專利名稱：一種使用微孔識別dna突變的方法及為此提供的試劑盒的制作方法
背景技術：
檢測微小突變如DNA序列的置換、插入和缺失的常規技術包括點漬法、RFLP(限制性片段長度多態性)分析、SSCP(單鏈構象多態性)分析和DNA測序。
首先，點漬技術利用DNA印跡法原理，其中在一特定溫度以上，即使一個單堿基對失配也會引起DNA雙鏈體的破壞。點漬法可以通過檢測由一個靶序列代表的寡核苷酸探針產生的信號確定突變的存在，當該寡核苷酸探針與固定在膜上的核酸雜交時，預先用連接到顯色應答體上的放射性同位素、熒光染料或酶標記(請參見《英國皮膚病學報》(British J.Dermatol.)，13172-77，1994)。也可以通過將一個寡核苷酸探針固定在膜上，并將一個靶向DNA進行預擴增，由被固定的寡核苷酸和擴增的DNA之間雙鏈體的形成確定突變。
其次，RFLP分析利用了只切割特定序列的限制酶的特性。換句話說，一個被PCR擴增的正常核苷酸序列可以用一種限制酶切割，而識別部位發生突變的相應的核苷酸序列卻不能被相同的酶切割。用一種限制酶處理正常的和發生突變的DNA樣品后，將所得到的DNA片段的混合物一起在相同的凝膠上進行電泳，可以通過比較每個樣品的DNA片段的數目測定突變的存在(請參見《分子細胞生物學》(Mol.CellBiol.)，279-281，1995)。
第三，SSCP分析利用單鏈DNA的特性，其中其由即使一個單點突變引起的構象的變化引起非變性凝膠中片段遷移的變化。在一種稱為SSCP的技術中，當正常DNA以及突變DNA的限制切割方式保持相同時，有時也可能通過序列變化對單鏈DNA的短片段的遷移的影響檢測序列的變化。通過比較非變性凝膠中突變DNA和未突變DNA鏈的遷移方式，可以確定突變的存在與否(請參見《分子細胞生物學》，289，1995)。
除了上面提到的幾種技術外，也可以由通過凝膠電泳或使用儀器進行的直接DNA測序檢測突變(請參見《分子細胞生物學》，245-248，1995)。所說的典型包括使用放射性物質、熒光染料或酶檢測信號的技術具有一些缺點，如安全問題，并且在使用放射性標記的情況下，處理廢物的成本很高，而在不使用放射性標記的情況下，由于使用膜或進行丙烯酰胺凝膠電泳而使操作麻煩并且費時。
同時，也可通過利用識別特異性核苷酸序列的方法，使用已經用于由識別抗體蛋白質，或用于通過與DNA或寡核苷酸雜交識別一種特異核苷酸序列的微孔板來確定突變的存在與否。例如，將一個樣品DNA固定到微孔上，然后使用與待識別的正常DNA序列對應的寡核苷酸探針識別即，將一個通過PCR技術擴增的樣品DNA固定到一個微孔上，用一個結合了生物素的探針進行雜交，然后使用一種酶對雜交進行評價(請參見《分子細胞生物學》，6(1)79-85，1992)。但是，在先技術方法在幾個方面被證明不能令人滿意由于在從病人采集樣品DNA后，樣品DNA必須被固定到微孔上，因此分析樣品DNA很費時；由于DNA的長度，由PCR擴增的樣品DNA可能還會有抑制與探針雜交的第二結構；長度較長的DNA分子可能會阻止其與孔的結合(請參見《分析生物化學》(Anal.Biochem.)，138-142，1991)；以及，由于使單鏈變性后一個樣品DNA固定到一個微孔上，在實驗期間內很容易發生單鏈DNA的復性，這降低了樣品DNA與探針結合的能力。
因此，本發明的一個主要目的是提供一種通過用PCR擴增靶(樣品)DNA并使用微孔，識別其相應的正常序列已經被測定的DNA序列的突變的方法。
本發明的另一個目的是由此提供一種方便使用的試劑盒。
本發明的詳細說明使用微孔識別DNA突變的方法包括以下步驟通過PCR，使用一個結合了生物素的引物，準備一個待識別的部分核苷酸序列的被擴增的、生物素化的DNA片段；準備一個與待識別的DNA序列對應的正常序列的探針；將如此制備的探針固定到微孔的胺基上；將如此制備的生物素化的DNA片段加入到固定了探針的微孔中；將一種連接了鏈霉抗生物素的降解酶加入到微孔中以將降解酶結合到探針的生物素部分上；以及，加入一種與降解酶反應的底物并檢測由底物的降解所引起的顏色或吸光度變化。
用于識別DNA突變的試劑盒包括一個微孔，其內部含有胺基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亞胺(EDC)溶液和1-甲基咪唑溶液，pH值為7.0用于固定探針；0.4M NaOH/0.25％吐溫-20溶液用于除去未固定的探針；一種包含dH2O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液用于保護微孔的表面；一種0.5×SSC/0.1％吐溫-20的溶液用于除去未雜交的生物素化的樣品DNA片段；一種將與生物素結合的、連接了鏈霉抗生物素的降解酶；一種包含150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于將鏈霉抗生物素與生物素結合；一種包含150mM NaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于除去未結合的鏈霉抗生物素；以及一種連接了鏈霉抗生物素的降解酶的底物。
在本說明書的描述中，使用術語“突變”是指一種序列變化，如置換，其中一個或多個核苷酸被另外的核苷酸置換；缺失，其中一個或多個現存的核苷酸被除去；和插入，其中插入一個或多個另外的核苷酸。
微生物體內經常發生由一個或多個核苷酸變化所引起的突變。例如，已知具有在特定部位的核苷酸變化的結核桿菌對利福平有抗藥性(請參見《柳葉刀》(Lancet)，341647-650，1993)。因此，檢測突變的存在與否，以及識別發生變化的核苷酸序列可能對醫治病人很有用。
按照本發明，該識別DNA突變的方法不僅可用來檢測突變的存在，而且也可以容易地識別突變的類型，如核苷酸的置換、插入和缺失。該方法包括以下步驟準備擴增的樣品DNA，準備一個探針，將探針固定到一個微孔上并通過將樣品DNA與探針結合來檢測突變。
步驟1樣品DNA的擴增通過使用一種結合了生物素的引物產生擴增的、生物素化的樣品DNA片段的聚合酶鏈反應(PCR)，將待進行突變識別的部分DNA序列擴增由于PCR是通過使用一種結合了生物素的引物進行的，因此被PCR擴增的產物為一種由互補的生物素化的和未生物素化的核苷酸序列組成的混合物。
步驟2探針的制備制備含有與待識別的DNA序列相對應的正常序列的DNA探針如此制備的探針含有10個以上核苷酸，并包含一個處于5’端位的磷酸酯部分，該磷酸酯部分使探針能夠固定到微孔的胺基上。
步驟3探針的固定將如此制備的探針固定到微孔內表面的胺基上由于所合成探針的核苷酸序列可能自發地重退火，因此可通過在90-100℃，最優選94℃下加熱該探針5-15分鐘，最優選10分鐘維持單鏈探針，然后立即在冰水中冷卻。將催化寡核苷酸的磷酸酯部分與微孔的胺基之間的共價鍵合反應的pH值為7.0的冰冷的10mM 1-甲基咪唑溶液和pH值為7.0的10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亞胺(EDC)溶液加到單鏈DNA探針上。將含有混合物的探針加到胺基衍生化的微孔中，并用膠帶將微孔密封以防止反應混合物的蒸發，然后在40-60℃，最優選50℃下溫育5-9小時，最優選7小時。通過這種方式，探針被共價固定到微孔的內表面上。室溫下用0.4M NaOH/0.25％吐溫，然后用蒸餾水洗滌固定了探針的微孔。
步驟4將樣品添加到微孔中將在前面步驟中獲得的生物素化的PCR片段加到固定了探針的微孔中首先，將一種含有dH2O、20×SSPE/0.067％ Triton X-100和鮭魚精子DNA的溶液(10mg/ml)加入到微孔中，并在40-60℃，最優選50℃下溫育10-20分鐘，最優選15分鐘，以防止生物素化的樣品與微孔表面的游離胺基結合。為使在步驟1中得到的生物素化的雙鏈DNA片段變性以與探針雜交，將片段在90-98℃，最優選94℃下加熱5-15分鐘，最優選10分鐘，并立刻在冰水中冷卻。然后，將一種含有dH2O、20×SSPE/0.067％ Triton X-100和鮭魚精子DNA的溶液(10mg/ml)加入到單鏈DNA樣品中。將混合物引入到微孔中，在50-70℃，最優選60℃下溫育5-15小時，最優選10小時。溫育以后，除去殘余的混合物，并用0.5×SSC，0.1％吐溫-20洗滌微孔。核苷酸序列發生變化的樣品將顯示出對于固定在微孔上的探針的較低的親和性，而具有正常序列的樣品將顯示高親和性。因此，樣品DNA片段的生物素可以收集到微孔中，并且發生突變的和未發生突變的序列對探針的親和性的差別可以按照與微孔結合的生物素的密度的差別測定。
步驟5添加一種降解酶為使降解酶與探針捕獲的樣品DNA片段的生物素部分結合，將連接了鏈霉抗生物素的降解酶加到微孔中為檢測突變的和未突變的DNA樣品的結合到微孔上的生物素密度的差別，降解酶與生物素結合。降解酶水解一種生色底物，并可以測定由此而產生的顏色強度或吸光度變化。例如，可以使用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶；用含有150mMNaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl緩沖液(pH＝7.5)洗滌微孔，并將用含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl緩沖液(pH＝7.5)稀釋的鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶加到微孔中，并在35-45℃，最優選40℃下溫育30-90分鐘，最優選60分鐘。除去殘留的反應混合物后，加入含有150mMNaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl緩沖液(pH＝7.5)，在50-70℃，最優選60℃下溫育5-15分鐘，最優選10分鐘，然后洗滌。
步驟6檢測酶反應將連接了鏈霉抗生物素的降解酶的底物加到微孔中，并檢測由酶反應引起的顏色或吸光度變化表現顏色或吸光度變化的合成肽是由酶-底物反應引起的降解中的理想底物。例如，當使用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶作為降解酶時，將100μl pNPP(磷酸對硝基苯基酯)加到微孔中，并在室溫下溫育60-120分鐘，最優選90分鐘。加入1M NaOH使反應中止后，測量405nm處的吸光度。盡管可以使用常規的分光光度計測量吸光度，但對于測量微孔中酶-底物反應混合物的吸光度，ELISA讀數器是一種更為理想的儀器。
另外，為實施上述方法，本發明還提供一種包含下述組成部分的試劑盒一個微孔，其內部含有胺基、EDC溶液和1-甲基咪唑溶液的，pH值為7.0用于固定探針，0.4M NaOH/0.25％吐溫-20溶液用于除去未固定的探針，一種包含dH2O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液用于保護微孔的表面的胺基，一種0.5×SSC/0.1％吐溫-20的溶液用于除去未雜交的生物素化的樣品DNA片段，一種要與生物素結合的、連接了鏈霉抗生物素的降解酶，一種包含150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于將鏈霉抗生物素與生物素結合，一種包含150mM NaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于除去未結合的鏈霉抗生物素，以及一種用于連接了鏈霉抗生物素的降解酶的底物。
按照本發明，可以通過測量與微孔結合的生物素密度區分突變的和未突變的DNA樣品。這就是說，降解酶與生物素結合，可以通過添加與降解酶反應的底物測定結合酶的活性。因此，可以檢測樣品DNA中突變的存在，此外還可以識別突變的類型。因此，在任何檢測DNA突變的試驗中，都可以一種比任何其它常規方法更經濟、更簡便和更安全的方法獲得結果，只要待識別的DNA部分可被擴增，并且可以制備一個包含與待識別的DNA相對應的正常序列的探針即可。
使用本發明的微孔識別DNA突變的方法優于常規方法的方面有
1.由于可以使用比常規方法更少量的寡核苷酸獲得同樣的結果，因此本發明方法更經濟。通過使用本發明方法，用100ng探針/孔可以獲得類似的吸光度結果，而在先技術方法需要600ng/孔(請參見《分子細胞探針》(Mol.Cell Probes)，12407-416，1998)。
2.在現有技術中，所提供的用于隨后結合寡核苷酸的微孔要進行預處理。相反，在本發明中提供固定了寡核苷酸的微孔，這反過來又減少了合成寡核苷酸以及制備微孔的成本。
3.當通過使用一種含有寡核苷酸將要與之結合的胺基的常規微孔檢測突變時，陰性對照的高吸光度是一個主要的問題。而通過使用本發明的微孔，陰性對照的吸光度顯著下降。
4.將樣品DNA固定到微孔上，檢測DNA突變的常規方法存在一些問題，如由樣品DNA的長度引起的二級結構、較弱的結合親和力和樣品核苷酸鏈之間的互補結合。在本發明中，通過預先將DNA探針固定到微孔上，解決了這些問題。
5.在先技術使用膜或凝膠，它們的處理很麻煩，并且在處理大量樣品時，除了困難，還需要很多復雜的工作，而本發明方法通過在一個孔中進行全部步驟而變得簡便。
6.在先技術有很多變化，如收集樣品和進行實驗的不同方法，這對于以重現性方法進行實驗是一個障礙。本發明的試劑盒不僅提供了實驗條件的一致性，而且還可以儲存一段較長的時間，這使得可以同時檢測大量的樣品。特別是由于通過使用儀器可以避免實驗誤差，因此可以統計方法分析實驗數據或樣品類型。
7.可以通過視覺識別結果。這就是說，可以用肉眼檢測由酶反應而產生的顏色變化，因此，由于結果很明顯，研究人員就可以相信結果。
通過以下實施例進一步說明本發明，這些實施例不應視為對本發明范圍的限制。實施例1使用微孔識別DNA突變本發明識別DNA突變的方法包括通過將一個含有與待識別的DNA相對應的正常序列的探針固定到微孔上，然后評價一個DNA樣品與一個固定在微孔上的互補寡核苷酸探針之間雜交的穩定性以檢測病人的DNA突變的存在的步驟。作為一個有代表性的實施例，本發明者使用了一個已知僅在結核桿菌BCG(卡介桿菌)基因組中發現的直接測序區，并評價病人的一個樣品DNA的雙鏈體和多種探針的穩定性，其中的多種探針包括一個直接測序區的正常核苷酸序列的探針，包含在直接測序區的不同類型突變的探針，和一個作為陰性對照的與直接序列無關的探針。實施例1-1含有正常核苷酸序列的探針的使用首先，通過常規方法合成含有結合生物素的核苷酸序列5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’(SEQ ID1)的引物a和5’-CCGACAGGGGACGGAAAC-3’(SEQ ID2)的引物b。然后，在含有DNA(包含BCG的直接序列)的PCR混合物中進行PCR直到最終濃度為200ng/μl，0.5μl引物a(100pmol/μl)、0.5μl引物b(100pmol/μl)、0.4μl dNTP(25mM)、10×Taq緩沖液、3μl MgCl2(25mM)、0.2μl Taq(5單位/μl，美國Promega)和40.4μl ClH2O，變性循環30次(94℃，1分鐘)，退火(55℃，1分30秒)并延伸(72℃，1分30秒)。
隨后，合成含有正常核苷酸序列5’-TTGACCTCGCCAGGAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID3)的探針#1和含有正常核苷酸序列5’-TCCGTACGCTCGAAACGCTTCCAAC-3’(SEQ ID4)的探針#2。將每個探針的10pmol等分量在94℃下加熱10分鐘，在冰水中冷卻10分鐘，離心濃縮。然后，pH值為7.0的EDC和1-甲基咪唑的溶液加到探針的每個等分量中，至終濃度為10mM。將100μl如此制備的每個探針混合物引入到置于冰上的微孔(丹麥Nunc)中，在50℃下溫育7個小時。除去殘余的探針混合物后，將一種含有138μl dH2O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和2μl鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液加到微孔中，并在50℃下溫育20分鐘，以將微孔表面上的游離胺基保護。
除去保護溶液后，向每個微孔中加入一種含有68μl dH2O、30μl20×SSPE/0.0167％ Triton X-100、1μl鮭魚精子DNA(10mg/ml)的樣品混合物和1μl前面制備的PCR擴增的樣品DNA，并在60℃下溫育約10個小時。除去混合物后，用200μl 0.5×SSC，0.1％吐溫-20洗滌每個微孔三次，然后加入相同的溶液并在60℃下溫育15分鐘。用同樣的溶液洗滌三次后，將100μl用含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)稀釋3000倍制備的鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶加到微孔中，并在40℃下溫育1個小時。
隨后，用含有150mM NaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌微孔三次，并三次在60℃下溫育5分鐘，并且相同的溶液洗滌。向每個微孔中加入100μl pNPP(N7653，美國Sigma)，溫育90分鐘，然后測量405nm處的吸光度(請參見
圖1)。實施例1-2帶有一個置換核苷酸的探針的使用為識別置換突變，通過用A置換探針#1的第十四核苷酸G合成探針#11 5’-TTGACCTCGCCAGAAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID5)，以及通過用G置換探針#2的第十四核苷酸A合成探針#21 5’-TCCGTACGCTCGAGACGCTTCCA AC-3’(SEQ ID6)。然后以與實施例1-1類似的方式進行DNA突變的識別，不同之處在于使用探針#11和#21而不是探針#1和#2(請參見
圖1)。實施例1-3帶有一個插入的核苷酸的探針的使用為識別插入突變，通過在探針#1的第13和第14核苷酸之間插入T合成探針#12 5’-TTGACCTCGCCAGTGAGAGAAGATCA-3’(SEQID7)。然后，以與實施例1-1類似的方式進行DNA突變的識別，不同之處在于使用探針#12而不是探針#1和#2(請參見
圖1)。實施例1-4使用一個被除去一個核苷酸的探針為識別缺失突變，通過將探針#1的第14核苷酸G除去合成探針#13 5’-TTGACCTCGCCAGAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID8)。然后，以與實施例1-1類似的方式進行DNA突變的識別，不同之處在于使用探針#13而不是探針#1和#2(請參見
圖1)。實施例1-5使用陰性對照探針作為陰性對照，合成含有僅在一種結核桿菌H37Rv中發現的核苷酸序列的探針#C 5’-GGAGCTTTCCGGCTTCTATCAGGTA-3’(SEQID9)。然后，以與實施例1-1類似的方式進行DNA突變的識別，不同之處在于使用探針#C(請參見
圖1)。
圖1表示一個基于僅在結核桿菌的基因組中發現的直接測序區BCG的圖形，通過評價從病人獲得的樣品DNA的雙鏈體和多種探針的穩定性顯示DNA突變的識別，其中的多種探針包括含有一個直接測序區的正常核苷酸序列的探針、在直接測序區含有不同類型的突變的探針和作為陰性對照與直接序列無關的探針。在
圖1中，No DNA表示沒有探針的對照；No.1為陰性對照探針#C；No.2為正常序列探針#1；No.3為置換突變體的探針#11；No.4為缺失突變體的探針#13；No.5為插入突變體的探針#12；No.6為正常序列探針#2；No.7為置換突變體的探針#21。
如
圖1所示，由于樣品DNA與正常序列的探針的雜交所得的OD值顯示最高值，經證明從病人獲得的樣品DNA包含正常序列。另一方面，盡管樣品DNA與突變序列的探針的雜交對于每個突變的探針的OD值來講多少有些差異，但這些值大大低于正常序列的探針，因此確保通過本發明方法可以清楚地識別突變的存在。
運用本發明，使通過包含具有一個或多個核苷酸變化的每個突變的序列的探針識別突變的位置和類型成為可能。
如上清楚的示例和論證說明，以比任何常規方法更經濟、更簡便和更安全的方式，本發明不僅可以用來識別一個或多個突變的存在，而且也可用來識別突變的類型，如置換、缺失和插入。
序列表<110>黃丞鏞<120>一種使用微孔識別DNA突變的方法及為此提供的試劑盒<160>9<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1ggttttgggt ctgacgac 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ccgacagggg acggaaac 18<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>3ttgacctcgc caggagagaa gatca 25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>4tccgtacgct cgaaacgctt ccaac 25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>5ttgacctcgc cagaagagaa gatca 25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>6tccgtacgct cgagacgctt ccaac 25<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>7ttgacctcgc cagtgagaga agatca26<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>8ttgacctcgc cagagagaag atca 24<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR產物<400>9ggagctttcc ggcttctatc aggta 2權利要求
1.一種使用微孔識別DNA突變的方法，其包括以下步驟(i)使用一個結合了生物素的引物，通過PCR制備一部分待識別的DNA序列的擴增的生物素化的DNA片段；(ii)制備一個包含與待識別的DNA序列相對應的正常序列的探針；(iii)將步驟(ii)中制備的探針固定到微孔的胺基上；(iv)將步驟(i)中制備的生物素化的DNA片段加入到固定了探針的微孔中；(v)為使降解酶與探針捕獲的樣品DNA片段的生物素部分結合，將一種連接了鏈霉抗生物素的降解酶加入到微孔中；和(vi)加入一種將與降解酶反應的底物，并檢測由底物的降解所引起的顏色或吸光度變化。
2.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中探針為含有10個以上核苷酸并在5’端位包含一個磷酸酯部分的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中步驟(iii)包括向微孔中加入單鏈探針；為將單鏈探針的磷酸酯部分結合到微孔的胺基上，加入催化劑；和洗滌微孔。
4.權利要求3所述的識別DNA突變的方法，其中催化劑為10mM1-甲基咪唑，pH值為7.0的冰冷溶液和10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亞胺(EDC)，pH值為7.0的冰冷溶液。
5.權利要求3所述的識別DNA突變的方法，其中洗滌通過使用0.4M NaOH/0.25％吐溫-20溶液進行。
6.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中步驟(iv)包括將步驟(i)獲得的單鏈DNA片段與微孔的探針結合；除去殘余的DNA片段；和洗滌微孔。
7.權利要求6所述的識別DNA突變的方法，其還包括在將步驟(i)獲得的單鏈DNA片段加入到微孔中之前，用含有dH2O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液在50℃下，預處理微孔20分鐘。
8.權利要求6所述的識別DNA突變的方法，其中將步驟(i)獲得的DNA片段與探針的結合在含有dH2O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液中進行。
9.權利要求6所述的識別DNA突變的方法，其中洗滌通過使用0.5×SSC/0.1％吐溫-20溶液進行。
10.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中步驟(v)包括第一次洗滌微孔；將連接了鏈霉抗生物素的降解酶加入到微孔中以使酶與生物素結合；除去殘余的反應混合物；和第二次洗滌微孔。
11.權利要求10所述的識別DNA突變的方法，其中第一次洗滌通過使用含有150mM NaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液進行。
12.權利要求10所述的識別DNA突變的方法，其中連接了鏈霉抗生物素的降解酶為溶于含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中的鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶。
13.權利要求10所述的識別DNA突變的方法，其中第二次洗滌包括在60℃下，用含有150mM NaCl/0.1％吐溫-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液處理微孔10分鐘。
14.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中將與連接了鏈霉抗生物素的降解酶反應的底物為在降解過程中顯示顏色或吸光度變化的合成肽。
15.權利要求14所述的識別DNA突變的方法，其中如果使用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶作為連接了鏈霉抗生物素的降解酶，則底物為pNPP(磷酸對硝基苯基酯)。
16.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中的顏色變化用肉眼檢測。
17.權利要求1所述的識別DNA突變的方法，其中吸光度通過使用一臺ELISA讀數器進行測量。
18.一種識別DNA突變的試劑盒，其包括(i)內部具有胺基的微孔；(ii)10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亞胺(EDC)，pH7.0，和10mM 1-甲基咪唑，pH7.0；(iii)0.4M NaOH/0.25％吐溫-20溶液；(iv)含有dH2O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和鮭魚精子DNA(10mg/ml)的溶液；(v)0.5×SSC/0.1％吐溫-20溶液；(vi)鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶；(vii)含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液；(viii)含有150mM NaCl/0.1吐溫-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液；(ix)pNPP(磷酸對硝基苯基酯)。
全文摘要
本發明提供一種使用微孔識別DNA突變的方法及為此提供的試劑盒。該識別DNA突變的方法包括以下步驟:使用結合了生物素的引物,制備由PCR擴增的、一部分待識別DNA的結合了生物素的核苷酸序列;制備一個包含與待識別的DNA相對應的正常序列的探針;將探針與微孔的胺基結合;向固定了探針的微孔中加入結合了生物素的核苷酸序列;向微孔中加入一種降解酶以使降解酶與探針的生物素結合;和加入一種將與降解酶反應的底物,并檢測由底物降解引起的顏色或吸光度變化。按照本發明,通過使用被PCR擴增的DNA和一個與DNA相對應的正常序列的探針,可以一種經濟、安全和簡便的方式實現對突變DNA的識別。
文檔編號C12Q1/68GK1352698SQ00808047
公開日2002年6月5日 申請日期2000年5月25日 優先權日1999年5月26日
發明者黃丞鏞, 鄭真旭, 金哲民 申請人:黃丞鏞