一種藍藻穿梭質粒表達載體及其用于表達胸腺素α1的方法

專利名稱：一種藍藻穿梭質粒表達載體及其用于表達胸腺素α1的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程。
藍藻(Cyanophyte)又稱藍細菌(Cyanobacterium)，是一種特殊的微生物。藍藻的基因組簡單，除了裸露的染色體DNA外不含葉綠體和線粒體DNA，便于進行基因分析。近年來，已克隆了大量藍藻基因，建立了一些藍藻的基因轉移系統以及外源基因表達系統。藍藻作為表達外源基因的受體菌已取得了不少研究成果。
由于藍藻質粒屬于隱秘型質粒，無可供利用的選擇性標記，又不能在E.coli中復制，所以無法直接用作基因工程的載體。而細菌的一些質粒或人工構建的很多載體雖有選擇性標記，但不能在藍藻中復制維持或轉化效率極低。因此，將藍藻內源質粒與E.coli質粒及其衍生的質粒載體重組構建穿梭載體(Shuttle vector)就成為藍藻遺傳操作的基本途徑。這種雜合質粒含有兩個復制起始位點，分別來自藍藻質粒和大腸桿菌質粒，能在這兩種生物中復制，便于利用二者的優勢進行遺傳操作。到目前為止，已構建的藍藻穿梭質粒載體主要有pLS103、pBAS系列、pCB4、pPRS-1等。而利用穿梭質粒轉化系統則可在藍藻中表達包括真核基因在內的外源基因，如Tandeau de Marsac(Mol.Gen.Genet1987，209296～298)以pUC303為載體，在單胞藍藻Synechococcus sp.PCC7942中表達了原核基因芽孢桿菌殺幼蚊毒素基因，轉基因藻株普遍具有良好的殺幼蚊毒性，為蚊蟲的生物防治開辟了新的途徑。Fukuda等人(Biotech，Lett.1994，161～6)以pUC303為載體在Synechococcus sp.PCC 7942中表達了植物的乙烯合成酶基因。孫軍等(生物工程進展，1994，14(6)39～42)將小鼠金屬硫蛋白-I(mMT-I)cDNA基因片段與穿梭質粒pDC-8重組在固氮絲狀藍藻Anabaena sp.PCC7120中表達了金屬硫蛋白，表達量約為40μgMT/g藻鮮重；Price等人(Plant physiol.1989，91505～513)通過穿梭表達載體pCA在藍藻Synechococcus PCC7942中表達了人的碳酸酐酶基因，表達產物具有活性，并對細胞的光合作用產生了顯著影響。Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994，919685～9689)把合成的人過氧化物歧化酶(hSOD)基因置于1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbc)的啟動子下，在Synechococcus sp.PCC6301中表達，表達產物達總蛋白的3％，并在胞內具有良好的生物活性。
胸腺(Thymus)是免疫系統中重要的中樞器官，負責T細胞的分化和成熟，在抗感染、抗腫瘤和抗自身免疫性疾病中起著重要作用。從胸腺素混合物中分離出的胸腺素α1(Tα1)，是一個二十八肽，它可以預防免疫抑制病人感染條件致病菌，提高機體的細胞免疫能力，可用于治療多種疾病如紅斑狼瘡、乙肝、艾滋病等，還可作為治療某些癌癥的輔助藥物。現在胸腺素制劑已廣泛應用于臨床，但均是從豬、牛的胸腺中提取的多組分胸腺肽，提取時易混入豬、牛的某些蛋白，注射后可能導致人產生過敏反應。采用人胚胎提取的人胸腺素雖療效不錯，但人胚胎來源困難，難以形成規模生產。用多肽合成儀可合成胸腺素α1，但價格太貴。王震熙等(浙江醫科大學學報，1989，18(3)106～109)把Tα1基因導入PWR590菌株，用SPA-ELISA改良法在轉化的菌株中檢測到Tα1的表達；Wetzel等(Biochemistry1980，196096～6104)根據Low和Goldstein(1979)確定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，與質粒pBR322連接后導入E.coli中表達，雖得到與天然Tα1活性相同的表達產物，但表達量低。
本發明的目的旨在構建一種新的藍藻穿梭質粒表達載體，該載體上有大腸桿菌源質粒和藍藻源質粒的復制起始位點，能在這兩種宿主中復制，具有選擇標記、啟動子、終止區等表達元件，可作為外源基因在藍藻中表達的表達系統；另外，本發明還提供一種運用穿梭質粒表達載體系統，將泛素融合的胸腺素α1基因插入新構建的穿梭表達載體，將獲得的含目的基因的重組質粒轉化進單胞藍藻中以高效得到含胸腺素α1的表達產物的方法。
下面為本發明的具體內容。
一、藍藻穿梭表達載體的構建本發明從織線藻Plectonema boryanum中提取出內源小質粒pPBS1，并對其序列進行測定，測出的序列已收入于DNA數據庫，編號為Genbank Accession No.AF176225，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t
該小質粒DNA序列全長1511bp，GC含量為47.1％。常用的限制性內切酶酶切位點有Acc I(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，Cla I(3)，Hpa I(1203)，HpaⅡ(1171)，Pvu I(877、899和1152)，Taq I(3、477和1099)。
將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的Cla I位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1；為了降低所構建的穿梭表達載體的大小，提高載體容納外源DNA片段的能力，按


圖1設計，用EcoRV、PvuⅡ雙酶切質粒pPRS-1，電泳回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA連接酶進行平端連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在Apr板上篩選轉化子，得質粒pPRS-1’；按圖2設計，用EcoR I和Sal I雙酶切含有啟動子、終止區、報告基因等部件的質粒pKYLX-71-35S，電泳分離、回收含CaMV 35SRNA啟動子、MCS、rbcS polyA終止區和Kmr基因的6.5kb片段，與經同樣雙酶切、電泳回收純化的pEBFP2.6kb片段連接重組，連接物轉化E.coli JM101，在含Km和Ap的固體培養基上篩選雙抗克隆子，得質粒pKE；按圖3設計，用EcoR I和Pst I完全雙酶切pPRS-1′，電泳回收含藍藻內源質粒和大腸桿菌質粒ori區的3.1kb的酶切片段，用EcoR I完全酶切質粒pKE，再用Pst I部分酶切，電泳回收含表達元件和Kmr基因的6.5kb片段，將回收的兩片段用T4DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，以Km進行篩選得穿梭表達載體質粒pPKE2，在此載體上組裝有大腸桿菌源質粒和藍藻質粒的復制起始位點，卡那霉素抗性選擇標記以及能啟動基因轉錄的CaMV35SRNA啟動子、多克隆位點、終止區等部件。
二、含UBTα1基因的重組質粒的構建根據Tα1基因片段兩端的序列設計一對PCR引物T1和T2，進行PCR擴增，得110bp的DNA片段；運用pUC18多克隆位點兩端的通用引物U1和U2，以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18質粒的SphI/BamHI位點之間所構建的質粒pUCUB為模板，按常規PCR方法擴增出含UB基因的328bp的DNA片段；純化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同時酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接產物為模板，以U1和T2’為引物進行特異性擴增，得380bp的UBTα1DNA片段；純化PCR擴增的UBTα1DNA片段，按圖4設計，用HindⅢ和Spe I雙酶切UB Tα1擴增片段，與用HindⅢ部分酶切、XbaI完全酶切的新構建的藍藻穿梭質粒表達載體pPKE2連接，連接物轉化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上篩選轉化子，得重組質粒pPKEUT。 ACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(2)UB引物U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(3)UBTα1引物 三、重組質粒pPKEUT轉化受體藍藻Synechococcus sp.PCC7942用重組質粒pPKEUT天然轉化受體藍藻Synechococcus sp.PCC7942，轉化后，將藍藻細胞與DNA混合液涂布于Millipore濾膜上，先在不含Km的BG-11固體培養基上恢復培養20hr，然后轉移濾膜至含Km12～15μg/ml的BG-11固體培養基上進行篩選培養，7～10天后轉化單藻落出現。經Southern雜交證實，目的基因UBTα1基因已轉入藍藻Synechococcussp.PCC7942細胞中。用Western印跡法檢測到了Tα1的表達產物。
本發明以從織線藻Plectonema boryanum中提取出的內源小質粒pPBS1構建了一新的藍藻穿梭表達載體pPKE2，該載體上有大腸桿菌源質粒和藍藻源質粒的復制起始位點，能在這兩種宿主中復制，具有卡那霉素抗性選擇標記、及能啟動基因轉錄的CaMV 35SRNA啟動子、多克隆位點、rbcS polyA終止區等表達元件，便于目的基因的插入、表達及重組子的篩選，不僅可用于研究胸腺素α1在藍藻中的表達，也可用于研究其他基因在藍藻中的表達，即可作為外源基因在藍藻中得以表達的載體系統。本發明利用泛素融合系統，將目的基因Tα1和泛素(UB)融合后插入穿梭表達載體pPKE2的多克隆位點，獲得了含目的基因的重組表達質粒，并成功地轉化進單胞藍藻Synechococcus sp.PCC7942細胞中，經Southern雜交證實和Western印跡法檢測到了Tα1表達產物，其表達效果好，成本低，具有很大的開發前景，為開發研究轉Tα1基因藍藻打下了基礎。
圖1為質粒pPRS-1’構建示意2為質粒pKE構建示意3為質粒pPKE2構建示意4為質粒pPKEUT構建示意圖下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1、藍藻穿梭質粒表達載體的構建本發明從織線藻Plectonema boryanum中檢測到一種1.5kb的小質粒pPBS1，并對它進行了序列測定(已被DNA數據庫收入，Genbank Accession No.AF176225)，并使用DNASIS(Version7.05)軟件(Pharmacia LKB Biotechnology)對序列進行分析，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t測序結果看出，該小質粒DNA序列全長1511bp，GC含量為47.1％。常用的限制性內切酶酶切位點有Acc I(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，Cla I(3)，Hpa I(1203)，HpaⅡ(1171)，Pvu I(877、899和1152)，Taq I(3、477和1099)。計算機分析結果揭示，在位置567-1460之間存在著多個重復序列。在該區中有一個13bp的重復序列(567-1448)、一個11bp的重復序列(892-1145)、一個10bp的重復序列(686-1051)和六個8bp的重復序列(1227-1255、1056-1183、986-1008、862-1239、779-1371、648-771)。分析pPBS1整個序列的發夾結構，發現能量最高的發夾結構在567-1460之間，位置處于945-961，其GC％高達70.6％，且該發夾上下游均為富含AT區，AT含量均在80％以上；此外，在該發夾結構的上游還可找到一個共有序列5’-TTGATA-3’，該共有序列是復制有關的Rep蛋白的靶序列，它可在5’-G↓ATA間產生缺刻。通過分析結果推測，pPBS1質粒的復制起始區位于567-1270之間，因此選用Cla I位點來構建穿梭載體不會破壞該質粒在藍藻中的復制能力。
將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的Cla I位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1；為了降低所構建的穿梭表達載體的大小，提高載體容納外源DNA片段的能力，首先對5.8kb的穿梭質粒pPRS-1進行改造。如
圖1設計，在不影響質粒穿梭功能的前提下，用EcoRV、PvuⅡ雙酶切5.8kb的穿梭質粒pPRS-1，電泳分離3.97kb和1.9kb的大小兩片段，膠回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA連接酶進行平端連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在Apr板上篩選轉化子。使用EcoRI、HindⅢ對轉化子的質粒進行酶切鑒定，發現所獲得的酶切片段大小比原pPRS-1被EcoR I單切的片段小，約為3.97kb；用Cla I酶切可獲得兩個片段，一個為1.5kb(藍藻內源質粒)，一個為2.47kb(含Apr基因和大腸桿菌質粒復制起始位點)，大小與預期相符，表明該質粒即為改造設計的更小的穿梭質粒pPRS-1’，大小為3.97kb，同時具有大腸桿菌和藍藻的復制起始子。再按圖2設計，用EcoR I和Sal I雙酶切質粒pKYLX-71-35S，電泳分離、回收含表達元件和Kmr基因的6.5kb片段，然后與經同樣雙酶切、電泳回收純化的pEBFP2.6kb片段連接重組，連接物轉化E.coli JM101，在含Km和Ap的固體培養基上篩選雙抗克隆子，提取質粒進一步用內切酶酶切分析，該質粒可被Xba I酶切成9.1kb大小的片段，這恰為原2.6kb片段和6.5kb片段之和；用EcoR I和Sal I雙酶切該質粒，可切出一條6.5kb的片段和一條2.6kb的片段；另外，按預先設計，在質粒pEBFP、pKYLX-71-35S的回收片段上各有一個PvuⅡ酶切位點，而該質粒也恰能被PvuⅡ酶切成兩個片段，片段大小也與預期相吻合，一個為6.4kb，一個為2.7kb。因此，該質粒為預期設計的質粒pKE，含有CaMV 35S RNA啟動子、MCS、rbcS polyA終止區和Kmr基因諸元件。
按圖3設計，用EcoR I和Pst I完全雙酶切pPRS-1′，電泳回收含藍藻內源質粒和大腸桿菌質粒ori區的3.1kb的酶切片段；用EcoR I完全酶切質粒pKE，再用Pst I部分酶切，電泳回收含表達元件和Kmr基因的6.5kb片段。然后將回收的兩片段用T4DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，以Km進行篩選。挑取抗性克隆子，對克隆子質粒進行限制性內切酶酶切分析鑒定。酶切結果顯示重組質粒可被Xba I單酶切成一個片段(9.6kb)，被EcoR I和Sal I雙酶切成兩個片段(6.5kb和3.1kb，分別來自pKE和pPRS-1′)；被EcoR I和Xba I雙酶切成兩個片段(8.3kb和1.3kb)，其中1.3kb為CaMV 35SRNA啟動子；被ClaI酶切成三個片段(1.5kb、2.0kb和6.1kb)，其中1.5kb片段為藍藻的內源質粒，2.0kb片段上含有35S啟動子、MCS和rbcS polyA終止區。均與預期相符，從而可確定穿梭表達載體pPKE2克隆成功，在此載體上組裝有大腸桿菌源質粒和藍藻質粒的復制起始位點，卡那霉素抗性選擇標記以及能啟動基因轉錄的CaMV 35SRNA啟動子、多克隆位點、終止區等部件。實施例2、含UBTα1基因的重組質粒的構建及表達胸腺素α1的方法步驟1．胸腺素α1基因(110bp)的PCR擴增首先按Tα1基因的序列設計了PCR引物T1、T2和T2’ 取T1和T2引物各2ul，加ddH2O至10ul，再加石蠟油30ul；先升至85℃，5min然后以1℃/1min的速度冷卻至25℃；再依次加入ddH2O 30ul，10×Taq酶緩沖液5ul，4×dNTP(2.5mmol/L)4ul，Taq酶(1u/ul)1ulPCR反應參數先94℃預變性5min；接著94℃變性30S；60℃復性兼延伸20S；10個循環；最后60℃再延伸反應20S。反應結束后，取3ul進行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得110bp的Tα1片段。
步驟2．UB片段(345bp)的PCR擴增除模板改為質粒pUCUB(人工合成UB基因并將其克隆至pUC18質粒的SphI/BamHI位點之間所構建成的質粒)，引物改為U1(通用引物M13/pUC Reverse SequencingPrimer(-48))和U2(通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47))外，其余反應組分同步驟1；PCR反應參數先94℃預變性5min；接著94℃變性30S；50℃復性30S；72℃延伸30S；30個循環；最后72℃再延伸反應3min。反應結束后，取5ul進行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得345bp的UB片段。
步驟3．UBTα1片段(388bp)的PCR擴增用BamHI酶切Tα1和UB片段后連接，再以上述連接物為模板，以U1和T2’為引物擴增獲得UBTα1片段。
UBTα1片段的PCR反應，除模板改為UB與Tα1之連接物，引物改為U1和T2’外，其余反應組分及反應參數同步驟2。
步驟4．目的基因UBTα1片段插入穿梭表達載體純化PCR擴增的UB Tα1基因片段，根據預先引物設計，該片段兩端分別具有HindⅢ和Spe I酶切位點，而穿梭表達載體pPKE2的多克隆位點上有HindⅢ和Xba I酶切位點。因此，按圖4設計，用HindⅢ和Spe I雙酶切UB Tα1擴增片段，與用HindⅢ部分酶切、XbaI完全酶切的pPKE2連接。連接物轉化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上篩選轉化子。挑取若干轉化子，提取質粒并進行酶切分析鑒定，對Xba I切不動的轉化子質粒進一步進行內切酶酶切鑒定，因為SpeI和XbaI是同尾酶，連接后兩個酶切位點都消失了。結果該質粒可被EcoRI切成一個片段(9.71kb)，被BamH I切成兩個片段(7kb和2.71kb)；用EcoRI和SphI雙酶切可使原2.77kb片段消失，而切出一條1.3kb的片段和一條1.82kb片段。這些結果與預期設計相符，表明目的基因UBTα1已克隆進穿梭表達載體pPKE2的多克隆位點，該質粒為預期設計的重組質粒pPKEUT。
步驟5．重組質粒pPKEUT轉化Synechococcus sp.PCC7942在最適條件下培養藍藻Synechococcus sp.PCC 7942至OD730=0.25～0.35。離心收集藻細胞，用10ml 10mmol/L NaCl洗一次。離心并濃縮藻細胞于原1/10體積的新鮮BG-11培養基中。加入2-3μg重組質粒pPKEUT，混勻。避光孵育過夜，供隨后篩選轉化子。
將孵育后的藍藻與DNA混合液涂布于覆蓋在BG-11固體培養基上的Millipore濾膜(φ9cm，孔徑0.45μm)上，正常生長條件下培養20hr。轉移濾膜至含卡那霉素15μg/ml的BG-11固體培養基上，培養7-10天后轉化單藻落出現，挑取生長好的藻落移入2ml BG-11液體培養基中(含10～15μg/ml卡那霉素)，經常搖動，培養7天。挑生長最好的藻株進行逐級擴大培養(加Km至15μg/ml)。
陰性對照組除不加質粒外，亦進行同樣的轉化處理。一周后，pPKEUT轉化組的濾膜上出現抗Km的綠色單藻落，而未用質粒轉化，但經同樣處理的陰性對照組不長藻落。可以認為，轉化組與對照組在15μg/ml Km篩選壓力下出現的顯著差異是由于重組質粒pPKEUT轉入受體藍藻細胞中造成的。實施例3、pPKEUT轉化藻株的雜交鑒定為了進一步證明外源基因已通過重組質粒pPKEUT轉化入藍藻細胞中并且獲得表達，進行了DNA水平的Southern雜交鑒定，及蛋白質水平的Western雜交檢測。1．探針的制備以重組質粒pPKEUT中含Tα1基因和部分Kmr基因的2.7kb的BamH I片段為探針模板，用隨機引物法制備DIG標記的探針。經與DIG標準標記物比較估算，制備的探針濃度約為30μg/μl。2．Southern雜交分別提取野生型Synechococcus sp.PCC7942及其轉化藻株的質粒，進行Southern轉移、探針雜交及顯色，首先以0.7％的瓊脂糖凝膠電泳分離Synechococcus sp.PCC7942的質粒DNA。電泳完畢后，修切凝膠塊成所需大小，在左上角切角。將凝膠浸泡在變性緩沖液中，輕輕搖動15min。將凝膠浸泡在中和緩沖液中，輕輕搖動30min。準備一張與凝膠等大的尼龍膜，先浸入水中再浸在10×SSC緩沖液中。在一大培養皿中倒扣一小培養皿，上置一張濾紙，加入適量的10×SSC緩沖液，并使濾紙的四周垂入SSC溶液中。濾紙浸透后，倒置凝膠于濾紙上，再將切好并浸濕的尼龍膜小心地放在凝膠上，避免氣泡，邊界對齊；取與尼龍膜等大的濾紙置于其上，接著放置吸水紙并壓一個平的重物。室溫轉移過夜，但注意更換濕透的吸水紙。揭下尼龍膜，在6×SSC緩沖液中浸泡一下。晾干后，80℃烘烤2hr，即可用于雜交。
將雜交膜放入雜交袋中，注入20ml雜交緩沖液，封口，置于68℃水浴輕搖30min，進行預雜交。沸水浴5min使DIG標記的DNA探針變性，并快速在冰浴中冷卻，與雜交緩沖液混勻，使探針濃度為5～25ng/ml。倒去預雜交液，加入10ml DIG探針/雜交緩沖液，68℃水浴雜交16hr。雜交結合后，倒出雜交液回收，將雜交膜移入洗膜液I，室溫下漂洗兩次，各5min。再將雜交膜移至洗膜液Ⅱ，于68℃輕搖漂洗兩次，各15min。
將雜交膜在雜交緩沖液1中短暫平衡2min。在50ml雜交緩沖液2中封閉30min。在20ml抗體反應液中結合抗體(anti-DIG-Ap)30min。用雜交緩沖液1洗2次，各15min。在雜交緩沖液3中平衡2～5min。最后浸在10ml染色液(新鮮配制)，暗處顯色，勿搖。顯色完畢后，漂洗，烘干，拍照。
結果顯示轉化藻株與陽性對照均出現雜交信號，而陰性對照藻株無雜交信號。3．pPKEUT轉化藻株的Western印跡鑒定重組質粒雖已轉化入受體藍藻細胞中，但目的基因是否能表達尚不能確定，必須通過Wesstern印跡法對轉化藻株進行表達產物的檢測。本發明利用兔抗UB抗體和鼠抗Tα1抗體，檢測pPKEUT轉化藻株是否表達出了UBTα1融合蛋白。
首先制樣離心藻體，置于一預先稱重的0.5ml離心管中，稱出藻體的重量，加入3倍量(V/W)的制樣緩沖液(溶液1∶上樣緩沖液=1∶1)，沸水浴5min，離心，取上清，置-20℃保存備用。
SDS-PAGE電泳分離蛋白質制膠配制15％的分離膠，5％的濃縮膠。
點樣分別將轉基因藻蛋白提取液、野生藻蛋白提取液、陽性對照樣品沸水浴處理3min。取適量處理后的樣品加入凝膠樣品孔中，記錄加樣順序。采用50V恒壓電泳，待溴酚藍泳動出濃縮膠后，電壓增至100V，溴酚藍泳動至凝膠邊緣時停止電泳。
電轉移電泳結束后，取出凝膠，浸泡于電轉移緩沖液中。剪取與凝膠等大的PVDF膜，先在無水甲醇中浸泡一下，再放至轉移緩沖液中。再剪6張與膜等大的濾紙，浸于電轉移緩沖液中備用。將轉移裝置中的海綿置于電轉移緩沖液中浸濕。將濾紙(3張)整齊置于海綿上，再依次放上凝膠、尼龍膜、濾紙(3張)，注意趕盡氣泡，邊界對齊，然后用海綿、篩孔板固定，插入電轉移槽中，并加入電轉移緩沖液，保證凝膠在陰極方向，PVDF膜在陽極方向。電轉移條件為100Vlhr，4℃。取下膠和膜，倒扣于濾紙上，用鉛筆在膜上描出膠上點樣孔位置，揭去膠，取下膜。
免疫學檢測將轉移后的膜置于TNT緩沖液中洗3次。轉入含1％BSA的TNT緩沖液中，37℃封閉30min，并輕輕搖動。將封閉后的膜置于TNT緩沖液中漂洗3次，每次5min。加入用TNT稀釋的第一抗體(兔抗UB抗體)2ml，37℃輕搖1hr。將結合了第一抗體的PVDF膜置TNT緩沖液中洗3次，每次5min。加入用TNT緩沖液適當稀釋的酶標第二抗體(羊抗兔IgG-HRP)，37℃輕輕搖動1hr。將PVDF膜用TNT緩沖液洗四次，每次5min。加入TMB底物，顯色10-15min，出現藍色帶者為陽性，用自來水沖洗以終止酶反應，取出晾干保存。拍照。
對轉基因藻株進行Western印跡鑒定，從免疫雜交結果來看，轉基因藻株檢測出了能與UB抗體結合的特異性條帶，而野生藻沒有出現特異性條帶。雖然我們檢測的只是表達出的UB抗原，但由于UB基因和Tα1基因是融合表達的，因此可認為目的基因Tα1已在轉基因藍藻中獲得了表達。
權利要求
1．一種藍藻穿梭質粒表達載體，其特征在于載體上組裝有大腸桿菌源質粒和藍藻源質粒的復制起始位點、卡那霉素抗性選擇標記、CaMV 35SRNA啟動子、多克隆位點及rbcS polyA終止區等表達元件。
2．權利要求1所述的藍藻穿梭質粒表達載體的構建，其特征在于從織線藻Plectonemaboryanum中提取出內源小質粒pPBS1，該質粒的序列已收入于DNA數據庫，編號為GenbankAccession No．AF176225，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t該小質粒DNA序列全長1511bp，GC含量為47.1％，常用的限制性內切酶酶切位點有AccI(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，ClaI(3)，HpaI(1203)，HpaⅡ(1171)，PvuI(877、899和1152)，TaqI(3、477和1099)；將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的ClaI位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1；用EcoRV、PvuⅡ雙酶切質粒pPRS-1，電泳回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA連接酶進行平端連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在Apr板上篩選轉化子，得質粒pPRS-1’；用EcoRI和SalI雙酶切質粒pKYLX-71-35S，電泳分離、回收含CaMV 35SRNA啟動子、MCS、rbcS polyA終止區和Kmr基因的6.5kb片段，與經同樣雙酶切、電泳回收純化的pEBFP2.6kb片段連接重組，連接物轉化E.coli JM101，在含Km和Ap的固體培養基上篩選雙抗克隆子，得質粒pKE；用EcoR I和Pst I完全雙酶切pPRS-1′，電泳回收含藍藻內源質粒和大腸桿菌質粒ori區的3.1kb的酶切片段；用EcoR I完全酶切質粒pKE，再用Pst I部分酶切，電泳回收含表達元件和Kmr基因的6.5kb片段，將回收的兩片段用T4DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，以Km進行篩選得穿梭表達載體質粒pPKE2。
3．藍藻穿梭質粒表達載體用于表達胸腺素α1的方法，其特征在于首先構建含目的基因Tα1的重組質粒，根據Tα1基因片段兩端的序列設計PCR引物T1、T2和T2’， PCR擴增得110bp的Tα1DNA片段；選用pUC18多克隆位點兩端的通用引物U1和U2，以質粒pUCUB為模板，按常規PCR方法擴增出含UB基因的328bp的DNA片段，純化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同時酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接物為模板，以U1和T2’為引物進行特異性擴增，得380bp的UB Tα1DNA片段，純化UB Tα1基因片段，用HindⅢ和Spe I雙酶切UB Tα1擴增片段，與用HindⅢ部分酶切、Xba I完全酶切的藍藻穿梭質粒表達載體pPKE2連接。連接物轉化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上篩選轉化子，得重組質粒pPKEUT；然后用重組質粒pPKEUT轉化受體藍藻Synechococcus sp.PCC7942。
4．如權利要求3所述的藍藻穿梭質粒表達載體用于表達胸腺素α1的方法，其特征在于所述的用重組質粒pPKEUT轉化受體藍藻Synechococcus sp.PCC7942為培養藍藻Synechococcus sp.PCC7942至OD730=0.25～0.35，離心收集藻細胞，用濃度為10mmol/L的NaCl洗滌，離心并濃縮藻細胞于原1/10體積的新鮮BG-11培養基上，加入2～3μg重組質粒pPKEUT，混勻，避光孵育過夜，供隨后篩選轉化子；將孵育后的藍藻與DNA的混合液涂布于覆蓋在BG-11固體培養基上的Millipore濾膜上，正常生長條件下培養20hr，轉移濾膜至含卡那霉素15μg／ml的BG-11固體培養基上，培養7～10天轉化單藻落出現，挑取生長好的藻落移入含10～15μg/ml卡那霉素的BG-11液體培養基中，搖動培養7天，挑生長最好的藻株進行逐級擴大培養。
5．如權利要求3所述的藍藻穿梭質粒表達載體用于表達胸腺素α1的方法，其特征在于所述的質粒pUCUB為以人工合成的泛素基因UB克隆至pUC18質粒的SphI/BamHI位點之間所構建的質粒。
6．如權利要求3所述的藍藻穿梭質粒表達載體用于表達胸腺素α1的方法，其特征在于所述的引物U1為通用引物M13/pUC Reverse Sequencing Primer(-48)，引物U2為通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47)。
全文摘要
涉及一種基因工程,以從織線藻Plectonemaboryanum中提取的內源小質粒pPBS1構建藍藻穿梭表達載體pPKE2, 其有大腸桿菌源和藍藻源質粒的復制起始位點,有選擇標記、啟動子、多克隆位點及終止區,可作為外源基因在藍藻中表達的受體菌,本發明將目的基因胸腺素α1(Tα1)基因和泛素基因融合后插入表達載體pPKE2的多克隆位點,獲得含目的基因Tα1的重組質粒,并轉化進單胞藍藻Synechococcussp.PCC7942中,Southern雜交證實和Western印跡法檢測到了Tα1表達產物。
文檔編號C12N15/63GK1285409SQ0012960
公開日2001年2月28日 申請日期2000年9月29日 優先權日2000年9月29日
發明者章軍, 徐虹, 樓士林, 歐陽青 申請人:廈門大學