專利名稱：一種核酸堿基成分的推測方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸堿基成分的推測方法。
分子遺傳診斷的基本方法是測定核酸序列的堿基組成或變化。核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的基本單位是核苷酸，它們通過磷脂鍵連成鏈狀結構，核苷酸的特征決定于其堿基，DNA中的四種堿基由A、C、G、T表示，RNA中的四種堿基為A、C、G、U。核酸中的堿基A與T(或U)配對(互補)，G與C配對(互補)，因為它們之間能形成穩定的氫鍵結構。有連續配對堿基的兩條核酸鏈能結合(雜交)成雙鏈結構，雙鏈核酸結構在高溫(90℃-100℃)下會分裂(變性)成單鏈核酸分子。核酸中的自然產堿基或核苷酸可被非自然產的類堿基或類核苷酸取代，類核苷酸包括雙脫氧核苷酸(ddNTP)、雙環核苷酸(LNA)、生物素標記脫氧核苷酸(Biotin-dNTP)和熒光素標記的雙脫氧核苷酸(F-ddNTP)。含有由非典型磷酯鍵組成的核酸包括肽鍵核酸(PNA)和硫代磷脂鍵脫氧核糖核酸(S-DNA)。包括類堿基或類核苷酸的核酸可具有熒光性、高穩定性、抗酶降解性等。利用雙脫氧核苷酸的特性可測定核酸的堿基序列，因而可以用于分子遺傳診斷，但這種傳統的序列測定采用電泳的方法，效率較低。一種較簡單的堿基測定法是單堿基延伸法(SBE)，這種方法使核酸引物與被檢核酸樣品(靶核酸)在設定的部位進行雜交，然后在聚合酶的作用下延伸一個雙脫氧核苷酸，根據所延伸的核苷酸的堿基成分，推測(求得)靶核酸中被測的堿基成分。這一反應所用的酶只有聚合酶活性，當聚合酶反應出錯時，被錯加的核苷酸不能被修正，因而會出現假陽性反應，這會降低分子遺傳診斷的準確性。在自然界中，許多核酸聚合酶除了具有聚合酶的活性外，還具有外切酶的活性。在這二種酶活性的同時作用下，在核酸復制過程中，一個核苷酸可被置換成另一可識別的具標記的類核苷酸。但這種置換反應所發生的位點較難預測，因而不被用于堿基序列測定。
本發明的目的是提供一種核酸堿基成分的推測方法，可用于分子遺傳診斷、核酸多態性測定等，它能克服現有方法的上述不足。
一種核酸堿基成分的推測方法，包括使核酸引物與樣品核酸雜交，通過酶反應，推測在樣品核酸鏈上與引物末端堿基位置相應的堿基成分，其特征是引物含有抗外切酶的類核苷酸。
本發明的優點是利用兩種酶活性在引物3’末端置換與靶核酸堿基相互補的標記堿基，使堿基的檢測準確性得到很大的提高。
下面通過實施例說明本發明。
對病人進行地中海貧血癥基因型測定，首先用化學方法合成含抗外切酶的PNA寡聚脫氧核糖核酸，并用其作引物，此引物的堿基序列與待測DNA中突變點后(5’→3’)20個堿基互補，把此引物通過5’端固定于多個小容器壁上，把多個待檢測病人的DNA加熱變性后分別加入這些小容器中，使其與引物雜交同時分別向各容器內加入緩沖液，并加入由不同熒光色素標記的雙脫氧核苷酸，以及具3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。把反應容器置于37℃溫度中，使引物3’端進行核苷酸置換反應30分鐘后對容器中的樣品進行清洗，然后對反應容器進行熒光信號檢測，最后根據熒光信號的特征確定標記堿基的存在，用堿基配對原理確定核酸樣品(靶核酸)中突變點的堿基成分。
本方法所用的核酸引物含非自然產的類核苷酸或核苷酸替代物，如肽鍵核酸(PNA)或硫代磷脂鍵脫氧核糖核酸。測定不同突變點的核酸探針可固定于一個平面上。
本方法所用的核酸樣品從生物體中提取或由生物化學或化學合成，包括DNA和RNA，被測的靶核酸具有單鏈結構或經熱變性分裂成單鏈結構。
本方法所用的酶反應為外切酶反應和聚合酶反應，反應時二種酶活性處于同一反應器中，由一個或多個酶提供。
權利要求
1.一種核酸堿基成分的推測方法，包括使核酸引物與樣品核酸雜交，通過酶反應，推測在樣品核酸鏈上與引物末端堿基位置相應的堿基成分，其特征是引物含有抗外切酶的類核苷酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的酶反應為外切酶反應和聚合酶反應，反應時二種酶活性處于同一反應器中，由一個或多個酶提供。
3 如權利要求1所述的方法，其特征是所述的核酸引物含非自然產的類核苷酸或核苷酸替代物，包括肽鍵核酸和硫代磷脂核酸。
4.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的核酸樣品從生物體中提取或由生物化學或化學合成，被測的靶核酸具有單鏈結構或經熱變性分裂成單鏈結構。
全文摘要
一種核酸堿基成分的推測方法,包括使核酸引物與樣品核酸雜交,通過酶反應,推測在樣品核酸鏈上與引物末端堿基位置相應的堿基成分,其特征是引物含有抗外切酶的類核苷酸。本發明的優點是利用兩種酶活性在引物3’末端置換與靶核酸堿基相互補的標記堿基,使堿基的檢測準確性得到很大的提高。
文檔編號C12Q1/68GK1360056SQ00129419
公開日2002年7月24日 申請日期2000年12月20日 優先權日2000年12月20日
發明者吳昌, 吳明 申請人:吳昌, 吳明