多肽的制作方法

專利名稱：多肽的制作方法
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本發明涉及在本文中稱為CASB612多核苷酸的多核苷酸、由其編碼的多肽(在本文中稱為CASB612多肽)、用于其生產的重組材料和方法。另一方面，本發明涉及使用這樣的多肽和多核苷酸的方法，包括治療癌癥和自身免疫性疾病以及其它相關病癥。再一方面，本發明涉及使用本發明提供的材料鑒定激動劑和拮抗劑/抑制劑的方法，以及使用所鑒定的化合物治療與CASB612失衡有關的病癥的方法。進一方面，本發明涉及用于檢測與CASB612多肽活性或水平異常有關的疾病的診斷檢測。
據認為本發明的多肽和多核苷酸是特異性預防或治療腫瘤的重要免疫原，因為與正常細胞相比，它們在腫瘤中特異性表達或高度過量表達，因此可成為抗原特異性免疫機制的靶，從而破壞腫瘤細胞。它們還可以用于腫瘤細胞的診斷。此外，它們在某些情況下的不適當表達可誘導自身免疫性不適當的免疫反應，而這可以通過使用同樣的多肽或多核苷酸進行適當接種而得到矯正。這一方面，達到目的的最重要生物活性是本發明多肽的抗原活性和免疫原性活性。本發明多肽還可以具有CASB612多肽的至少一種其它生物活性，這一點使它能夠成為與免疫反應無關的治療性干預靶或預防性干預靶。
功能基因組學非常依賴于高通量DNA測序技術以及從目前許多分子生物學數據庫鑒定具有潛在價值的基因序列的各種生物信息學工具。可以使用最近發展的扣除克隆策略，構造富集與特定組織或生理狀況相關的基因的cDNA文庫。此外，可以使用合適的電子篩選方法鑒定見于某些組織的文庫而在其它組織的文庫中沒有的cDNA。高通量基于基因組或基因的生物學使得能夠使用新方法鑒定和克隆有效免疫反應的靶基因，以對疾病如癌癥和自身免疫進行預防和疫苗治療。
第一方面，本發明涉及CASB612多肽。這樣的肽包括分離的多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO2的全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選至少95％同一性、最優選至少97-99％同一性的氨基酸序列。這樣的多肽包括包含SEQ ID NO2的氨基酸的多肽。
本發明的其它肽包括分離的多肽，其氨基酸序列在SEQ ID NO2的全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選至少95％同一性、最優選至少97-99％同一性。這樣的多肽包括SEQ ID NO2的多肽。
本發明的其它肽包括分離的多肽，所述多肽由包含SEQ ID NO1中序列的多核苷酸編碼。
本發明還提供CASB612多肽的免疫原性片段，所述片段是CASB612多肽的連續部分，與包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽具有相同或相似免疫原性特性。這就是說，所述片段(如果必要，當綴合到一種載體上時)能夠引起識別CASB612多肽的免疫反應。這樣一種免疫原性片段可以包括，例如缺乏N-末端前導序列、跨膜結構域或C-末端錨定結構域的CASB612多肽。在一個優選的方面，依照本發明的CASB612免疫原性片段包含在SEQ ID NO2的全長上與SEQ ID NO2的多肽有同一性的多肽的基本所有胞外結構域，所述同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少90％、更優選至少95％、最優選至少97-99％。
本發明多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是更大的蛋白如前體或融合蛋白的一部分。包括包含以下序列的額外氨基酸序列通常是有利的分泌序列或前導序列、原序列(pro-sequence)、有助于純化的序列如多組氨酸殘基、或在重組產生過程中有利穩定性的其它序列。此外，也可以考慮添加外源多肽或脂質尾或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性潛力。
一方面，本發明涉及遺傳工程的可溶融合蛋白，所述融合蛋白包含本發明多肽或其片段，以及不同免疫球蛋白亞族(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區的不同部分。作為免疫球蛋白，優選的是人類IgG(特別是IgGl)的重鏈的恒定部分，其中在絞鏈區融合。在一個特定實施方案中，可以通過加入可用凝血因子Xa切除的切割序列就可除去Fc部分。此外，本發明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及這些融合蛋白在藥物篩選、診斷和治療中的應用。本發明的再一方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多核苷酸。在國際專利申請號WO94/29458和WO94/22914中可以找到融合蛋白技術實例。
所述蛋白也可以化學綴合或表達為重組融合蛋白，以使得與未融合的蛋白相比，在表達系統中高水平表達。所述融合配偶體可以協助提供T輔助細胞表位(免疫融合配偶體)，最好是被人類識別的T輔助細胞表位，或者所述配偶體協助以比天然重組蛋白更高產量表達所述蛋白(表達增強物)。最好所述融合配偶體既是免疫融合配偶體，又是表達增強配偶體。
融合配偶體包括B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza B)的D蛋白以及流感病毒的非結構蛋白NS1(血凝素)。另一種免疫融合配偶體是稱為LYTA的蛋白。最好使用LYTA分子的C末端部分。Lyta產生自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，它合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶LYTA)(1ytA基因編碼{Gene，43(1986)第265-272頁})即特異性降解肽聚糖主鏈中某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C末端結構域對膽堿或一些膽堿類似物如DEAE具有親和性。已經利用該特性開發用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質粒。已經描述了純化在其氨基末端包含C-LYTA片段的雜種蛋白{Biotechnology10，(1992)第795-798頁}。可利用存在于Lyta分子C末端的起始于殘基178的重復部分，例如殘基188-305。
本發明還包括上面提到的多肽的變異體，即通過保守氨基酸取代與參比物不同的多肽，其中一個殘基由另一個具有相似特性的殘基取代。通常這樣的取代發生在Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe和Tyr之間。特別優選的是其中幾個即5-10個、1-5個、1-3個、1-2個或1個氨基酸以任何組合發生取代、缺失或添加的變異體。
可以以任何合適的方法制備本發明多肽。這樣的多肽包括分離的天然多肽、重組產生的多肽、合成產生的多肽或通過這些方法的組合產生的多肽。用于制備這樣的多肽的方法是本領域眾所周知的。
另一方面，本發明涉及CASB612多核苷酸。這樣的多核苷酸包括包含編碼多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸，其中所述多肽在SEQ ID NO2的全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選95同一性。在這一方面，具有至少97％同一性的多肽是高度優選的，而具有至少98-99％同一性的多肽是更高度優選的，具有至少99％同一性的多肽是最高度優選的。這樣的多核苷酸包括包含SEQ ID NO1中編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
本發明的其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含在完整編碼區上與編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列存在同一性的核苷酸序列，其中所述同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少90％、更優選至少95％。在這一方面，具有至少97％同一性的多核苷酸是高度優選的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更高度優選的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度優選的。
本發明的其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含在SEQ ID NO1的全長上與SEQ ID NO1存在同一性的核苷酸序列，所述同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少90％、而更優選至少95％。在這一方面，具有至少97％同一性的多核苷酸是高度優選的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更高度優選的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度優選的。這樣的多核苷酸包括包含SEQ ID NO1的多核苷酸的多核苷酸，還包括SEQ IDNO1的多核苷酸。所述多核苷酸可以插入合適質粒或重組微生物載體并用于免疫接種(見例如Wolff等人，Science 2471465-1468(1990)；Corr等人，J.Exp.Med.1841555-1560(1996)；Doe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.938578-8583(1996))。本發明還提供與所有上面所述多核苷酸互補的多核苷酸。
本發明還提供CASB612多核苷酸的片段，當將所述片段給予接受者時，所述片段具有與SEQ ID NO1多核苷酸相同的免疫原性特性。
本發明還提供編碼前面定義的CASB612多肽的免疫片段的多核苷酸。
SEQ ID NO1的核苷酸序列與任何已知基因沒有同源性。SEQ IDNO1的核苷酸序列是cDNA序列，而且包含編碼369個氨基酸的多肽即SEQ ID NO2多肽的多肽編碼序列(核苷酸133-1242)。編碼SEQID NO2的多肽的核苷酸序列可以與SEQ ID NO1中的多肽編碼序列相同，或者可以是與SEQ ID NO1中的多肽編碼序列不同的序列，由于遺傳密碼豐余性(簡并性)，所述不同序列也編碼SEQ ID NO2的多肽。SEQ ID NO2的多肽與任何已知蛋白無關。
預期本發明的優選多肽和多核苷酸與其同源多肽和多核苷酸的特別相似的生物學功能/特性。此外，根據情況，本發明優選的多肽、免疫片段和多核苷酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的至少一種活性。
本發明還涉及在確定SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的相應全長序列之前首次鑒定的部分或其它不完全的多核苷酸序列和多肽序列。
因此，再一方面，本發明提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸(a)包含在SEQ ID NO3的全長上與SEQ ID NO3存在至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選至少95％同一性、更加優選至少97-99％同一性的核苷酸序列；(b)具有在SEQ ID NO3的全長上與SEQ ID NO1存在至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選至少95％同一性、更加優選至少97-99％同一性的核苷酸序列；(c)SEQ ID NO3的多核苷酸；或(d)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽序列在SEQ ID NO4的全長上與SEQ ID NO4的氨基酸序列具有至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、更優選至少95％同一性、更加優選至少97-99％同一性；以及SEQ ID NO3的多核苷酸。
本發明還提供多肽，它(a)包含在SEQ ID NO4全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列存在至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、而更優選至少95％同一性、最優選至少97-99％同一性的氨基酸序列；(b)具有在SEQ ID NO4全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列存在至少70％同一性、優選至少80％同一性、更優選至少90％同一性、而更優選至少95％同一性、最優選至少97-99％同一性的氨基酸序列；(c)包含SEQ ID NO4的氨基酸；和(d)是SEQ ID NO4的多肽；以及由包含SEQ ID NO3中的序列的多核苷酸編碼的多肽。
SEQ ID NO3的核苷酸序列和由其編碼的肽序列來自EST(已表達序列標志)序列。本領域技術人員公認在EST序列中不可避免地會有一些核苷酸序列閱讀錯誤(見Adams，MD.等人，Nature 377(增刊)3，1995)。因此，SEQ ID NO3的核苷酸以及由其編碼的肽序列在序列精確性上受到同樣的先天限制。此外，由SEQ ID NO3編碼的肽序列包含與最相近的同源蛋白或結構相似蛋白具有同一性或相近同源性和/或相近結構相似性(例如一個保守氨基酸差異)的區。
可以使用標準克隆和篩選技術，從由人類結腸癌細胞、肺癌細胞、子宮癌細胞和胎組織細胞的mRNA得到的cDNA文庫中獲得本發明的多核苷酸(例如Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Springharbor，N.Y.(1989))。也可以從天然來源如基因組DNA文庫獲得本發明的多核苷酸，或使用眾所周知和商業性可用技術合成本發明的多核苷酸。
當本發明的多核苷酸用于重組產生本發明多肽時，所述多核苷酸可以包括成熟多肽本身的編碼序列；或與其它編碼序列在同一可讀框內的成熟多肽編碼序列，所述其它編碼序列如編碼前導序列或分泌序列、前蛋白(pre-protein)序列、原蛋白(pro-protein)序列或前原蛋白(prepro-protein)序列或其它融合肽部分的編碼序列。例如可以編碼便利純化融合多肽的標記序列。在本發明這一方面的某些優選實施方案中，所述標記序列是在pQE載體(Qiagen，Inc.)中提供并在Gentz等人，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821-824中描述的六組氨酸肽，或者所述標記序列是HA標記。所述多核苷酸還可以包含不編碼的5’序列和3’序列，如轉錄但不翻譯的序列、剪切信號和聚腺苷酸化信號、核糖體結合位點和穩定mRNA的序列。
本發明的其它實施方案包括編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽變異體的多核苷酸，在所述氨基酸序列中幾個(如5-10個、1-5個、1-3個、1-2個或1個)氨基酸殘基以任何組合發生取代、缺失或添加。
與SEQ ID NO1中的核苷酸序列相同或足夠相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針或用作核酸擴增(PCR)反應的引物，以分離編碼本發明多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及用于分離與SEQ ID NO1具有高序列相似性的其它基因(包括編碼來自人類來源的共生同源物(paralogs)以及來自非人類物種的共生同源物和直向同源物(ortholog)的基因)的cDNA和基因組克隆。通常這些核苷酸序列與參比物的核苷酸序列70％相同、優選80％相同、更優選90％相同、最優選95％相同。所述探針或引物一般將包含至少15個核苷酸，最好包含至少30個核苷酸，可以具有至少50個核苷酸。特別優選的探針將具有30到50個核苷酸。特別優選的引物將具有20到25個核苷酸。尤其是由同源動物來源的序列得到的多肽或多核苷酸可以用作免疫原，以獲得與人類基因的交叉反應性免疫反應。
可以使用包括下列步驟的方法獲得編碼本發明多肽(包括人類以外其它物種的同源物)的多核苷酸使用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的標記探針，在嚴格雜交條件下篩選合適的文庫；分離包含所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。這樣的雜交技術對于本領域技術人員是眾所周知的。優選的雜交條件包括用包含以下成分的溶液42℃溫育過夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt氏溶液，10％葡聚糖硫酸酯以及20微克/ml變性、剪切的鮭魚精子DNA；然后在約65℃下在0.1×SSC中洗滌濾膜。因此，本發明還包括使用具有SEQ IDNO1的序列或其片段的標記探針，通過在嚴格雜交條件下篩選合適文庫可獲得的多核苷酸。
有經驗的技術人員會了解在許多情況下，分離的cDNA序列將是不完全的，因為編碼多肽的區在cDNA的5’缺失。
對于本領域技術人員來說，有幾種獲得全長cDNA或延伸短cDNA的方法是可利用并且眾所周知的，例如基于cDNA末端快速擴增(RACE)的方法(見例如Frohman等人，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最新改進的該技術例如MarathonTM技術(Clontech LaboratoryInc.)已經明顯簡化了對更長cDNA的搜索。在MarathonTM技術中，從由選定組織提取的mRNA制備cDNA，并將“接頭”序列連接到每個末端。然后使用基因特異性寡核苷酸引物和接頭特異性寡核苷酸引物的組合，進行核酸擴增(PCR)以擴增所述cDNA“缺失的”5’端。然后使用“嵌套”引物重復所述PCR反應，“嵌套”引物即是設計在所擴增的產物內退火的引物(通常是在所述接頭序列的遠3’端退火的接頭特異性引物和在已知基因序列的遠5’退火的基因特異性引物)。然后通過DNA測序分析該反應的產物，隨后通過直接連接所述產物到存在的cDNA產生完整的序列，或使用新的序列信息設計5’引物來進行另一次全長PCR，構造全長cDNA。
可以通過本領域內眾所周知的方法，用包含表達系統的遺傳工程宿主細胞制備本發明的重組多肽。因此，在再一方面，本發明涉及包含本發明的多核苷酸的表達系統，涉及使用這樣的表達系統遺傳工程宿主細胞，以及涉及通過重組技術產生本發明多肽。也可以使用無細胞翻譯系統利用由本發明的DNA構造物得到的RNA，產生這樣的蛋白。
為進行重組表達，可以遺傳工程操作宿主細胞以加入用于本發明多核苷酸的表達系統或其部分。可以通過在許多標準實驗室手冊中描述的方法將多核苷酸引入宿主細胞，所述實驗室手冊如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。優選的這樣的方法包括，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉位、顯微注射、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、scrape loading、彈道引入或感染。
本發明的蛋白最好與反式硫氧還蛋白(thioredxin in trans)(TIT)共表達。相對于順式硫氧還蛋白，優選與反式硫氧還蛋白共表達，使得抗原不含硫氧還蛋白，從而不必加入蛋白酶。硫氧還蛋白共表達使本發明的蛋白容易溶解。硫氧還蛋白共表達對于蛋白純化產量、所純化蛋白的溶解度和質量也有顯著影響。
合適宿主的典型實例包括細菌細胞，如鏈球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)和枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)細胞；真菌細胞，如酵母細胞和曲霉屬(Aspergillus)細胞；昆蟲細胞，如果蠅屬S2(Drosophila S2)和SpodopteraSf9細胞；動物細胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。
可以使用多種表達系統，例如染色體系統、附加型系統以及病毒衍生系統，如衍生自細菌質粒的載體、衍生自噬菌體的載體、衍生自轉座子的載體、衍生自酵母附加體的載體、衍生自插入元件的載體、衍生自酵母染色體元件的載體、衍生自病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉錄病毒)的載體、以及它們組合衍生的載體，如衍生自質粒和噬菌體遺傳元件的載體(諸如粘粒和噬菌粒)。所述表達系統可以包含調節以及引起表達的控制區。一般來說，可以使用在宿主中能夠維持、繁殖或表達多核苷酸以產生多肽的任何系統或載體。可以通過多種眾所周知和常規的技術中的任何一種將合適的核苷酸序列插入表達系統中，所述技術如Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(見上文)中所述技術。可以將合適的分泌信號加入所需的多肽以使轉錄蛋白能夠分泌入內質網的腔、周質間隙或胞外環境。這些信號對于所述多肽可以是內源的，或者它們可以是異源信號。
所述表達系統也可以是活的重組微生物，例如病毒或細菌。可以將目的基因插入活的重組病毒或細菌的基因組。用該活的載體接種和體內感染將使所述抗原在體內表達并誘導免疫反應。用于該目的的病毒和細菌可以是例如痘病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒)、甲病毒屬(新培斯病毒、塞姆利基森林病毒、委瑞內拉馬腦炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、小核糖核酸病毒(脊髓灰質炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘-帶狀皰疹病毒等)、李斯特菌屬、沙門氏菌屬、志賀菌屬、BCG。這些病毒和細菌可以是有毒力的，或者以各種方式減毒以獲得活疫苗。這樣的活疫苗也構成本發明的一部分。
可以用眾所周知的方法由重組細胞培養物回收和純化本發明多肽，所述方法包括硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子交換層析或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。最優選使用離子金屬親和層析(IMAC)進行純化。當所述多肽在胞內合成、分離和或純化過程中變性時，可以使用眾所周知的重折疊蛋白技術重建活性構象。
本發明的另一重要方面涉及在哺乳動物中誘導、強化或調節免疫反應的方法，包括用本發明的片段或完整多肽或多核苷酸接種所述哺乳動物，所述片段或完整多肽或多核苷酸足以產生抗體和/或T細胞免疫反應，以預防或治療性治療癌癥和自身免疫性疾病以及相關病癥。而本發明的再一方面涉及在哺乳動物中誘導、強化或調節免疫反應的方法，包括通過載體或細胞傳遞本發明的蛋白以誘導這樣的免疫反應，產生預防或治療所述哺乳動物疾病的免疫反應，其中所述載體或細胞在體內控制所述多核苷酸的表達并編碼所述多肽。
本發明的又一方面涉及免疫/疫苗制劑(組合物)，當將所述免疫/疫苗制劑(組合物)入哺乳動物宿主時，在該哺乳動物體內誘導、強化或調節針對本發明多肽的免疫反應，其中所述組合物包含本發明多肽或多核苷酸或其以上定義的免疫片段。所述疫苗制劑還可以包含合適的載體。由于多肽可在胃內分解，所以最好胃腸外給予(例如皮下注射、肌內注射、靜脈內注射或皮內注射)。適于胃腸外給予的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液以及水性和非水性無菌懸浮液，所述無菌注射溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得所述制劑與接受者血液等滲的溶質，所述無菌懸浮液可以包括懸浮劑或增稠劑。所述制劑可以裝在單位劑量容器或多劑量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可以保存在凍干環境下，只需要在使用前加入無菌液體載體。
本發明的再一方面涉及使用哺乳動物免疫系統細胞，體外誘導針對本發明的片段或全長多肽或多核苷酸的免疫反應或針對包含本發明多肽或多核苷酸的分子的免疫反應，并將這些活化的免疫細胞再輸注入所述哺乳動物以治療疾病。如下完成所述免疫系統細胞的活化在存在或不存在各種免疫調制劑分子的情況下，將所述細胞與本發明的完整多肽或多核苷酸或者包含本發明的多肽或多核苷酸的分子體外溫育。本發明的又一方面涉及通過給予抗原呈遞細胞而免疫哺乳動物，所述抗原呈遞細胞通過在體外加載本發明的部分或完整多肽或包含本發明多肽的分子而修飾并以免疫原性方式在體內給予。或者，可以在體外用包含本發明的片段或完整多核苷酸的載體或者用包含包括本發明多核苷酸的分子的載體轉染抗原呈遞細胞以表達相應多肽，然后以免疫原性方式體內給予。
本發明的疫苗制劑也可以包括增強所述制劑的免疫原性的佐劑系統。所述佐劑系統最好增強TH1型反應。
免疫反應可以主要分為兩大類體液免疫應答或細胞介導的免疫應答(傳統上特征分別在于保護的抗體機制和效應細胞機制)。這兩類免疫反應稱為TH1型反應(細胞免疫反應)以及TH2型免疫反應(體液免疫反應)。
非常典型的TH1型免疫反應特征在于產生抗原特異性單倍型限制性細胞毒性T淋巴細胞以及天然殺傷細胞反應。在小鼠中，TH1型反應通常特征在于產生IgG2a亞型抗體，而在人類中這些抗體相當于IgG1型抗體。TH2型免疫反應特征在于產生各種各樣的免疫球蛋白同種型，在小鼠包括IgG1、IgA和IgM。
可以認為產生這兩種類型免疫反應的驅動力是細胞因子。高水平的TH1型細胞因子傾向于促進誘導對給定抗原的細胞介導的免疫反應，而高水平的TH2型細胞因子傾向于促進誘導對抗原的體液免疫反應。
TH1型免疫反應和TH2型免疫反應的區別并不是絕對的。實際上，有個別人支持將免疫反應描述為主要是TH1型或主要是TH2型的免疫反應。然而，按照Mosmann和Coffman描述鼠CD4+ve T細胞克隆時采用的細胞因子家族分類來考慮細胞因子家族常常是合適的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)THl和TH2細胞不同模式的淋巴因子分泌產生不同的功能特性.Annual Review of Immunology，7，第145-173頁)。傳統上，TH1型反應與T淋巴細胞產生IFN-γ和IL-2細胞因子有關。其它常常與誘導TH1型免疫反應有關的細胞因子如IL-12并不是T細胞產生的。相反，TH2型反應與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13分泌有關。
已知某些疫苗佐劑特別適于刺激TH1型或TH2型細胞因子反應。傳統上，在免疫接種或感染后免疫反應的TH1∶TH2平衡的最佳指標包括在體外用抗原再刺激后直接測量T細胞產生的TH1或TH2細胞因子，和/或測量抗原特異性抗體反應的IgG1∶IgG2a比例。
因此，TH1型佐劑是在體外用抗原再刺激時優先刺激分離的T細胞群體產生高水平TH1型細胞因子而且促進產生CD8+細胞毒性T淋巴細胞以及與TH1型同種型有關的抗原特異性免疫球蛋白反應的佐劑。
國際專利申請號WO 94/00153和WO 95/17209描述了能夠優先刺激TH1細胞反應的佐劑。
3脫氧酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)就是一種這樣的佐劑。這從GB 2220211(Ribi)得知。在化學上它是具有4、5或6個酰化鏈的3脫氧酰化單磷酰脂質A的混合物，由Ribi Immunochem，Montana生產。3脫氧酰化單磷酰脂質A的優選形式公開于歐洲專利0 689 454 Bl(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
3D-MPL的顆粒最好小得足以使其可以無菌濾過0.22微米的膜(歐洲專利號0 689 454)。3D-MPL劑量范圍為每劑10μg-100μg、最好25-50μg，其中所述抗原的劑量范圍通常為每劑2-50μg。
另一種優選的佐劑包含QS21，即一種從Quillaja Saponaria Molina的樹皮得到的Hplc純化無毒部分。可選地將QS21與3脫氧酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)混合，可選地還與另一種載體混合。
美國專利號5,057,540公開了制備QS21的方法。
以前已經描述了包含QS21的非反應性佐劑制劑(WO96/33739)。已經證實包含QS21和膽固醇的這類制劑當與抗原一起配制時是成功的TH1刺激佐劑。
TH1細胞反應優先刺激物的其它佐劑包括免疫調制性寡核苷酸，例如在WO 96/02555中公開的非甲基化CpG序列。
還考慮組合諸如上述的不同TH1刺激佐劑，以提供屬于TH1細胞反應優選刺激物的佐劑。例如QS21可以與3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比例通常約為1∶10到10∶1；最好是1∶5到5∶1，而實際上常常是1∶1。最佳協同作用的最優范圍是2.5∶1到1∶1的3D-MPL∶QS21。
依照本發明的疫苗組合物中最好還存在一種載體。所述載體可以是水包油乳劑，或者是一種鋁鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁。
優選的水包油乳劑包含一種可代謝的油如鯊烯、α-生育酚和Tween 80。在一個特別優選的方面，用這樣的乳劑將本發明疫苗組合物的抗原與QS21和3D-MPL混合。此外所述水包油乳劑可以含有Span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
給予人時，通常疫苗中的QS21和3D-MPL含量范圍為每劑1μg-200μg，如10-100μg，最好是10μg-50μg。而水包油乳劑通常含有2-10％的鯊烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween 80。鯊烯∶α-生育酚的比例最好是等于或小于1，因為這樣的比例提供更穩定的乳濁液。Span 85含量也可以為1％。在某些情況下，本發明的疫苗另外含有一種穩定劑是有利的。
無毒的水包油乳劑最好在水溶液載體中含有一種無毒的油，如角沙烷或角鯊烯，以及一種乳化劑如Tween 80。所述水溶液載體可以是例如磷酸緩沖鹽溶液。
WO 95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，該制劑為包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳劑。
本發明還提供多價疫苗組合物，所述多價疫苗組合物包含本發明的疫苗制劑以及其它抗原，尤其是用于治療癌癥、自身免疫性疾病和相關病癥的抗原。這樣的一種多價疫苗組合物可以包括如前面所述的TH-1誘導佐劑。
本發明還涉及使用以下物質作為診斷試劑由本發明的多核苷酸獲得的引物形式的多核苷酸以及本發明多肽特異性抗體或試劑形式的多肽。
鑒定血液或組織中使得能夠檢測到癌癥發生非常早期的變化的遺傳或生化標記有助于確定患者的最佳治療。可以使用替代腫瘤標記如多核苷酸表達診斷不同形式和狀態的癌癥。鑒定本發明的多核苷酸的表達水平有助于對癌性疾病分期以及對癌性組織性質進行分級。所述分期過程監測癌癥的發展，并根據在進行活組織檢查的區域是否存在惡性組織而確定。本發明的多核苷酸可以通過鑒定癌癥侵襲性的標記例如在身體不同部位存在所述標記而使所述分期過程更準確。所述癌癥的分級描述了腫瘤與其同類型的正常組織相近程度，并通過它的細胞形態學和其它分化標記進行評估。由于本發明的多核苷酸能夠幫助確定腫瘤細胞的分化狀態，因此它們可以用于確定癌癥級別。
所述診斷測定通過包含下列步驟的方法的診斷提供診斷或確定對癌癥、自身免疫性疾病和相關病癥的易感性的方法測定受檢者樣品中異常降低或升高的多肽或mRNA。該診斷方法被稱為差異表達。比較特定基因在患病組織和正常組織中的表達。，比較兩種組織中多核苷酸相關基因、mRNA或蛋白質的差異，例如在懷疑患病的人體組織中，指示基因變化或調節所述基因的基因變化的分子量、氨基酸序列或核苷酸序列、相對豐度差異。
可以在RNA水平上測量表達的降低或增加。首先從所述兩種組織中分離polyA RNA，可以通過例如在組織切片上的原位雜交、逆轉錄酶-PCR、使用包含poly A+mRNA的RNA印跡或任何其它直接或間接的RNA檢測方法，檢測相當于差異化表達的本發明多核苷酸的基因編碼的mRNA。與正常組織相比，給定RNA在患病組織中的表達增強或降低暗示所述轉錄物和/或所述表達的蛋白在疾病中具有某種作用。因此，檢測到相當于SEQ ID NO1或3的mRNA相對于正常水平增高或降低說明所述患者存在癌癥。
通過用樣品制備表達序列標記(EST)的文庫，可以確定所述樣品中的mRNA表達水平。可以用EST在所述文庫中的相對表現度評估所述基因轉錄物在起始樣品中的相對表現度。然后將受試樣品的EST分析與參比樣品的EST分析相比較，確定目的多核苷酸的相對表達水平。
可以使用基因表達連續分析(SAGE)方法(Velculescu等人，Al.Science(1995)270484)，差異展示方法(例如US 5,776,683)或依賴于核苷酸相互作用特異性的雜交分析進行其它mRNA分析。
另一方面，可以在蛋白質水平上進行比較。在對兩種組織提取出的蛋白進行的蛋白質印跡中，使用抗體檢測多肽，可以比較兩種組織中的蛋白大小。使用抗相應蛋白的抗體，可以免疫學檢測表達水平和亞細胞定位。可用于測定宿主樣品中的蛋白(如本發明多肽)水平的其它測定技術是本領域內技術人員眾所周知的。與正常組織中相同多肽的表達水平相比，在所述患病組織中的蛋白表達水平升高或降低說明所表達的蛋白質可能參與所述疾病的形成。
在本發明的測定中，通過檢測至少一種SEQ ID NO1或3所示序列編碼的基因產物表達水平，可以確定診斷。也可利用比較患病組織與正常組織中mRNA或蛋白質水平來跟蹤疾病是惡化還是緩解。
可以使用多核苷酸陣列測量樣品中大量的多核苷酸序列。可用于檢測基因的差異表達以及確定基因功能。例如可利用多核苷酸序列SEQ ID NO1或3陣列確定任何一種多核苷酸是否在正常細胞和癌癥細胞差異表達。在本發明的一個實施方案中，可以構造包含SEQID NO1或3核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列，有效篩選例如遺傳突變。陣列技術方法是眾所周知的而且具有普遍應用性，可用于闡明分子遺傳學中的多種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(見例如M.Chee等人，Science，第274卷，第610-613頁(1996))。
本文所用的“診斷”包括檢測受檢者對疾病的易感性、檢測受檢者目前是否患病以及罹患所述疾病的患者的預后。
本發明還涉及用于進行診斷測定的診斷試劑盒，它包括(a)本發明的多核苷酸或其片段，所述多核苷酸最好是SEQ IDNO1或3的核苷酸序列；(b)與(a)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(c)本發明多肽或其片段，所述多肽最好是SEQ ID NO2或4的多肽；(d)抗本發明多肽的抗體，最好是抗SEQ ID NO2或4多肽的抗體。
本發明的核苷酸序列對于染色體定位也是有價值的。所述序列特異性靶向單個人類染色體的特定位點，并可與該位點雜交。依照本發明將相關序列作圖到染色體上，這是將那些序列與基因相關疾病聯系起來的重要的第一步。一旦將序列作圖到精確的染色體位點上，就可以將該序列在所述染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據相聯系。這樣的數據可以在例如V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過Johns Hopkins University Welch Medical Library在線獲得)中找到。然后通過連鎖分析(物理性相鄰基因的共遺傳)鑒定已經作圖到同一染色體區的基因和疾病之間的關系。也可以測定患病個體和非患病個體之間在cDNA或基因組序列方面的差異。
本發明多肽或它們的片段或它們的類似物或表達它們的細胞也可以用作免疫原，產生對本發明多肽具有免疫特異性的抗體。術語“免疫特異性”是指所述抗體與本發明多肽的親和力明顯高于與在先技術中的其它相關多肽的親和力。
又一方面，本發明提供對依照本發明多肽或其前面定義的免疫片段具有免疫特異性的抗體。所述抗體最好是單克隆抗體。
可以通過使用常規方法，給予動物(最好是非人類動物)本發明多肽或帶有表位的片段、類似物或細胞，獲得針對本發明多肽產生的抗體。為制備單克隆抗體，可以使用通過連續細胞系培養產生抗體的任何技術。實例包括雜交瘤技術(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
可以改進用于產生單鏈抗體的技術如美國專利第4,946,778介紹的技術，產生抗本發明多肽的單鏈抗體。同時，可以使用轉基因小鼠或其它生物包括其它哺乳動物來表達人源化抗體。
可以使用上面描述的抗體分離或鑒定表達所述多肽的克隆，或通過親和層析純化所述多肽。也可使用本發明的抗體預防或治療癌癥(尤其是卵巢癌和結腸癌)、自身免疫性疾病和相關病癥。
本發明的另一方面涉及誘導或調節哺乳動物免疫反應的方法，包括用本發明多肽接種所述哺乳動物，接種量足以產生抗體和/或T細胞免疫反應以保護或改善疾病的癥狀或進一步發展。而本發明的又一方面涉及誘導或調節哺乳動物免疫反應的方法，包括通過載體傳遞本發明多肽，以誘導這樣的免疫反應來產生保護所述哺乳動物抵抗疾病的抗體，其中所述載體在體內控制所述多核苷酸的表達并編碼所述多肽。
因此，人們應該知道，本發明提供治療與CASB612多肽活性的存在、或者過量、或者表達減少有關的異常病癥的方法，所述異常病癥例如癌癥和自身免疫性疾病，尤其是卵巢癌和結腸癌。
本發明還提供篩選化合物以鑒定刺激或抑制CASB612多肽功能的化合物的方法。一般來說，可以使用激動劑或拮抗劑治療或預防上文所述疾病。可以從多種來源鑒定化合物，所述來源例如細胞、無細胞制備物、化學文庫和天然產物混合物。根據具體情況，如此鑒定的這樣的激動劑、拮抗劑或抑制劑可以是所述多肽的天然底物或修飾底物、配體、受體、酶等；或者所述激動劑、拮抗劑或抑制劑可以是所述多肽的結構模擬物或功能模擬物(見Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)第五章(1991))。篩選方法是本領域內技術人員周知的。其它篩選方法可見于例如D.Bennett等人，JMol Recognition，852-58(1995)；和K.Johanson等人，J Biol Chem，270(16)9459-9471(1995)以及其中的參考文獻。
因此，本發明提供篩選鑒定刺激或抑制本發明多肽的功能的化合物的方法，包括選自以下的方法(a)利用與候選化合物直接或間接結合的標記，測量候選化合物與所述多肽(或帶有所述多肽的細胞或膜)或其融合蛋白的結合；(b)在標記競爭物存在下，測量候選化合物與所述多肽(或帶有所述多肽的細胞或膜)或其融合蛋白的結合；(c)使用適用于帶有所述多肽的細胞或膜的檢測系統，測試所述候選化合物是否產生由于所述多肽的激活或抑制而產生的信號；(d)將候選化合物與含有權利要求1的多肽的溶液混合以形成混合物，測量所述多肽在所述混合物中的活性，并將所述混合物的活性與標準品比較；或(e)使用例如ELISA測定，檢測候選化合物對細胞中編碼所述多肽的mRNA和所述多肽的產生的影響。
可以通過本領域已知的標準受體結合技術，使用本發明多肽鑒定膜結合受體或可溶性受體(如果有的話)。也可使用眾所周知的篩選方法鑒定與本發明多肽競爭結合其受體的本發明多肽的激動劑或拮抗劑(如果有的話)。
因此，另一方面，本發明涉及鑒定本發明多肽的激動劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等等的篩選試劑盒；或涉及鑒定降低或增強所述多肽的產生的化合物，它包括(a)本發明的多肽；(b)表達本發明多肽的重組細胞；(c)表達本發明多肽的細胞膜；或(d)抗本發明多肽的抗體；所述多肽最好是SEQ ID NO2的多肽。
有經驗的技術人員很容易知道，本發明多肽也可用于根據結構設計所述多肽的激動劑、拮抗劑或抑制劑的方法，所述方法如下進行(a)首先測定所述多肽的三維結構；(b)推導激動劑、拮抗劑或抑制劑的可能活性位點或結合位點的三維結構；(c)合成預期與所推導的結合位點或活性位點結合或反應的候選化合物；(d)測試所述候選化合物是否確實是激動劑、拮抗劑或抑制劑。
也可使用基因療法使接受者的相關細胞內源性產生CASB612多肽。關于基因療法的綜述參見Human Molecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)的第20章“基因治療和其它基于分子遺傳學的治療方法”(以及其中引用的參考文獻)。
Pharmaceutical Biotechnology，第61卷“疫苗設計-亞單位和佐劑方法”，Powell和Newman編輯，Plenum Press，1995中一般性介紹了疫苗制劑。New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人編輯，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如Fullerton的美國專利4,235,877介紹了脂質體包囊。例如Likhite的美國專利4,372,945和Armor等人的美國專利4,474,757公開了蛋白質與大分子的綴合。
各疫苗劑量中的蛋白質量選定為誘導免疫保護性反應而不會在普通接種者引起明顯副作用的量。這樣的量隨使用的特定免疫原而不同。一般來說，預期每劑量將包含1-1000μg蛋白、優選2-100μg蛋白、最好4-40μg蛋白。可以用包括觀察接種者的抗體滴度和其它反應的標準研究決定具體疫苗的最佳量。在初次接種后，接受者可以在約4周后接受一次強化接種。
“分離”是指自然狀態的“人為”改變。如果一種“分離的”組合物或物質是天然存在的，那么它的自然環境已改變、或已經從其自然環境中分離出來、或者兩者兼而有之。例如作為本文使用的此術語，在活動物中天然存在的多核苷酸或多肽并不是“分離的”，但與其天然狀態共存的物質分開的相同多核苷酸或多肽是“分離的”。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是包括單鏈和雙鏈區的未修飾RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。
“變異體”是指與參比多核苷酸或多肽不同但保持原有基本特性的多核苷酸或多肽。典型多核苷酸變異體的核苷酸序列與另一參比多核苷酸不同。變異體核苷酸序列變化可以改變或可以不改變參比多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下文所論述，核苷酸改變可能導致參比序列編碼的多肽的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。典型多肽變異體的氨基酸序列與另一參比多肽不同。一般來說，差異是有限的，以便所述參比多肽和所述變異體的序列在總體上非常相似并在許多區是相同的。變異體和參比多肽可能由于任何組合的一個或多個取代、添加、缺失而氨基酸序列不同。取代或插入的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。多核苷酸或多肽的變異體可以是天然存在變異體如等位基因變異體，或者所述變異體可以是未知的天然變異體。可以通過誘變技術或通過直接合成制備多核苷酸和多肽的非天然變異體。
本領域已知“同一性”是通過比較序列確定的兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關系。在本領域“同一性”也是指根據情況，通過多肽或多核苷酸序列排列匹配確定這樣的序列之間的序列相關程度。用已知方法可以很容易地計算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于下列文獻介紹的方法(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.編輯，Oxford UniversityPress，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.，和Griffin，H G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，yon Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編輯，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。設計測定同一性的優選方法以獲得所測試序列之間的最大匹配。測定同一性和相似性的方法可用公眾可得到的計算機程序編制。用于測定兩序列間同一性和相似性的優選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Atschul，S.F.等，J.MolecBiol.215403-410(1990))。BLAST X程序可以從NCBI和其它來源公開得到(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。也可以使用眾所周知的Smith Waterman算法測定同一性。
優選使用的算法是FASTA。用該算法進行多肽序列或多核苷酸序列比較的優選參數包括以下參數空位罰分12空位拓展罰分4字串大小2，最大為6
用其它方法進行多肽序列比較的優選參數包括以下參數1)算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62，Proc.Natl.AcadSci.USA.8910915-10919(1992)。
空位罰分12空位長度罰分4可使用這些參數的程序可以“空位(gap)”程序從GeneticsComputer Group，Madison WI公開獲得。上述參數是進行多肽比較(對末端空位沒有罰分)的默認參數。
用于多核苷酸比較的優選參數包括下列參數1)算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣匹配＝+10，錯配＝0空位罰分50空位長度罰分3可使用這些參數的程序可以“空位”程序從Genetics ComputerGroup，Madison WI公開獲得。上述參數是進行多核苷酸比較的默認參數。
例如本發明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1的參比序列相同，即100％相同，或者與所述參比序列相比，它可包括高至某一整數的核苷酸改變。這樣的改變可以是至少一個核苷酸缺失、取代(包括堿基轉換和堿基顛換)或插入，并且所述改變可以發生在所述參比核苷酸序列的5′或3′末端位置或兩個末端位置間的任何地方，或者各自單獨散置于參比序列的核苷酸，或者散置于參比序列的一個或多個連續組。所述核苷酸改變的數量如下確定SEQ ID NO1核苷酸總數乘以相應同一性百分率的數字式百分數(除以100)，隨后從所述SEQ ID NO1核苷酸總數減去該乘積，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數目，xn是SEQ ID NO1核苷酸總數，y是例如0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)、0.90(90％)、0.95(95％)等等，其中將xn和y的任何非整數乘積從xn減去之前，將該乘積下舍到最近的整數。編碼SEQ ID NO2多肽的多核苷酸中的改變可能在該編碼序列中產生無義、錯義或移碼突變，并因此在這樣的改變后改變由所述多核苷酸編碼的多肽。
同樣，本發明多肽序列可以與SEQ ID NO2的參比序列相同，即100％相同，或者與所述參比序列比較，該序列包括高至某一整數的氨基酸改變，以至同一性百分率小于100％。這樣的改變選自至少一個氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，其中所述改變可以發生在所述參比多肽序列的氨基末端位置或羧基末端位置或兩個末端位置間的任何地方，或者各自單獨散置于參比序列的氨基酸，或者散置于參比序列中的一個或多個連續組。如下確定給定同一性百分率的氨基酸改變數目SEQ ID NO2氨基酸總數乘以相應同一性百分率的數字式百分數(除以100)，隨后從所述SEQ IDNO2氨基酸總數減去該乘積，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改變數目，xa是SEQ ID NO2氨基酸總數，y是例如0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)等等，其中將任何xa和y的非整數乘積從xa減去之前，將該乘積下舍去到最近的整數。
“同源物”是本領域使用的遺傳術語，指多核苷酸序列或多肽序列與研究序列具有高度序列相關性。可以通過確定如上所述比較的序列之間的同一性和/或相似性水平而定量這樣的相關性。屬于該通用術語的有術語“ortholog”和“paralog”，“ortholog”指在另一物種為多核苷酸或多肽的功能等同物的多核苷酸或多肽，“paralog”指當在同一物種內考慮時功能相似的序列。
使用TriPure試劑(Boehringer)從迅速冰凍的結腸活檢組織中提取總RNA。正常組織總RNA來源于如上的InVitrogen。使用寡聚dT磁珠(Dynal)從DNA酶處理后的總RNA純化poly-A+mRNA。使用SybrII染料(Molecular Probes)，通過分光熒光測定(BioRad)定量mRNA。使用Perkin-Elmer Primer Express軟件，用針對TaqMan擴增條件的默認選項，設計用于擴增的引物。
根據標準PCR方法組織實時反應，在每個反應中使用2ng純化mRNA。實時檢測時以1/75000的最終稀釋度加入Sybr I染料(Molecular Probes)。用PE 7700系統進行擴增(40個循環)和實時檢測。使用7700序列檢測器軟件計算每位患者的腫瘤(CtT)樣品和正常(CtN)樣品的Ct值。Ct值差異(CtN-CtT)直接量度腫瘤組織和正常組織間轉錄水平差異。由于Ct值與拷貝數成對數線性相關，并且在常規實驗條件下PCR擴增的效率接近理論擴增效率，因此2(CtN-CtT)估測兩種組織相對轉錄物水平(即mRNA在腫瘤中成倍過量表達)。用6位患者的數據組(復份)計算過量表達患者的百分率以及在這些患者的腫瘤中mRNA過量表達的平均水平。表3
表46對結腸樣品的CASB612實時RT-PCR Ct值
N正常結腸T結腸癌當不能從所述cDNA文庫直接獲得全長基因時，使用RACE技術(Marathon試劑盒，ClonTech)分離丟失的序列。該方法依賴于mRNA逆轉錄為雙鏈cDNA，連接接頭到所述cDNA的末端，并使用基因特異性引物和一個寡核苷酸接頭擴增所述cDNA的所需末端。將Marathon PCR產物克隆進質粒并測序。實施例33.1腫瘤特異性抗原的表達和純化使用在微生物宿主中的表達來產生疫苗目的的本發明抗原，以及產生蛋白片段或完整蛋白，以快速純化和產生通過免疫組織化學表征天然表達的蛋白所需的抗體或隨后純化所需的抗體。
可以在兩種微生物宿主，即大腸桿菌和酵母(如啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))中表達重組蛋白。這使得能夠選擇用于該特定抗原生產具有最佳特征的表達系統。一般來說，所述重組抗原將在大腸桿菌中表達，而所述試劑蛋白將在酵母中表達。
表達策略首先涉及設計所述重組抗原的一級結構。一般來說，將表達融合配偶體(EFP)置于N末端以改善表達水平，所述N末端也可包括用于調節所述抗原的免疫原性特性的區，即免疫融合配偶體(IFP)。此外，在所述C末端包括用于有利于進一步純化的親和融合配偶體(AFP)。
當可獲得重組株時，通過評估表達水平和通過分析粗提取物行為進一步預測所述蛋白溶解度，從而表征所述重組產物。
在合適的培養基中培養并誘導所述重組蛋白表達后，通過SDS-PAGE分析總提取物。所述重組蛋白在染色凝膠中顯現，并使用特異性抗體通過蛋白質印跡分析進行鑒定。
評估比較不同形式的表達抗原使得可以選擇用于進一步純化和免疫評估的最有潛力的候選抗原。
純化工作遵循一個傳統的方法，該方法基于所述重組蛋白中存在His親和尾。在一個典型的實驗中，過濾破碎細胞，將無細胞提取物加載到特異性保留所述重組蛋白的離子金屬親和層析柱(IMAC；Ni++NTA，Qiagen)上。保留蛋白用0-500mM咪唑梯度的磷酸緩沖液(可能存在去污劑)洗脫。根據所述Imac步驟的良好結果以及污染物的性質，該步驟后最好有陰離子交換樹脂步驟和大小排阻層析步驟。3.2抗體產生和免疫組織化學可以使用小量相對純化的蛋白制備免疫工具，目的是(a)通過正常組織或癌組織切片的免疫組織化學檢測表達；(b)檢測表達，并在純化過程中跟蹤所述蛋白(ELISA/蛋白質印跡)；或(c)特征鑒定/定量所純化的蛋白(ELISA)。3.2.1多克隆抗體免疫接種使用以佐劑3D-MPL/QS21配制的100μg蛋白，以3周間隔3次肌肉注射(I.M.)免疫接種2-3只兔。每次免疫3周后，取血液樣品，使用所述蛋白作為包被抗原，根據標準方法通過ELISA估計血清抗體滴度。ELISA用5μg蛋白在4℃下包被96孔微量板(maxisorb Nunc)過夜。在37℃下用PBS NCS 1％飽和1小時后，加入連續稀釋的兔血清在37℃處理1小時30分鐘(開始于1/10)。用PBS Tween洗滌3次后，加入抗兔生物素化抗血清(Amersham)(1/5000)。洗板，并加入過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(1/5000)在37℃處理30分鐘。洗滌后，加入50μl TMB(BioRad)7分鐘，然后用H2SO40.2M終止反應。在450nm下測量OD，并通過SoftmaxPro計算中點稀釋度。3.2.2單克隆抗體免疫接種使用5μg純化蛋白，以3周間隔3次免疫5只BALB/c小鼠。在第2次免疫后14天以及第3次免疫后1周取血。使用純化蛋白作為包被抗原，通過Elisa測試所述血清。根據這些結果(中點稀釋度＞10000)，選擇一只小鼠進行融合。融合/HAT選擇根據標準方法，使用PEG 40％和DMSO 5％將脾細胞與SP2/0骨髓瘤融合。然后將細胞以2.5×104-105細胞/孔接種到96孔板，并在HAT培養基中選擇抗性克隆。測試這些雜交瘤上清液中的特異性抗體含量，當顯示陽性，就進行2個循環的有限稀釋。在2輪篩選后，選擇3個雜交瘤用于產生腹水。3.2.3免疫組織化學當可得到抗體時，對正常組織切片或癌組織切片進行免疫染色，目的是確定●本發明的蛋白抗原在癌組織中相對于正常組織的表達水平或●表達所述抗原的某些類型癌癥的比例●其它癌癥類型是否也表達所述抗原●在癌癥組織中表達所述抗原的細胞的比例●所述抗原的細胞定位組織樣品制備在解剖后，將所述組織樣品在軟木盤上用OCT化合物固定，并在預先于液氮(-160℃)中超冷(super cool)的異戊烷中快速冷凍。然后將該組織塊在-70℃下保存備用。在恒冷切片機室(-20，-30℃)中制作7-10μm的切片。染色組織切片在室溫(RT)下干燥5分鐘，在室溫下于丙酮中固定10分鐘，干燥后用PBS 0.5％BSA 5％血清飽和。在RT下30分鐘后，使用抗原特異性抗體進行直接或間接染色。直接染色特異性更好但染色較淺，而間接染色強度高但特異性低。3.3分析針對本發明抗原的人細胞免疫反應可以通過體外激發人T細胞評價本發明抗原的免疫相關性。所有T細胞淋巴細胞系和樹突細胞來自健康供體(最好是HLA-A2亞型)的PBMC(外周血單核細胞)。也使用HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠篩選HLA-A2.1肽。
產生新發現抗原特異性CD8+T細胞系并通過每周體外刺激進行維持。使用標準程序測試CD8系對所述抗原或抗原衍生肽的裂解活性和γ-IFN產量。
使用兩種產生CD8+T細胞系的策略基于肽的方法和基于完整基因的方法。這兩種方法都要求新發現抗原的全長cDNA以正確讀框克隆進合適的傳遞系統，或者用于預測HLA結合肽的序列。基于肽的方法通過Parker算法預測HLA-A2結合肽序列。然后用HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠模型(Vitiello等人)篩選肽。簡要地說，用佐劑化HLA-A2肽免疫轉基因小鼠，用人類系統進一步分析不能誘導CD8反應的肽(以對肽脈沖處理(pulsed)的自身脾細胞的有效裂解定義)。用肽脈沖處理人樹突細胞(按照Romani等人的方法培養的細胞)，并用所述細胞刺激CD8分選的T細胞(通過Facs)。在刺激幾周后，首先測試CD8細胞系對肽脈沖處理的自身BLCL(EBV-B轉化細胞系)的作用。為證實所述肽的正確體內加工，測試所述CD8系對cDNA轉染的腫瘤細胞的作用(HLA-A2轉染的LnCaP、Skov3或CAMA腫瘤細胞)。基于完整基因的方法用或者基因槍轉染的樹突細胞、或者逆轉錄病毒轉導的B7.1轉染的成纖維細胞、或者重組痘病毒(Kim等人)或腺病毒(Butterfield等人)感染的樹突細胞激發和刺激CD8+T細胞系。由于所述抗原在病毒感染的細胞中以高水平表達，因此所述細胞對于呈遞抗原性肽是非常有效的，但所述細胞只能用一次，以避免病毒T細胞系的過度生長。
在用另外的方法刺激后，如上所述以cDNA轉柒的腫瘤細胞測試所述CD8系。確定肽特異性和同一性以證實免疫有效性(immunological validation)。參考文獻Vitiello等人(L.Sherman)，J.Exp.Med.，J.Exp.Med，1991，1731007-1015.Romani等人，J.Exp.Med.，1994，18083-93.Kim等人，J.Immunol.，1997，20276-286.Butterfield等人，J.Immunol.，1998，1615607-5613.
在本說明書中引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請)特此通過引用結合到本文中，正如具體個別指出各個出版物一樣通過引用整體結合到本文中。
序列信息SEQ ID NO1GAACCCCGCCGCGCGCGCTTTGAATTTCCCAGCCGCTAAGCGCCTCTCCTGGTCGGTGTCCCAGGCAGAAAGGTGCAGAGACCCATCTGACGCAGGACTCCAGGTAGACAAGCTCCAGCAGAGAGTGGCCAGatgtggtgcctggagcgactccgcttgggtcctgagtgccttcggcggagcggagactggcttctcccgggtcgggcccgcggagccaagtctcgcaccaccgccgcgtgcgcaaatgtgctcactccggaccgcatccctgagttctgcatcccgccacggctcatgccccgcctggccttggctgcgctccggaattcttgggtcgaagaagcagggatggacgagggcgccggccgcacagactgggacccgcgctcgcaggccgcgctgtcactgccgcacctgccccgtgtgcgcaccgcctacggcttctgcgcgctgctcgagagcccgcacacgcgccgcaaggagtcgctcctgctcgggggcccgcccgcgccccggccccgggcccacacctacggcggcggcggcggcccggacgcccycctggggaccctgygcgkcccgcgaggtccgggcccggccacccccgcggcccccggcggtccccgcctgccccaggacgcgctcgctgcggggccccgccgctgccgcctcctgcgcgtccccgacgggctgctgagtcgcgcgctgcgggctggaaggagtcgccgcctggcccgcgtccgctccgtctccagcgggaacgaggacgaggagcgccgcgcgggatccgagtccccggcccgggccccctcctcgagcccgctgtcatccagggccccgcttcctgagcgcctggaggccaagggcaccgtggctctgggccgcgccggcgacgccctgcgcctggctgctgagtactgtccgggaacccggcgtctccgcctccggctgctccgcgcggagagcctggtcggaggcgcccccgggccccgcgccgtccgctgccgcctcagcctcgtcctgcggccgccgggcacygcgcktyggcaatgcagcrctgtggtggggcgcagccgcaaggcctcctttgaccaggacttttgcttcgacggcctctcggaagacgaggtgcgccgcctggccgttcgcgtcaaggcccgggatgagggtcgcggccgggatcggggccgcctgctgggccagggtgagctgtccctgggcgccctcctgctgctctgaGGGCCCAGCCCTCCCCGGGGCGCTCTGCCCTGGAGACTCCGGACACTGACAGCCGCGTGGTACAGAATAAACGTTATTTATTTTTTTATTTATGATACTGCTTTATTGACGTTTTACTTCCTCACCATCCACATTTGTCATCGTCTRTTGGTAAAGAAGAAAAAGATAATGACTCCCTGTTCTGTTCACAGGACCCCCATATCTCTTTCCAGACCATTTTTGCATTCCAAGGAAAAATGGGTTGGCTTGGGACTGGGAGAGAAAGGAAGTACACCCATCTGCATTGTTTSEQ ID NO2MWCLERLRLGPECLRRSGDWLLPGRARGAKSRTTAACANVLTPDRIPEFCIPPRLMPRLALAALRNSWVEEAGMDEGAGRTDWDPRSQAALSLPHLPRVRTAYGFCALLESPHTRRKESLLLGGPPAPRPRAHTYGGGGGPDAXLGTLXXPRGPGPATPAAPGGPRLPQDALAAGPRRCRLLRVPDGLLSRALRAGRSRRLARVRSVSSGNEDEERRAGSESPARAPSSSPLSSRAPLPERLEAKGTVALGRAGDALRLAAEYCPGTRRLRLRLLRAESLVGGAPGPRAVRCRLSLVLRPPGTAXXQCSXVVGRSRKASFSEQ ID NO3GCGGGGCCCCGCCGCTGCCGCATCCTGCGCGTCCCCGACGGGCTGCTGAGTCGCGCGCTGCGGGCTGGAAGGAGTCGCCGCCTGGCCCGCGTCCGCTCCGTCTCCAGCGGGAACGAGGACGAGGAGCGCCGCGCGGGATCCGAGTCCCCGGCCCGGGCCCCCTCCTCGAGCCCGCTGTCATCCAGGGCCCCGCTTCCTGAGCGCCTGGAGGCCAAGGGCACCGTGGCTCTGGGCCGCGCCGGCGACGCCCTGCGCCTGGCTGCTGAGTACTGTCCGGGAACCCGGCGTCTCCGCCTCCGGCTGCTCCGCGCGGAGAGCCTGGTCGGAGGCGCCCCCGGGCCCCGCGCAGTCCGCTGCCGCCTCASEQ ID NO4AGPRRCRILRVPDGLLSRALRAGRSRRLARVRSVSSGNEDEERRAGSESPARAPSSSPLSSRAPLPERLEAKGTVALGRAGDALRLAAEYCPGTRRLRLRLLRAESLVGGAPGPRAVRCRL
說明書的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.
<120>新型化合物<130>BC45215<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1531<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>1gaaccccgcc gcgcgcgctt tgaatttccc agccgctaag cgcctctcct ggtcggtgtc 60ccaggcagaa aggtgcagag acccatctga cgcaggactc caggtagaca agctccagca 120gagagtggcc agatgtggtg cctggagcga ctccgcttgg gtcctgagtg ccttcggcgg 180agcggagact ggcttctccc gggtcgggcc cgcggagcca agtctcgcac caccgccgcg 240tgcgcaaatg tgctcactcc ggaccgcatc cctgagttct gcatcccgcc acggctcatg 300ccccgcctgg ccttggctgc gctccggaat tcttgggtcg aagaagcagg gatggacgag 360ggcgccggcc gcacagactg ggacccgcgc tcgcaggccg cgctgtcact gccgcacctg 420ccccgtgtgc gcaccgccta cggcttctgc gcgctgctcg agagcccgca cacgcgccgc 480aaggagtcgc tcctgctcgg gggcccgccc gcgccccggc cccgggccca cacctacggc 540ggcggcggcg gcccggacgc ccycctgggg accctgygcg kcccgcgagg tccgggcccg 600gccacccccg cggcccccgg cggtccccgc ctgccccagg acgcgctcgc tgcggggccc 660cgccgctgcc gcctcctgcg cgtccccgac gggctgctga gtcgcgcgct gcgggctgga 720aggagtcgcc gcctggcccg cgtccgctcc gtctccagcg ggaacgagga cgaggagcgc 780cgcgcgggat ccgagtcccc ggcccgggcc ccctcctcga gcccgctgtc atccagggcc 840ccgcttcctg agcgcctgga ggccaagggc accgtggctc tgggccgcgc cggcgacgcc 900ctgcgcctgg ctgctgagta ctgtccggga acccggcgtc tccgcctccg gctgctccgc 960gcggagagcc tggtcggagg cgcccccggg ccccgcgccg tccgctgccg cctcagcctc1020gtcctgcggc cgccgggcac ygcgcktygg caatgcagcr ctgtggtggg gcgcagccgc1080aaggcctcct ttgaccagga cttttgcttc gacggcctct cggaagacga ggtgcgccgc1140ctggccgttc gcgtcaaggc ccgggatgag ggtcgcggcc gggatcgggg ccgcctgctg1200ggccagggtg agctgtccct gggcgccctc ctgctgctct gagggcccag ccctccccgg1260ggcgctctgc cctggagact ccggacactg acagccgcgt ggtacagaat aaacgttatt1320tattttttta tttatgatac tgctttattg acgttttact tcctcaccat ccacatttgt1380catcgtctrt tggtaaagaa gaaaaagata atgactccct gttctgttca caggaccccc1440atatctcttt ccagaccatt tttgcattcc aaggaaaaat gggttggctt gggactggga1500gagaaaggaa gtacacccat ctgcattgtt t 1531<210>2<211>320<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>2Met Trp Cys Leu Glu Arg Leu Arg Leu Gly Pro Glu Cys Leu Arg Arg1 5 10 15Ser Gly Asp Trp Leu Leu Pro Gly Arg Ala Arg Gly Ala Lys Ser Arg20 25 30Thr Thr Ala Ala Cys Ala Asn Val Leu Thr Pro Asp Arg Ile Pro Glu35 40 45Phe Cys Ile Pro Pro Arg Leu Met Pro Arg Leu Ala Leu Ala Ala Leu50 55 60Arg Asn Ser Trp Val Glu Glu Ala Gly Met Asp Glu Gly Ala Gly Arg65 70 75 80Thr Asp Trp Asp Pro Arg Ser Gln Ala Ala Leu Ser Leu Pro His Leu85 90 95Pro Arg Val Arg Thr Ala Tyr Gly Phe Cys Ala Leu Leu Glu Ser Pro100 105 110His Thr Arg Arg Lys Glu Ser Leu Leu Leu Gly Gly Pro Pro Ala Pro115 120 125Arg Pro Arg Ala His Thr Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Pro Asp Ala Xaa130 135 140Leu Gly Thr Leu Xaa Xaa Pro Arg Gly Pro Gly Pro Ala Thr Pro Ala145 150 155 160Ala Pro Gly Gly Pro Arg Leu Pro Gln Asp Ala Leu Ala Ala Gly Pro165 170 175Arg Arg Cys Arg Leu Leu Arg Val Pro Asp Gly Leu Leu Ser Arg Ala180 185 190Leu Arg Ala Gly Arg Ser Arg Arg Leu Ala Arg Val Arg Ser Val Ser195 200 205Ser Gly Asn Glu Asp Glu Glu Arg Arg Ala Gly Ser Glu Ser Pro Ala210 215 220Arg Ala Pro Ser Ser Ser Pro Leu Ser Ser Arg Ala Pro Leu Pro Glu225 230 235 240Arg Leu Glu Ala Lys Gly Thr Val Ala Leu Gly Arg Ala Gly Asp Ala245 250 255Leu Arg Leu Ala Ala Glu Tyr Cys Pro Gly Thr Arg Arg Leu Arg Leu260 265 270Arg Leu Leu Arg Ala Glu Ser Leu Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro Arg275 280 285Ala Val Arg Cys Arg Leu Ser Leu Val Leu Arg Pro Pro Gly Thr Ala290 295 300Xaa Xaa Gln Cys Ser Xaa Val Val Gly Arg Ser Arg Lys Ala Ser Phe305 310 315 320<210>3<211>364<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>3gcggggcccc gccgctgccg catcctgcgc gtccccgacg ggctgctgag tcgcgcgctg 60cgggctggaa ggagtcgccg cctggcccgc gtccgctccg tctccagcgg gaacgaggac 120gaggagcgcc gcgcgggatc cgagtccccg gcccgggccc cctcctcgag cccgctgtca 180tccagggccc cgcttcctga gcgcctggag gccaagggca ccgtggctct gggccgcgcc 240ggcgacgccc tgcgcctggc tgctgagtac tgtccgggaa cccggcgtct ccgcctccgg 300ctgctccgcg cggagagcct ggtcggaggc gcccccgggc cccgcgcagt ccgctgccgc 360ctca 364<210>4<211>121
<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>4Ala Gly Pro Arg Arg Cys Arg Ile Leu Arg Val Pro Asp Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ala Leu Arg Ala Gly Arg Ser Arg Arg Leu Ala Arg Val Arg20 25 30Ser Val Ser Ser Gly Asn Glu Asp Glu Glu Arg Arg Ala Gly Ser Glu35 40 45Ser Pro Ala Arg Ala Pro Ser Ser Ser Pro Leu Ser Ser Arg Ala Pro50 55 60Leu Pro Glu Arg Leu Glu Ala Lys Gly Thr Val Ala Leu Gly Arg Ala65 70 75 80Gly Asp Ala Leu Arg Leu Ala Ala Glu Tyr Cys Pro Gly Thr Arg Arg85 90 95Leu Arg Leu Arg Leu Leu Arg Ala Glu Ser Leu Val Gly Gly Ala Pro100 105 110Gly Pro Arg Ala Val Arg Cys Arg Leu115 120
權利要求
1.一種分離的多肽，它包含在SEQ ID NO2全長上與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
2.權利要求1要求保護的分離多肽，其中所述氨基酸序列與SEQID NO2具有至少95％同一性。
3.權利要求1要求保護的多肽，它包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2的分離多肽。
5.一種多肽，它包含權利要求1到4任一項要求保護的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原性活性基本與SEQ IDNO2多肽的免疫原性活性相同。
6.一種分離的多核苷酸或者與該分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含編碼在SEQ ID NO2的全長上與SEQID NO2的氨基酸序列有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列。
7.一種分離的多核苷酸或者與該分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含在整個編碼區上與編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列。
8.一種分離的多核苷酸或者與該分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含在SEQ ID NO1的全長上與SEQ IDNO1的核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列。
9.權利要求6到8任一項定義的分離多核苷酸，其中所述同一性至少為95％。
10.一種分離的多核苷酸或與該分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸選自(a)包含編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(b)SEQ ID NO1的多核苷酸；和(c)用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的標記探針，在嚴格雜交條件下通過篩選合適文庫可獲得的多核苷酸。
11.一種表達載體或重組的活微生物，它們包含依照權利要求6-10任一項的分離多核苷酸。
12.一種包含權利要求11的表達載體的宿主細胞或其表達權利要求1的多肽的膜。
13.一種產生權利要求1的多肽的方法，所述方法包括在足以產生所述多肽的條件下培養權利要求12的宿主細胞并從所述培養基中回收所述多肽。
14.一種疫苗，它包含有效量的權利要求1到5任一項的多肽和藥學上可接受的載體。
15.一種疫苗，它包含有效量的權利要求6到10任一項的多核苷酸和藥學上有效的載體。
16.一種疫苗，它包含有效量的抗原呈遞細胞和藥學上的有效載體，所述抗原呈遞細胞通過體外加載權利要求1到5任一項的多肽而修飾或在體外遺傳修飾而表達權利要求1的多肽。
17.權利要求14到16任一項要求保護的疫苗，所述疫苗還包含TH-1誘導佐劑。
18.權利要求17要求保護的疫苗，其中所述TH-1誘導佐劑選自3D-MPL、QS21、QS21和膽固醇的混合物以及CpG寡核苷酸。
19.一種抗體，它為權利要求1到5任一項要求保護的多肽或免疫片段的免疫特異性抗體。
20.一種篩選鑒定化合物的方法，所述化合物刺激或抑制權利要求1到5任一項的多肽的功能，所述方法包括選自以下的方法(a)利用直接或間接與候選化合物結合的標記，測量所述候選化合物與所述多肽(或帶有所述多肽的細胞或膜)或其融合蛋白的結合；(b)在標記競爭物存在下，測量候選化合物與所述多肽(或帶有所述多肽的細胞或膜)或其融合蛋白的結合；(c)使用適用于帶有所述多肽的細胞或細胞膜的檢測系統，測試所述候選化合物是否導致由于對所述多肽的激活作用或抑制作用而產生的信號；(d)使候選化合物與含有權利要求1到5任一項的多肽的溶液混合形成混合物，測量所述混合物中所述多肽的活性，并比較該混合物與標準品的活性；或(e)使用例如ELISA測定，檢測候選化合物對細胞產生編碼所述多肽的mRNA和所述多肽的影響。
21.一種通過免疫預防或免疫治療來治療患者的方法，該方法包括使權利要求1到5任一項的多肽或權利要求6到10任一項的多核苷酸與哺乳動物免疫系統細胞溫育，從而體外誘導針對權利要求1到5任一項的分子的免疫反應，然后將這些活化的免疫細胞再輸注入所述哺乳動物以治療疾病。
22.權利要求21要求保護的方法，其中所述治療為對卵巢癌或結腸癌的治療。
23.權利要求1到5的多肽的激動劑或拮抗劑。
24.一種化合物，它是用于治療的(a)權利要求1到5的多肽的激動劑或拮抗劑；(b)權利要求6到10的分離多核苷酸；或(c)調節編碼權利要求1到5任一項的多肽的核苷酸序列表達的核酸分子。
25.一種診斷患者疾病或對疾病的易感性的方法，所述疾病與權利要求1到5任一項的多肽在患者中的表達或活性有關，所述方法包括分析取自所述患者的樣品中是否存在所述多肽或其存在量。
26.一種診斷患者疾病或對疾病的易感性的方法，所述疾病與權利要求6到10任一項的多核苷酸在患者中的表達或活性有關，所述方法包括分析取自所述患者的樣品中是否存在所述多核苷酸或其存在量。
27.一種診斷患者是否罹患結腸癌或對結腸癌的易感性的方法，所述疾病與權利要求1到5任一項的多肽在患者中的表達或活性有關，所述方法包括分析取自所述患者的樣品中是否存在所述多肽或其存在量。
28.一種診斷患者是否罹患結腸癌或對結腸癌的易感性的方法，所述疾病與權利要求6到10任一項的多核苷酸在患者中的表達或活性有關，所述方法包括分析取自所述患者的樣品中是否存在所述多核苷酸或其存在量。
29.一種分離的多核苷酸，它選自(a)包含在SEQ ID NO3的全長上與SEQ ID NO3有至少70％同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO3的多核苷酸的分離多核苷酸；(c)SEQ ID NO3的多核苷酸；或(d)包含編碼在SEQ ID NO4的全長上與SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
30.一種多肽，它選自(a)包含在SEQ ID NO4的全長上與SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)其中所述氨基酸序列在SEQ ID NO4的全長上與SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少70％同一性的多肽；(c)包含SEQ ID NO4的氨基酸的多肽；(d)為SEQ ID NO4的多肽的多肽；或(e)由包含SEQ ID NO3中序列的多核苷酸編碼的多肽。
31.一種活疫苗組合物，它包含依照權利要求11的表達載體或重組的活微生物。
全文摘要
本發明公開了CASB612多肽和多核苷酸以及通過重組技術產生這樣的多肽的方法。還公開了在診斷中利用CASB612多肽和多核苷酸的方法,以及用于預防和治療性治療癌癥(尤其是卵巢癌和結腸癌)、自身免疫性疾病和相關病癥的疫苗。
文檔編號C12N1/15GK1344317SQ00805135
公開日2002年4月10日 申請日期2000年1月17日 優先權日1999年1月20日
發明者C·維納爾斯-巴索斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司