGAACTTC CCCATTAGCC CTATCGAGAC GGTACCGGTG AAGCTGAAGC 1800CCGGGATGGA CGGCCCGAAG GTCAAGCAAT GGCCATTGAC AGAGGAGAAG ATCAAGGCAC 1860TGGTGGAGAT TTGCACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT CTCCAAGATT GGGCCTGAGA 1920ACCCGTACAA CACGCCGGTG TTCGCAATCA AGAAGAAGGA CTCGACGAAA TGGCGCAAGC 1980TGGTGGACTT CCGCGAGCTG AACAAGCGCA CGCAAGACTT CTGGGAGGTT CAGCTGGGCA 2040TCCCGCACCC CGCAGGGCTG AAGAAGAAGA AATCCGTGAC CGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100CCTACTTCTC CGTTCCCCTG GACGAAGACT TCAGGAAGTA CACTGCCTTC ACAATCCCTT 2160CGATCAACAA CGAGACACCG GGGATTCGAT ATCAGTACAA CGTGCTGCCC CAGGGCTGGA 2220AAGGCTCTCC CGCAATCTTC CAGAGTAGCA TGACCAAAAT CCTGGAGCCT TTCCGCAAAC 2280AGAACCCCGA CATCGTCATC TATCAGTACA TGGATGACTT GTACGTGGGC TCTGATCTAG 2340AGATAGGGCA GCACCGCACC AAGATCGAGG AGCTGCGCCA GCACCTGTTG AGGTGGGGAC 2400TGACCACACC CGACAAGAAG CACCAGAAGG AGCCTCCCTT CCTCTGGATG GGTTACGAGC 2460TGCACCCTGA CAAATGGACC GTGCAGCCTA TCGTGCTGCC AGAGAAAGAC AGCTGGACTG 2520TCAACGACAT ACAGAAGCTG GTGGGGAAGT TGAACTGGGC CAGTCAGATT TACCCAGGGA 2580TTAAGGTGAG GCAGCTGTGC AAACTCCTCC GCGGAACCAA GGCACTCACA GAGGTGATCC 2640CCCTAACCGA GGAGGCCGAG CTCGAACTGG CAGAAAACCG AGAGATCCTA AAGGAGCCCG 2700TGCACGGCGT GTACTATGAC CCCTCCAAGG ACCTGATCGC CGAGATCCAG AAGCAGGGGC 2760AAGGCCAGTG GACCTATCAG ATTTACCAGG AGCCCTTCAA GAACCTGAAG ACCGGCAAGT 2820ACGCCCGGAT GAGGGGTGCC CACACTAACG ACGTCAAGCA GCTGACCGAG GCCGTGCAGA 2880AGATCACCAC CGAAAGCATC GTGATCTGGG GAAAGACTCC TAAGTTCAAG CTGCCCATCC 2940AGAAGGAAAC CTGGGAAACC TGGTGGACAG AGTATTGGCA GGCCACCTGG ATTCCTGAGT 3000GGGAGTTCGT CAACACCCCT CCCCTGGTGA AGCTGTGGTA CCAGCTGGAG AAGGAGCCCA 3060TAGTGGGCGC CGAAACCTTC TACGTGGATG GGGCCGCTAA CAGGGAGACT AAGCTGGGCA 3120AAGCCGGATA CGTCACTAAC CGGGGCAGAC AGAAGGTTGT CACCCTCACT GACACCACCA 3180ACCAGAAGAC TGAGCTGCAG GCCATTTACC TCGCTTTGCA GGACTCGGGC CTGGAGGTGA 3240ACATCGTGAC AGACTCTCAG TATGCCCTGG GCATCATTCA AGCCCAGCCA GACCAGAGTG 3300AGTCCGAGCT GGTCAATCAG ATCATCGAGC AGCTGATCAA GAAGGAAAAG GTCTATCTGG 3360CCTGGGTACC CGCCCACAAA GGCATTGGCG GCAATGAGCA GGTCGACAAG CTGGTCTCGG 3420CTGGCATCAG GAAGGTGCTA TTCCTGGATG GCATCGACAA GGCCCAGGAC GAGCACGAGA 3480AATACCACAG CAACTGGCGG GCCATGGCTA GCGACTTCAA CCTGCCCCCT GTGGTGGCCA 3540AAGAGATCGT GGCCAGCTGT GACAAGTGTC AGCTCAAGGG CGAAGCCATG CATGGCCAGG 3600TGGACTGTAG CCCCGGCATC TGGCAACTCG ATTGCACCCA TCTGGAGGGC AAGGTTATCC 3660TGGTAGCCGT CCATGTGGCC AGTGGCTACA TCGAGGCCGA GGTCATTCCC GCCGAAACAG 3720GGCAGGAGAC AGCCTACTTC CTCCTGAAGC TGGCAGGCCG GTGGCCAGTG AAGACCATCC 3780ATACTGACAA TGGCAGCAAT TTCACCAGTG CTACGGTTAA GGCCGCCTGC TGGTGGGCGG 3840GAATCAAGCA GGAGTTCGGG ATCCCCTACA ATCCCCAGAG TCAGGGCGTC GTCGAGTCTA 3900TGAATAAGGA GTTAAAGAAG ATTATCGGCC AGGTCAGAGA TCAGGCTGAG CATCTCAAGA 3960CCGCGGTCCA AATGGCGGTA TTCATCCACA ATTTCAAGCG GAAGGGGGGG ATTGGGGGGT 4020ACAGTGCGGG GGAGCGGATC GTGGACATCA TCGCGACCGA CATCCAGACT AAGGAGCTGC 4080AAAAGCAGAT TACCAAGATT CAGAATTTCC GGGTCTACTA CAGGGACAGC AGAAATCCCC 4140TCTGGAAAGG CCCAGCGAAG CTCCTCTGGA AGGGTGAGGG GGCAGTAGTG ATCCAGGATA 4200ATAGCGACAT CAAGGTGGTG CCCAGAAGAA AGGCGAAGAT CATTAGGGAT TATGGCAAAC 4260AGATGGCGGG TGATGATTGC GTGGCGAGCA GACAGGATGA GGATTAG 4307SEQ.ID.NO.3-來自HIV-1MN的包膜基因(基因庫接收號M17449)ATGAGAGTGA AGGGGATCAG GAGGAATTAT CAGCACTGGT GGGGATGGGG CACGATGCTC 60CTTGGGTTAT TAATGATCTG TAGTGCTACA GAAAAATTGT GGGTCACAGT CTATTATGGG 120GTACCTGTGT GGAAAGAAGC AACCACCACT CTATTTTGTG CATCAGATGC TAAAGCATAT 180GATACAGAGG TACATAATGT TTGGGCCACA CAAGCCTGTG TACCCACAGA CCCCAACCCA 240CAAGAAGTAG AATTGGTAAA TGTGACAGAA AATTTTAACA TGTGGAAAAA TAACATGGTA 300GAACAGATGC ATGAGGATAT AATCAGTTTA TGGGATCAAA GCCTAAAGCC ATGTGTAAAA 360TTAACCCCAC TCTGTGTTAC TTTAAATTGC ACTGATTTGA GGAATACTAC TAATACCAAT 420AATAGTACTG CTAATAACAA TAGTAATAGC GAGGGAACAA TAAAGGGAGG AGAAATGAAA 480AACTGCTCTT TCAATATCAC CACAAGCATA AGAGATAAGA TGCAGAAAGA ATATGCACTT 540CTTTATAAAC TTGATATAGT ATCAATAGAT AATGATAGTA CCAGCTATAG GTTGATAAGT 600TGTAATACCT CAGTCATTAC ACAAGCTTGT CCAAAGATAT CCTTTGAGCC AATTCCCATA 660CACTATTGTG CCCCGGCTGG TTTTGCGATT CTAAAATGTA ACGATAAAAA GTTCAGTGGA 720AAAGGATCAT GTAAAAATGT CAGCACAGTA CAATGTACAC ATGGAATTAG GCCAGTAGTA 780TCAACTCAAC TGCTGTTAAA TGGCAGTCTA GCAGAAGAAG AGGTAGTAAT TAGATCTGAG 840AATTTCACTG ATAATGCTAA AACCATCATA GTACATCTGA ATGAATCTGT ACAAATTAAT 900TGTACAAGAC CCAACTACAA TAAAAGAAAA AGGATACATA TAGGACCAGG GAGAGCATTT 960TATACAACAA AAAATATAAT AGGAACTATA AGACAAGCAC ATTGTAACAT TAGTAGAGCA 1020AAATGGAATG ACACTTTAAG ACAGATAGTT AGCAAATTAA AAGAACAATT TAAGAATAAA 1080ACAATAGTCT TTAATCAATC CTCAGGAGGG GACCCAGAAA TTGTAATGCA CAGTTTTAAT 1140TGTGGAGGGG AATTTTTCTA CTGTAATACA TCACCACTGT TTAATAGTAC TTGGAATGGT 1200AATAATACTT GGAATAATAC TACAGGGTCA AATAACAATA TCACACTTCA ATGCAAAATA 1260AAACAAATTA TAAACATGTG GCAGGAAGTA GGAAAAGCAA TGTATGCCCC TCCCATTGAA 1320GGACAAATTA GATGTTCATC AAATATTACA GGGCTACTAT TAACAAGAGA TGGTGGTAAG 1380GACACGGACA CGAACGACAC CGAGATCTTC AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT 1440TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA GTAACAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCA 1500ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA GAAAAAAGAG CAGCGATAGG AGCTCTGTTC 1560CTTGGGTTCT TAGGAGCAGC AGGAAGCACT ATGGGCGCAG CGTCAGTGAC GCTGACGGTA 1620CAGGCCAGAC TATTATTGTC TGGTATAGTG CAACAGCAGA ACAATTTGCT GAGGGCCATT 1680GAGGCGCAAC AGCATATGTT GCAACTCACA GTCTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCAAGA 1740GTCCTGGCTG TGGAAAGATA CCTAAAGGAT CAACAGCTCC TGGGGTTTTG GGGTTGCTCT 1800GGAAAACTCA TTTGCACCAC TACTGTGCCT TGGAATGCTA GTTGGAGTAA TAAATCTCTG 1860GATGATATTT GGAATAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAAA GAGAAATTGA CAATTACACA 1920AGCTTAATAT ACTCATTACT AGAAAAATCG CAAACCCAAC AAGAAAAGAA TGAACAAGAA 1980TTATTGGAAT TGGATAAATG GGCAAGTTTG TGGAATTGGT TTGACATAAC AAATTGGCTG 2040TGGTATATAA AAATATTCAT AATGATAGTA GGAGGCTTGG TAGGTTTAAG AATAGTTTTT 2100GCTGTACTTT CTATAGTGAA TAGAGTTAGG CAGGGATACT CACCATTGTC GTTGCAGACC 2160CGCCCCCCAG TTCCGAGGGG ACCCGACAGG CCCGAAGGAA TCGAAGAAGA AGGTGGAGAG 2220AGAGACAGAG ACACATCCGG TCGATTAGTG CATGGATTCT TAGCAATTAT CTGGGTCGAC 2280CTGCGGAGCC TGTTCCTCTT CAGCTACCAC CACAGAGACT TACTCTTGAT TGCAGCGAGG 2340ATTGTGGAAC TTCTGGGACG CAGGGGG G GAAGTCCTCA AATATTGGTG GAATCTCCTA 2400CAGTATTGGA GTCAGGAACT AAAGAGT GT GCTGTTAGCT TGCTTAATGC CACAGCTATA 2460GCAGTAGCTG AGGGGACAGA TAGGGTTATA GAAGTACTGC AAAGAGCTGG TAGAGCTATT 2520CTCCACATAC CTACAAGAAT AAGACAGGGC TTGGAAAGGG CTTTGCTATA A 2571SEQ.ID.NO.4-SYNgp-160mn-密碼子最優化的env序列ATGAGGGTGA AGGGGATCCG CCGCAACTAC CAGCACTGGT GGGGCTGGGG CACGATGCTC 60CTGGGGCTGC TGATGATCTG CAGCGCCACC GAGAAGCTGT GGGTGACCGT GTACTACGGC 120GTGCCCGTGT GGAAGGAGGC CACCACCACC CTGTTCTGCG CCAGCGACGC CAAGGCGTAC 180GACACCGAGG TGCACAACGT GTGGGCCACC CAGGCGTGCG TGCCCACCGA CCCCAACCCC 240CAGGAGGTGG AGCTCGTGAA CGTGACCGAG AACTTCAACA TGTGGAAGAA CAACATGGTG 300GAGCAGATGC ATGAGGACAT CATCAGCCTG TGGGACCAGA GCCTGAAGCC CTGCGTGAAG 360CTGACCCCCC TGTGCGTGAC CCTGAACTGC ACCGACCTGA GGAACACCAC CAACACCAAC 420AACAGCACCG CCAACAACAA CAGCAACAGC GAGGGCACCA TCAAGGGCGG CGAGATGAAG 480AACTGCAGCT TCAACATCAC CACCAGCATC CGCGACAAGA TGCAGAAGGA GTACGCCCTG 540CTGTACAAGC TGGATATCGT GAGCATCGAC AACGACAGCA CCAGCTACCG CCTGATCTCC 600TGCAACACCA GCGTGATCAC CCAGGCCTGC CCCAAGATCA GCTTCGAGCC CATCCCCATC 660CACTACTGCG CCCCCGCCGG CTTCGCCATC CTGAAGTGCA ACGACAAGAA GTTCAGCGGC 720AAGGGCAGCT GCAAGAACGT GAGCACCGTG CAGTGCACCC ACGGCATCCG GCCGGTGGTG 780AGCACCCAGC TCCTGCTGAA CGGCAGCCTG GCCGAGGAGG AGGTGGTGAT CCGCAGCGAG 840AACTTCACCG ACAACGCCAA GACCATCATC GTGCACCTGA ATGAGAGCGT GCAGATCAAC 900TGCACGCGTC CCAACTACAA CAAGCGCAAG CGCATCCACA TCGGCCCCGG GCGCGCCTTC 960TACACCACCA AGAACATCAT CGGCACCATC CGCCAGGCCC ACTGCAACAT CTCTAGAGCC 1020AAGTGGAACG ACACCCTGCG CCAGATCGTG AGCAAGCTGA AGGAGCAGTT CAAGAACAAG 1080ACCATCGTGT TCAACCAGAG CAGCGGCGGC GACCCCGAGA TCGTGATGCA CAGCTTCAAC 1140TGCGGCGGCG AATTCTTCTA CTGCAACACC AGCCCCCTGT TCAACAGCAC CTGGAACGGC 1200AACAACACCT GGAACAACAC CACCGGCAGC AACAACAATA TTACCCTCCA GTGCAAGATC 1260AAGCAGATCA TCAACATGTG GCAGGAGGTG GGCAAGGCCA TGTACGCCCC CCCCATCGAG 1320GGCCAGATCC GGTGCAGCAG CAACATCACC GGTCTGCTGC TGACCCGCGA CGGCGGCAAG 1380GACACCGACA CCAACGACAC CGAAATCTTC CGCCCCGGCG GCGGCGACAT GCGCGACAAC 1440TGGAGATCTG AGCTGTACAA GTACAAGGTG GTGACGATCG AGCCCCTGGG CGTGGCCCCC 1500ACCAAGGCCA AGCGCCGCGT GGTGCAGCGC GAGAAGCGGG CCGCCATCGG CGCCCTGTTC 1560CTGGGCTTCC TGGGGGCGGC GGGCAGCACC ATGGGGGCCG CCAGCGTGAC CCTGACCGTG 1620CAGGCCCGCC TGCTCCTGAG CGGCATCGTG CAGCAGCAGA ACAACCTCCT CCGCGCCATC 1680GAGGCCCAGC AGCATATGCT CCAGCTCACC GTGTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCCCGC 1740GTGCTGGCCG TGGAGCGCTA CCTGAAGGAC CAGCAGCTCC TGGGCTTCTG GGGCTGCTCC 1800GGCAAGCTGA TCTGCACCAC CACGGTACCC TGGAACGCCT CCTGGAGCAA CAAGAGCCTG 1860GACGACATCT GGAACAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAGC GCGAGATCGA TAACTACACC 1920AGCCTGATCT ACAGCCTGCT GGAGAAGAGC CAGACCCAGC AGGAGAAGAA CGAGCAGGAG 1980CTGCTGGAGC TGGACAAGTG GGCGAGCCTG TGGAACTGGT TCGACATCAC CAACTGGCTG 2040TGGTACATCA AAATCTTCAT CATGATTGTG GGCGGCCTGG TGGGCCTCCG CATCGTGTTC 2100GCCGTGCTGA GCATCGTGAA CCGCGTGCGC CAGGGCTACA GCCCCCTGAG CCTCCAGACC 2160CGGCCCCCCG TGCCGCGCGG GCCCGACCGC CCCGAGGGCA TCGAGGAGGA GGGCGGCGAG 2220CGCGACCGCG ACACCAGCGG CAGGCTCGTG CACGGCTTCC TGGCGATCAT CTGGGTCGAC 2280CTCCGCAGCC TGTTCCTGTT CAGCTACCAC CACCGCGACC TGCTGCTGAT CGCCGCCCGC 2340ATCGTGGAAC TCCTAGGCCG CCGCGGCTGG GAGGTGCTGA AGTACTGGTG GAACCTCCTC 2400CAGTATTGGA GCCAGGAGCT GAAGTCCAGC GCCGTGAGCC TGCTGAACGC CACCGCCATC 2460GCCGTGGCCG AGGGCACCGA CCGCGTGATC GAGGTGCTCC AGAGGGCCGG GAGGGCGATC 2520CTGCACATCC CCACCCGCAT CCGCCAGGGG CTCGAGAGGG CGCTGCTGTA A 2571
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權利要求
1.適于體內使用的選擇系統，該系統包含i)所編碼基因產物能直接或間接與核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列群；其中結合所述核苷酸序列所需的第一核苷酸序列的區域在第一核苷酸序列群中是異質的；和ii)第二核苷酸序列，其包含(a)編碼與mRNA穩定及/或翻譯所需序列有效連接的可檢測標記的編碼區；及(b)第三核苷酸序列，其位于編碼區及至少一個mRNA穩定和/或翻譯所需序列之間；其中(a)和(b)與能指導(a)和(b)作為毗鄰RNA分子在宿主細胞中表達的調控序列有效連接。
2.載體系統，該系統包含i)載體群，其中各載體獨立包含所編碼基因產物能直接或間接與核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列；其中結合所述核苷酸序列所需的第一核苷酸序列的區域在載體群中是異質的；和ii)第二核苷酸序列，其包含(a)編碼與mRNA穩定及/或翻譯所需序列有效連接的可檢測標記的編碼區；及(b)第三核苷酸序列，其位于編碼區及至少一個mRNA穩定和/或翻譯所需序列之間；其中(a)和(b)與能指導(a)和(b)作為毗鄰RNA分子在宿主細胞中表達的調控序列有效連接，其中第二核苷酸序列存在于載體群中或作為另一載體的部分存在。
3.按照權利要求1或2的系統，其中基因產物選自核酶、反義核糖核酸和外部指導序列。
4.按照權利要求2或3的系統，其中的載體是病毒載體。
5.按照權利要求4的系統，其中的病毒載體是逆轉錄病毒載體。
6.按照上述權利要求中任一項的系統，其中的可檢測標記是選擇標記。
7.按照權利要求6的系統，其中的選擇標記是能將前體藥物轉變為細胞毒性化合物的酶。
8.按照權利要求7的系統，其中的酶是胸苷激酶，而前體藥物是丙氧鳥苷。
9.按照上述權利要求中任一項的系統，其中第三核苷酸序列存在于第二核苷酸序列的3’和/或5’非翻譯區。
10.病毒顆粒群，其中各病毒顆粒含按權利要求1的第一核苷酸序列及按權利要求1的第二核苷酸序列。
11.產生按權利要求10的病毒顆粒群的方法，該方法包括將以下核苷酸序列引入生產者細胞a)如權利要求1中所定義的第一核苷酸序列群和b)如權利要求1中所定義的第二核苷酸序列。
12.用權利要求11的方法產生的病毒顆粒群。
13.從第一核苷酸序列群中選擇所編碼基因產物能直接或間接與第三核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列的方法，該方法包括i)將一或多種第一核苷酸序列引入包含權利要求1所定義的第二核苷酸序列的宿主細胞；并ii)若可檢測標記不以活性形式在宿主細胞中表達，則選擇出該宿主細胞；并任選的，iii)分離第一核苷酸序列并確定其核苷酸序列。
14.按照權利要求13的方法，其中在步驟(ii)中，可檢測標記是選擇標記，且宿主細胞與選擇標記存在時具細胞毒性的化合物接觸。
15.按照權利要求14的方法，其中選擇標記是胸苷激酶，而化合物是丙氧鳥苷。
16.按照權利要求13至15中任一項的方法，其中進一步包含選擇步驟以去除所編碼基因產物能直接或間接與可檢測標記編碼區結合并實現其切割的任何第一核苷酸序列。
17.按照權利要求16的方法，其中第一核苷酸序列群中的各第一核苷酸序列均位于編碼可檢測標記無活性變體的第四核苷酸序列的下游。
18.按照權利要求16或17的方法，其中第一核苷酸序列群存在于病毒載體群中，所說的病毒載體含編碼可檢測標記無活性變體的第四核苷酸序列，并且作為一個選擇步驟，將載體群引入一種或多種生產者細胞中，產生的任何感染性病毒顆粒用于步驟(i)中從而將第一核苷酸序列引入含第二核苷酸序列的生產者細胞中。
19.用權利要求13至18中任一項所述方法獲得的第一核苷酸序列。
20.含按照權利要求19之第一核苷酸序列的逆轉錄病毒載體。
21.按照權利要求19的第一核苷酸序列用于治療。
22.利用權利要求1-9中任一項的選擇系統鑒定mRNA分子上的開放位點的方法。
全文摘要
本發明提供了適于體內使用的選擇系統,該系統包含:i)所編碼基因產物能直接或間接與核苷酸序列或其轉錄產物結合并實現其切割的第一核苷酸序列群;其中結合所述核苷酸序列所需的第一核苷酸序列的區域在第一核苷酸序列群中是異質的;和ii)第二核苷酸序列,其包含(a)編碼與mRNA穩定及/或翻譯所需序列有效連接的可檢測標記的編碼區;及(b)第三核苷酸序列,其位于編碼區及至少一個mRNA穩定和/或翻譯所需序列之間;其中(a)和(b)與能指導(a)和(b)作為毗鄰RNA分子在宿主細胞中表達的調控序列有效連接。
文檔編號C12N15/09GK1353769SQ0080836
公開日2002年6月12日 申請日期2000年6月2日 優先權日1999年6月3日
發明者K·米特羅法諾斯, N·金, E·科特索波羅 申請人:牛津生物醫學(Uk)有限公司