專利名稱：中空纖維模擬骨髓造血裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種體外造血技術，主要是為造血干、祖細胞移植進行臨床前造血細胞培養與擴增提供技術設備。
骨髓以及造血干、祖細胞移植是重建造血與免疫功能、治療某些嚴重血液病及惡性腫瘤的有效途徑之一，也是基因治療可供選擇的方法之一。然而，造血細胞來源非常有限，為了獲取這些細胞，人們寄希望于造血干、祖細胞的體外擴增和大規模培養。
目前體外培養與擴增造血細胞尚處于實驗階段。無基質細胞的培養體系加組合細胞因子配方仍然是當今的熱門研究方向。這是一種液體懸浮培養體系，主要有多孔板和方瓶培養技術、可透氣袋細胞培養技術以及小型生物反應器攪拌式灌注培養技術等。這類技術的缺陷在于培養造血細胞的條件與體內造血細胞生存的內環境條件相差甚遠，而且各種組合細胞因子配方仍然不能阻止原始造血細胞的迅速分化與耗竭。另一方面，采用滋養層基質細胞支持造血細胞在體外培養與擴增也是當前倍受矚目的發展方向，主要采用骨髓基質細胞或工程細胞來支持體外造血。這類技術在克服離體造血細胞迅速分化與耗竭方面有了很大的進步。但是，用消化與分散等方法轉移基質細胞，將會造成不同程度的損傷，且在操作過程中容易造成污染而導致失敗。
本發明所涉及的一種人工骨髓裝置，主要采用中空纖維膜和微載體技術以及密封式無菌操作技術，模擬骨髓造血功能，可以有效地克服現有技術中存在的缺陷和不足，開辟體外培養和有效擴增造血細胞的新途徑。經查閱血液學期刊并經計算機聯網檢索，在造血(Hematopoiesis)、中空纖維/膜(Membrane/Hollow Fiber)和人工器官(Artificial organ)領域內迄今未見有關報道，同時亦未見有與本發明技術特征相似的專利申請或文章發表。
本發明的要點是，該裝置系由中空纖維制成的細胞培養管、微載體支持物及密封式灌注管道系統三部分組成。
一、細胞培養管由可拆卸的部件組裝而成，以便于收獲培養增殖的細胞。這與現行的中空纖維生物反應器不同，后者的中空纖維細胞培養管不可拆卸，其目的是收獲細胞產生的蛋白質產物。
本發明的細胞培養管由四部份組成1、中空纖維集束組成的柱狀體(圖1-5)，其兩端采用樹脂凝膠等(圖1-7)封固并保留每根中空纖維管內腔管道的開口(圖1-11)。空心的纖維外徑一般為200至1000微米(μm)，是已知的醋酸纖維素或聚砜等膜材料。在兩端樹脂凝膠塊間，沿中空纖維束柱狀體的邊緣，勻稱地加了三條聚四氟乙烯制成的支持筋(圖1-4)，柔軟的中空纖維束在兩個樹脂凝膠塊和三根支撐筋之間得到固定與保護。
2、套筒(圖1-3)可采用醫用塑料等制成的兩端開口的管筒，套裝在中空纖維束柱狀體外面。套筒與中空纖維膜管之間，形成了中空纖維膜的外腔；每根中空纖維膜的內部管道構成了中空纖維膜的內腔。
3、下蓋(圖1-2)為套管下端的密封蓋。蓋與套筒端口之間構成了中空纖維膜內腔的共有匯集小室，并有硅橡膠O型墊圈密封(圖1-10)。蓋與套筒端口用法蘭盤與螺栓加以連接緊固。蓋的中心有支管(圖1-1)接有無菌連接器，與管道系統相通，可引導管道系統的氣、液流體從下蓋支管匯集于小室，再進入每根中空纖維膜的內腔。
4、上蓋(圖1-8)為套管上端的密封蓋，結構同下蓋，可將進入每根中空纖維內腔的氣、液流體匯集于上蓋小室，再從中心支管(圖1-9)經無菌連接器排出，流進屬于中空纖維內腔的管道系統。
二、細胞與微載體在細胞培養管內中空纖維膜的外腔，可接種造血細胞和骨髓基質細胞，而這些基質細胞事先被粘附在其支持物-微載體表面。微載體(圖1-12)為已知的葡聚糖凝膠球體，粒珠直徑約200微米，表面有變性膠原涂層。骨髓基質細胞(圖1-13)可按一定比例數量接種于微載體上，待基質細胞在微載體上貼附牢固后，同將要培養的造血細胞(圖1-15)混合，通過套筒的下支管(圖1-14)接種進入中空纖維膜外腔。此外，亦可采用明膠微載體，它易于與纖維蛋白等細胞外基質蛋白結合。這種附有胞外基質的微載體，在與某些細胞因子結合后也具有支持體外造血的部分功能。
造血細胞是將要培養的細胞，可取自骨髓、外周血或臍帶血，經過分離后取出有核細胞或單個核細胞；也可通過富集純化取出CD34+(細胞分化抗原34陽性)細胞等原始造血細胞。造血細胞與微載體-基質細胞無菌混合后即可注入中空纖維培養管外腔，加培養液后可進行培養。培養期間可通過無菌連接器和下支管補充細胞所需營養物質。廢培養液可通過套管的上支管(圖1-6)排出。中空纖維薄膜管可模擬血管輸送營養物質，進行氣體與物質交換，排除代謝廢物。微載體與貼附的基質細胞可模擬骨髓造血微環境，支持體外造血，維持造血干細胞自我更新潛能，并刺激造血細胞增殖與分化。最后通過無菌操作收獲擴增的造血細胞；拆卸細胞培養管，取出中空纖維柱狀體與細胞懸液，沖洗，分級沉降，去掉微載體，按常規操作收獲細胞。再通過已知的免疫磁珠陽性選擇技術等，分離出較純凈的原始造血細胞備用。
三、密封式灌注管道系統(圖2)本發明采用改良的密封式灌注系統培養造血細胞，整個系統有兩個循環回路1、中空纖維外腔循環回路由火焰消毒無菌連接器(圖2-2)、供液瓶/廢液瓶(圖2-3)、貯液瓶(圖2-4)和泵(圖2-5)等組成。泵驅動培養液經無菌連接器，從培養套筒下支管進入中空纖維外腔，灌注細胞后由套筒上支管排出，作為取樣標本或廢棄液；或用附加泵通過火焰消毒無菌連接器(圖2-2)，由供液瓶(圖2-3)加入新鮮培養基與試劑等，給造血細胞與基質細胞提供營養成分和添加劑，如各種細胞因子和血清等。此外，也可加入NaHCO3等調節試劑對培養參數進行直接調控。外腔循環回路安裝了火焰消毒無菌連接器(圖2-2)，這是一種多功能無菌接口，實現了添加新鮮培養基、取樣以及排除廢液等密封式無菌操作，可使批量培養細胞操作簡便，也可保證操作過程無污染。
2、中空纖維內腔循環回路這是透析循環回路，透析液由貯液瓶(圖2-9)流出，通過氣體交換器(圖2-8)、泵(圖2-7)、pH電極監測小室(圖2-6)和無菌連接器，從培養管下蓋支管(圖1-1)流進中空纖維內腔，通過中空纖維膜與外腔培養液進行小分子物質交換，為外腔中的細胞提供氧和生理濃度的CO2以及小分子營養物質如氨基酸、葡萄糖和鹽類等；同時可去除外腔中積聚的小分子廢物如乳酸、銨離子和多余的CO2等。透析液從上蓋支管排出，流經無菌連接器和溶氧(DO)電極監測小室(圖2-12)返回貯液瓶(圖2-9)。當廢物積聚導致pH值下降到一定指標時，可通過改良的多功能接口-火焰消毒無菌連接器(圖2-11)排出廢液，進入廢液瓶(圖2-10)再通過火焰消毒無菌連接器換上新的供液瓶。此外，也可通過該接口取樣，作離線檢測。
3、細胞培養環境的超濾調節由于透析液與培養液小分子物質成分基本上是相同的，因此按照常規操作可對細胞培養條件作超濾調節。當培養管內腔回路的上蓋管道加夾閥時，內腔透析液在泵的壓力之下，可從內腔過濾進入外腔；相反，夾閥加在外腔回路套筒上支管管道時，外腔培養液，除被截留的大分子物質外，也可透過中空纖維膜過濾進入內腔回路中，從而可以調節高密度細胞所處的環境條件。這種調節可利用已知的電子儀器和定時器等附加裝置來實現。
四、消毒與保溫中空纖維培養管的四個支管上安裝了高壓蒸汽消毒備用的硅橡膠管及火焰消毒無菌連接器。中空纖維培養管連同無菌連接器一道，先用40Gy中子射線照射消毒，再用1％H2O2灌注中空纖維培養管外腔和內腔，用消毒去離子水、10-5mol/L巰基乙醇、Hanks鹽水以及培養液依次清洗后備用。或在安裝火焰消毒無菌連接器后，把中空纖維培養管用塑料封裝起來，送環氧乙烷消毒室進行滅菌處理。
除中空纖維培養管外，灌注系統可從無菌連接器接口處斷開，分別包裝進行高壓蒸汽消毒(0.1Mpa,30分鐘)備用。使用時，可通過酒精燈火焰消毒無菌連接器的接口，將整個灌注系統連接起來投入運行。
整個灌注系統置于37℃培養箱中保溫，5％CO2-空氣等通過管道與空氣濾器從箱外輸入。
本發明的優點與積極效果在于中空纖維膜管加微載體基質細胞可模擬骨髓造血組織中的血管與造血微環境，有利于體外造血干細胞維持自我更新潛能、抑制過度分化與耗竭；微載體的可以移動、可分割、可定量的特點，有利于基質細胞和胞外基質附著，對造血調控、細胞分離和推向臨床提供了便利條件；中空纖維細胞培養管為可拆卸結構，有利于收獲中空纖維之間培養擴增的造血細胞；由于該模擬造血裝置采用密封式無菌操作技術，將有助于杜絕污染，為大規模培養造血細胞提供了安全保障，有助于實現體外造血的管道化和自動化。
c-kit原癌基因只在原始的造血干/祖細胞中表達。采用RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)，同內參GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)引物并行測試的方法可半定量檢測c-kit表達的mRNA水平。
小鼠實驗表明，在中空纖維管培養二周后，仍然保留了大量的原始造血細胞。在不加細胞因子的條件下，中空纖維組G1的c-kit表達比原骨髓有所降低，但比方瓶組G2高出一倍，而常規液體懸浮培養體系G4與G3組，在沒有外加細胞因子的條件下，基本上沒有c-kit基因表達。說明原始造血干/祖細胞全部分化耗竭盡了。實驗表明，中空纖維模擬骨髓造血裝置確實能維持部分造血干/祖細胞的自我更新潛能，可抑制造血細胞過度分化與耗竭。
實施例2臍帶血細胞培養實驗微載體(MC)20mg用胞外基質蛋白-纖連蛋白(FN)涂層，在無菌條件下將臍帶血單個核細胞與MC·FN混合，加入富含細胞因子的條件培養液，共同注入中空纖維培養管外腔，其內腔灌注由10％CO2-空氣調節的透析液。用流式細胞儀每次檢測104個細胞。臍血單個核細胞在接種前其造血干/祖細胞CD34+細胞含量為1.2％；中空纖維管培養二周后，CD34+細胞百分含量為20％，常規方瓶液體懸浮培養對照為4.9％。結果顯示中空纖維管灌注培養后，CD34+細胞含量比液體懸浮培養對照組高4倍。實驗說明，中空纖維灌注結合微載體胞外基質在條件培養液刺激之下，較有利于原始造血細胞增長。
圖1中空纖維模擬骨髓造血的細胞培養管示意圖其中1-下蓋支管2-下蓋3-套筒4-支撐筋5-中空纖維束柱狀體6-套筒上支管7-樹脂凝膠塊8-上蓋9-上蓋支管10-O型墊圈11-中空纖維管道及開口12-微載體13-骨髓基質細胞14-套筒下支管15-造血細胞圖2密封式灌注管道系統示意圖其中1-中空纖維細胞培養管2-火焰消毒無菌連接器3-供液瓶/廢液瓶4-貯液瓶5-泵6-pH電極在線監測小室7-泵8-氣體交換器9-貯液瓶10-供液瓶/廢液瓶11-火焰消毒無菌連接器12-溶氧電極在線監測小室
權利要求
1.中空纖維模擬骨髓造血裝置，其特征是所述的裝置系由中空纖維細胞培養管、微載體支持物和密封式灌注管道三部分連接組成一個循環系統。
2.按照權利要求1所述的中空纖維摸擬骨髓造血裝置，其特征是為便于收獲培養增殖的細胞，所說的細胞培養管由可拆卸的相關部件組裝而成(1)由醋酸纖維素或者聚砜等膜材料制造的中空纖維集束柱狀體(1-5)在兩端樹脂凝膠塊(1-7)和三根用聚四氟乙烯制成的支持筋(1-4)之間得到固定與保護；(2)選擇醫用塑料等制成的套筒(1-3)，兩端開口，套裝在中空纖維束柱狀體外面，形成中空纖維膜的外腔；每根中空纖維膜的內部管道構成其內腔；(3)下蓋(1-2)、與套筒端口之間構成了中空纖維膜內腔的共有匯集小室并由硅橡膠O型墊圈進行密封(1-10)，通過蓋的中心支管(1-1)、無菌連接器與管道系統相連，可引導該系統的氣、液流體從下蓋支管匯集于小室，再進入每根中空纖維膜的內腔；(4)上蓋(1-8)，結構同下蓋，可將進入每項根中空纖維內腔的氣、液流體匯集于上蓋小室，再經中心支管(1-9)、無菌連接器排除，流進屬于中空纖維內腔的管道系統。
3.按照權利要求1所述的中空纖維模擬骨髓造血裝置，其特征是微載體(1-12)為葡聚糖凝膠或者明膠等制成的球體，表面敷有變性膠原涂層或者胞外基質蛋白涂層，置于細胞培養管中空纖維膜的外，作為骨髓基質細胞和培養造血細胞賴以依附的支持物。
4.按照權利要求1所述的中空纖維模擬骨髓造血裝置，其特征是密封式灌注管道(2)由中空纖維外腔循環回路和中空纖維內腔循環回路兩部分組成(1)中空纖維外腔循環回路包括火焰消毒無菌連接器(2-2)、供液瓶/廢液瓶(2-3)、貯液瓶(2-4)和泵(2-5)等部件；(2)中空纖維內腔循環回路(透析循環)包括貯液瓶(2-9)、氣體交換器(2-8)、泵(2-7)、PH電極監測小室(2-6)等。
5.按照權利要求1、2、3或4所述的中空纖維模擬骨髓造血裝置，其特征是中空纖維膜管可模擬血管輸送營養物質，進行氣體與物質的交換，排除代謝廢物；微載體與貼附的基質細胞可模擬骨髓造血微環境，支持體外造血，維持造血干細胞自我更新潛能，并刺激造血細胞增殖與分化。
全文摘要
中空纖維模擬骨髓造血裝置,也稱人工骨髓,屬于一種體外造血細胞培養技術,該裝置由中空纖維細胞培養管、微載體支持物及密封式灌注管道系統組成,其特征是中空纖維膜管可模擬血管輸送營養物質,進行氣體與物質交換,排除代謝廢物;微載體與貼附的基質細胞可模擬骨髓造血微環境,支持體外造血,維持造血干細胞自我更新潛能,并刺激造血細胞增殖與分化。小鼠骨髓培養和臍帶血細胞培養實驗證明,在沒有外加細胞因子條件下,中空纖維灌注培養方式明顯優于常規方瓶及液體懸浮培養的效果。
文檔編號C12M3/04GK1321741SQ0013418
公開日2001年11月14日 申請日期2000年12月8日 優先權日2000年12月8日
發明者張君奎, 張永富, 張海玲, 楊少光, 田征, 黃志剛, 趙鈞銘 申請人:中國醫學科學院血液學研究所, 中國醫學科學院生醫學工程研究所