專利名稱：：回收重組HBsAg的方法
技術領域：
：本發明涉及從表達HBsAg的酵母細胞回收重組HBsAg的方法。破碎微生物的細胞壁-細胞破碎-是回收胞內生物活性蛋白的第一步。在生產規模上，近幾年適合的有機械破碎方法，例如在球磨機中濕研磨。由于對于研細和分散不斷提高的要求，已經從色素處理中使用的常規球磨機開發出了緊湊構造型高速攪拌器球磨機。它們由垂直軸或水平軸旋轉的中空筒體組成，所述簡體中裝有混合的玻璃或鋯的氧化物小球，最大裝填度為80％。轉速不以為了提高沖擊/加壓粉碎的任何期望的方式而提高，因為離心力補償了磨細效果。此外，提高的速度和裝填度會產生熱度問題，其可能會破壞要回收的產物。使用篩筒，旋轉篩隙或者使用安裝在軸承套中的同軸環隙進行連續的研磨材料/研磨體分離。研磨材料通過研磨容器周圍的雙層夾套冷卻；轉動軸也可以被部分冷卻。濕研磨的破碎原理在于將動能從攪拌器傳遞給研磨體。這主要通過粘合力與排代力結合實現，所述排代力源于攪拌器元件的組裝和類型。該力和內聚力驅動研磨室。研磨體徑向方向的加速促進層流的形成。根據研磨體運動的絕對速度和距離，研磨體層之間的差示速度曲線影響高剪切力，所述高剪切力除去碰撞結果外，是微生物細胞壁破碎的主要原因。細胞壁也可以通過高壓勻漿器機械破碎。這樣一種裝置主要由高壓活塞泵和勻漿裝置組成。當達到啟動壓力時，勻漿閥門打開，然后細胞懸浮液加壓下以非常高的速度通過該閥門裝置。之后，細胞懸浮液每100巴加熱約2.5℃。離開破碎閥裝置之后，利用熱交換器冷卻細胞懸浮液。這樣，與濕研磨相反，在這里破碎材料被短時間加熱。通過勻漿裝置時，使細胞懸浮液具有非常高的湍流，空化和剪切力。高壓勻漿器的破碎原理在于在一個非常短的時間內迅速減小細胞懸浮液中的能量密度，即高壓差和快速注壓可以被認為是破碎程度的主要原因。兩種機械破碎方法用于不同的微生物。根據微生物的類型，特別是根據其結構，選擇各自的方法。例如，在Pittroff,M.等，DECHEMA-Biotechno1.Conf.；(1990),4,Pt.B,1055-60中對于各種各樣的微生物，例如釀酒酵母，藤黃微球菌和大腸桿菌，試驗了兩種細胞破碎方法，得出的結論是微生物的形態學差異影響兩種方法的破碎效果。例如Pittroff,M.等，DECHEMA-Biotechnol.Conf.；(1992),5,Pt.B,687-91和Pittroff,M.等，Chem.Ing.Techn.；(1992),64,10,950-53指出對于特殊的微生物，例如桿狀細菌，優選使用高壓破碎方法。相反，球磨方法優選用于具有圓形結構的球狀微生物。發現兩種方法對于破碎釀酒酵母種酵母細胞破碎程度相同。此外，Luther,H.等，Acta-Biotechnol.；(1992),12,4,281-91，描述了從釀酒酵母或大腸桿菌純化蛋白質所使用的球磨機和高壓勻漿器之間的進一步比較。證明酵母和細菌細胞都可以使用球磨機或高壓勻漿器破碎。發現高壓勻漿器的缺點是生成粘液的微生物或機械污染非常容易導致阻塞。關于酵母細胞指出，高壓勻漿器破壞了較少量細胞。盡管沒有明確指出，但是已經設想出高壓勻漿器得到較低的產率。Schutte,H.,Biol.Recombinant-Microorg.Anim.Cells；(1991)Oholo34Meet.,293-305也證明高壓勻漿器可進行酵母和細菌細胞的有效破碎，但是不非常適合菌絲體微生物。Baldwin,C.,Biotechnol.Tech；(1990),96,4,329-34中研究了使用高壓勻漿器破碎釀酒酵母。發現利用高壓勻漿器破碎細胞通常給出低的破碎率(5次產率40％)。只有事先用來自溶黃質厄氏菌的消解酶處理才能發現高壓勻漿器中酵母細胞的完全破碎。從迄今為止已經進行的充分研究進一步明確地看到，要純化的蛋白質的類型對于各種破碎方法的選擇處于決定性重要地位。這里特別感興趣的是乙肝表面抗原(HBsAg)表達細胞的細胞破碎。Choo；K.B.等Biochem.Biophys.Res.Commun.；(1985),131,1,160-66研究了使用球磨機破碎釀酒酵母細胞回收HBsAg。但是，只能提取少量顆粒形式的HBsAg。FentonD.M.等，Abstr.Ann.Med.Am.Soc.Microbiol.；(1984),84Meet.193描述了利用高壓勻漿器細胞破碎方法從釀酒酵母回收重組HBsAg。該文獻中指出激活形式即抗原形式的HBsAg大規模溶解存在問題。用高壓勻漿器只有通過10次處理后才發現細胞的充分破碎和令人滿意的蛋白質釋放，并且只有在15次處理后才發現最大HBsAg釋放。作者得出結論抗原激活HBsAg的釋放需要亞細胞結構的破碎。因此，迄今為止這兩種破碎方法還不可能提供通過細胞破碎最佳產生HBsAg的合適的系統。因此本發明的目的是提供從重組微生物高產率回收重組HBsAg的方法。根據本發明，該目的是通過回收重組HBsAg的方法實現的，其中使用高壓勻漿器破碎能表達HBsAg的重組甲基營養酵母(methylotrophicyeast)細胞，并且從得到的細胞碎屑回收HBsAg。出人意料地發現在高壓勻漿器中破碎表達HBsAg的多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)細胞可以獲得比用常規方法，特別是利用高壓勻漿器或玻璃球磨機對釀酒酵母的細胞破碎，高得多的每克細胞干重的產品產率。因此，本發明方法對于以前公知的用于從微生物回收HBsAg的方法進行了相當大的改進。在本發明方法中，從能表達HBsAg的重組甲基營養酵母細胞回收重組HBsAg。優選地，使用漢遜氏酵母屬下的種的表達HBsAg的菌株，特別優選多形漢遜氏酵母。也可以使用畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和球擬酵母屬下的種的甲基營養酵母。在發酵過程中控制標準參數，例如pH，通氣量和溫度。甘油，甲醇和葡萄糖，優選甘油，適合用作底物。向發酵罐培養基補充該底物直到達到酵母細胞至少80，優選至少90克/升(g.l-1)細胞干重的期望的細胞密度。達到所述細胞密度后，在酵母培養基中誘導HBsAg的表達。在優選的實施方案中，通過自甲醇代謝中涉及的基因衍生的啟動子來控制甲基營養酵母中HBsAg的表達。充分描述過的啟動子是MOX啟動子，DAS和FMD啟動子(Ledeboer,A.M.等，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)(1985),13,9,3063-3082；Janowics,Z.A.等，核酸研究(Nucl.AcideRes.)(1995),13,9,2043-3062,EP299108)。為了實現所述啟動子控制下的最佳表達，首先讓酵母細胞在全合成營養培養基中生長。加入甲醇誘導，使得細胞懸浮液中含有大約1％的甲醇。關于甲基營養酵母的培養和上述三種啟動子的誘導條件的詳細情報可以例如參見Gelissen,G.,Murooka/lmanaka(編著)工業和農業應用的重組微生物(Recombinantmicrobesforindustrialandagriculturalapplications),MarcelDekker,NY1993,787-796和Weydemann,U.等，應用微生物。生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1995),44,377-385。完成發酵過程后，通過切向流過濾從培養基成分分離細胞。通過用破碎緩沖液適當稀釋來調節期望的細胞密度。對于破碎，優選以50-150克/升細胞干重的細胞密度使用酵母細胞。精確的細胞密度取決于各重組甲基營養酵母細胞物種。特別地，70-120克/升細胞干重的細胞密度是優選的。如果根據本發明使用的重組甲基營養酵母細胞的細胞密度太低，則該方法變得費時且不經濟。酵母細胞細胞密度過高時，破碎變得越來越效率低，對冷卻能力的要求提高。根據本發明使用的高壓勻漿器正如導論中所描述的是常規高壓勻漿器，其可以用于細胞破碎。特別優選的是使用NanojetLAB30PL型或相當型的高壓勻漿器。在細胞破碎過程中，勻漿器裝置中的壓力是1000-2000巴。1200-1600巴的壓力是優選的。特別優選的壓力是1500-1600巴。酵母細胞的起始溫度優選是2-15℃，特別優選4-8℃。通常以細胞懸浮液形式存在的酵母細胞可以在攪拌下冷卻到期望的溫度。優選冷卻高壓勻漿器，使得在產物出口處觀察到的低出口溫度例如是2-15℃，優選3-13℃，特別優選5-10℃。在高壓勻漿器中，細胞通常經幾次循環(通過)破碎。發現共3-8次循環(通過)對于最佳產物收率就足夠了。對于回收重組HBsAg的細胞破碎優選3-6次，特別優選4次循環(周期)。細胞破碎過程完全后，用該方法制備的產物優選使進行進一步分離和純化步驟。所述附加的處理步驟是將提取物中的重組HBsAg進行進一步純化和富集的常規方法。例如，可以進行一種或幾種下面的分離和純化步驟，如以指出的順序用聚乙二醇沉淀細胞碎屑，分離PEG上清液，在硅石基質上吸附，分離硅石基質，從硅石基質解離產物，分離硅石基質上清液，離子交換層析，通過超濾濃縮離子交換集液(ionexchangerpool)，氯化銫中的密度梯度分離，大小排阻層析和無菌過濾(最后的含水物質(bulk))。下面的實施例將解釋本發明。實施例1通過高壓破碎細胞破碎多形漢遜氏酵母回收HBsAg1．高壓勻漿器下面說明的裝置用于高壓破碎方法NanojetLab30PL破碎原理高壓體積流速(100±20)毫升/分鐘，不可調節活塞泵輸入壓力4-7巴勻漿裝置壓力1200-1600巴勻漿閥門碳化鎢冷卻管式熱交換器細胞干重70克/升密封劑EPDM高壓密封BunaN材料1-45-71鋼2．微生物及其培養在全合成營養培養基中培養表達HBsAg的多形漢遜氏酵母菌株，例如Janowicz等，酵母(Yeast)，7:431-443,1991中描述的菌株。在發酵過程中，控制pH，通氣量和溫度。發酵過程中，響應溶解的氧的濃度間歇性地向發酵罐培養基補充作為底物的甘油使得細胞密度最大大約90克/升細胞干重。在細胞密度大約90克/升細胞干重和約46小時發酵時間時，通過18-26小時內加入甲醇一次，在多形漢遜氏酵母培養基中誘導HBsAg表達。通過在干重天平上蒸發直至恒重從培養物等份測定細胞干重。最后加入后，使培養物再生長2-9小時。接著，通過交叉流過濾從發酵培養基成分大量分離細胞。破碎之前將細胞緩沖。緩沖使用20mM磷酸鹽緩沖液和2mMNa2-乙二胺四乙酸二水合物(TriplexⅢ)。向最后的懸浮液加入每克細胞干重75毫克洗滌劑Tween2O。破碎多形漢遜氏酵母時，以大約70克/升細胞干重細胞密度使用發酵罐培養肉湯。3．細胞破碎攪拌下將緩沖的細胞冷卻到4-8℃。破碎裝置上的起始溫度調節到8±5℃。在一個分開的冷卻攪拌容器中收集細胞提取物。通過活塞沖程體積和每分鐘的沖程次數測定高壓勻漿器中體積流速并且不能各個調節。作為原則，在每分鐘100毫升細胞懸浮液的流速下進行破碎。將細胞共4次循環破碎。第4次循環完成后，用80mMPMSF貯存溶液調節到2mM終濃度。細胞破碎后，可以以下面指出的次序或者以不同的次序通過下面的分離和純化步驟來純化產物·用聚乙二醇沉淀細胞碎屑·分離PEG上清液·在硅石基質上吸附·分離硅石基質·從硅石基質解離產物·分離硅石基質上清液·離子交換層析·過超濾濃縮離子交換器集液·氯化銫中的密度梯度分離·大小排阻層析·無菌過濾(最后的含水物質)為了研究高壓破碎的效率，通過Lowry方法測定總的蛋白質含量，并且通過免疫學方法(ELISA”)測定細胞提取物中HBsAg濃度。以10升發酵規格進行Nanojet高壓破碎。為了保證可比性，使HBsAg的產率與細胞破碎之前各細胞量相關聯。4．結論4．1測試Nanojet高壓破碎菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發酵培養基RL-98/17d目的測定破碎循環必要的次數從4次起不再能夠檢測到蛋白質和產物(HBsAg)明顯的增加。因此下面的試驗設定為4次通過。4．2粗提物和“最后的含水物質”(終產物)的Nanojet高壓破碎的破碎效率“最后的含水物質”是進行過上面提到的分離和制備步驟后，獲得的產物菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發酵培養基NJ-4()RL-98/19,NJ-6,-7<tablesid="table2"num="002"><table>蛋白質毫克數/克細胞干重HBsAg毫克數/克細胞干重NanojetLAB30PL粗提物最后的含水物質粗提物最后的含水物質發酵NJ-4128.21.9810.81.77發酵NJ-6100.41.297.11.41發酵NJ-792.60.996.91.10平均值107.11.428.31.43</table></tables>對比實施例1通過濕磨細胞破碎多形漢遜氏酵母回收HBsAg1．玻璃球勻漿器下面說明的裝置用于濕磨方法FrymaCoballMillMS18破碎原理濕磨轉子直徑192mm有效研磨體積1200ml研磨體的填入有效研磨體積的70-80％研磨間隙6.50mm分離間隙0.05mm篩間隙0.20mm差示間隙0.18mm轉子圓周速度14m/s冷卻雙層夾套和轉子冷卻細胞干重100-120克/升體積流速(200-300)毫升/分鐘密封材料乙烯丙烯DynoMillKDLSpezial:破碎原理濕磨有效研磨腔體積600ml攪拌盤4，聚氨基甲酸乙酯研磨體的填入有效研磨體積的80-85％轉速6.8m/s同軸環間距0.1mm冷卻雙套夾套細胞干重70克/升體積流速100毫升/分鐘密封材料Viton使用直徑0.45-0.55mm的玻璃球進行濕磨。2．微生物及其培養使用和實施例1相同的材料，但是發酵培養肉湯的細胞密度是70-120克/升細胞干重。3．細胞破碎根據實施例1所述進行前處理和后處理。DynoMillKDLSpezial中濕磨通過體積流速為100毫升/分鐘的蠕動泵向臥式破碎室連續加入含有70克/升細胞的細胞懸浮液。同時，為了蛋白酶抑制，加入80mMPMSF溶液，在立即混合下1/40的細胞懸浮液流向破碎室的分開的入口部分。在一個循環內破碎細胞懸浮液。FrymaCoballMillMS18內濕磨這里也是通過蠕動泵連續向豎式破碎室加入細胞懸浮液。但是，該實施例中的細胞密度是100-120克/升，體積流速設定在200-300毫升/分鐘。與DynoMillKDLSpezial相對照，蛋白酶抑制劑貯存液(80mMPMSF)不在球磨機出口之前加入。細胞懸浮液在一個循環內被破碎。終細胞提取物中的PMSF終濃度是2mM。以50升規模進行使用FrymaCoballMillMS18進行破碎試驗。在使用DynoMillKDLSpezial進行的濕研磨中使用10升發酵規模。為了保證可比性，使HBsAg的產率與細胞破碎之前各細胞量相關聯。4．結論4.1DynoMill玻璃球破碎的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發酵培養基RL-98/194.2Fryma玻璃球破碎達到終產物最后的含水物質”的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料50升發酵培養基RL-98/26,/29,/35實施例2濕磨和高壓破碎之間的比較1．Nanojet高壓破碎和DynoMill玻璃球破碎的破碎效率在與DynoMill玻璃球研磨機中細胞破碎比較時，從相同的起始物每克干物質釋放出高四倍的產物的量。而同時總的蛋白質量只增加了2倍。結果，從相同的起始物釋放出了更大量的產物(HBsAg)。在得到最后的含水物質的所有隨后的處理步驟之后，高壓破碎方法中最初的產物產率保持增長，產物的質量相當于標準方法(濕磨)的質量。這可以利用所描述的Lowry和ELISA的組合來證明。2．Nanojet高壓破碎和FrymaCoballMill玻璃球破碎的破碎效率從各三次通過的平均值來看，與玻璃球破碎相比，Nanojet高壓破碎每克干物質釋放出高2.9倍的產物的量。細胞破碎更高的產物量得到高2.6倍的量的最后的含水物質中純化的產物。根據下面的分析證明證實，兩種破碎方法的產物的質量處于相同規格。3．分析結果3.1高壓破碎樣品rHBsAg批量號.NJ6GFC1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學會提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導偶聯的等離子體-質譜3鱟變形細胞溶解物試驗(檢測內毒素的方法)4內毒素單位3.2玻璃球破碎樣品rHBsAg批量號.RL98/35最終物質(FinalBulk)1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學會提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導偶聯的等離子體-質譜3鱟變形細胞溶解物試驗(檢測內毒素的方法)4內毒素單位4．結論上述分析提供了與現有技術作出的設想相反的證據，高壓破碎對于酵母細胞，至少對于甲基營養型酵母細胞相當有利。通過高壓破碎，產率可以提高2.5-4倍。權利要求1．一種回收重組HBsAg的方法，其中使用高壓勻漿器破碎能表達HBsAg的重組甲基營養酵母細胞，并且從得到的細胞碎屑回收HBsAg。2．根據權利要求1的方法，特征在于所述重組甲基營養酵母細胞是漢遜氏酵母屬的種的酵母細胞。3．根據權利要求1或2的方法，特征在于所述酵母細胞在50-150克/升細胞干重的細胞密度下用于破碎。4．根據權利要求1-3任一項的方法，特征在于在高壓勻漿器的勻漿裝置中的1000-2000的壓力下破碎酵母細胞。5．根據權利要求1-3任一項的方法，特征在于產物出口處的溫度是2℃至15℃。6．根據權利要求1-5任一項的方法，特征在于細胞破碎3-6次循環(通過)。7．根據權利要求1-6任一項的方法，特征在于細胞破碎之后，使重組HBsAg進行進一步的分離和純化步驟。全文摘要本發明涉及一種獲得重組HBsAg的方法。根據該方法,使用高壓勻漿器破碎能表達HbsAg的重組甲基營養酵母細胞,并且從得到的細胞碎屑回收HbsAg。本發明方法特征在于每克細胞干重的高產品產率,因此是對已知的從微生物獲得HBsAg的方法的相當大的改進。文檔編號C12N1/19GK1302329SQ00800644公開日2001年7月4日申請日期2000年4月17日優先權日1999年4月23日發明者M·派昂泰克,M·維尼格申請人:萊因新生物技術工藝和產品公司