來源于鴨跖草黃斑駁病毒和木薯葉脈花葉病毒的嵌合表達啟動子的制作方法

專利名稱：來源于鴨跖草黃斑駁病毒和木薯葉脈花葉病毒的嵌合表達啟動子的制作方法
〔說明〕本發明涉及嵌合表達啟動子，特別是打算用于植物生物工程領域的。
一般說來，表達啟動子是生物工程和遺傳操作領域中眾所周知的。更具體就植物生物工程而論，編碼希望在宿主細胞中產生的多肽的基因的表達率常常取決于所用的啟動子。與此相關的問題是常用的各種啟動子常常只是因為它們的組織特異性或表達強度而限于特定的應用或組織。例如可能列舉的是花椰菜花葉病毒啟動子35S，它與例如來源于nos基因的啟動子相比是相對較強的啟動子，這兩種啟動子都更特定地用于植物生物工程領域。因此，需要能夠克服現今已知的啟動子應用中的上述缺點的新的啟動子。
在以WO97/48819號公布的PCT申請中已報道了解決該問題的一種嘗試，它描述了得自木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)的啟動子，整個啟動子包含一部分具有與該申請書中提到的參比序列的同源性至少為80％的18個連續核苷酸的核酸序列。
除非另有說明，否則本說明書和權利要求書中所用的表達方式具有以下含義-“核酸”是指DNA或RNA；-“核酸序列”是指從5’末端朝向3’末端閱讀的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈低聚體或多聚體，它包括自我復制型質粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA聚合體以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申請所用的核苷酸符號標示中，除非另有說明，否則單鏈核苷酸序列的左手末端一定是5’末端；-“衍生核酸序列”是指從某序列例如通過一個或多個核苷酸的置換、缺失、添加、突變、斷裂和/或合成而直接或間接得到的序列；-“啟動子”或“啟動子核酸序列”是指翻譯起始密碼子的核酸上游區，它直接參與識別和結合RNA聚合酶以及轉錄所需的其他蛋白質；-“植物啟動子”是能夠在植物細胞中引發轉錄的啟動子；
-“組成型啟動子”是能夠在生物體的整個發育過程中在該宿主生物體的所有或基本上所有組織中表達操作性連接的核酸序列的啟動子；-“組織特異性啟動子”是能夠在宿主生物體的某些特定組織中選擇性表達與所述啟動子操作性連接的核酸序列的啟動子；-“操作性連接”是指將啟動子與編碼要產生的多肽的核酸序列或基因連接，使得該啟動子真正驅動所述連接核酸序列的轉錄。應當理解，該啟動子序列也包括位于轉錄起始位點和翻譯起始密碼子之間的轉錄序列；-“表達盒”是指能夠指導編碼要在與所述序列相容的宿主生物體中產生的多肽的核酸序列或基因的表達的核苷酸序列。這種表達盒至少包括一個啟動子和轉錄終止信號，以及可選的用于表達或表達所需的其他因子；-“載體”是指表達系統，例如用DNA包被的發射物、基于核酸的轉運載體、適于傳遞核酸的核酸分子、和自我復制型自主環狀DNA，例如質粒、粘粒、噬菌粒等等。當重組微生物或細胞培養物描述為表達載體的宿主時，這還可包括環狀染色體外DNA(諸如象線粒體或葉綠體DNA)，已整合到宿主的染色體中的DNA，或者作為整合到宿主基因組中的自主結構在有絲分裂期間由細胞穩定復制、或者保持在宿主的核或胞質中的載體；-“質粒”是指能夠在細胞中復制的自主環狀DNA分子，包括稱為“表達質粒”的質粒和稱為“非表達質粒”的質粒。當重組微生物或細胞培養物在本申請中描述為“表達質粒”的宿主時，這是指環狀染色體外DNA分子和已整合到宿主染色體中的DNA分子。若質粒保持在細胞宿主中，該質粒或者作為自主結構在有絲分裂期間由這些細胞穩定復制，或者整合到宿主基因組中；“異源序列”或“異源核酸序列”是指來源于對其天然環境來說是外來的來源或種的序列，或者若是來自相同環境，則已對其原始天然形式進行了修飾。可以對核酸序列進行修飾，例如通過用限制酶處理核酸，以產生能夠操作連接到啟動子的核酸片段。修飾也可以用諸如位點特異性誘變或定點誘變等技術進行；-“箱”是指賦予調節功能的核酸序列；
-“…樣”是指該術語提到的箱和/或核酸序列包含某些與已知參比箱和/或核酸序列相同的序列或共有序列，優選與參比序列至少50％的序列同一性，甚至更優選至少75％的序列同一性，首選至少90％的序列同一性。序列同一性百分數是在至少6個鄰接核苷酸堿基的比較窗口的基礎上計算出的。可以使用序列對齊算法來確定比較窗口，以確定與參比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性對齊算法和相似檢索算法，這些算法也有電子或計算機化形式，名稱為GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分數通過比較參比序列與箱和/或核酸序列得到；-“位于”是指鑒定元件核酸序列上的位置，諸如“箱”、限制酶部位或具有特定功能的密碼子。給出的位置用在核酸序列中該元件的起始位置數指示，是以核酸序列的讀框方向來說的，也就是說，除非另有說明，否則絕大多數是從5’向3’方向；-“轉基因植物”是指用基因操作技術得到的植物，包括由此得到的完整植物、它們的后代、以及用這些技術得到的生命植物器官，例如根、莖和葉。本發明的轉基因植物可以有不同的倍性水平，特別可以是多倍體、二倍體和單倍體；-“繁殖體”是指由此可能再生完整植物的植物細胞的有結構或無特定結構的集合或裝配或聯合體，例如外植體、愈合組織、莖、葉、根、插枝、甚至是種子。
本發明的申請人采用了與前面所討論的PCT專利申請的申請人所用的不同方法。的確，本發明申請人已奇跡般成功地生產了能夠滿足并實現前述要求的嵌合啟動子，尤其是相對現有的常用啟動子來說，能夠增加編碼要在宿主細胞中、更特別是在植物細胞或再生植物中產生的多肽的基因或核酸序列的表達率的嵌合啟動子。另外，為了能夠選出最適合所面對的任務或應用以及將要進行工作的環境的啟動子，申請人還成功地生產了一族完整的啟動子，并因此使得有可能在一定程度上控制要表達的編碼要產生的多肽的基因的表達率。
所以，本發明的一個目的是包含至少一個得自包含植物維管表達啟動子區的第一植物啟動子的核酸序列的嵌合表達啟動子，所述植物維管表達啟動子區被得自第二植物啟動子的核酸序列取代并包含植物綠色組織表達啟動子區。
優選地，第一植物啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)，而第二植物啟動子來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。
更優選地，啟動子核酸序列來源于第一啟動子和第二啟動子的基因間隔區。
在特別優選的實施方案中，嵌合表達啟動子包含至少部分SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，該序列與至少部分SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。在更優選的實施方案中，本發明的嵌合啟動子選自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06和SEQ.ID.No.07所述的核酸序列。
按照本發明的另一個目的，申請人發現有可能從病毒來源的基礎啟動子開始生產特別具有活性的嵌合表達啟動子，其部分由能夠促進植物綠色組織表達(GT)的外源元件組成。優選地，外源GT啟動子元件也是病毒來源的。此外，按照本發明此方面的優選實施方案，病毒來源的啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)。優選地，外源啟動子元件來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。更優選的是，外源GT元件置換能夠促進病毒來源的啟動子的維管組織表達(VT)的內源元件。
按照上文中提到的先前確定的本發明目的的優選實施方案，該嵌合啟動子還包含至少一個“胚乳樣”箱，更優選包含4至10個“胚乳樣”箱，首選包含6個“胚乳樣”箱。
按照另一個優選實施方案，該啟動子還包含至少一個與植物綠色組織GT啟動子元件操作性連接的“as1樣”箱。
按照又一個優選實施方案，本發明的啟動子包含至少一個與植物綠色組織(GT)啟動子元件操作性連接的“as1”箱。
在另一個優選實施方案中，該啟動子還包含至少一個與植物綠色組織(GT)啟動子元件操作性連接的“as2”箱。
優選地，一個或多個“as1樣”、“as1”和“as2”箱操作性連接植物綠色組織表達GT啟動子元件的上游或下游。
更優選的是，一個或多個“as1樣”、“as1”和“as2”箱以正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向操作性連接。
最優選的是，啟動子包含至少一個正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向的“as2/as2/as2”箱。
優選前述啟動子選自SEQ.ID.No.01、SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的核酸序列。
本發明的另一個目的是包含至少一個得自包含植物維管表達啟動子區的第一植物啟動子的核酸序列的表達盒，所述植物維管表達啟動子區被得自第二植物啟動子的核酸序列取代并包含植物綠色組織表達啟動子區，該啟動子核酸序列與編碼要產生的多肽的要表達的核酸序列或基因操作連接，后述核酸序列或基因又與轉錄終止子核酸序列操作性連接。
優選地，按照這一實施方案，所述第一植物啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)，而所述第二植物啟動子來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。更優選該表達盒包含至少部分SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，該序列與至少部分SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。更優選的是，該表達盒的嵌合啟動子的核酸序列選自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
按照本發明的另一個目的，提供了分離啟動子核酸序列，它選自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
本發明還有一個目的涉及用于生產如上所定義的啟動子或啟動子核酸序列的脫氧核苷酸構件。這些構件可以是-“定向”構件，即以和最終啟動子序列的讀框相同的方向、通常是從5’末端到3’末端閱讀的序列；和/或-“引導”構件，即其末端包含與定向構件的末端重疊的核苷酸堿基的序列。
這樣，優選定向構件對應于至少一個選自SEQ.ID.No.8、SEQ.ID.No.9、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.11、SEQ.ID.No.13和SEQ.ID.No.14所述的序列。另外，優選使用與至少一個選自SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列相對應的脫氧核苷酸“引導”構件。
本發明的另一個目的是包含能夠引發編碼要產生的多肽的核酸序列或基因的轉錄的啟動子或啟動子核酸序列的載體，其中所述啟動子或啟動子核酸序列相當于如上文中所述的嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列。
優選該載體選自下列雙元載體pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172、pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188、pMRT1182、pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。
最后，本發明的另一個目的是制備如上文所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的方法，其中所述方法包括以下步驟-進行稱作LCR的連接鏈式反應，以從至少一個選自分別由SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13和SEQ.ID.No.14所述的“定向”脫氧核苷酸構件S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的脫氧核苷酸構件和至少一個選自分別由SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的引導脫氧核苷酸G1、G2、G3和G4的、所述啟動子核酸序列或啟動子的“引導”脫氧核苷酸構件生產單鏈連續DNA；-對從前一步驟得到的單鏈DNA進行PCR擴增，以生產相當于嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列的雙鏈DNA；-可選地分離啟動子核酸序列的啟動子。
有利并優選地，脫氧核苷酸構件在連接前磷酸化。更優選連接在至少一種DNA連接酶的存在下以下列條件下的熱循環進行-約94℃下約1分鐘，1個循環；-8個相同循環，每個由以下步驟組成-65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和37℃下10分鐘。
本發明的另一個目的是具有穩定整合到其基因組中的至少一個如上文所定義的啟動子或至少一個啟動子核酸序列的轉基因植物。該轉基因植物最好選自雙子葉植物，并優選馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、蕓苔、低芥子酸菜子、甜菜根或向日葵，或選自單子葉植物，并優選小麥、大麥、燕麥、稻米或玉米。
本發明的又一個目的是如前文所定義的轉基因植物的繁殖體，優選該繁殖體是種子。
按照本發明，另一個目的是含有如上文所定義的啟動子或啟動子核酸序列的細胞，優選該細胞是植物細胞。
按照本發明的另一個目的，提供了通過細胞表達編碼要產生的多肽的核酸序列或基因的方法，其中該方法包括以下步驟-用包含如前文所定義的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉化細胞；-在使得編碼所述多肽的核酸序列或基因能夠表達和生產的條件下培養該細胞。優選該細胞是原核細胞或真核細胞，更優選是選自微生物細胞、藻類和微藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞、哺乳動物和人類細胞以及植物細胞的細胞，首選是植物細胞。
按照本發明的另一個目的，提供了制備轉基因植物或繁殖體的方法，其中該方法包括以下步驟-用包含如前文所定義的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉化植物細胞；-選出具有整合啟動子或啟動子核酸序列的植物細胞；-通過培養或通過再生整個嵌合或轉基因植物來繁殖選出和轉化的植物細胞。
附圖
的簡要描述本發明將通過以下對一個或多個單純作為非限制性實施例給出的優選實施方案的詳細描述并參照附圖而得到更好的理解，在附圖中-圖I、II和III圖解表示了比較參比構建物的結構，使得本發明的嵌合啟動子能夠與已知并使用的那些啟動子進行比較。圖I中，有關的構建含有在完全沒有任何這樣的啟動子序列的情況下編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的報道基因，并因此用作陰性對照。
-圖II圖解表示了含有受CaMV雙35S啟動子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶基因的構建物，用作強參比對照；-圖III表示了用作瞬時表達實驗的內部參照的構建物，包括受CaMV 35S啟動子控制的編碼熒光素酶的報道基因；-圖IV圖解表示了按照本發明生產的嵌合啟動子的幾種優選實施方案的結構。嵌合啟動子MPr1116和MPr1117用稱為lb-PCR的技術得到。MPr1146和MPr1147通過在限制酶位點DraIII克隆來自CaMV啟動子的激活元件as1和as2得到。啟動子MPr1154通過存在于MPr1147的5’區域中的來自CoYMV啟動子的兩個“as-1樣”序列的缺失得到。所有這些啟動子在限制位點PstI和BamHI克隆到載體pMRT1144中，以得到具有報道基因uidA的轉錄融合體；-圖V表示了用本發明的不同啟動子轉化的煙草葉的組織化學染色情況。煙草葉利用biolistic方法使用從BIORAD購得的《PDS1000/He》基因槍在下列條件下進行轉化斷裂圓盤以900psi、2μgDNA連續轟擊兩輪以上，發射體由直徑約1μm的金珠或金球組成，植物材料安置在從大載體開始6至9cm處。轟擊完后，這些煙草葉在黑暗中在培養室中培養48小時，使得報道基因得以表達。然后這些煙草葉在37℃下在含有2mg/mlX-Glu的0.1M磷酸鹽緩沖液中培養24至48小時，之后在70％乙醇浴中漂白。
-圖VI表示了煙草葉中不同構建物在瞬時表達后的相對啟動子活性的對比圖。轟擊3天后，將這些煙草葉磨碎，然后通過離心澄清粗提物。用熒光測定法測量粗提物試樣的β-葡糖醛酸糖苷酶和熒光素酶活性，然后確定GUS活性/LUC活性的比率。直方圖相當于所示構建物的平均比率+/-標準均差；-圖VII圖解表示了本發明嵌合啟動子的其他優選實施方案，其中深色圓盤形符號代表綠色組織表達特異性元件；小的白色平行六面體符號代表“胚乳樣”箱；小的和大的黑色陰影平行六面體分別代表來自CaMV啟動子的“as-2”和“as-1”箱。
-圖VIII表示在瞬時表達實驗中本發明的不同啟動子在玉米胚乳中的相對活性的比較，其中利用熒光測定法測量粗提物試樣的β-葡糖醛酸糖苷酶和熒光素酶活性。直方圖相當于所示構建物的平均值+/-標準均差；-圖IX表示在穩定的煙草表達中評估的嵌合啟動子MPr1116、MPr1146、MPr1167和參比啟動子MPr1092的相對活性的比較。樣品從在植物轉移到溫室中后的第2、4、6、8和10周的每種初級轉化體采集。測量每種樣品的β-葡糖醛酸糖苷酶活性并稱量其相對蛋白質總重量的量。對于每一系列轉化體，在所示時間，將活性按減小的順序排序并進行比較。
在各圖中，某些術語具有以下含義-uidA＝編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的序列；-IV2＝patatin基因內含子；-nos term＝來自胭脂氨酸合酶基因的終止子；-35S term＝RNA 35S CaMV終止子；-CaMV＝花椰菜花葉病毒；-as-1＝來自CaMV 35S啟動子的活化序列1；-as-2＝來自CaMV 35S啟動子的活化序列2；-B＝內切核酸酶限制位點BamHI；-E＝內切核酸酶限制位點EcoRI；-H＝內切核酸酶限制位點HindIII；-P＝內切核酸酶限制位點PstI；-Sp＝內切核酸酶限制位點SphI；-D＝內切核酸酶限制位點DraIII；-N＝內切核酸酶限制位點NdeI；-S＝內切核酸酶限制位點SpeI；-CoYMV＝鴨跖草黃斑駁病毒；-CsVMV＝木薯葉脈花葉病毒；-TATA＝TATA箱；-+1＝轉錄起始位點；-“…樣”如前文所定義，是指與其提到的序列不是100％同源的序列。
實施例實施例1比較構建物(對照)為了能夠進行本發明的嵌合啟動子和已知且目前常用的那些啟動子之間的比較，在一種啟動子和得自根癌農桿菌的胭脂氨酸合酶基因(nosterm)的終止子的控制下，將編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986年)和含有得自馬鈴薯patatin基因ST-LS1的內含子IV2序列(Vancanneyt等，1990年)的uidA基因(uidA-IV2)放置到由Promega公司(Madison，USA)商業化的質粒pGEM3Z中。
1.1.陰性對照pMRT1144的構建為了促進克隆，生產只含有序列“uidA-IV2/nos term”并沒有任何啟動子序列的得自pGEM3Z的質粒。將這種質粒命名為pMRT1144并用作陰性對照(圖I)。為了將uidA/nos term序列插入到pGEM3Z中，在來自豌豆質體藍素基因的整個啟動子和胭脂氨酸合酶終止子的控制下從5μg質粒pGA492-PpetE分離uidA序列。這種質粒已通過將得自質粒pKHn2的來源于豌豆質體藍素基因的petE啟動子(Pwee et Gray，1993)代替來源于質粒bp I221-Pem2的em2啟動子(Gaubier等，1993年)克隆到質粒pGA492-Pem2-uidA中得到。質粒bp I221-Pem2在37℃下用各20單位的酶HindIII和EcoRI消化1小時。然后，表達盒“Pem2/uidA/nosterm”通過電泳在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中并插入質粒pGA492(An，1986)的HindIII和EcoRI位點處，質粒pGA492事先用這兩種酶在37℃下消化1小時，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后再懸浮于水中。連接在1.0μl T410X DNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下進行16小時。將先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌轉化(Hannahan，1983)。在添加了四環素(12mg/l)的Luria-Bertani培養基(LB，細菌用胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l，瓊脂15g/l)上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法(Birnboim et Doly，1983)提取并通過酶消化進行分析。
從所得pGA492-Pem2-uidA質粒開始，通過用HindIII和XbaI雙重消化除去啟動子Pem2。該質粒片段通過電泳在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，按照制造商的建議在37℃下接受DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)作用30分鐘。然后，其通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水。之后，其在37℃下使用10單位的小牛腸堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)按照制造商的建議去磷酸化1小時，通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白質，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中。所得質粒命名為pGA492ΔPem2。
并列地，對應于豌豆質體藍素基因的啟動子的啟動子petE(818bp)通過在37℃下用NcoI消化1小時而從質粒pKHn2得到。828bp啟動子片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中，然后按照制造商的建議在30℃下接受5單位的綠豆核酸酶(New England Biolabs)作用30分鐘，通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白質，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水。如上所述，將這種啟動子片段在1.0μl T4 10XDNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小時而插入到質粒pGA492ΔPem2中。將先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌轉化(Hannahan，1983)。在添加了四環素(12mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pGA492-petEprom。
為了分離表達盒“petE prom/uidA/nos term”，5μg質粒pGA492-petEprom用PstI(位于豌豆質體藍素基因啟動子的5′區的位點)和EcoRI(位于終止子序列的3′區的位點)在37℃下消化1小時，接受0.8瓊脂糖凝膠電泳并按照供應商的建議在QIAquick親和柱(Qiagen，Hilden，Germany)上純化。另外，500ng質粒pGEM3Z同時在37℃下用EcoRI和PstI(存在于多克隆部位或多接頭中的限制位點)消化1小時，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，然后在QIAquick親和柱上純化。連接用50ng載體pGEM3Z-PstI/EcoRI和50ng表達盒petE prom/uidA/nos term在18℃下以12μl的反應體積在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。先前制備的大腸桿菌DH5α細菌用連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pGEM3Z-petE prom。
為了將來自馬鈴薯patatin基因的192bp IV2內含子插入到編碼uidA序列中，將該基因的內部部分(pGEM3Z-petE prom中的710bp的片段SnaBI/BstBI)切除，然后用含有IV2內含子的同等序列(902bp的片段SnaBI/BstBI)取代。為此，質粒pGEM3Z-petE prom在37℃下用SnaBI(位于uidA基因起始ATG密碼子下游的+383bp位的限制位點)消化1小時，然后在65℃下用BstBI(位于+1093bp位的位點)消化1小時。缺失了這710bp片段的質粒通過0.8％凝膠瓊脂糖電泳分離，然后在QIAquick親和柱上純化。對應于IV2內含子序列的902bp的片段BstBI/SnaBI再加上從位置+383延伸至+1093bp的uidA序列從質粒pSCV1.2-GI分離并純化。按照常規克隆方法，該質粒得自質粒pSCV1.2，它又得自由G.A.Edwards于1990年構建的質粒pSCV1。雙元質粒pSCV1.2通過帶有表達盒“35S prom/nptll/nos term”的片段HindIII(Fromm等，1986)在pSCV1的HindIII位點的克隆得到。表達盒“35S prom/GUS-IV2/35Sterm”通過如Vancanneyt等(1990)所述在37℃下用HindIII消化質粒p35S GUS INT達1小時而得到。對應于該表達盒的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，然后在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥并再懸浮于水中。該片段的5′突出端通過DNA聚合酶I克列諾片段(New England Biolabs)按照制造商的建議在37℃下作用30分鐘而鈍化，并且該片段通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白質，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘后，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，并最終在1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小時而與在25℃下用SmaI消化了1小時的20ng質粒pSCV1.2連接。轉化先前制備的感受態并有活力的大腸桿菌DH5α細菌。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。
5微克(5μg)質粒pSCV1.2-GI在37℃下用SnaBI(位于uidA基因的起始ATG密碼子下游的+383bp位的限制位點)消化1小時，然后在65℃下用BstBI(位于+1285bp位的位點)消化1小時。該902bp片段通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在QIAquick親和柱上純化。連接用20ng載體pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI和80ng 902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下以10μl的反應體積在1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。先前制備的感受態并有活力的大腸桿菌DH5α細菌用連接反應混合物的一半轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pGEM3Z-petE prom/IV2。
為了從質粒pGEM3Z-petE prom/IV2除去對應于818bp片段(petE)的啟動子序列，該質粒在37℃下用BamHI消化1小時，然后在37℃下用PstI消化1小時，通過電泳在0.8％凝膠瓊脂糖上分離，然后在QIAquick親和柱上純化。該質粒的5′突出端按照供應商的建議用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。連接用10ng由此修飾的質粒在18℃下以12μl的反應體積在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。先前制備的感受態并有活力的大腸桿菌DH5α細菌用一半的連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，通過酶消化進行分析，并通過按照Sanger等(1977)所述方法測序來檢定。所得質粒命名為pMRT1144(圖I)。
1.2.陽性對照MPr1092的構建為了得到參比啟動子序列，將來自花椰菜花葉病毒的“雙35S”啟動子(CaMV D35S prom)置于序列uidA-IV2/nos term的上游。質粒pMRT1092(圖I)由以下克隆步驟得到首先，如1.1部分中所述將來自馬鈴薯patatin基因的192bp IV2內含子插入到編碼序列uidA的+383bp位置。1微克量(1μg)的質粒pBI221(Clontech，CA，USA)在37℃下用SnaBI消化1.5小時，然后在65℃下用BstBI消化1.5小時。缺失了710bp片段的質粒通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在QIAquick親和柱上純化。
20納克量(20ng)的載體pBI221 BstBI/SnaBI和80ng如前所述來源于pSCV1.2-GI的902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下以10μl的反應體積在1μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接1夜。先前制備的感受態并有活力的大腸桿菌DH5α細菌用一半的連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pBI221/uidA-IV2。
接著，存在于質粒pBI221/uidA-IV2中的單純35S CaMV啟動子序列用“CaMV D35S”序列置換。為此，質粒pBI221/uidA-IV2在37℃下用10單位的HindIII消化10.5小時，然后粘端通過DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)按照制造商的建議在37℃下作用30分鐘而鈍化。該反應的產物在QIAquick親和柱上純化后，DNA在37℃下用10單位的BamHI消化1夜。對應于缺失828bp CaMV 35S啟動子片段的載體的質粒片段通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在QIAquick親和柱上純化。
CaMV D35S啟動子從質粒pJIT163Δ得到。該質粒得自pJIT163，它又得自質粒pJIT160(Guerineau et Mullineaux，1993)。質粒pJIT163具有在多接頭的位點HindIII和SalI之間的ATG密碼子。為了除去該ATG并得到質粒pJIT163Δ，pJIT163的質粒DNA用HindIII和SalI消化，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，按照制造商的建議在37℃下接受DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)作用30分鐘，通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白質，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥并最終在1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下連接16小時。轉化先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。
10微克(10μg)質粒pJIT163Δ在37℃下用10單位的KpnI(位于啟動子5′區中的位點)消化10.5小時，然后粘端用6單位的T4 DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)在37℃下按照制造商的建議作用30分鐘而鈍化。該反應的產物在QIAquick親和柱上純化后，DNA在37℃下用10單位的BamHI消化1夜。對應于D35S啟動子的所得761bp DNA片段通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在QIAquick親和柱上純化。含有10ng質粒載體、100ng 761bp片段、1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的反應混合物以10ml在18℃下連接1夜。先前制備的有活力且為感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半的連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pMRT1092(圖II)。
1.3.參比質粒pCaMV35Sluc的描述用作瞬時表達的內部參照的質粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在RNA CaMV 35S啟動子和終止子控制下的熒光素酶(luc)報道基因的表達盒(圖III)。
實施例2將來自CsVMV的元件與CoYMV啟動子結合的嵌合啟動子的構建CoYMV的基因間隔區的整個啟動子對應于從-1026bp位延伸至+12bp位的1038bp序列(關于CoYMV轉錄物的5′末端，先前已確定為序列EMBL X52938，Medberry等，1992年)。保留該整啟動子的243bp片段(Medberry和Olszewski，1993)用于構建本發明的如序列表中SEQ.ID01所述的嵌合啟動子。在這個243bp片段上，已推定了幾個可能的調節序列(從5′末端朝3′末端方向，其位置用關于轉錄引發起始點+1的堿基對(bp)指示，如圖IV中所示)-與存在于CaMV 35S啟動子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的長度為16bp的“as-1樣”箱，從-226bp位延伸至-210bp位；-引起在維管組織中的表達的76bp序列(Medberry等，1992)，從-161bp位延伸至-85bp位，在圖IV中指示為VT；-位于-76bp位的對在綠色組織中的表達專一的GTAA元件；-與引起在谷類植物胚乳中的特定表達的箱具有一定相似性的3個“胚乳樣”箱，位于-118bp位、-77bp位和-20bp位；-在-32bp位的“TATA”箱；-轉錄起始點+1(1位)；-從+1位延伸至+12bp位的5′未翻譯區(UTR)。
CsVMV的基因間隔區的啟動子對應于從+7162bp位延伸至+7677bp位的515 bp序列(先前已確定為序列EMBLU59751，Verdaguer等，1996年)。在這個由序列表中SEQ.ID02所述的515bp片段上，已推定了幾個可能的調節序列(從5′末端朝3′末端方向，其位置用關于轉錄引發起始點+1的堿基對(bp)指示，如圖IV中所示)-據報道能引起在綠色組織中的強表達的104bp序列，從-220bp位延伸至-116bp位，在圖IV中指示為GT；-與存在于CaMV 35S啟動子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的長度為16bp的“as-1樣”箱，從-219bp位延伸至-203bp位；-對在綠色組織中的表達專一的7個“GTAA”元件，位于-437、-216、-144、-130、-116bp、+16和+63bp位；-與引起在谷類植物胚乳中的特定表達的箱具有一定相似性的7個“胚乳樣”箱，位于-196、-145、-136、-130、-122、+14和+31bp位；-在-33bp位的“TATA”箱；-轉錄引發起始點+1(+1位)；-從+1位延伸至71bp位的5′未翻譯區(UTR)。
2.1.MPr1116的構建從-221bp位延伸至-116bp位(以轉錄啟發起始點+1為參照)的CsVMV的104bp序列具有4個“胚乳樣”箱，4個對在綠色組織中的表達專一的“GTAA”元件，和1個as-1型元件，該序列可引起在維管組織中的表達。CoYMV的76bp區(如序列表中SEQ.ID.No.01所述從-160bp位延伸至-84bp位)可引起在維管組織中的表達。
如圖IV中圖解說明的，啟動子MPr1116通過使用lb-PCR技術將來自CsVMV基因組的基因間隔區的啟動子的104bp序列(由序列表中SEQ.ID02所述)與缺失了其76bp區的CoYMV序列融合加以制備。
這種技術結合了從“定向”寡脫氧核苷酸構件開始生產單鏈連續DNA的稱為LCR的連接鏈式反應(Barany，1991)和用于生產雙鏈DNA的PCR反應。
單鏈連續DNA從以下“定向”脫氧核苷酸開始形成-S1＝5′CATGCTGCAGACTAGTATCCGCCGTCATCAATGACATCATCACAGTACTGAGGAGATGAATAGCT 3′(SEQ.ID08)-S2＝5′AGCCATGACACTCTGTGCGAATATTGAAGACGTAAGCACTGACGACAACAATGAAAAGAA 3′(SEQ.ID09)-S3＝5′GAAGATAAGGTCGGTGATTGTGAAAGAGACATAGAGGACACATGTAAGGTGGAAAATGTAAG 3′(SEQ.ID10)-S4＝5′GGCGGAAAGTAACCTTATGCATTTGTAACTTGGTTACCCGGTATGCCGGTTCCCAAGCTTTAT 3′(SEQ.ID11)-S5＝5′TTCCTTATTTAAGCACTTGTGTAGTAGCTTAGAAAACCAACACAACAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID12)100微微摩爾脫氧核苷酸S1、S2和S3在5’區中通過在5μl10X激酶緩沖液(Amersham)和500微微摩爾ATP(Sigma)的存在下用15單位的激酶(Amersham)在37℃下作用30分鐘而磷酸化。這些磷酸化寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。
為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導”寡脫氧核苷酸-G1＝5′GACTCCTCTACTTATCGATCGGTACTGTGAGACA 3′(SEQ.ID15)
-G2＝5′GCTGTTGTTACTTTTCTTCTTCTATTCCAGCCA 3′(SEQ.ID16)-G3＝5′ATTCCACCTTTTACATTCCCGCCTTTCATTG 3′(SEQ.ID17)-G4＝5′CAAGGGTTCGAAATAAAGGAATAAATTCGTGA 3′(SEQ.ID18)為了進行LCR反應，10pmol的磷酸化“定向”脫氧核苷酸S1、S2、S3、S4和S5在10pmol的“引導”脫氧核苷酸G1、G2、G3和G4、5μl10X Taq DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接。該連接反應以GeneAmpPCR系統9700熱循環(Perkin Elmer，Norwalk，USA)進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環；和8個相同循環，各自由下列連續步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應混合物按照供應商的建議在QIAquick柱上純化。
最后，所得單鏈DNA的PCR擴增以GeneAmp PCR System 9700熱循環在各100pmol的寡脫氧核苷酸探針5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTGT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的DNA Vent聚合酶(New England Biolabs)的存在下完成。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、55℃下30秒雜交步驟和72℃下45秒延伸步驟組成的25個循環，然后在72℃下繼續延伸5分鐘。
來自該反應混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在QIAquick柱上純化。將它們插入到在37℃下用BamHI消化1小時然后在37℃下用PstI消化1小時的質粒pGEM3Z-petE prom(1.2.部分中所述)中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在QIAquick親和柱上純化，在37℃下在12μl10X緩沖液3(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在QIAquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質粒和100ng從PCR反應得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和使用在啟動子上選出的脫氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和在uidA序列上選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增進行分析。將所得2個質粒pMRT1116和pMRT1117測序。質粒pMRT1116含有啟動子MPr1116(SEQ.ID03)，而質粒pMRT1117具有啟動子MPr1117(SEQ.ID04)，它與MPr1116的不同在于在嵌合啟動子的5’區中“as-1樣”箱及其直接環境的復本，其長度為33bp，以及在-140、-25和-24位缺失了3bp，和在-54bp位胞嘧啶被胸腺嘧啶置換(如圖IV所示IV)。
2.2.啟動子MPr1146的構建啟動子MPr1146(圖IV)通過將來源于RNA 35S CaMV啟動子的對應于as-2元件(Lam et Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)復本的58bp序列插入MPr1116的限制位點NheI和DraIII得到。
為此，質粒pMRT1116在37℃下用25單位的NheI消化1小時，然后在37℃下用4單位的DraIII消化1小時。由此消化的質粒在QIAquick親和柱上分離，在37℃下在12μl 10X緩沖液3(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后再在QIAquick親和柱上純化1次。
含有2個as-2元件和as-1元件的70bp片段SpeI/DraIII從質粒pMRT1111得到。該質粒含有來源于通過加入“G”箱修飾的最小豌豆質體藍素啟動子上游35S RNA CaMV啟動子的對應于as-2元件(Lam etChua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)復本的58bp序列，該質粒通過lb-PCR以下列方式得到。單鏈連續DNA使用以下“定向”脫氧核苷酸產生-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID08)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA 3′(SEQ.ID09)-S5＝5′CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)-S7＝5′CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID14)100微微摩爾(100pmol)脫氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl 10X激酶緩沖液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15單位的激酶(Amersham)進行5′磷酸化30分鐘。這些磷酸化寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導”寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)為了進行LCR反應，10pmol的磷酸化定向脫氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的“引導”脫氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(NewEngland Biolabs)的存在下連接。該連接反應以GeneAmp PCR系統9700熱循環(Perkin Elmer，Norwalk，USA)進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環；和8個相同循環，各自由下列連續步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應混合物按照供應商的建議在QIAquick親和柱上純化。
最后，所得單鏈連續DNA的PCR擴增以GeneAmp PCR System 9700熱循環在各100pmol下列寡脫氧核苷酸探針5′CAIGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環，然后進一步在72℃下延伸5分鐘。
該反應混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在QIAquick柱上純化。將它們插入到在37℃下用BamHI消化1小時然后在37℃下用PstI消化1小時的質粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在QIAquick親和柱上純化，在37℃下在12μl10X緩沖液3(New EnglandBiolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在QIAquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。這些克隆之一pMRT1111通過測序檢定。
含有2個as-2元件和as-1元件的70bp片段通過25μg質粒pMRT1111在37℃下用40單位SpeI消化1小時、然后在37℃下用4單位DraIII消化1小時得到。該片段通過電泳在Nu-Sieve3％凝膠瓊脂糖(FMC，Rockland，USA)上分離，最后在QIAquick親和柱上純化。
連接用30ng去磷酸化質粒載體pMRT1116 NheI/DraIII和50ng該70bp片段在18℃下以20μl的反應體積在2.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和800單位的T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)的存在下進行15小時。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和使用在啟動子上選出的脫氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和在uidA序列上選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增進行分析。這些克隆之一的啟動子序列MPr1146(SEQ.ID05)通過測序檢定。
2.3.啟動子MPr1147的構建啟動子MPr1147(圖IV)通過將來自RNA 35S CaMV啟動子的含有as-2和as-1元件(Lam，1989；Lam等，1989)的44 bp序列插入與MPr1117(SEQ.ID04)的NheI和DraIII位點相鄰的限制位點得到。
為此，質粒pMRT1117在37℃下用25單位的NheI消化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。所產生的末端按照供應商的建議通過PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化，然后所得質粒在37℃下用4單位的DraIII消化1小時。由此修飾的質粒在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，在QIAquick親和柱上純化，并在37℃下在12μl 10X緩沖液3(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后再次在QIAquick親和柱上純化。
含有CaMV 35S的44bp的as-2和as-1元件的54bp片段PstI/DraIII從質粒pMRT1110得到。含有通過加入“G”箱修飾的最小豌豆質體藍素啟動子上游35S RNA CaMV啟動子的對應于as-2元件(Lam et Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)的44bp序列的質粒pMRT1110通過lb-PCR以下列方式得到。單鏈連續DNA使用下列“引導”脫氧核苷酸形成-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID08)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID09)-S5＝5′CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)-S6＝5′CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID13)
100微微摩爾(100pmol)脫氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl 10X激酶緩沖液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15單位的激酶(Amersham)在5′區中磷酸化30分鐘。這些磷酸化寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導”寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)為了進行LCR反應，10pmol的磷酸化“定向”脫氧核苷酸S1、S2、S5和S6在10pmol的“引導”脫氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10XDNA連接酶緩沖液和40單位Taq DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接。該連接反應以GeneAmp PCR系統9700熱循環進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環；和8個相同循環，各自由下列連續步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應混合物按照供應商的建議在QIAquick柱上純化。
最后，所得單鏈DNA的PCR擴增在熱循環GeneAmp PCR System9700中在各100pmol寡脫氧核苷酸探針5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl 10X Vent DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環，然后進一步在72℃下延伸5分鐘。該反應混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在QIAquick柱上純化。將它們插入在37℃下用BamHI消化1小時然后在37℃下用PstI消化1小時的質粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在QIAquick親和柱上純化，在37℃下在12μl 10X緩沖液3(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在QIAquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。該質粒pMRT1110具有的啟動子序列MPr1110通過測序檢定。
含有來源于CaMV啟動子的as-2和as-1序列的54bp片段通過25μg質粒pMRT1110在37℃下用80單位PstI消化1小時得到，然后所產生的末端按照供應商的建議通過Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化。由此修飾的質粒在37℃下用4單位的DraIII消化1小時，該54bp片段通過電泳在3％Nu-Sieve瓊脂糖凝膠(FMC，Rockland，USA)上分離，并最終在QIAquick親和柱上純化。連接用30ng如前所述制備的載體pMRT1117和50ng該54bp片段在18℃下以20μl的反應體積在2.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和800單位的T4DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行15小時。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和使用從啟動子選出的脫氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和從uidA序列選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增進行分析。這些克隆之一的啟動子序列MPr1147(SEQ.ID06)通過測序檢定。
2.4.啟動子MPr1154的構建啟動子MPr1154(圖IV)通過從存在于啟動子MPr1147(SEQ.ID04)中的CoYMV除去含有復制as-1-樣元件的44 bp序列得到。
為此，質粒pMRT1147在37℃下用20單位的SpeI消化1小時，在0.8％凝膠瓊脂糖上分離，在QIAquick親和柱上純化，并在18℃下以10μl反應體積在1μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下再連接15小時。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和使用從質粒選出的脫氧核苷酸5′ATTTAGGTGACACTATAG 3′和從uidA序列選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增進行分析。這些克隆之一的啟動子序列MPr1154(SEQ.ID07)通過測序檢定。
2.5.啟動子MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165的構建啟動子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165(圖VII)通過將在兩側具有限制位點的對應于35S RNA CaMV啟動子的as-2箱(Lam和Chua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的復本的70bp序列的一個或多個拷貝以5′＞3′方向或反過來、即以3′＞5′方向插入到MPr1116(SEQ.ID03)的BstEII位點中得到。
為此，質粒pMRT1116在37℃下用4單位的BstEII消化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。所產生的末端按照供應商的建議通過PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化，然后在37℃下在12μl 10X“緩沖液3”(New England Biolabs)和25單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時。最后，由此得到的質粒再次在QIAquick親和柱上純化。
含有2個“as-2”箱和“as-1”箱的70bp SpeI/DraIII片段從質粒pMRT1111得到。
含有來自通過加入“G”箱修飾的最小豌豆質體藍素啟動子上游的35S RNA CaMV啟動子的對應于as-2箱(Lam et Chua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的復本的58bp序列的質粒pMRT1111通過lb-PCR以下列方式得到。單鏈DNA在下列定向寡脫氧核苷酸的幫助下生產-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID08)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID09)-S5＝5′CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)-S7＝5′CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID14)100微微摩爾(100pmol)寡脫氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶緩沖液(Amersham)和500 pmol ATP(Sigma)的存在下用15單位的激酶(Amersham)進行5′磷酸化30分鐘。這些磷酸化脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。為了連接定向寡脫氧核苷酸，使用以下引導寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)為了進行LCR反應，10pmol的磷酸化定向寡脫氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的引導寡脫氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(NewEngland Biolabs)的存在下連接。該連接反應以“GeneAmp PCR系統9700”熱循環(Perkin Elmer，Norwalk，USA)進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環；和8個相同循環，各自由下列連續步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應混合物按照供應商的建議在QIAquick柱上純化。
最后，所得單鏈DNA的PCR擴增以“GeneAmp PCR System 9700”熱循環在各100pmol寡脫氧核苷酸探針5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環，然后進一步在72℃下延伸5分鐘。
來自該反應混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在QIAquick柱上純化。將它們插入到先前在37℃下用BamHI消化1小時然后在37℃下用PstI消化了1小時的質粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在QIAquick親和柱上純化，在37℃下在12μl 10X“緩沖液3”(New England Biolabs)和25單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在QIAquick親和柱上純化。為了進行連接，使如此處理過的25ng質粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得克隆之一的啟動子序列MPr1111通過測序檢定。
含有2個“as-2”箱和“as-1”箱的70bp片段通過25mg質粒MPr1111在37℃下用40單位的SpeI消化1小時、然后在37℃下用4單位的DraIII消化1小時而得到。該片段通過電泳在Nu-Sieve 3％瓊脂糖凝膠(FMC，Rockland，USA)上分離，并最終在QIAquick親和柱上純化。該片段的末端按照供應商的建議通過Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化，然后在QIAquick親和柱上再次純化。
連接用30 ng如前所述制備的pMRT1116載體和50ng 70bp片段在18℃下在20μl反應混合物中在2.0μl 10X T4 DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行15小時。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用三分之一的連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和借助位于啟動子5’區的通用SP6寡脫氧核苷酸(5′TAAATCCACTGTGATATCTTATG3′)和在uidA序列上選出的寡脫氧核苷酸5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增進行分析。這種克隆策略使得生產的70bp片段能夠以5′＞3′方向(序列as-2/as-2/as-1以和它們的天然啟動子相同的方向克隆)、以3′＞5′反義方向(與CaMV 35S啟動子中存在的相反的方向)和以一個或多個拷貝插入到載體中。下列合成和嵌合啟動子可使用這種策略得到MPr1162(SEQ.ID19)，相當于以正常的5’＞3’方向插入單70bp序列；MPr1163(SEQ.ID20)，相當于以正常的5’＞3’方向插入2個70bp序列；MPr1164(SEQ.ID21)，相當于以相反或反義方向插入單70bp序列；和MPr1165(SEQ.ID22)，相當于以正常的5’＞3’方向插入4個70bp序列。這些克隆中的每一個都通過測序檢定。
2.6.啟動子MPr1167、MPr1168和MPr1169的構建啟動子MPr1167、MPr1168和MPr1169(圖VII)由MPr1147(SEQ.ID06)產生。它們通過將含有對應于35S RNA CaMV啟動子的as-2箱(Lam etChua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的復本的58bp序列的一個或多個正常的5’＞3’方向(即以和CaMV啟動子中的序列的天然方向相同的方向克隆)的70bp序列插入到MPr1147的BstEII位點中而得到。
為此，質粒pMRT1147在37℃下用4單位的BstEII消化1小時，然后在Qiaquick親和柱上純化。所產生的末端按照供應商的建議通過PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化，然后在37℃下在12μl 10X“緩沖液3”(New England Biolabs)和25單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小時。最后，由此得到的質粒再次在QIAquick親和柱上純化。
含有2個“as-2”箱和“as-1”箱的70bp SpeI/DraIII片段從質粒pMRT1111得到，其生產如前所述。該片段的末端如上所述加以鈍化。
連接用30ng如前所述制備的載體pMRT1147和50ng 70bp片段在18℃下在20μl反應混合物中在2.0μl 10X T4 DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行15小時。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌通過與三分之一的連接反應混合物反應而轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化和使用位于啟動子5’區的通用SP6寡脫氧核苷酸(5′TAAATCCACTGTGATATCTTATG3′)和從uidA序列選出的寡脫氧核苷酸5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因擴增進行分析。下列合成啟動子可通過前面的方法制備MPr1167(SEQ.ID23)，相當于以正常的5’＞3’方向插入3個70bp序列；MPr1168(SEQ.ID24)，相當于以正常的5’＞3’方向插入2個70bp序列；和MPr1169(SEQ.ID25)，相當于以正常的5’＞3’方向插入單70bp序列。這些克隆中的每一個都通過測序檢定。
2.7.含有啟動子MPr1218的雙元載體pMRT1218的生產用于GUS報道基因在玉米種子胚乳中的表達的參比啟動子是編碼屬于γ-玉米醇溶蛋白族的玉米種子中的28kDa貯藏蛋白的基因的啟動子。這種構建物已在以本申請人的名義于1999年9月30日提交的法國專利申請FR9912373中作了描述，該文結合在此，目的是具體說明所述參比啟動子和載體。將如Reina等(1990)所述包含在質粒p63中的1.7kbγ-玉米醇溶蛋白全長啟動子序列(Prγ-玉米醇溶蛋白)置于命名為pMRT1126的載體中的uidA-IV2/term-nos序列的上游。載體pMRT1126在上述法國專利申請中作了充分描述，其說明書結合在此以便說明該載體。載體pMRT1126中的啟動子Mpr1126從HMWG-Dx5(高分子量麥谷蛋白)啟動子通過除去位于核苷酸-142上游的序列得到，該序列包含2個“醇溶蛋白樣”箱、2個“GATA”箱、1個“G”箱和激活物元件。該啟動子片段通過PCR擴增并分離。1.7kbγ-玉米醇溶蛋白啟動子通過15μg質粒p63在37℃下用限制酶HindIII和BamHI消化1小時得到。由此釋放的1.7kb Prγ-玉米醇溶蛋白片段在0.8％瓊脂糖凝膠上使用《Concert Rapid Gel Extraction System》試劑盒分離。
并列地，10μg質粒pMRT1126在37℃下用限制酶HindIII和BamHI消化1小時。該載體片段然后在0.8％瓊脂糖凝膠上使用《Concert RapidGel Extraction System》試劑盒分離，并在10X“緩沖液3”的存在下用40單位的小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)在37℃下去磷酸化1小時。
連接反應用50ngγ-玉米醇溶蛋白啟動子片段和100ng質粒pMRT1126、以10μl的反應體積、在塞子T4 10X DNA連接酶和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下、以如上所述的《GeneAmp PCR System 9700》熱循環進行。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用全部連接反應混合物轉化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pMRT1218。
3.含有啟動子的雙元質粒的構建用3種類型的雙元載體來克隆各種表達盒。載體pGA492用于制備含有MPr1116、MPr1146、MPr1147和MPr1092的盒，以便分別制造表達盒或雙元載體pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172和pGA492MPr1092。載體pGA492如下所述制備。25μg量的質粒pGA492(An，1986)用80單位的HindIII在37℃下消化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。該質粒的5′突出端按照供應商的建議使用PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此修飾的質粒用80單位的EcoRI在37℃下消化1小時，然后該缺失其291bp片段的載體在0.7％瓊脂糖凝膠上分離，并在QIAquick親和柱上純化。25μg量的質粒pGA492(An，1986)用80單位的HindIII在37℃下消化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。
載體pMRT1118用于在啟動子MPr1162、MPr1164、MPr1165、MPr1167和MPr1092的控制下克隆這些表達盒，以分別得到載體pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188和pMRT1182。
質粒pMRT1118在也是以本申請人的名義于1999年9月3日提交的法國專利申請FR9911112中作了充分描述，該申請的具體說明結合在此作用參考。雙元質粒pMRT1118(5971pb)通過利用AvrII酶消化將T-DNA片段引入到另一個去磷酸化質粒(該質粒也在同一申請人的前述在先申請中作了充分描述，并命名為pMRT1106，該文也具體結合在此作為參考)的AvrII位點中得到。為了實現插入，pMRT1106質粒DNA(5μg)用AvrII酶消化，借助《QIAquick PCR Purification》試劑盒純化，然后用50單位的小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)以120μl終反應混合物體積在12μl 3x 10緩沖液(New England Biolabs)的存在下在37℃下去磷酸化1小時，通過電泳在0.6％瓊脂糖凝膠上在TBE緩沖液中分離，用《QIAquick Gel Extraction》試劑盒純化，在上述條件下用小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化1秒鐘，最后用《QIAquick PCR Purification》試劑盒純化并轉移到50μl H2O中。
PCR連接反應用32.5ng經過消化的去磷酸化質粒pMRT1106和50ng的以10μl反應混合物體積在1μl T4 10x DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行了消化的T-DNA片段進行。連接包含各自包括2個步驟的180個循環，第一個是在《GeneAmp PCR System 9700》熱循環中在10℃下進行30秒，第二個步驟是在30℃下進行30秒。
轉化先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌(Hanahan，1983)。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取(Birnboim et Doly，1979)并通過酶消化和測序加以檢定。所得質粒命名為pMRT1118。
這種載體然后用下列方式制備25μg量的質粒在37℃下用80單位的HindIII消化1小時，然后在Qiaquick親和柱上純化。該質粒的5′突出端按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此修飾的質粒用80單位的EcoRI在37℃下消化1小時，然后該載體在0.7％瓊脂糖凝膠上分離，并在QIAquick親和柱上純化。其然后按照制造商的建議在37℃下用10單位的小牛腸堿性磷酸酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。
載體pMRT1195用于在啟動子MPr1116、MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165、MPr1167、MPr1168、MPr1169和MPr1092的控制下克隆這些表達盒，以分別得到載體pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。
載體pMRT1195也在以本申請人的名義于1999年9月3日提交的在先法國申請FR9911112中作了描述，該文結合在此作為特定方面的參考，該載體次序包含oriRK2區加上ori ColEI區，接著是nptIII和nptII區，然后是trfA區，隨后接著轉化DNA左邊緣區，nos終止子區，條棒區(編碼膦絲菌素乙酰轉移酶-一種引起除草劑抗性的蛋白質)，稻米肌動蛋白內含子-1區，聚腺苷酸化轉錄終止信號區，多克隆位點區，然后是轉化DNA右邊緣區。載體pMRT1195用以下方式制備。20μg量的質粒pMRT1195在37℃下用15單位的HpaI消化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。由此斷開的載體按照制造商的建議用10單位的小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)在37℃下去磷酸化1小時，然后在QIAquick親和柱上純化。
3.1.pMRT1152的生產表達盒MPr1116/uidA-IV2/nos term在雙元質粒pGA492的修飾HindIII位點克隆。它從用80單位的PstI在37℃下消化1小時并在QIAquick親和柱上純化的質粒pMRT1116得到。該質粒的5′突出端按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此修飾的質粒同時用80單位的EcoRI和40單位的XmnI在37℃下消化1小時，然后對應于表達盒的2.5kb DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在QIAquick親和柱上純化。
連接通過將100ng如上所述制備的雙元質粒pGA492和50ng表達盒在18℃下以20μl的反應體積在2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下混合在一起過1夜來進行。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了四環素(12mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化以及通過使用從該雙元質粒的轉化DNA選出的脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′和從uidA序列中的表達盒選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因擴增加以分析。所得克隆命名為pMRT1152。
3.2.雙元質粒pMRT1171的生產表達盒MPr1146/uidA-IV2/nos term通過與對質粒pMRT1152所述的相同的方案在雙元質粒pGA492的修飾HindIII位點克隆，不同的只是該表達盒從質粒pMRT1146分離。所得克隆命名為pMRT1171。
3.3.雙元質粒pMRT1172的生產表達盒MPr1147/uidA-IV2/nos term通過與對質粒pMRT1152所述的相同的方案在雙元質粒pGA492的修飾HindIII位點克隆，不同的只是該表達盒從質粒pMRT1147分離。所得克隆命名為pMRT1172。
3.4.雙元質粒pGA492MPr1092的生產將啟動子片段MPr1092和uidA-IV2/nos term序列插入如上所述制備的雙元質粒pGA492中。這兩個片段以下列方式制備-CaMV D35S prom通過10μg質粒pJIT163Δ在37℃下用40單位的KpnI消化1小時而分離。該線型化質粒的末端按照制造商的建議使用6單位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下鈍化30分鐘。由此修飾的質粒在QIAquick親和柱上純化，然后用80單位的HindIII在37℃下再消化1小時。對應于該啟動子的743bp片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在QIAquick親和柱上純化。
-盒“uidA-IV2/nos term”通過4μg質粒pMRT1092用40單位的HindIII和EcoRI消化1小時而得到。對應于序列uidA-IV2/nos term的2.2kb片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在QIAquick親和柱上純化。
這三個片段之間的連接通過將100ng雙元質粒、50ng啟動子片段和50ng對應于“uidA-IV2/nos term”序列的片段以20μl的反應體積、在2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下混合而進行。培養通過使連接混合物經受198個各自由“在30℃下培養30秒和在10℃下培養30秒”組成的循環而以熱循環進行。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了四環素(12mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化以及使用從雙元質粒的轉化DNA選出的脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和從uidA序列中的表達盒選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因擴增加以分析。保留的克隆之一命名為pGA492MPr1092。
質粒pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172和pMRT1182按照Holsters等(1978)描述的技術轉移到根癌農桿菌菌株LBA4404中。在添加了利福平(50mg/l)和四環素(5mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取，通過向細胞再懸浮緩沖液中加入溶菌酶(25mg/ml)進行修飾。所得質粒DNA通過酶消化以及使用從質粒選出的脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和從表達盒選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因擴增進行分析。所得農桿菌克隆用于進行植物遺傳轉化。
3.5.雙元載體pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187和pMRT1188的生產表達盒MPr1162/uidA-IV2/nos term、MPr1164/uidA-IV2/nos term、MPr 1165/uidA-IV2/nos term和MPr1167/uidA-IV2/nos term分別從質粒pMRT1162、pMRT1164、pMRT1165和pMRT1167生產，并將它們如前所述克隆到雙元質粒pMRT1118中。各10μg量的質粒pMRT1162、pMRT1164、pMRT1165和pMRT1167在37℃下用PstI消化1小時，然后在親和柱上純化。這些不同的斷開的載體的5’突出端按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此處理過的載體再次在37℃下同時用20單位的EcoRI和10單位的XmnI消化1小時。對于每個消化作用來說，對應于表達盒的DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在Qiaquick親和柱上純化。
連接以熱循環(GeneAmp PCR Systems 9700)通過將100ng如上所述制備的雙元質粒pMRT1118和50ng表達盒以12μl反應體積在1.2μl T410X DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3單位的10X DNA連接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而完成。該連接反應由一系列各自由“在10℃下的30秒步驟和在30℃下的30秒步驟”組成的200個相同循環組成。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過用酶BamHl和EcoRI進行的酶消化加以分析。所得克隆命名為pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187和pMRT1188，它們分別含有啟動子MPr1162、MPr1164、MPr1165和MPr1167。
3.6.陽性對照雙元載體pMRT1182的生產雙元載體pMRT1182通過將PrD35S CaMV啟動子片段和uidA-IV2/term-nos序列插入到如上所述制備的雙元質粒pMRT1118中得到。
PrD35S CaMV啟動子通過10μg質粒pJIT163Δ在37℃下連續用KpnI和HindIII消化1小時而分離。對應于pD35S CaMV的743bp片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
“uidA-IV2/nos term”序列通過4μg質粒pMRT1092用40單位的HindIII和EcoRI消化1小時而得到。對應于“uidA-IV2/nos term”序列的2.2kb片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
連接在100ng雙元質粒、50ng PD35S CaMV片段和50ng對應于uidA-IV2/term-nos序列的片段的存在下以20μl的反應體積、在T4(1X)DNA連接酶緩沖液和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行。培養如前所述以《GeneAmp PCR System 9700》熱循環通過PCR循環進行。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質粒命名為pMRT1182。
3.7.雙元載體pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252和pMRT1253的生產表達盒MPr1116/uidA-IV2/nos term、MPr1154/uidA-IV2/nos term、MPr1162/uidA-IV2/nos term、MPr1163/uidA-IV2/nos term、MPr1164/uidA-IV2/nos term、MPr1165/uidA-IV2/nos term、MPr1167/uidA-IV2/nos term、MPr1168/uidA-IV2/nos term和MPr1169/uidA-IV2/nos term分別從質粒pMRT1116、pMRT1154、pMRT1162、pMRT1163、pMRT1164、pMRT1165、pMRT1167、pMRT1168和pMRT1169生產，并將它們克隆到雙元載體pMRT1195的HpaI位點中。各10μg量的質粒pMRT1116、pMRT1154、pMRT1162、pMRT1163、pMRT1164、pMRT1165、pMRT1167、pMRT1168、pMRT1169在37℃下同時用20單位的PstI、20單位的EcoRI和10單位的XmnI消化1小時。對于每個消化作用，與表達盒對應的DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在Qiaquick親和柱上純化。這些不同片段的5′突出端按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。連接以熱循環(GeneAmp PCR Systems 9700)通過將100ng如上所述制備的雙元載體pMRT1195和50ng表達盒以12μl的反應體積在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3單位10X DNA連接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而進行。該連接反應由一系列各自由“在10℃下的30秒步驟和在30℃下的30秒步驟”組成的200個相同循環組成。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過用酶BamHI和EcoRI進行的酶消化加以分析。所得克隆命名為pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252和pMRT1253，它們分別含有啟動子MPr1116、MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165、MPr1167、MPr1168和MPr1169。
3.8.陽性對照雙元載體pMRT1254的生產雙元載體pMRT1254在評估植物中的表達期間用作陽性對照。
將表達盒MPr1092/uidA-IV2/nos term克隆到如上所述制備的雙元載體pMRT1195的HpaI位點中。它通過10μg質粒pMRT1182用40單位的KpnI在37℃下消化1小時、該消化產物在親和柱上純化、然后用40單位的EcoRI消化而得到。對應于表達盒的2.8kb DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在Qiaquick親和柱上純化。該片段的5’突出端sortantes按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。連接以熱循環(GeneAmp PCR Systems 9700)通過將100ng如前所述制備的雙元載體pMRT1195和50ng表達盒以12μl的反應體積在1.2μlT4 10X DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3單位10X DNA連接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而進行。該連接反應由一系列各自由“在10℃下的30秒步驟和在30℃下的30秒步驟”組成的200個相同循環組成。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過用酶BamHI和EcoRI進行的酶消化加以分析。所得克隆命名為pMRT1254。
3.9.陰性對照雙元載體pMRT1255的生產雙元載體pMRT1255在評估植物中的表達期間用作陰性對照。
將喪失了啟動子并與“uidA-IV2/nos term”序列對應的表達盒克隆到雙元載體pMRT1195的HpaI位點中，以使用這種質粒作為陰性對照。
該序列通過10μg質粒pMRT1163在37℃下用40單位的BamHI消化1小時、在親和柱上純化該消化產物、然后用40單位的EcoRI在37℃下消化1小時而得到。與該無啟動子的表達盒對應的2.2kb DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在Qiaquick親和柱上純化。該片段的5′突出端按照供應商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。
連接以熱循環(GeneAmp PCR Systems 9700)通過將100ng如上所述制備的雙元載體pMRT1195和50ng表達盒以12μl的反應體積在1.2μlT4 10X DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies )、1.2μl 25mM ATP溶液和3單位10X DNA連接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而進行。該連接反應由一系列各自由“在10℃下的30秒步驟和在30℃下的30秒步驟”組成的200個相同循環組成。先前制備的有活力且感受態的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應混合物轉化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養基上選出的所得克隆的質粒DNA按照堿裂解法提取并通過用酶BamHI和EcoRI進行的酶消化加以分析。所得克隆命名為pMRT1255。
4.通過瞬時表達實驗測量和對比本發明的不同啟動子的表達水平。
4.1.培養物和植物材料的生產。
4.1.1煙草的體外培養物，葉制劑。
瞬時表達實驗用6周大的煙草葉(Nicotiana tabacum L.)品種PBD6進行。成熟的煙草cv.PBD6種子在飽和次氯酸鈣溶液(70g/l)中滅菌10分鐘，然后用無菌去離子水沖洗三次5分鐘。將這些無菌種子置于MS20培養基(Murashige和Skoog，1962)上并在培養室中培養6周(恒溫24℃，光周期為16小時光/8小時黑暗，發光強度為200μmol光子.m-2.sec-1)。
為了避免葉肉細胞在轉化過程中分裂，在用基因槍轉化前24小時從6周大的煙草植物PBD6上切下2片主葉，并將其面朝上附著地置于溫和的質壁分離BY3培養基上(鹽MS4,4g/l，肌醇100mg/l，硫胺1mg/l，KH2PO4 200mg/l，蔗糖30g/l，山梨糖醇45,5g/l，2,4D 1mg/l，pH5.8)。
4.1.2.玉米種子的生產和制劑。
瞬時表達實驗用L2玉米種子(品種SN 87 165)的胚乳進行，這些玉米種子是從在24℃、60％相對濕度和16小時光/8小時黑暗的光周期條件下在人工氣候室中培養的玉米植物得到的。授粉12天(12DAP)后，將玉米種子取出并在20％Domestos浴中滅菌，同時攪拌5分鐘。通過用無菌去離子水連續沖洗除去Domestos后，在無菌條件下仔細地移開果皮和糊粉細胞層。切向割開剛才暴露出的胚乳并將其置于用最小Murashige和Skoog培養基(MS5524，Sigma)浸透的濾紙上。
4.1.3.玉米葉的生產瞬時表達實驗用L2玉米(品種SN 87 165)的葉子進行，這些葉子是從在24℃、60％相對濕度和16小時光/8小時黑暗的光周期的條件下在人工氣候室中培養2周后的植物得到的。
發芽12天后，取下最年幼的葉子并在20％Domestos浴中滅菌，同時攪拌5分鐘。通過用無菌去離子水連續沖洗除去Domestos后，將這些葉子放置到弱質壁分離培養基N6P60.4M(鹽MS 3.98g/l，維生素N6 100mg/l，L-脯氨酸700mg/l，水解酪蛋白(casein hydrosylate)100mg/l，蔗糖20g/l，山梨糖醇36,4g/l，甘露糖醇36,4g/l，2,4D 1mg/l，pH5.8，植物凝膠(phytagel)3g/l)上24小時，面朝上附著，以避免葉細胞在轉化過程中分裂。
4.2.用嵌合構建物DNA包被的金顆粒Biolistic轉化需要優先將DNA沉積到直徑為0.6μm的球形金珠上，這些金珠已用無水乙醇(99.98％，小于0.02％的水)滅菌10分鐘，用無菌去離子水洗滌4次，并最終在-20℃下在50％甘油溶液中儲存最多4周。
在這些轉化實驗中所用的所有對照和測試質粒的濃度都調節至1μg/μl。在每個轉化實驗中，共同轉化內部參比對照(pCaMV35Sluc)，以使不同實驗間GUS活性的差異正常化(Leckie等，1994)。
DNA向如上制備的金珠上的包被在無菌室中在層流下進行。1.8mg無菌珠粒在30μl甘油50％中的懸浮液試樣在渦旋中充分混合1分鐘，然后與含有4μg要測試的質粒之一和2μg參比質粒pCaMV35Sluc的20μlDNA懸浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5M CaCl2并用力混合10秒。接著向該混合物中加入20μl 0.1M亞精胺并將整個混合物在渦旋中再攪拌30秒。這些珠粒通過將該混合物在冰中培養15分鐘繼續進行DNA包被，然后包被的珠粒以低速率離心5秒并用無水乙醇洗滌兩次。
洗滌后，將這些包被的珠粒再懸浮于32μl無水乙醇中，進行超聲處理三次，每次持續2秒，在渦旋中用力混合15秒，然后立即在按照供應商的建議制備的Biolistic PDS-1000/He系統(BioRad，Hercule，USA)的無菌“大載體”圓盤上分成4等份試樣。“大載體支持物/帶有珠粒沉積物的大載體”的整個組件放置干燥5分鐘。
4.3煙草葉組織的轟擊和瞬時表達按照供應商(BioRad，Hercule，USA)有關操作法和裝置的不同組件的裝配的通用建議，使用Biolistic PDS-1000/He基因槍系統進行對煙草葉的轟擊。每片葉子在下列發射條件下連續轟擊兩次-用于加速包被金珠所選擇的氦壓為6200kPa(900psi)。
-將植物樣品置于距離珠粒加速區9cm處。
-發射在27mm汞的真空中進行。
轟擊完后，將這些葉子置于BY3培養基中并在培養室中在黑暗中在24℃下培養48小時。這種培養使得引入到細胞中的轉基因發生瞬時表達。
4.3.1通過組織化學染色評估不同啟動子的活性β-葡糖醛酸糖苷酶表達的揭示如Jefferson等(1987)所述通過組織化學染色進行。在培養室中培養48小時后，將每片葉子沿著中棱縱軸切成兩半。半片葉子在用于β-葡糖醛酸糖苷酶(5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)500mg/l，Triton x100 0.05％溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，pH7.0)的染色緩沖液中在37℃下培養48小時，而另半片在液氮中冷凍，然后儲存在-80℃下。
染色后，通過將這些葉子分別浸到兩份95％乙醇浴中3小時和12小時進行漂白，然后用蒸餾水沖洗并在兩張玻璃紙之間平展干燥。這些組織化學染色的結果見圖V。不同構建物的啟動子活性通過每半片葉子在用總量為2μg的帶有GUS報道基因的DNA轟擊兩次后所顯示出的藍色斑點的數量來評估。
鑒定出兩類啟動子。用啟動子MPr1116和MPr1146轟擊的葉子顯示出的平均藍色斑點量比在相同條件下用相同量的參比對照質粒pMRT1092轟擊的葉子顯示出的藍色斑點量明顯多150(圖VIII)。用啟動子MPr1117和MPr1147轟擊的葉子顯示出包含在50和150之間的平均藍色斑點量(參見圖VIII)。
總之，嵌合啟動子MPr1116和MPr1146使得能夠或促進β-葡糖醛酸糖苷酶的表達到大于或等于使用強組成型參比啟動子D35S prom得到的水平。
4.3.2.利用發光酶活性測定量化不同啟動子對β-葡糖醛酸糖苷酶的表達將冷凍的半片葉子在乳缽中磨碎，然后讓這些粉末在提取緩沖液(Tris磷酸鹽25mM pH7.8，二硫蘇糖醇2mM，1，2-二氨基環己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中以1ml緩沖液對200mg組織的比例融解。使該混合物均勻后在冰中培養15分鐘，然后通過以16060g離心5分鐘使澄清。
使用“GUS-光化學發光報道基因測定”檢測試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供應商的建議測量20μl澄清的粗制葉提取物的GUS活性。光發射的測量使用Lumat LB-9507發光計(EGG-Berthold，BadWildbad，Germany)進行。
使用“熒光素酶測定系統”檢測試劑盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供應商的建議測量20μl粗制葉提取物的熒光素酶活性。光發射的測量使用Lumat LB-9507發光計進行。
結果呈現在圖VI中。對于每項實驗(1片受過轟擊的葉子＝1份粗提物)，計算利用發光計測量的β-葡糖醛酸糖苷酶和熒光素酶活性間的比例。確定所給構建物不同實驗的均值和標準平均誤差。所得結果顯示啟動子MPr1116和MPr1146(圖IV)顯示出比雙35S CaMV參比啟動子(MPr1092，圖II)顯著增加的表達。啟動子MPr1146與啟動子MPr1116的不同在于在位于CoYMV啟動子的“as-1樣”箱和CsVMV啟動子的綠色組織特異性元件之間的35S CaMV啟動子的“as-1”箱前面插入“as-2”箱的復本。在MPr1146中插入來自35S CaMV啟動子的元件顯示稍微增加了關于啟動子MPr1116(4.5％)的平均表達度。這些元件似乎與這樣一種組合的正向協同作用有關。
啟動子MPr1116和MPr1117(圖IV)的不同僅在于MPr1117中加入了來自CoYMV啟動子的“as-1樣”箱。由啟動子MPr1117帶來的平均表達明顯低于用MPr1116(22％)得到的。這種結果提示位于嵌合啟動子5’區中的來自CoYMV的“as-1樣”元件在啟動子活性中起阻抑物作用。
啟動子MPr1147(圖IV)與啟動子MPr1117的不同在于在來自CoYMV啟動子的“as-1樣”元件和來自CsVMV啟動子的綠色組織特異性元件之間插入了“as-1”和“as-2”箱。這些箱的加入和與其他元件的相互作用看來導致了關于MPr1117(43％)的平均表達率的顯著減小。這些元件的聯合似乎有助于負協同作用。這可以用于當在轉化細胞中需要相對低的表達水平時的構建物中，例如當為選擇或標記目的而提供抗生素或除草劑抗性時。雖然如此，但由啟動子MPr1147帶來的最弱的表達與由啟動子MPr1092得到的僅相差51％。就嵌合啟動子而言，這種負作用可以解釋為與反式激活元件的競爭或者這些因子對啟動子的位阻作用，因此減小了其活性。
最后，嵌合啟動子MPr1116和MPr1146似乎引起了煙草葉中GUS報道基因的平均表達，它明顯優于用MPr1092得到的。啟動子MPr1092在文獻中一般報道為是最強的嵌合啟動子(比強組成型啟動子CaMVp35S大約10倍(Kay等，1987))，常規用于基因轉移。MPr1116和MPr1146因此可歸類為迄今已知的最強的嵌合啟動子。
如上所述所研究的較弱的表達啟動子可以作為啟動子用于為選擇目的而帶來抗生素抗性，例如以和“nos”型啟動子相同的方式。
圖IX說明了補充結果。對于每項實驗，計算用發光計測量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和熒光素酶活性之間的比值。確定所給構建物不同實驗的均值和標準平均誤差。所得結果顯示-啟動子MPr1163和MPr1165(參見圖VII)與啟動子MPr1116和MPr1146(參見圖VII)很象，引起報道基因的平均表達比用參比啟動子MPr1092得到的分別稍大8％、5％、6.5％和11.5％。啟動子MPr1163和MPr1165與啟動子MPr1116的不同在于在來自CsVMV啟動子的綠色組織特異性區的下游立即分別插入了2列和4列as-2/as-2/as-1箱。向MPr1116中插入來自CaMV 35S啟動子的多數箱沒有使關于啟動子MPr1116的平均表達度增加。
-啟動子MPr1146和MPr1162的平均活性的比較顯示向MPr1116中將來自CaMV啟動子的一系列激活元件“as-2/as-2/as-1”克隆到CsVMV啟動子的綠色組織特異性區的5’區中(MPr1146就是這樣的)比將這些相同元件克隆到該序列的3’區中(MPr1162是這樣的)更有利。該數據表明激活元件彼此的位置與啟動子對有效轉錄的能力顯著相關。因此激活元件之間有協同作用。
-啟動子MPr1162、MPr1163和MPr1165的平均活性的比較顯示as-2/as-2/as-1箱在CsVMV啟動子的綠色組織特異性區下游的立即增殖沒有導致這些啟動子在瞬時表達中的活性顯著成比例增加。該數據傾向表明在這類結合物中裝配的所有這些激活元件箱之間沒有正向協同作用。不希望受到理論的限制，這可以解釋為反式激活元件的競爭或這些反式激活元件對啟動子的位阻問題。
-所報道的來自CoYMV的“as-1樣”箱的負作用(該負作用已在上文中比較只有一個這種箱的啟動子MPr1116和有兩個這種箱的啟動子MPr1117的活性時提到過)得到證實。這些“as-1樣”箱在啟動子MPr1154中關于啟動子MPr1147的缺失使得啟動子的活性顯著增加65％。
-啟動子MPr1162和MPr1164(圖VII)只是CsVMV序列下游來自CaMV的一系列as-2/as-2/as-1箱的方向不同。這兩種啟動子之間沒有觀察到顯著差異。這些箱的方向因此至少以目前的構型沒有顯示出對嵌合啟動子活性的任何削弱作用。
最后，嵌合啟動子MPr1163和MPr1165看來刺激了煙草葉中GUS報道基因的平均表達，程度至少與用啟動子MPr1092得到的一樣大。嵌合啟動子MPr1163和MPr1165與啟動子MPr1116和MPr1146很象，因此可歸類為迄今所述的最強的嵌合啟動子，并因此可作為CaMVD35S(雙35S或增強的)啟動子的代替物在基因轉移程序中常規用于雙子葉植物。
4.4.玉米轟擊和瞬時表達對不同玉米組織和其中的幼葉和胚乳的轟擊按照供應商(BioRad，Hercule，USA)有關操作法和裝置的不同組件的裝配的通用建議使用Biolistic PDS-1000/He基因槍系統進行。每份胚乳用直徑為0.6μm的鎢顆粒連續轟擊兩次，使用以下發射條件-用于加速顆粒的氦壓為6200kPa(900psi)，-植物樣品置于距離顆粒加速區6cm處，-發射在27mm汞的真空中進行。
轟擊結束后，將胚乳放置在適當位置并在培養室中在黑暗中在26℃下培養24小時，使得引入到細胞中的轉基因能夠瞬時表達。
4.5.通過組織化學染色評估不同啟動子在玉米胚乳中的活性β-葡糖醛酸糖苷酶表達的揭示如Jefferson等(1987)所述通過組織化學染色進行。在培養室中培養48小時后，每份胚乳在37℃下在已加入了Triton x100 0.05％的存在于0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.0中的500mg/l5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物X-Gluc底物的存在下培養48小時。
染色后，每份胚乳用水沖洗，然后儲存在96％乙醇浴中。
不同構建物的啟動子活性通過每份胚乳在用總量為2μg的帶有GUS報道基因的DNA轟擊兩次后所顯示出的藍色斑點的數量來評估。
組織化學染色結果的分析顯示可鑒定出兩類啟動子。用啟動子MPr1092、MPr1116、MPr1146和MPr1147轟擊的胚乳顯示出平均相對較少的小直徑藍色斑點，數量范圍從1至15。用啟動子MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1167和MPr1169以及參比對照啟動子MPr1218轟擊的胚乳顯示的藍色斑點數在10至30之間，這些斑點的直徑大于用前面所述的啟動子得到的那些。
4.6.使用發光酶測定評估玉米胚乳中β-葡糖醛酸糖苷酶的表達將冷凍的胚乳部分在試管中在以1ml緩沖液對200mg組織比例的提取緩沖液(Tris磷酸鹽25 mM pH7.8，二硫蘇糖醇2mM，1，2-二氨基環己烷N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中磨碎。使該混合物均勻后在冰中培養15分鐘，然后通過以16060g離心5分鐘使澄清。使用“GUS-光化學發光報道基因測定”檢測試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供應商的建議測量20μl澄清的粗提物的GUS活性。光發射的測量使用Lumat LB-9507發光計(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)進行。使用“熒光素酶測定系統”檢測試劑盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供應商的建議測量20μl粗提物的熒光素酶活性。發射光的測量使用Lumat LB-9507發光計進行。
結果呈現在圖VIII中。對于每份粗提物，計算利用發光計測量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和熒光素酶活性之間的關系。確定所給構建物不同實驗的均值和標準平均誤差。所得結果顯示原始嵌合病毒啟動子MPr1116帶來的活性比用參比啟動子MPr1218得到的活性大3.8倍。這表明含有“胚乳樣”箱的嵌合啟動子具有GUS報道基因在玉米種子中表達所必需的信號。從啟動子MPr1116衍生的嵌合啟動子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165具有的活性是用MPr1218得到的活性的4.7至6倍，是用MPr1116得到的1.2至1.6倍。考慮到從MPr1116衍生的所有嵌合啟動子都具有包含除了來自CaMV啟動子的激活元件之外的相同調節元件或箱的相同基礎序列這一事實，所觀察到的活性的差異似乎是由于來自CaMV的激活元件導致的。含有來自CoYMV的“as-1樣”箱的復本的啟動子(啟動子MPr1167、MPr1168和MPr1169的情況就是這樣)都顯示出比只含有單個“as-1樣”箱的啟動子(啟動子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165的情況是這樣)顯著小的平均活性。這些結果似乎證實了來自CoYMV的這種元件的阻抑物作用，這種作用已在煙草的瞬時表達中觀察到。但是，由啟動子MPr1116和MPr1154帶來的平均活性的比較顯示在MPr1154中“as-1樣”箱的缺乏及其被來自CaMV的激活序列“as-2/as-1”的置換并沒有導致關于MPr1116的活性的增加。由此看來，似乎是CsVMV的104bp序列的5’區中立即插入的箱的位置不利于活性而不是箱本身。不希望受到理論的束縛，很可能在該位置中的反式激活物的附著誘導了整個“啟動子序列/蛋白質”組件中的構象變化，且這不利于其他激活元件和/或轉錄機構的附著。對結果的分析顯示“as-2/as-2/as-1”箱組合的重復數有可能調節嵌合啟動子的活性。例如，在具有單列元件的Mpr1162、具有兩列這種元件的Mpr1163、和具有4列這種元件的Mpr1165之間觀測到了平均活性的增加，雖然差異并不非常顯著。以相同的方式，分別具有1、2和3列箱的MPr1169、MPr1168和MPr1167之間的活性也增加了。最后，這些激活箱或元件的方向看來對活性沒有任何削弱作用，因為在啟動子MPr1162和MPr1164之間沒有觀測到顯著差異。
總之，按照本發明制造的嵌合啟動子在單子葉植物中是功能性和操作性的，并顯示出特別是在玉米胚乳中的強活性。啟動子MPr1163和MPr1165是在授粉12天后的玉米胚乳中的瞬時表達中顯示出最大的GUS基因活性的啟動子。這種活性是高水平的，因為它比用引起玉米胚乳中主要的貯存蛋白γ-玉米醇溶蛋白的活性表達的強啟動子得到的高大約6倍。這些啟動子因此可常規用于單子葉植物的基因轉移程序中，作為其他異源啟動子的有效代替物。
5.穩定轉化后不同啟動子在煙草中的表達5.1.煙草的穩定轉化煙草轉化(Nicotiana tabacum L.，品種PBD6)通過按照Horsch等(1985)描述的方法用重組農桿菌感染6周大的從煙草植物分離的葉片來進行。
轉化期間，陪替氏培養皿在培養室中在下列條件下培養溫度為24℃，光周期為16小時黑暗/8小時光，發光強度為200μmol光子.m-2.sec-1，且除了開始的共培養步驟以外，整個callogenesis、再生和生根步驟都在添加了Augmentin(400mg/l)和卡那霉素(200或100mg/ml)的不同選擇培養基上進行；所用的不同步驟和培養基如下-共培養步驟持續3天，在用農桿菌感染植物細胞期間，在添加了1mg/l芐氨基嘌呤和0.1mg/l吲哚-3乙酸的固體MS30共培養基(添加了維生素(Gamborg等，1968)4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖30g/l、瓊脂8g/l(Merck)，pH5.7的帶有MS基質的培養基(Murashige和Skoog，1962))上進行。
-形成兩個芽的步驟持續兩周，各自在培養室中在添加了1mg/l芐氨基嘌呤、0.1mg/l吲哚-3乙酸、400mg/l Augmentin和200mg/l卡那霉素的固體MS20再生培養基(鹽和維生素，MS4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l(Merck)，pH5.7)上進行。
-發育和生根步驟持續3周，在培養室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固體MS20發育培養基上進行。
-移植到玻璃盆中的步驟在培養室中在添加了400mg/l Augmentin和100mg/l卡那霉素的固體MS20發育培養基上進行。
5.2.再生煙草植物中β-葡糖醛酸糖苷酶的測量和比較β-葡糖醛酸糖苷酶活性用第一代轉基因植物樣品測量，該樣品取自在溫室中適應環境2周后的植物。對于每個植物取3份葉樣品，一份來自“老化”葉(位于基底的葉子)，一份來自成熟葉(位于中部的葉子)，一份來自幼葉(位于植物頂端)。每份樣品在液氮中在乳缽中磨碎，然后將這些粉末以1ml緩沖液對200mg組織的比例再懸浮于提取緩沖液(Tris磷酸鹽25mM pH7.8，二硫蘇糖醇2mM，1，2-二氨基環己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使該混合物均勻后在冰中培養15分鐘，然后通過以16060g離心5分鐘使澄清。使用“GUS-光化學發光報道基因測定”檢測試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供應商的建議測量20μl澄清的粗制葉提取物的GUS活性。光發射的測量使用Lumat LB-9507發光計(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)進行。
粗提物中存在的蛋白質總量按照Bradford技術(1976)使用“BioRad蛋白質測定”(BioRad，Munchen，Germany)進行測量。
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序列表<110>默里斯坦治療公司(MERISTEM THERAPEUTICS)<120>嵌合表達啟動子，含有它們的表達盒、載體、轉基因植物和種子，以及它們的生產方法(CHIMERIC EXPRESSION PROMOTERS，EXPRESSIONCASSETTES，VECTORS，TRANSGENIC PLANTSAND SEEDS CONTAINING THEM，AND METHODS FOR THEIRMANUFACTURE.)<130>嵌合啟動子CoYMV/CsVMV<140><141><160>25<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>243<212>DNA<213>人工序列<220><223>來自鴨跖草黃斑駁病毒基因間隔區的243bp啟動子片段<220><221>啟動子<222>(1)..(243)<300><301>Medberry，S.L.Lockhart，B.E.Olszewski，N.E.<302>來自鴨跖草黃斑駁病毒啟動子是脈管和生殖組織中的強啟動子<303>Plant Cell<304>4<306>185-192<307>1992<313>(1)..(243)<400> 1atccgccgtc atcaatgaca tcatcacagt actgaggaga tgaatactta gccatgaagt 60agcgtgcgaa tattacctat gcctttattc gcagcgttag tggcactgaa aggcataaag 120tttgttcgtt cttatcaaaa acgaatctta tctttgtaac ttggttaccc ggtatgccgg 180ttcccaagct ttatttcctt atttaagcac ttgtgtagta gcttagaaaa ccaacacaac 240aac243<210>2<211>515<212>DNA<213>人工序列<220><223>來自木薯葉脈花葉病毒基因間隔區的長度為515bp的啟動子<220><221>啟動子<222>(1)..(515)<300><301>Verdaguer，B.ofKochko，A.Beachy，R.N.Fauquet，C.<302>木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子在轉基因煙草和稻米植物中的分離和表達<303>Plant Mol.Biol.<304>31<306>1129-1139<307>1996<308>EMBL U59751<400>2ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60gaagtattat gtgagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttg 515<210>3<211>317<212>DNA<213>人工序列<220><223>啟動子MPr1116<220><221>啟動子<222>(1)..(317)<400>3aagcttgcat gctgcagact agtatccgcc gtcatcaatg 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1.包含至少一個得自包含植物維管表達啟動子區的第一植物啟動子的核酸序列的嵌合表達啟動子，所述植物維管表達啟動子區被得自第二植物啟動子的核酸序列取代并包含植物綠色組織表達啟動子區。
2.按照權利要求1的嵌合表達啟動子，其中所述第一植物啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)，而所述第二植物啟動子來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。
3.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中核酸序列來源于所述第一和第二啟動子的基因間隔區。
4.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它包含至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，該序列與至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。
5.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中該嵌合啟動子的核酸序列由選自下列成員的序列組成在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
6.包含病毒來源的啟動子的嵌合表達啟動子，其部分由能夠促進植物綠色組織(GT)中的表達的外源元件組成。
7.按照權利要求6的嵌合表達啟動子，其中GT外源啟動子元件也是病毒來源的。
8.按照權利要求6的嵌合表達啟動子，其中病毒來源的啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)。
9.按照權利要求8的嵌合表達啟動子，其中外源啟動子元件來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。
10.按照權利要求6的嵌合表達啟動子，其中外源GT元件置換病毒來源的內源維管組織表達(VT)啟動子。
11.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它還包含至少一個“胚乳樣”箱。
12.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它還包含至少一個與植物綠色組織表達GT啟動子元件操作性連接的“as1樣”箱。
13.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它還包含至少一個與綠色組織表達GT啟動子元件操作性連接的“as1”箱。
14.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它還包含至少一個與植物綠色組織表達GT啟動子元件操作性連接的“as2”箱。
15.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中一個或多個“as1樣”、“as1”和“as2”箱操作性連接植物綠色組織表達GT啟動子元件的上游或下游。
16.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中一個或多個“as1樣”、“as1”和“as2”箱以正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向操作性連接。
17.按照上述權利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中它包含至少一個正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向的“as2/as2/as2”箱。
18.按照權利要求6-17任一項所述的嵌合啟動子，其中它包含至少一個選自下列成員的序列在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
19.包含至少一個得自包含植物維管表達啟動子區的第一植物啟動子的核酸序列的表達盒，所述植物維管表達啟動子區被得自第二植物啟動子的核酸序列取代并包含植物綠色組織表達啟動子區，該序列與編碼要產生的多肽的核酸序列或基因操作連接，后述核酸序列或基因自身又與轉錄終止核酸序列操作性連接。
20.按照權利要求19的表達盒，其中所述第一植物啟動子來源于鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)，而所述第二植物啟動子來源于木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)。
21.按照權利要求19的表達盒，其中它包含至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，該序列與至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。
22.按照權利要求19的表達盒，其中啟動子核酸序列由選自下列成員的序列組成在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
23.分離啟動子核酸序列，其中它包含至少部分各自在序列表中由SEQ.ID.No.01和SEQ.ID.No.02所述的序列的融合體。
24.按照權利要求23的分離啟動子核酸序列，其中它對應于下列序列中的任何一個在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。
25.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.08所述的序列。
26.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.09所述的序列。
27.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.10所述的序列。
28.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.11所述的序列。
29.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.12所述的序列。
30.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.13所述的序列。
31.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.14所述的序列。
32.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的引導脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.15所述的序列。
33.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的引導脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.16所述的序列。
34.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的引導脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.17所述的序列。
35.用于構建權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或分離啟動子核酸序列的引導脫氧核苷酸構件，其中它對應于在序列表中由SEQ.ID.No.18所述的序列。
36.包含能夠引發編碼要產生的多肽的核酸序列或基因的轉錄的啟動子或啟動子核酸序列的載體，其中所述啟動子或分離啟動子核酸序列對應于權利要求1-18或23或24任一項所述的嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列。
37.按照權利要求36的載體，其中它選自下列雙元載體pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172、pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188、pMRT1182、pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。
38.具有穩定整合到其基因組中的至少一個分別如權利要求1-18或23或24任一項所述的啟動子或至少一個啟動子核酸序列的轉基因植物。
39.按照權利要求38的轉基因植物，其中它選自雙子葉植物，優選馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、蕓苔、甜菜根或向日葵，或選自單子葉植物，優選小麥、大麥、燕麥、稻米或玉米。
40.按照權利要求38或39任一項所述的轉基因植物的繁殖體。
41.按照權利要求40的轉基因植物繁殖體，其中它是種子。
42.含有分別按照權利要求1-18或23或24任一項所述的啟動子或啟動子核酸序列的細胞，優選是植物細胞、人類細胞、動物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類、微觀藻類細胞。
43.按照權利要求42的細胞，其中它是植物細胞。
44.通過細胞表達編碼要產生的多肽的核酸序列或基因的方法，其中該方法包括以下步驟-用包含按照權利要求1-18或23或24任一項所述的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉化細胞；-在使得編碼多肽的核酸序列或基因能夠表達的條件下培養該細胞。
45.按照權利要求44的方法，其中所述細胞是原核細胞或真核細胞。
46.按照權利要求44或45任一項所述的方法，其中所述細胞是選自細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、人類細胞、動物細胞、藻類細胞、微觀藻類細胞和植物細胞的細胞。
47.按照權利要求44-46任一項所述的方法，其中所述細胞是植物細胞。
48.制備按照權利要求38或39任一項所述的轉基因植物或按照權利要求40的繁殖體的方法，其中該方法包括以下步驟-用包含按照權利要求1-18或23或24任一項所述的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉化植物細胞；-選出具有整合啟動子或啟動子核酸序列的植物細胞；-通過培養或通過再生整個嵌合或轉基因植物來繁殖選出的轉化植物細胞。
全文摘要
本發明涉及包含至少一個得自包含植物維管表達啟動子區的第一植物啟動子的核酸序列的嵌合啟動子,所述植物維管表達啟動子區被得自第二植物啟動子的核酸序列取代并包含植物綠色組織表達啟動子區。本發明還涉及這些啟動子的制備方法,以及含有它們的表達盒、載體、和轉基因植物以及種子。
文檔編號C12Q1/68GK1353763SQ00808252
公開日2002年6月12日 申請日期2000年3月29日 優先權日1999年3月29日
發明者I·朗塞, V·格魯伯, M·泰森 申請人:默里斯坦治療公司