專利名稱：分支桿菌快速變色液體培養基及分支桿菌鑒定方法及分支桿菌藥敏和mic測定方法
技術領域：
本發明屬于分支桿菌培養、鑒定和藥敏的技術領域，具體涉及一種分支桿菌快速變色液體培養基，及用此快速變色液體培養基進行結核與非結核分支桿菌快速鑒定、分支桿菌快速藥敏和最小抑菌濃度(MIC)測定的方法。
目前，我國大多數醫院實驗室使用一種被稱為“改良羅氏培養基”的固體培養基培養分支桿菌，其成分和制備方法參見由熊禮寬編著、中國科學技術出版社1992年7月出版發行的《結核病的實驗室診斷及其進展》第27-28頁，具體的成分及含量為磷酸二氫鉀2.4g、硫酸鎂·7H2O 0.24g、枸櫞酸鎂0.6g、甘油1.2ml、天門冬3.6g、淀粉30g、蒸餾水600ml、2％孔雀綠水溶液20ml、新鮮雞卵液1000ml。制備方法為將各鹽類成分溶于水后，加入淀粉，混勻后，置沸水浴中煮沸30-40分鐘，呈糊狀，待冷卻后，加入已消毒的紗布過濾的新鮮雞卵液，混勻后，再加入孔雀綠溶液，待混勻后，分裝于試管中，置血清凝固器在90℃下1-2小時，然后在4℃保存。此培養基制備較麻煩，分支桿菌培養陽性率低，為20-40％，所需時間長，一般20-56天。用此改良羅氏培養基培養分支桿菌后，再經過生化反應進行鑒別是結核分支桿菌，還是非結核分支桿菌，其鑒定程序麻煩，所需時間長，一般需28天。用此改良羅氏培養基進行藥敏試驗，是在其中加入一定量的藥物來進行，其所需時間長，規定需28天以上才能出結果，而且藥物因加熱被破壞使藥敏準確性差。
國外有實驗室采用液體培養基培養分支桿菌，多采用含放射性的碳標記一種底物，如棕櫚酸，當有活的細菌生長時，則分解14C標記的棕櫚酸脫羧產生有放射性的二氧化碳，再通過檢測二氧化碳含量來判斷分支桿菌是否存在，如BACTEC 460檢測系統，參見《結核病的實驗室診斷及其進展》第70-73頁。也有采用熒光底物的液體培養基培養分支桿菌，如BACTEC 9000MB和MGIT系列。這些液體培養基檢測分支桿菌陽性率高于固體培養基，所需時間也明顯縮短，但均需要特殊儀器，試劑昂貴，且依靠進口。
本發明的第一個目的在于針對上述各種現有培養基存在的問題，提供一種快速且培養陽性率高的分支桿菌液體培養基。
本發明的第二個目的在于針對上述各種分支桿菌鑒定方法或時間長、準確率不高，或需要專用儀器、價格昂貴的缺點，提供一種不需要儀器、準確而快速的分支桿菌鑒定方法。
本發明的第三個目的在于針對上述用改良羅氏培養基進行藥敏試驗所需時間長、藥敏準確性差的缺點，提供一種快速而準確的分支桿菌藥敏和MIC測定方法。
本發明的第一個目的是這樣實現的本發明的分支桿菌快速變色液體培養基是在溶劑為蒸餾水的溶液中含有緩沖系統、基礎成分、微量元素成分、促生長劑和混合抗生素，還含有變色劑MTT和/或XTT，變色劑的含量為在1000ml溶液中含有5-8mg。上述變色劑MTT為噻唑蘭(Thiazolyl)，即溴化[3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯四唑]，即3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，變色劑XTT為2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)-2H-四唑-5-carboxanilid，即2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide。MTT和XTT均為市售成品。
上述緩沖系統包括磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，基礎成分包括硫酸鎂·7H2O、枸櫞酸鈉·2H2O、甘油、谷氨酸鈉和小牛血清，微量元素成分包括硫酸銨、硫酸鋅、硫酸銅、枸櫞酸鐵銨、氯化鈣，促生長劑包括白蛋白-油酸-葡萄糖液、鹽酸吡哆醇、泛酸鈣、生物素、觸酶，上述各組分的含量為，在1000ml溶劑為蒸餾水的溶液中，磷酸二氫鉀1.875-2.5g、磷酸氫二鈉1.875-2.5g、硫酸鎂·7H2O 25-50mg、硫酸銨250-500mg、硫酸鋅1-2mg、硫酸銅1-2mg、枸櫞酸鐵銨20-40mg、枸櫞酸鈉·2H2O 200-400mg、氯化鈣0.5-1mg、鹽酸吡哆醇1-2mg、泛酸鈣1-2mg、生物素0.25-0.5mg、觸酶200-400μg、甘油2-5ml、谷氨酸鈉250-500mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液50-200ml、小牛血清50-l00ml、混合抗生素20-100mg、變色劑MTT和/或XTT5-8mg。其配制方法為把除小牛血清、抗生素混合液等不能高壓滅菌的組分之外的其余組分均勻混合在一起，然后高壓滅菌，待冷卻后加入小牛血清、抗生素混合液等不能高壓滅菌的組分即可。采用上述快速變色液體培養基與傳統的羅氏培養基比較，經130例對照試驗，結果顯示(1)時間采用羅氏培養基分支桿菌平均生長時間22天，采用本發明的快速變色液體培養基分支桿菌平均生長時間為8天；(2)陽性率采用羅氏培養基分支桿菌培養陽性率為30.8％(40/130)，采用本發明的快速變色液體培養基分支桿菌培養陽性率為52.3％(68/130)；(3)污染率采用羅氏培養基污染率為2.3％(3/130)，采用本發明的快速變色液體培養基污染率為1.5％(2/130)。
本發明的快速變色液體培養基具有快速、培養陽性率高和污染率低的優點。
本發明的第二個目的是這樣實現的往每個鑒定組中加入50-100體積份數的有機溶劑、100-200體積份數的稀釋菌液和對硝基苯甲酸，對硝基苯甲酸作為結核分支桿菌抑制劑，其終濃度為0.5mg/ml，稀釋菌液是把待鑒定菌液用本發明的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照組中加入50-100體積份數的有機溶劑與1-2體積份數濃度為5mg/ml的變色劑，變色劑的種類與鑒定組中相同，然后在35-37℃下培養，觀察結果，當對照組變紫或變紅色后，往測試組中再加入1-2體積份數的同種變色劑，35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當兩組均變紫或變紅色，則待鑒定菌為非結核分支桿菌，當對照組變紫或變紅色，而鑒定組不變色，則待鑒定菌為結核分支桿菌。
上述有機溶劑最好選用液體石蠟。
上述分支桿菌鑒定方法由于采用了本發明的快速變色液體培養基，具有如下優點1．快速，只需1-6天。2．簡便，不需儀器；3．準確，準確性達99.5％。
本發明的分支桿菌鑒定方法通過對人型結核分支桿菌、牛型結核分支桿菌、非洲分支桿菌、卡介苗、堪薩斯分支桿菌、海分支桿菌、猿分支桿菌、瘰疬分支桿菌、戈分支桿菌、蘇分支桿菌、鳥分支桿菌、蟾分支桿菌、潰瘍分支桿菌、胃分支桿菌、胞內分支桿菌、地分支桿菌、malmoense分支桿菌、無色分支桿菌、次要分支桿菌、嗜血分支桿菌、副結核分支桿菌、shimaidei分支桿菌、偶發分支桿菌、副偶發分支桿菌、龜分支桿菌龜亞種、龜分支桿菌膿腫亞種、耐熱分支桿菌、轉黃分支桿菌、草分支桿菌、恥垢分支桿菌和牡牛分支桿菌等ATCC、MTC分支桿菌標準株及臨床分離株進行試驗后發現，本發明的鑒定方法可快速、準確的將非結核與結核分支桿菌進行鑒別，將傳統的方法需28天縮短為1-6天。
本發明的分支桿菌鑒定方法與采用傳統的羅氏培養基的鑒定方法比較，進行結核分支桿菌和非結核分支桿菌鑒別試驗，經200例對照試驗，結果顯示在羅氏培養基上需要28天，而本發明的快速變色液體培養基只需1-6天，鑒定結果兩者完全一致。
本發明的第三個目的是這樣實現的往每個鑒定組中加入50-100體積份數有機溶劑、100-200體積份數的稀釋菌液和待測藥物，其中稀釋菌液是把菌液用本發明的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照組中加入50-100體積份數的有機溶劑與1-2體積份數濃度為5mg/ml的變色劑，變色劑的種類與鑒定組中相同，然后在35-37℃下培養，觀察結果，當對照組變紫或變紅色后，往測試組中再加入1-2體積份數的同種變色劑，35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當兩組均變紫或變紅色，則為耐藥，當對照組變紫或變紅色，而鑒定組不變色，則為敏感，以不變色的最低藥物濃度組的藥物濃度為其MIC。
上述有機溶劑最好選用液體石蠟。
本發明的分支桿菌藥敏試驗和MIC測定方法由于采用了本發明的快速變色液體培養基，具有如下優點1．快速，只需1-6天。2．簡便，不需儀器；3．準確，準確性達99.5％。4．傳統的方法只適用于異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸鈉、利福平、乙胺丁醇、氨硫脲、乙硫異煙胺、卡那霉素和卷曲霉素這些藥物，而本發明的方法除適用于上述藥物外，幾乎適用于所有的抗菌素，如阿米卡星、吡嗪酰胺、利福噴丁、利福布丁、克拉霉素、羅紅霉素、阿齊紅霉素、米若環素、亞胺培南、多西環素、妥布霉素、頭胞西丁、環丙沙星、氧氟沙星和斯帕沙星等。
把本發明的藥敏試驗方法與采用傳統的羅氏培養基的藥敏試驗方法相比較，進行了異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇和利福平藥敏試驗，經200例對照試驗，結果顯示在羅氏培養基上需要28天，而采用本發明的快速變色液體培養基的方法只需1-6天，藥敏結果一致。
采用了本發明的分支桿菌MIC測定方法對20例非結核分支桿菌進行MIC測定，能在1-6天內測出阿米卡星、吡嗪酰胺、利福噴丁、利福布丁、克拉霉素、羅紅霉素、阿齊紅霉素、米若環素、亞胺培南、多西環素、妥布霉素、頭胞西丁、環丙沙星、氧氟沙星和斯帕沙星的MIC。
上述三個實施例中的變色劑MTT可以用變色劑XTT或MTT和XTT的任意比的混合變色劑替代。
實施例四分支桿菌快速鑒定方法鑒定在微量反應板上進行。往每個鑒定孔中加入液體石蠟50μl、稀釋菌液100μl和對硝基苯甲酸，對硝基苯甲酸的終濃度為0.5mg/ml，稀釋菌液是把待鑒定菌液用實施例一的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照孔中加入變色劑MTT 1μl，MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟50μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照孔變紫或變紅色后，往測試孔中再加入MTT 1μl,35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當鑒定孔和對照孔均變紫或變紅色，則待鑒定菌為非結核分支桿菌，當對照組變紫或變紅色，而鑒定組不變色，則待鑒定菌為結核分支桿菌。
實施例五分支桿菌快速鑒定方法鑒定在微量反應板上進行。往鑒定孔中加入液體石蠟100μl、稀釋菌液200μl和對硝基苯甲酸，對硝基苯甲酸的終濃度為0.5mg/ml，稀釋菌液是把待鑒定菌液用實施例二的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往對照孔中加入變色劑MTT2μl，MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟100μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照組變紫或變紅色后，往測試組中再加入MTT2μl,35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當鑒定孔和對照孔均變紫或變紅色，則待鑒定菌為非結核分支桿菌，當對照孔變紫或變紅色，而鑒定孔不變色，則待鑒定菌為結核分支桿菌。
實施例六分支桿菌快速鑒定方法鑒定在微量反應板上進行。往每個鑒定孔中加入液體石蠟80μl、稀釋菌液150μl和對硝基苯甲酸，對硝基苯甲酸的終濃度為0.5mg/ml，稀釋菌液是把待鑒定菌液用實施例三的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照孔中加入MTT1.2μl,MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟150μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照孔變紫或變紅色后，往測試孔中再加入MTT 1.2μl,35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當鑒定孔和對照孔均變紫或變紅色，則待鑒定菌為非結核分支桿菌，當對照孔變紫或變紅色，而鑒定孔不變色，則待鑒定菌為結核分支桿菌。
上述實施例四至實施例六中，如果快速變色液體培養基是采用變色劑XTT或MTT和XTT的混合變色劑，則對照孔中加入同種類型的變色劑。
實施例七分支桿菌快速藥敏和MIC測定方法測定在微量反應板上進行。往每個鑒定孔中加入液體石蠟50μl、稀釋菌液100μl和待測藥物，其中稀釋菌液是把菌液用實施例一的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照孔中加入變色劑MTT 1μl，MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟50μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照孔變紫或變紅色后，往測試孔中再加入MTT 1μl,35-37℃培養1-3小時，觀察結果，以不變色的最低藥物濃度孔的藥物濃度為其MIC。
實施例八分支桿菌快速藥敏和MIC測定方法測定在微量反應板上進行，往每個鑒定孔中加入液體石蠟100μl、稀釋菌液200μl和待測藥物，其中稀釋菌液是把菌液用實施例二的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，，往每個對照孔中加入變色劑MTT 2μl,MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟100μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照孔變紫或變紅色后，往測試孔中再加入MTT 2μl,35-37℃培養1-3小時，觀察結果，以不變色的最低藥物濃度孔的藥物濃度為其MIC。
實施例九分支桿菌快速藥敏和MIC測定方法測定在微量反應板上進行。往每個鑒定孔中加入液體石蠟80μl、稀釋菌液150μl和待測藥物，其中稀釋菌液是把菌液用實施例三的快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照孔中加入MTT 1.2μl，MTT的濃度為5mg/ml，液體石蠟80μl，然后在35-37℃下培養，每天觀察結果1次，當對照孔變紫或變紅色后，往測試孔中再加入MTT 1.2μl，35-37℃培養1-3小時，觀察結果，以不變色的最低藥物濃度孔的藥物濃度為其MIC。
上述實施例七至實施例九中，如果快速變色液體培養基是采用變色劑XTT或MTT和XTT的混合變色劑，則對照孔中加入同種類型的變色劑。
權利要求
1．一種分支桿菌快速變色液體培養基，在溶劑為蒸餾水的溶液中含有緩沖系統、基礎成分、微量元素成分、促生長劑和抗生素混合液，其特征在于還含有變色劑噻唑蘭和/或2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)-2H-四唑-5-carboxanilide，變色劑的含量為在1000ml溶液中含有5-8mg。
2．根據權利要求2所述的分支桿菌快速變色液體培養基，其特征在于所述緩沖系統包括磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，所述基礎成分包括硫酸鎂·7H2O、枸櫞酸鈉·2H2O、甘油、谷氨酸鈉和小牛血清，所述微量元素成分包括硫酸銨、硫酸鋅、硫酸銅、枸櫞酸鐵銨、氯化鈣，所述促生長劑包括鹽酸吡哆醇、泛酸鈣、生物素、觸酶、白蛋白-油酸-葡萄糖液；上述各組分的含量為，在1000ml溶劑為蒸餾水的溶液中，磷酸二氫鉀1.875-2.5g、磷酸氫二鈉1.875-2.5g、硫酸鎂·7H2O 25-50mg、硫酸銨250-500mg、硫酸鋅1-2mg、硫酸銅1-2mg、枸櫞酸鐵銨20-40mg、枸櫞酸鈉·2H2O 200-400mg、氯化鈣0.5-1mg、鹽酸吡哆醇1-2mg、泛酸鈣1-2mg、生物素0.25-0.5mg、觸酶200-400μg、甘油2-5ml、谷氨酸鈉250-500mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液50-200ml、小牛血清50-100ml、混合抗生素20-100mg、變色劑5-8mg。
3．一種分支桿菌快速鑒定方法，其特征在于往每個鑒定組中加入50-100體積份數的有機溶劑、100-200體積份數的稀釋菌液和對硝基苯甲酸，對硝基苯甲酸的終濃度為0.5mg/ml，稀釋菌液是把待鑒定菌液用快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照組中加入50-100體積份數的有機溶劑與1-2體積份數濃度為5mg/ml的變色劑，變色劑的種類與鑒定組中相同，然后在35-37℃下培養，觀察結果，當對照組變紫或變紅色后，往測試組中再加入1-2體積份數的同種變色劑，35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當兩組均變紫或變紅色，則待鑒定菌為非結核分支桿菌，當對照組變紫或變紅色，而鑒定組不變色，則待鑒定菌為結核分支桿菌。
4．根據權利要求3所述的分支桿菌快速鑒定方法，其特征在于所述有機溶劑為液體石蠟。
5．一種分支桿菌快速藥敏和MIC測定方法，其特征在于往每個鑒定組中加入50-100體積份數有機溶劑、100-200體積份數的稀釋菌液和待測藥物，其中稀釋菌液是把菌液用快速變色液體培養基稀釋成5×105-5×107菌落數/ml而成，往每個對照組中加入50-100體積份數的有機溶劑與1-2體積份數濃度為5mg/ml的變色劑，變色劑的種類與快速變色液體培養基中相同，然后在35-37℃下培養，觀察結果，當對照組變紫或變紅色后，往測試組中再加入1-2體積份數的同種變色劑，35-37℃培養1-3小時，觀察結果，當兩組均變紫或變紅色，則為耐藥，當對照組變紫或變紅色，而鑒定組不變色，則為敏感，以不變色的最低藥物濃度組的藥物濃度為其MIC。
6．根據權利要求5所述的分支桿菌快速鑒定方法，其特征在于所述有機溶劑為液體石蠟。
全文摘要
本發明為一種分支桿菌快速變色液體培養基及分支桿菌鑒定方法及藥敏和MIC測定方法,本發明的快速變色液體培養基是在溶劑為蒸餾水的溶液中含有緩沖系統、基礎成分、微量元素成分、促生長劑和混合抗生素,還含有變色劑MTT和/或XTT,變色劑含量為在1000ml溶液中含有5—8mg,該培養基具有快速、培養陽性率高的優點。采用了本發明快速變色液體培養基進行分支桿菌鑒定及藥敏和MIC測定,具有快速、簡便、準確和可靠的優點,幾乎適應于所有抗菌素。
文檔編號C12Q1/18GK1298023SQ00128498
公開日2001年6月6日 申請日期2000年11月20日 優先權日2000年11月20日
發明者周亞紅, 熊禮寬 申請人:深圳市怡百世生物技術有限公司