專利名稱：胡蘿卜素羥化酶和制備葉黃素衍生物的方法
技術領域：
本發明涉及具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶活性的蛋白，涉及編碼這些蛋白的核酸，涉及含有這些核酸的核酸構建體，涉及基因操作改造的生物，其中與野生型相比上述基因操作導致或提高了該核苷酸的基因表達，本發明還涉及制備葉黃素衍生物的方法。
葉黃素是動物，植物或微生物來源的含氧的類胡蘿卜素。作為色素底物和維生素A的前體，葉黃素如黃體素(lutein)，玉米黃質或蝦青素在人類和牲畜的膳食中是重要的添加物。此外，葉黃素(xanthophyll)具有重要的健康促進作用，如增強免疫應答和，由于它們的抗氧化特性，防癌作用，這使得它們成為感興趣的營養藥。因此，制備葉黃素和葉黃素含量增高的食品的經濟方法非常重要。特別是，制備葉黃素的經濟方法為生物技術方法，它利用了源自產葉黃素生物的葉黃素生物合成的蛋白和生物合成基因。
催化β-胡蘿卜素通過β-隱黃質向玉米黃質酶學轉化的原核β-胡蘿卜素羥化酶以及編碼這些蛋白的基因在細菌夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)Misawa et al.，J.of Bacteriology 1990，6704-6712；EP 393690 B1)，草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)(WO 9113078)，產堿桿菌屬(Alcaligenes)sp.PC-1(EP 735 137A1)，產黃菌屬(Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes etal.，Gene 1997，185，35-41；EP 747483 A2)中和在藍藻(Cyanobacterium)，集胞藻屬(Synechocystis)sp.PCC6803(Masamoto et al.，Plant Cell Physiol.1998，39(5)，560-564)中是已知的。
還已知源自橙黃農桿菌(Agrobacterium aurantiacum)，產堿桿菌屬(Alcaligenes)和夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)的原核β-胡蘿卜素羥化酶還能將角黃素通過adonirubin轉化成蝦青素(Misawa et al.，J.of Bacteriology 1995，6575-6584；Fraseret al.，J.Biol.Chem.1997，272，6128-6135)。
在真核生物來源中，已知三種植物β-胡蘿卜素羥化酶能催化β-胡蘿卜素通過β-隱黃質向玉米黃質的酶學轉化。相應的cDNA已經從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Cunningham et al，J.Biol.Chem.1996，271，24349-24352，WO 9736998)和從辣椒(Capsicum annuumL.)(Bouvier et al.，Biochimica et Biophysica Acta 1998，1391，320-328)中分離得到。
真核來源的基因比原核基因的優越之處在于它們在高等轉基因生物，如植物，中的表達更好。然而，仍然有必要通過對生物整合真核核酸以改善或提高制備葉黃素衍生物或制備葉黃素含量增高的食品的經濟方法的葉黃素產量。
此外，在現有技術中適宜的真核β-胡蘿卜素羥化酶的缺點在于它們的底物范圍很窄，以至于不能被羥化酶轉化的代謝產物增加，并且可能對上述羥化酶產生抑制效應。
本發明的一個目標為彌補上述的現有技術中的缺陷，并提供具有改良特性的β-胡蘿卜素羥化酶。
我們發現這個目標可以通過一種蛋白達到，該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列具有至少50％同源性的序列。
在此后的胡蘿卜素羥化酶的意思為根據本發明的的一種蛋白，即，具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性的蛋白，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列在氨基酸水平上具有至少50％同源性的序列。
SEQ ID NO2中所描述的氨基酸序列是通過SEQ ID NO1中所描述的cDNA序列的翻譯得到的。
根據本發明的蛋白能夠催化β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質的轉化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化，β-隱黃質向玉米黃質的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質的轉化，或其它含有最多可達40個C原子并含有β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件，例如角黃素向蝦青素的轉化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，或其它含有最多可達到40個C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉化。
對于源自β-胡蘿卜素的葉黃素的說明可以參考Misawa et al.，J.Biotechnol.1998，59，174頁(top)中的生物合成圖解。黃體素(lutein)的生物合成從α-胡蘿卜素開始通過α-隱黃質而發生。含有通過氨基酸的替代，插入或缺失從SEQ ID NO.2衍生得到的氨基酸序列，并且在氨基酸水平上與序列SEQ ID NO.2具有至少50％的同源性的蛋白具有一種將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性，優選地上述活性與含有序列SEQ ID NO.2的蛋白的活性可比。
替代的意思是一個或多個氨基酸被一個或多個氨基酸取代。優選的取代是那些所謂的保守取代，其中替代的氨基酸與原始氨基酸具有類似的性質，例如Glu被Asp，Gln被Asn，Val被Ile，Leu被Ile，Ser被Thr替代。
缺失是用直接連接取代氨基酸。優選的缺失位置是多肽末端和單個蛋白結構域之間的連接位置。
插入是將氨基酸引入多肽鏈，形式上為用一個或多個氨基酸取代直接連接。
蛋白之間的同源性指各個蛋白在全長上的氨基酸同一性，是在計算機程序GAP的幫助下通過比較計算得到的(UWGCG，University ofWisconsin，Genetic Computer Group，Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.1970，48，443-453的程序算法)，設置以下參數縫隙加權(Gap Weight) 12長度加權(Length Weight)4平均匹配(Average Match)2.912
平均錯配(Average Mismatch) -2.003在氨基酸水平上與SEQ ID NO.2序列具有至少50％同源性的蛋白因此表示一種蛋白，利用上述程序算法和上面所設置的參數，該蛋白序列與序列SEQ ID No.2相比具有至少50％的同一性，優選地60％，特別優選地70％。
根據本發明的胡蘿卜素羥化酶與已知的原核β-胡蘿卜素羥化酶有29.9％(產黃菌屬)，36.8％(夏孢歐文氏菌)，38.5％(草生歐文氏菌)，35.0％(產堿桿菌)，和35.6％(橙黃農桿菌)的同源性，以及與已知的源自Arabidopsis thaliana的真核β-胡蘿卜素羥化酶有41.2％的同源性。
優選的蛋白具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質的酶學活性和將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性，并且含有氨基酸序列SEQ ID NO.2或一種蛋白，該蛋白是通過氨基酸的替換，插入或缺失從上述序列衍生得到的，并且在氨基酸水平上與序列SEQ ID NO.2具有至少50％的同源性。
上述優選的蛋白能夠催化β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質的轉化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化，β-隱黃質向玉米黃質的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質的轉化，或其它含有最多可達到40個C原子并含有β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件，例如角黃素向蝦青素的轉化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，或其它含有最多可達到40個C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉化。
特別優選的蛋白是源自綠藻Haematococcus pluvialis FlotowNIES-144的具有序列SEQ ID NO.2的真核胡蘿卜素羥化酶。上述特別優選的蛋白能夠催化β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質的轉化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化，β-隱黃質向玉米黃質的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質的轉化，或其它含有最多可達到40個C原子并含有β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉化，以及能夠催化4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件，例如角黃素向蝦青素的轉化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，或其它含有最多可達到40個C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉化。
如在下文所描述，可以通過表達編碼胡蘿卜素羥化酶的適當的核酸，從天然的或基因操作改造的生物中制備這些蛋白。
本發明進一步涉及編碼上文所描述的根據本發明的蛋白的核酸，該核酸在下文中稱為胡蘿卜素羥化酶基因。可以根據遺傳密碼通過反翻譯多肽序列得到適當的核酸序列。用于上述目的的優選的密碼子是那些根據生物特異的密碼子使用頻率頻繁使用的密碼子。通過對相關生物中其它已知基因的計算機分析可以容易地找到密碼子使用頻率。例如，如果在植物中表達蛋白，在反翻譯中使用上述植物的密碼子使用頻率經常是有利的。
優選的核酸含有序列SEQ ID NO.1。上述核酸是一種源自綠藻Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144的真核cDNA，它編碼序列SEQ ID NO.2的胡蘿卜素羥化酶。由于上述cDNA的閱讀框在5’末端是開放的，SEQ ID NO.1可能不代表cDNA的完全序列。該cDNA的表達得到有功能的蛋白。通過分析源自Haematococcus pluvialisFlotow NIES-144的cDNA文庫的重疊cDNA片段，任何在5’末端缺失的部分序列可以以本來已知的方式得以彌補。
已知綠藻Haematococcus pluvialis在惡劣的環境條件下，如磷或氮缺乏或光強度過高，產生大量的蝦青素以保護其免受光氧化應激(photooxidative streβ)(Kobayashi et al.，Appl.Environ.Microbiol.1993，59，867-873；Boussiba et al.，Methods Enzymol1992，213，386-391)。該過程通常伴隨著外形的改變，這種綠藻的營養性細胞發展成胞囊細胞(Zyst Zell)。
添加醋酸鈉和FeSO4以及增加光強度在Haematococcuspluvialis Flotow NIES-144懸浮培養物中誘導蝦青素生物合成和胞囊細胞的形成。從該階段的Haematococcus pluvialis分離出RNA以構建cDNA文庫。具有SEQ ID NO 1序列的cDNA是從該cDNA文庫分離得到的。
上述的所有胡蘿卜素羥化酶都可以通過化學合成以自身已知的方式從核苷酸結構單元制備，例如，通過雙螺旋的重疊互補的各個核酸結構單元的片段縮合。寡聚核苷酸的化學合成是可能的，例如，通過一種已知的通過亞磷酰胺的方法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897頁)。合成寡核苷酸的添加，利用DNA聚合酶的Klenow片段填補缺口，連接反應，以及常規克隆方法在Sambrook et al.(1989)，Molecular cloningA Laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中有所描述。本發明進一步涉及含有上文所描述的根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的核酸構建體，其中上述胡蘿卜素羥化酶基因與一個或多個調節信號連接以提高基因的表達。這些調節序列為，例如，誘導劑或阻遏劑結合的并從而調節該核酸的表達的序列。除了這些新的調節序列外，或作為這些序列的替代，對這些序列的天然調節仍然可能存在于真正的結構基因之前，并在適當的時候被進行基因改造，以便天然調節被關閉，并且上述基因的表達得以提高。
但是，上述核酸構建體也可能具有更簡單的結構，這就是說在上述的胡蘿卜素羥化酶基因之前并未插入另加的調節信號，同時天然啟動子與其調節并未被缺失。替代地，天然調節序列被突變，以便調節不再發生，并且基因的表達提高了。這些改造的啟動子也可以被置于天然基因的上游以提高其活性。上述核酸構建體此外可以有利地含有一個或多個與啟動子功能性連接的所謂的增強子序列，它可能提高上述核酸序列的表達。還可以在上述DNA序列的3’端插入另加的有利序列，例如進一步的調節元件或終止子。上述胡蘿卜素羥化酶基因可以以一個或多個拷貝存在于該基因構建體中。
對于下文描述的制備葉黃素的方法，對于下文描述的基因改造的生物而言，根據本發明的核酸構建體的有利的調控序列存在于，例如，啟動子如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或在λ-PL啟動子中，這些啟動子有利地用于革蘭氏陰性細菌中。
進一步有利的調控序列存在于，例如，革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2中，酵母和真菌啟動子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH或存在于植物啟動子CaMV/35S[Franck et al.，Cell21(1980)285-294]，PRP1[Ward et al.，Plant.Mol.Biol.22(1993)]，SSU，OCS，leb4，usp，STLS1，B33，nos或存在于泛素啟動子或菜豆球蛋白啟動子中。
特別有利的啟動子為那些能確保在某些組織或植物部分中特異性表達的植物啟動子，其中在上述組織或植物部分中發生類胡蘿卜素或其前體的生物合成，或者上述產物有利地富集。
特別值得一提的的是在組成型表達的基礎上的整體植物啟動子，例如，CaMV啟動子，源自農桿菌的OCS啟動子(章魚肉堿合成酶)，源自農桿菌的NOS啟動子(胭脂堿合成酶)，泛素啟動子，液泡ATP酶亞基的啟動子或源自小麥的富含脯氨酸蛋白的啟動子(WO9113991)，種子特異的啟動子，例如，源自Vicia faba的菜豆球蛋白啟動子和USP啟動子，源自Vicia的豆球蛋白基因啟動子(leb4)或者源自Brassica的Bce4基因啟動子(WO 9113980)，綠色組織特異的啟動子，例如，rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羥化-加氧酶)的SSU啟動子(小亞基)或STLS1啟動子(Solanumtuberosum(馬鈴薯)，源自馬鈴薯的捕光系統1)，葉肉特異的啟動子，例如，源自馬鈴薯細胞質FBPase的FBPase啟動子(WO9705900)，塊莖，儲存根或根特異的啟動子，例如，I類patatin啟動子(B33)，源自馬鈴薯的組織蛋白酶D抑制劑啟動子，淀粉合成酶的啟動子(GBSS1)或sporamin啟動子，果實特異的啟動子，例如，源自西紅柿的果實特異的啟動子(EP409625)，
果實成熟特異的啟動子，例如，源自西紅柿的果實成熟特異的啟動子(WO 9421794)，花朵特異的啟動子，例如，八氫番茄紅素合成酶啟動子(WO9216635)或P-rr基因的啟動子(WO9822593)，特異的質體或色質體啟動子，例如，RNA聚合酶啟動子(WO9706250)或病原體或化學誘導的啟動子，例如，PRP1啟動子，苯磺胺誘導的(EP 388186)，四環素誘導的(Gatz et al.，(1992)Plant J.2，397-404)，脫落酸誘導的(EP335528)或乙醇或環己酮誘導的(WO9321334)啟動子。
使用源自Glycine max的磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶啟動子或EP249676中的另一種節點(Nodie)特異的啟動子也是可能并有利的。
對于根據本發明的方法，原則上可能象上文所述那樣使用所有的天然啟動子及其調節序列。此外，使用合成的啟動子也是可能并有利的。
上述核酸構建體也可以含有待引入到上述生物的其它基因。這些基因可以處于單獨的調節之下，或與上述的胡蘿卜素羥化酶基因處于同一調節區域。這些基因的例子是使得合成的增加成為可能的類胡蘿卜素合成的其它生物合成基因。特別值得一提的是在生物化學上限制性的，類胡蘿卜素生物合成的其它基因，如編碼八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫氫酶，異戊基-焦磷酸異構酶或β-環化酶的基因。
編碼異戊基-焦磷酸異構酶的基因在，例如，生物Phaffiarhodozyma和Haematococcus pluvialis(EP 769 551)或擬南芥(Arabidospsis thaliana)和萬壽菊(Tagetes)(Marigold)(WO9736998)中是已知的。
編碼八氫番茄紅素合成酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，西紅柿(9109128)，瓜(WO9602650)Flavobacterium(EP 747483)或煙草(US 5705624)中是已知的。
編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，煙草(US 5705624)或產黃菌(EP 747483)中是已知的。
編碼β-環化酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP 393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，(9109128)，黃桿菌(EP 747483)，煙草和西紅柿(WO9628014)或Capsicum annuum中是已知的。
本發明進而涉及制備下文所描述的基因改造的生物的方法，其中根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據本發明的核酸構建體被引入到初始生物的基因組中。初始生物的意思為進行根據本發明的基因改造之前的生物。
原則上可以通過技術人員所知道的所有方法將根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據本發明的核酸構建體引入到下文所描述的初始生物中，從而對其進行基因改造。
它們有利地通過轉化，轉染，電穿孔，用所謂的顆粒槍(particlegun)或通過微量注射被引入到初始生物或它們的細胞。
在以下參考書中技術人員可以找到用于微生物的適當方法bySambrook，J.et al.(1989)分子克隆實驗室手冊(MolecularcloningA laboratory manual)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，by F.M.Ausubel et al.(1994)Current protocols inmolecular biology，John Wiley and Sons，by D.M.Glover et al.，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISSN 019-963476-9)，by Kaiser et al.(1994)酵母遺傳學方法(Methods in YeastGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者by Guthrieet al.Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methodsin Enzymology，1994，Academic Press。
值得一提的有利方法的例子為那些，如，通過同源或異源重組引入DNA，例如利用ura-3基因，特別是利用源自Ashbya的ura-3基因，如德國申請DE 19801120.2中所描述，以及通過下文所所描述的REMI(＝“限制性酶介導的整合”)方法。
REMI技術是基于用同一種限制性核酸內切酶水解線性DNA構建體的兩端，然后將上述線性DNA構建體與用于限制它的限制性核酸內切酶一起共轉化入生物中。然后被引入DNA構建體和限制性酶的生物的基因組DNA為限制性核酸內切酶所水解。這導致細胞自身修補機制的激活。這些修補機制修補基因組DNA中由核酸內切酶導致的鏈的間斷，并且在該過程中共轉化的DNA構建體也以一定的頻率被整合入基因組中。通常，在上述過程中在DNA的兩端保留限制性水解位點。
Blker et al.(Mol Gen Genet，248，1995547-552)描述了上述技術用于真菌的插入突變。Von Schiestl and Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，19917585-7589)利用上述技術尋找在酵母中是否存在異源重組。Brown et al.(Mol.Gen.Genet. 251，199675-80)描述了將上述方法用于一種可誘導的報告基因的穩定轉化和可調表達。
利用REMI方法在基因組中的轉錄活躍位點對根據本發明的核酸片段或上述根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因進行定位是可能的。
將上述核酸與至少一個報告基因一起克隆到DNA構建體中是可能并有利的，該構建體被引入基因組中。該報告基因必須是易于通過生長，熒光，化學或生物發光檢測或通過光度計測定而檢測。
值得一提的報告基因的例子是抗生素抗性基因，水解酶基因，熒光蛋白基因，生物發光基因，葡萄糖苷酶基因，熒光素酶基因的過氧化酶基因，β-半乳糖苷酶基因，gfp基因，脂肪酶基因，酯酶基因，過氧化物酶基因，β-內酰胺酶基因，乙酰基，磷酸基或腺嘌呤轉移酶基因。上述基因使得轉錄活性的簡易測量和定量，并從而使得基因表達的簡易測量和定量成為可能。這意味著在基因組上鑒定產量差異高達2倍的位點成為可能。
如果打算將多個基因，如，例如，進一步的類胡蘿卜素生物合成的crt基因，引入到生物時，它們可以在單一的載體中與一個報告基因被同時引入生物，或者每次單個基因在一個載體中與一個報告基因被引入生物，有可能在一次同時或相繼引入各個載體。還可能在REMI技術中插入編碼各個活性的基因片段。
所有原則上適于將根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構建體整合到初始生物基因組的限制性內切酶都是已知的限制性內切酶。僅僅識別4個堿基對作為限制性水解位點的限制性內切酶是較不優選的，因為它們在基因組上或在待整合載體上的切割過于頻繁，優選的酶識別6，7，8或更多個堿基對作為水解位點，如BamHI，EcoRI，BglII，SphI，SpeI，XbaI，XhoI，NcoI，SalI，ClaI，KpnI，HindIII，SacI，PstI，BpnI，NotI，SrfI或SfiI，僅提到可能的限制性內切酶中的一小部分。如果上述酶在待引入的DNA上不再有水解位點將是優選的；這提高了整合的效率。通常在REMI混合物中使用5到500 U，優選地10到250 U，特別優選地10到100U的酶。上述酶在一種水溶液中應用是有利的，上述水溶液含有滲透壓穩定物質，如糖，如蔗糖，海藻糖或葡萄糖，多醇如甘油或聚乙二醇，含有一種緩沖劑，該緩沖劑在pH5到9，優選地在6到8，特別優選地在7到8之間起緩沖作用是有利的，如Tris，MOPS，HEPES，MES或PIPES，和/或含有穩定核酸的物質，如Mg，Cu，Co，Fe，Mn或Mo的有機或無機鹽。還可能在適當的情況下存在一些物質，如EDTA，EDDA，DTT，β-巰基乙醇或核酸酶抑制劑。但是，也可能在不添加這些物質的情況下執行REMI技術。
執行該方法的溫度在5到80℃，優選地在10到60℃，特別優選地在20到40℃之間。其它使細胞膜不穩定的已知方法也適用于該方法，如，例如，電穿孔，與負載的脂質體融合或或者用各種堿性金屬或堿性稀土金屬鹽進行去穩定，如鋰，銣或鈣鹽，鋰鹽是優選的。
上述核酸可以在純化后或者在分離后直接用于進行根據本發明的反應。
原則上可以通過技術人員所已知的所有方法將根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據本發明的核酸構建體引入到植物中。
將外源基因轉移到植物基因組中被稱為轉化。如果這樣的話，用所描述的方法進行轉化并從植物組織或植物細胞重新生成植株，以進行瞬時的或穩定的轉化。
適當的方法為通過聚乙二醇誘導DNA攝入的原生質體轉化，使用基因槍，電穿孔，將干的胚芽在含DNA的溶液中溫育，微量注射和農桿菌介導的基因轉移。上述的方法在，例如，B.Jenes et al.，Techniques for Gene Transfer，inTransgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，edited by S.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，和在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中有所描述。
待表達的構建體優選地被克隆到適于轉化根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的載體中，例如pBin19(Bevan etal.，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。用根癌農桿菌進行轉化在，例如，Hofgen and Willmitzer in Nucl.Acids，Res.(1988)16，9877中有所描述。
用根據本發明的載體轉化的農桿菌可能被以已知的方式用于轉化植物，特別是萬壽菊，向日葵，擬南芥，煙草，辣椒，大豆，西紅柿，茄子，辣椒，胡蘿卜，馬鈴薯，玉米，萵苣和蕓苔，燕麥，黑麥，小麥，黑小麥，粟，大米，紫花苜蓿，亞麻，十字花科植物如，例如，油菜或Canola，甜菜，甘蔗或木本植物如，例如，白楊或紅豆杉，例如通過將損傷的葉片或葉片的碎片浸泡于農桿菌溶液然后在適當的培養基中培養。
基因改造過的植物細胞可以通過技術人員已知的所有方法再生。適當的方法可以在上述的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hofgen和Willmitzer的出版物中找到。
在細胞中增強胡蘿卜素羥化酶基因的酶學活性有很大的可能。
一種可能是修飾內源的胡蘿卜素羥化酶基因，以便其編碼的酶的胡蘿卜素羥化酶活性比原始酶的活性高。另一種對酶活性的增強可以通過，例如，通過修飾催化位點以增加底物的轉化或通過中止酶抑制劑的作用而達到，即它們的比活增加或它們的活性不被抑制。在一個進一步的有利實施方案中通過在細胞中增加酶的合成也可以增強酶活性，例如通過消除抑制酶合成的因子，或通過增強促進合成增加的因子或調控元件的活性，或優選地通過引入更多的基因拷貝。這個方法增強細胞中基因產物的整體活性而不改變比活。聯合利用上述方法也是可能的，即增強比活加上增強整體活性。原則上可以通過技術人員已知的所有方法將這些修飾引入基因、調控元件或其啟動子的核酸序列。為此目的，可以將序列進行，例如，突變，如D.M.Glover etal.，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963467-9)，第6章，193頁et seq所描述的定點突變。
Spee et al.(Nucleic acid Research，Vol.21，No.3，1993777-778)描述了利用dITP進行隨機突變的PCR方法。
Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，199410747-10751)描述了體外重組技術在分子演化中的應用。
Moore et al.(Nature Biotechnology Vol.14，1996458-467)描述了PCR和重組方法的結合。
改造后的核酸序列隨后通過載體回到生物中。
為了增強酶活性，可以將改造后的啟動子區域置于天然基因之前以增強基因的表達，并從而最終提高活性。也可以在3’末端引入序列，例如，以增加mRNA的穩定性，并從而使得翻譯的增加成為可能。這同樣也導致更高的酶活性。
在一個進一步優選的實施方案中，為了在下文所描述的一種生物中表達，根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構建體被插入到載體例如，質粒，噬菌體或其它使基因在原核或真核生物中的最佳表達成為可能的DNA中。上述載體可能含有用于表達根據本發明的蛋白的ATG起始密碼子。
在E.coli中合適的質粒的例子為pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11，pBdCI，pET載體系列(Novagen and Stratagene)，pMAL或pQE系列(Qiagen)，在真菌中pALS1，pII2或pBB116，在酵母中2μ，pAG-1，YEp6，YEp13或pEMBLYe23或在植物中pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004，pDH51，或上述質粒的衍生物。
上述的質粒代表可能質粒的小部分選擇。更多的質粒被技術人員所熟知并在，例如，在書本Cloning Vector(Eds.Pouwels P.H.etal.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444904018)中可以找到。合適的植物載體在“Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，第6/7章，71-119頁中特別描述。
如果核酸片段在3’和/或5’末端還含有另加的增強表達的調控序列，表達其它存在的基因是有利的，上述調控序列的選擇是為了所選擇的宿主生物和基因的最佳表達。
上述調控序列是用于使基因的特異表達和蛋白表達成為可能。這可能意味著，例如，根據宿主生物，只有在誘導之后基因才表達和/或過量表達，或基因立即表達和/或過量表達。
此外調控序列或因子可以優選地對引入基因的表達具有有利的作用，并從而增強表達。因此在轉錄水平上通過使用強轉錄信號例如啟動子和/或增強子，從而增強調控元件是有利地可能的。但是，還可能通過，例如，提高mRNA的穩定性而增強翻譯。
在載體的一個進一步實施方案中，根據本發明的核酸構建體也可以有利地以線性DNA形式被引入宿主生物中，并通過異源或同源重組被整合到宿主生物基因組中。這種線性DNA可以由線性化的質粒或僅僅由作為載體的核酸片段組成。
也可以使用任何在細胞中自我復制的質粒作為載體，但也可以，如上文所述，使用整合到宿主基因組中的線性DNA片段作為載體。上述整合可以通過異源或同源重組發生，但優選地，如所述的那樣，通過同源重組(Steiner et al.，Genetics，Vol.140，1995973-987)。上述的胡蘿卜素羥化酶基因進而可以在基因組各個位點或各個載體中單獨存在，或在基因組中或一個載體中一起存在。
本發明進一步涉及利用根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因生產基因改造的生物。
本發明進一步涉及相應的基因改造的生物，與野生型相比，在初始生物含有根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的情況下，基因改造生物通過基因改造，其根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達得以增強，或在初始生物不含根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的情況下，基因改造生物通過基因改造導致根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達。
基因改造的生物是指一種生物，在該生物中，優選地通過上文所描述的一種方法，被插入了根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構建體。
基因改造的生物含有至少一個根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或至少一個根據本發明的核酸構建體。根據初始生物，核酸可以存在于染色體內或染色體外。
與野生型相比，基因改造生物中類胡蘿卜素代謝優選地被改變。
合適的基因改造生物原則上都是能夠合成葉黃素的生物。
優選的初始生物是那些天然能夠合成葉黃素的生物。但是，由于引入類胡蘿卜素生物合成基因而能夠合成葉黃素的初始生物也是合適的。初始生物是指原核或真核生物例如，微生物或植物。優選的微生物是細菌，酵母，藻類或真菌。
可以使用的細菌既是由于引入產類胡蘿卜素生物的類胡蘿卜素生物合成基因而能夠合成葉黃素的細菌，例如，含有，例如，源自歐文氏菌屬的crt基因，的埃希氏桿菌屬的細菌，可以使用的細菌也是本身就能合成葉黃素的細菌，例如，歐文氏菌屬，農桿菌屬，產黃菌屬，產堿桿菌屬的細菌或集胞藻屬的藍藻。優選的細菌是大腸桿菌(Escherichia coli)，草生歐文氏菌，夏孢歐文氏菌，Agrobacterium aurantiacum，Alcaligenes sp.PC-1，產黃菌R1534菌株或Cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803。
優選的酵母是假絲酵母(Candida)，酵母菌屬(Saccharomyces)，漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤氏酵母菌屬(Pichia)。
優選的真菌是曲霉屬(Aspergillus)，木霉屬(Trichoderma)，Ashbya，脈孢菌(Neurospora)，鐮孢菌(Fusarium)或其它在IndianChem Engr.Section B.Vol 37，No.1，2(1995)第15頁，表6中所描述的真菌。
優選的藻類是綠藻例如，紅球藻屬(Haematococcus)，Phaedactylum tricornatum，團藻(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)。特別優選的藻類是Haematococcus pluvialis或Dunaliella bardawil。
在一個優選的實施方案中，用植物作為初始生物，并因此也作為基因改造的生物。優選植物的例子是萬壽菊，向日葵，擬南芥(Arabidopsis)，煙草，辣椒，大豆，西紅柿，茄子，辣椒，胡蘿卜，馬鈴薯，玉米，萵苣和蕓苔，燕麥，黑麥，小麥，黑小麥，粟，大米，紫花苜蓿，亞麻，十字花科植物如，例如，油菜或Canola，甜菜，甘蔗或木本植物如，例如，白楊或紅豆杉。
特別優選的是Arabidopsis thaliana，Tagetes erecta，油菜，canola，馬鈴薯，和含油種子以及通常的類胡蘿卜素生產者例如大豆，向日葵，辣椒，胡蘿卜，胡椒或玉米。
本發明進一步涉及葉黃素衍生物的制備方法，該方法包括在根據本發明的蛋白存在的情況下，將β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件和/或將4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件。
葉黃素衍生物是指葉黃素類，優選的葉黃素含有至少一個羥基如，例如，玉米黃質，β-隱黃質，3’-羥基海膽酮，3-羥基海膽酮，adonixanthin(4-酮玉米黃質)，蝦青素，phoenicoxanthin(adonirubin)，α-隱黃質或黃體素或其最多可達到40個C原子并在分子中含有至少一個3-羥基-β-紫羅酮或至少一個3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件的衍生物，例如，3-羥基-6-乙烯基-β-紫羅酮，3-羥基-4-酮-6-乙烯基-β-紫羅酮，3-羥基視黃醇，3-羥基-4-酮視黃醇，3-羥基視黃醛，3-羥基-4-酮視黃醛，3-羥基視黃酸或3-羥基-4-酮視黃酸。
優選的葉黃素衍生物是玉米黃質，黃體素(Lutein)和蝦青素。
在根據本發明的方法中，在根據本發明的蛋白存在的情況下，含有β-紫羅酮結構元件向3-羥基-β-紫羅酮結構元件的轉化，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質的轉化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化，β-隱黃質向玉米黃質的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質的轉化，或最多可達到40個C原子并含有β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉化，或含有4-酮-β-紫羅酮結構元件向3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件的轉化，例如角黃素向蝦青素的轉化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，或最多可達到40個C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉化。
在上述方法的一個優選實施方案中，培養上述根據本發明的基因改造生物，收集后一種生物，并隨后從該生物中分離葉黃素衍生物。
根據本發明的基因改造生物的培養是以本來已知的方式進行的，例如培養合適的野生型，例如在微生物的情況下，在合適的培養基如，例如，在瓊脂培養板或懸浮培養基中培養，或在植物的情況下，在土壤或合適的營養基質中培養。在微生物的情況，收集意味著微生物的分離，在植物的情況，收集意味著切下植物或，在適當的情形下，含有葉黃素衍生物的特定的植物部位。葉黃素衍生物以本來已知的方式分離，例如通過生物細胞的破壞，葉黃素衍生物的提取以及隨后通過化學或物理分離方法例如萃取或層析純化葉黃素衍生物。
本發明進一步涉及用根據本發明的胡蘿卜素羥化酶或根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因制備葉黃素衍生物。
下面的實施例對本發明進行示例說明。
實施例1將胡蘿卜素羥化酶基因整合到產β-胡蘿卜素的E.coli中，轉基因生物的發酵和葉黃素的分離常規方法類胡蘿卜素的分離為了分離類胡蘿卜素(胡蘿卜素和葉黃素)，通過離心收集E.coli細胞，并將得到的細胞物質凍干24h。凍干的細胞在丙酮中懸浮并在55℃用丙酮15min萃取兩次。混合兩次萃取物，在分液漏斗中用二乙醚/石油醚(沸點35-80℃)混合物(1∶9，v/v)洗滌，并在旋轉蒸發器中在氮氣環境下濃縮至干燥。
HPLC分析利用Nucleosil 100-5 C18柱子(Machery-Nagel)，以1.5ml/min的洗脫液流速分離萃取物。在實施例1中用于分離β-胡蘿卜素和羥基化的葉黃素的洗脫液是乙腈/甲醇/2-丙醇混合物(85∶10∶5，v/v/v；flow)。在實施例2中為了分離含有酮基的葉黃素，將乙腈/甲醇/H2O混合物(50∶44∶6，v/v/v)作為洗脫液1，洗22min，并將甲醇作為洗脫2使用。直接利用Waters 994diode array detector進行檢測。用于HPLC分析的對比標準是從Sigma或Roth購買的β-胡蘿卜素，蝦青素和玉米黃質。
1.1產β-胡蘿卜素E.coli的生產使用的生物包括菌株JM101的E.coli細胞。質粒pACCAR16DcrtX含有源自夏孢歐文氏菌的細菌類胡蘿卜素生物合成基因crtE，crtB，crtIhe crtY，并導致β-胡蘿卜素的生物合成(N.Misawa Res.Commun.209(1995)867-876)。
為了制備上述質粒，將源自夏孢歐文氏菌(質粒pCAR16delB)的類胡蘿卜素生物合成基因簇的一個6.0kb Asp718(KpnI)-EcoRI片段克隆到質粒pACY184的EcoRI位點(R.E.Rose，Nucl.Acids Res.16(1998)355)。質粒pCAR16delB在β-胡蘿卜素羥化酶ORF(開放閱讀框)中含有一個移碼突變(Misawa et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.209(1995)867-876)。因此導致β-胡蘿卜素不能被羥化成玉米黃質。將質粒pACCAR16DcrtX插入到E.coli中并且制備和分離改造的E.coli細胞是以本來已知的方式進行的，如在Sambrock et al.，Molecular cloninga Laboratory manul，2ndedn.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中有所描述。
1.2 Haematococcus pluvialis λcDNA表達文庫的構建和含有胡蘿卜素羥化酶基因的質粒的分離Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144來源于NationalInstitute for Environmental Studies(國家環境研究所NIES)，Tsukuba，Japan。Haematococcus pluvialis生長階段的基礎培養基(pH 6.8)每升含有1.2g乙酸鈉，2.0g酵母提取物，0.4g L-天冬酰胺，0.2g MgCl2*6H2O，0.01g FeSO4*7H2O，和0.02gCaCl2*2H2O。Haematococcus pluvialis在20℃生長4天，生長時的黑暗/光照循環為12小時的光照(20μE/m2s)和12小時的黑暗。
為了誘導蝦青素生物合成和胞囊細胞形成，4天后加入乙酸鈉和FeSO4，其濃度分別達到45mM和450μM。之后，將光照條件改變為連續的光照(125μE/m2s)，如在Kajiwara et al.，Plant Mol.Biol.29(1995)343-352所描述。
在誘導胞囊細胞形成8小時后，分離Haematococcus pluvialis的RNA以便從胞囊細胞構建cDNA文庫。
利用寡聚(dT)-纖維素(Biolabs)純化多聚(A)RNA。cDNA的合成和λZAP表達文庫的構建借助于cDNA Synthesis和ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning試劑盒(Stratagene)進行。根據Stratagene的使用說明書，利用MMLV反轉錄酶和含有XhoI限制性酶識別位點的多聚(dT)引物合成cDNA的第1條鏈。相應地利用DNA聚合酶I合成第2條鏈。通過用PfuDNA聚合酶填補產生DNA的平頭末端，并且在平頭末端連接上EcoRI適配序列。然后按照大小將得到的cDNA片段分離并隨后連接到Uni-ZAP載體的EcoRI-XhoI識別位點上。在分離和純化胡蘿卜素羥化酶陽性斑塊后，根據Stratagene的使用說明書，通過使用ExAssist輔助噬菌體和SOLR E.coli菌株，通過體內切割而回收含有胡蘿卜素羥化酶cDNA的pBluescript噬菌粒。根據DNA序列分析，得到的質粒除了在5’-(5’-AATTCGGCACGAG-3’)和3’(5’-TCGAG-3’)末端含有短適配序列之外，還含有與多克隆位點的EcoRI和XhoI限制位點連接的長1608bp的cDNA片段。如1.1下面所描述，上述質粒用來將胡蘿卜素羥化酶基因插入到產β-胡蘿卜素的E.coli細胞。
1.3將胡蘿卜素羥化酶基因整合到產β-胡蘿卜素E.coli細胞，轉化細胞的培養，以及葉黃素家族的玉米黃質和β-隱黃質的分離用1.3下面描述的含有胡蘿卜素羥化酶基因的質粒轉化在1.1下面描述的含有質粒pACCAR16DcrtX的產β-胡蘿卜素E.coli細胞是以自身已知的方式進行的，如J.Sambrook et al.，Molecularcloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉化的E.coli細胞在添加有氨芐青霉素(50μg/ml；對于含有胡蘿卜素羥化酶基因的質粒) 和氯霉素(30μg/ml；質粒pACCAR16DcrtX)的LB培養基中28℃培養48小時。
類胡蘿卜素的分離如常規方法所描述。
圖1表示從以下提取的類胡蘿卜素的HPLC圖(A)含有源自1.1的質粒pACCAR16DcrtX的E.coli細胞(B)含有質粒pACCAR16DcrtX和源自1.2的胡蘿卜素羥化酶基因的E.coli細胞
圖1中峰號(peak number)表示3玉米黃質5β-隱黃質6β-胡蘿卜素從
圖1明顯看出，由于整合了根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因，轉化后的E.coli細胞產生羥化的葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質，而未經轉化的E.coli只產生β-胡蘿卜素。因此根據本發明的胡蘿卜素羥化酶可以將β-胡蘿卜素轉化成β-隱黃質，將β-隱黃質轉化成玉米黃質或將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質。
實施例2將胡蘿卜素羥化酶基因和源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)整合到產β-胡蘿卜素E.coli細胞，轉化細胞的培養和葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質和β-隱黃質的分離2.1含有源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質粒的制備為了制備含有源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因的質粒pRKbktl(Kajiwara et al.，Plant Mol.Biol.29(1995)343-352)，通過瓊脂凝膠電泳分離pUC19bkt質粒的PvuII部分消化的1kb產物(Breitenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.140(1996)241-246)。上述DNA片段含有lacZ啟動子和酮酶的ORF(開放閱讀框)并且被亞克隆到預先用HindIII消化并用Klenow酶處理的質粒pRK404中。
得到的質粒pRKbktl被一次單獨插入到產β-胡蘿卜素E.coli細胞中并且一次與1.2下面描述的胡蘿卜素羥化酶基因質粒一起被插入到產β-胡蘿卜素E.coli細胞中。
2.2將質粒pRKbktl整合到產β-胡蘿卜素E.coli細胞中，轉化細胞的培養和葉黃素角黃素的分離用2.1下面描述的含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質粒pRKbktl轉化1.1下面描述的含有質粒pACCAR16DcrtX的產β-胡蘿卜素E.coli細胞是以自身已知的方式進行的，如J.Sambrook et al.，Molecular cloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉化的E.coli細胞的培養與1.3下面的描述類似，但在添加有氯霉素(30μg/ml；質粒pACCAR16DcrtX)，四環素(10μg/ml；質粒pRKbktl)和異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.5mM)的LB培養基中28℃培養48小時。
類胡蘿卜素的分離如常規方法所描述。
圖2(A)表示從含有質粒pACCAR16DcrtX和包含β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質粒pRKbktl的E.coli細胞提取的類胡蘿卜素的HPLC圖。質粒pRKbktl的整合導致轉化的E.coli細胞產生具有酮基的葉黃素，角黃素。
2.3將質粒pRKbktl和胡蘿卜素羥化酶基因整合到產β-胡蘿卜素E.coli細胞，轉化細胞的培養和葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質以及β-隱黃質的分離用2.1下面描述的含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質粒pRKbktl以及用2.3描述的含有胡蘿卜素羥化酶基因的質粒，轉化1.1下面描述的含有質粒pACCAR16DcrtX的產β-胡蘿卜素E.coli細胞是以自身已知的方式進行的，如J.Sambrook et al.，Molecularcloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉化的E.coli細胞的培養與1.3下面的描述類似，但在添加有氨芐青霉素(50μg/ml；含有胡蘿卜素羥化酶基因的質粒)氯霉素(30μg/ml；質粒pACCAR16DcrtX)，四環素(10μg/ml；質粒pRKbktl)和異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.5mM)的LB培養基中28℃培養48小時。
類胡蘿卜素的分離如常規方法所描述。圖2表示從以下提取的類胡蘿卜素的HPLC圖(A)含有質粒pRKbktl和源自1.1的質粒pACCAR16DcrtX的E.coli細胞。
(B)含有質粒pRKbktl和胡蘿卜素羥化酶基因以及源自1.2的質粒pACCAR16DcrtX的E.coli細胞。
圖2(C)表示與標準相比的蝦青素圖2中的峰號表示1蝦青素2adonixanthin
3玉米黃質4角黃素5β-隱黃質6β-胡蘿卜素從圖2可以看出，由于整合了根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因和含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質粒pRKbktl，轉化的E.coli細胞產生羥化的和/或含有酮的葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質和β-隱黃質，而不含根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的E.coli細胞只產生角黃素。
在關于源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶的酶研究中表明上述酶主要將β-胡蘿卜素轉化成角黃素，而含有羥基的葉黃素例如玉米黃質和β-隱黃質很少被轉化，并且只轉化成adonixanthin而不轉化成蝦青素(T.Lotan，J.Hisrschberg，FEBSLett.364(1995)125-128；J.Breitenbach，N.Misawa，S.Kajiwara，G.Sandmann，FEMS Microbiol.Lett.140(1996)241-246；P.D.Fraser，H.Shimada，N.Misawa，Eur.J.Biochem.252(1998)229-236)。
在實施例2.3中改造的E.coli細胞能產生蝦青素這一事實證明了根據本發明的胡蘿卜素羥化酶能將角黃素通過phoenicoxanthin(adonirubin)轉化成蝦青素。
因此根據本發明的胡蘿卜素羥化酶能夠催化β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質的轉化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化，β-隱黃質向玉米黃質的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質的轉化，或其它最多可達到40個C原子并含有β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件，例如角黃素向蝦青素的轉化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質)的轉化，或其它最多可達到40個C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環的化學化合物向相應的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉化。
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>胡羅卜素羥化酶和制備葉黃素衍生物的方法<130>OZ 0050/49896<140><141><160>2<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1607<212>DNA<213>Haematococcus pluvialis<220><221>CDS<222>(3)..(968)<400>1ct aca ttt cac aag ccc gtg agc ggt gca agc gct ctg ccc cac atc47Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile1 5 10 15ggc cca cct cct cat ctc cat cgg tca ttt gct gct acc acg atg ctg 95Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu20 25 30tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc 143Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala35 40 45cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg 191Arg Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser50 55 60tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga 239Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly65 70 75acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca 287Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala80 85 90 95ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa 335Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys100 105 110cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc 383Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly115 120 125gtg tca ggc att gcc atc ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cac 431Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His130 135 140atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc 479Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu145 150 155ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat 527Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr160 165 170 175gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac 575Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His180 185 190aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg 623Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu195 200 205ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc 671Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly210 215 220ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg 719Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu225 230 235ggc atc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg 767Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu240 245 250 255gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg 815Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met260 265 270aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt 863Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly275 280 285ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att 911Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile290 295 300cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp305 310 315tcc aag cgg tagggtgcgg aaccaggcac gctggtttca cacctcatgc 1008Ser Lys Arg320ctgtgataag gtgtggctag agcgatgcgt gtgagacggg tatgtcacgg tcgactggtc 1068tgatggccaa tggcatcggc catgtctggt catcacgggc tggttgcctg ggtgaaggtg 1128atgcacatca tcatgtgcgg ttggaggggc tggcacagtg tgggctgaac tggagcagtt 1188gtccaggctg gcgttgaatc agtgagggtt tgtgattggc ggttgtgaag caatgactcc 1248gcccatattc tatttgtggg agctgagatg atggcatgct tgggatgtgc atggatcatg 1308gtagtgcagc aaactatatt cacctagggc tgttggtagg atcaggtgag gccttgcaca 1368ttgcatgatg tactcgtcat ggtgtgttgg tgagaggatg gatgtggatg gatgtgtatt 1428ctcagacgta gaccttgact ggaggcttga tcgagagagt gggccgtatt ctttgagagg 1488ggaggctcgt gccagaaatg gtgagtggat gactgtgacg ctgtacattg caggcaggtg 1548agatgcactg tctcgattgt aaaatacatt cagatgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1608<210> 2<211> 322<212> PRT<213> Haematococcus pluvialis<400> 2Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile Gly1 5 10 15Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser20 25 30Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg35 40 45Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu50 55 60Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr65 70 75 80Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu
85 90 95Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg100 105 110Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly Val115 120 125Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met130 135 140Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu145 150 155 160Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala165 170 175His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys180 185 190Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe195 200 205Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe210 215 220Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly225 230 235 240Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val245 250 255His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys260 265 270Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly275 280 285Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile Pro290 295 300Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser305 310 315 320Lys Arg
權利要求
1.一種蛋白，該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列具有至少50％同源性的序列。
2.根據權利要求1的一種蛋白，其中該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質的酶學活性和將角黃素轉化成蝦青素的酶學活性。
3.一種編碼根據權利要求1或2的蛋白的核酸。
4.根據權利要求3的核酸，其含有SEQ ID NO.1.中所描述的序列。
5.一種含有根據權利要求3或4的核酸的核酸構建體，上述核酸與一個或多個調節信號功能性地連接以增強基因表達。
6.根據權利要求5的核酸構建體，其中根據權利要求3或4的核酸被插入到一種載體中，該載體適合該基因在原核或真核生物中表達。
7.一種基因操作的生物，其中基因的改變使得根據權利要求3或4的核酸的表達在初始生物含有根據權利要求3或4的核酸的情況下，與野生型相比得以增強，或在初始生物不含根據權利要求3或4的核酸的情況下，與野生型相比得以發生。
8.根據權利要求7的基因操作的生物，其類胡蘿卜素代謝不同于野生型。
9.根據權利要求7或8的基因操作的生物，其中所用的生物是真核生物。
10.根據權利要求9的基因操作的生物，其中用所用的真核生物是植物。
11.產生根據權利要求7-10任何一項的基因改造生物的一種方法，該方法包括將根據權利要求3或4的核酸或根據權利要求5或6的核酸構建體引入初始生物的基因組中。
12.根據權利要求3或4的核酸在產生基因操作的生物中的應用。
13.制備葉黃素衍生物的一種方法，該方法包括，在根據權利要求1或2的蛋白存在的情況下，將β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-β-紫羅酮結構元件和/或將4-酮-β-紫羅酮結構元件轉化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結構元件。
14.根據權利要求13的制備葉黃素衍生物的方法，其中，培養根據權利要求7-10中任何一項的生物，收集該生物，然后從該生物分離葉黃素衍生物。
15.根據權利要求1或2的蛋白在制備葉黃素衍生物中的應用。
16.根據權利要求3或4的核酸在制備葉黃素衍生物中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有將β－胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶活性的蛋白,涉及編碼這些蛋白的核酸,涉及含有這些核酸的核酸構建體,涉及基因操作改造的生物,其中與野生型相比上述基因操作導致或提高了該核苷酸的基因表達,本發明還涉及制備葉黃素衍生物的方法。
文檔編號C12N15/09GK1352689SQ00808149
公開日2002年6月5日 申請日期2000年3月28日 優先權日1999年4月9日
發明者H·林登, G·桑德曼 申請人:Basf公司