專利名稱：新的微生物多糖結冷膠生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵和食品添加劑生產領域，更具體地，本發明涉及微生物多糖結冷膠的發酵和提取等生產工藝。
三十多年來，微生物多糖獲得了極大發展，尤其是1960年開發成功的黃原膠被譽為微生物多糖生產和應用的″杰出產品″。1992年獲美國FDA批準應用的結冷膠(Gellan Gum)，是一種高品質的凝膠劑和懸浮劑，在食品添加劑、藥用輔料和微生物及植物組織培養基等領域極具應用價值，有望成為繼黃原膠之后的第二個微生物多糖″杰出產品″。
至今唯有美國實現了結冷膠的工業生產。中國于1996年批準結冷膠作為食品添加劑應用，但高昂的市場價格限制了它在國內的廣泛應用。實現結冷膠的國產化和低成本是解決問題的關鍵。要達到目標在技術方面需解決的問題包括1、結冷膠由產膠微生物在適宜的培養基中經糖代謝合成。培養基組分中，糖類為主的碳源、蛋白質為主的氮源構成發酵原料成本的最大部分。尋找能促進產物合成，又價格低廉的碳、氮源是實現高產量、低成本生產結冷膠必需考慮的。
2、結冷膠發酵液屬高粘度反應體系(最高達7000-8000cP)。傳統的機械攪拌發酵罐是針對低粘度發酵體系設計的，應用于高粘度體系時有主體混合差、傳質效率低而能量消耗高等缺點，使反應體系的養料和氧氣供應成為提高發酵效率的限制因素。要達到結冷膠發酵高產高效之目的，對發酵設備有特殊要求。
3、過濾除去發酵液中的菌體碎片和蛋白質，得到澄清結冷膠溶液是提取過程中的難點，該步驟也是影響產品純度、外觀和應用性能的關鍵所在。導致除雜困難的原因是發酵液粘度高、蛋白含量高及色素的存在。
4、包括黃原膠、結冷膠在內的一些多糖化合物的提取，為使產品達到高品質、可食用的要求，一般需使用大量醇溶劑(乙醇、異丙醇等)，而醇溶劑的損耗和回收能源往往構成生產成本的最大部分，所以找到低溶劑使用量的提取方法很有意義。
因此，本領域迫切需要開發新的生產微生物多糖結冷膠的工藝。該工藝可以降低結冷膠的生產成本和/或提高生產效率。
本發明的第一個目的是提供一種低成本的結冷膠發酵液的生產工藝，其中將廉價的粗淀粉水解糖液作為發酵原料。
本發明的第二個目的是提供一種低成本的從結冷膠發酵液中獲得脫酰基、透明結冷膠產品的提取方法。該方法不僅可獲得高品質的結冷膠，而且將提取過程中的醇溶劑用量大幅減少。
本發明的第三個目的是提供一種適用于本發明方法的發酵罐，該發酵罐特別適用于高粘度的結冷膠發酵體系。
在本發明的第一方面，提供了一種結冷膠的生產方法，它包括發酵步驟，所述的發酵包括將結冷膠生產菌接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中，在適合生長的條件下進行通風、攪拌培養，其中所述的碳源為粗淀粉水解糖液。
較佳地，在發酵中，氮源為酵母膏，并且培養條件是pH值7.0-7.5、溫度27-29℃，發酵時間50-60小時。
在本發明的另一實施例中，發酵是在高徑比為2-4的發酵罐中攪拌進行。
在本發明的另一實施例中，在發酵步驟之后還包括提取步驟(a)對發酵液進行堿處理，以去除結冷膠分子中的部分酰基；(b)對步驟(a)中經堿處理的發酵液先進行粗濾，再進行微濾；(c)對步驟(b)中經過濾處理的發酵液進行凝膠化處理，形成凝膠；(d)對步驟(c)中的凝膠進行壓榨除水；(e)烘干。
在本發明的第二方面，提供了一種提取結冷膠生產方法，它包括步驟(a)對含結冷膠的發酵液進行堿處理，以去除結冷膠分子中的部分酰基；(b)對步驟(a)中經堿處理的發酵液先進行粗濾，再進行微濾；(c)對步驟(b)中經過濾處理的發酵液進行凝膠化處理，形成凝膠；(d)對步驟(c)中的凝膠進行壓榨除水，形成經壓榨的膠片；(e)對步驟(d)中的膠片進行烘干。
較佳地，所述的粗濾是在80-200目條件下進行，而微濾是在0.2-1.0微米條件下進行。
在本發明的一個實施例中，所述的凝膠化處理是向熱濾液中加入終濃度為0.05-0.2％的凝膠化劑，并冷卻至室溫。
在本發明的另一實施例中，在步驟(d)和(e)之間，還包括步驟用少量低級醇浸泡壓榨所形成的膠片，以脫去殘色。
在本發明的第三方面，提供了一種用于本發明方法的發酵罐，所述發酵罐的高徑比為2-4，攪拌級數為3-6級，且底層攪拌采用徑向流圓盤透平槳，上層攪拌采用軸向流攪拌槳，以及槳直徑與罐直徑之比為1/2.5-1/2。
在附圖中，
圖1是本發明的發酵罐的剖面圖。
圖2A和2B分別為圓盤透平槳和軸流攪拌槳的正視圖。
圖3A和3B分別為圓盤透平槳和軸流攪拌槳的俯視圖。
定義如本文所用，術語“脫酰基的透明結冷膠”指對發酵所得天然結冷膠進行堿處理脫除乙酰基和甘油酰基，并用過濾等手段除去菌體蛋白，及濃縮和烘干后所得的水溶液呈透明狀的結冷膠產品。這是用途最廣泛的結冷膠商品形式。
如本文所用，術語“凝膠化劑”指加入結冷膠溶液中可引起結冷膠凝膠化的物質。本領域已知的用于凝膠化的各種試劑都可以用于本發明。合適的凝膠化劑的例子包括(但并不限于)氯化鈣、氯化鎂、氯化鋰等等。凝膠化劑的用量隨凝膠化劑種類不同而有所不同，本領域技術人員可通過常規試驗或經驗而加以確定。
首先，本發明提供一套優化的結冷膠發酵液的生產工藝，其中特別地提供一種廉價的粗淀粉水解糖液作為發酵原料。
目前，結冷膠發酵培養基中碳源一般采用精制的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等，氮源一般采用酵母膏、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉、酪蛋白水解液等。然而，本發明利用粗淀粉水解糖液作碳源，這基于以下考慮①與葡萄糖、蔗糖等相比價格低廉許多；②粗淀粉中富含蛋白質等營養。
可用于本發明的粗淀粉包括玉米粉、馬鈴薯粉、豆粉和山芋粉等，較佳地為玉米粉。粗淀粉用量(以葡萄糖計)為培養基總重量的2-4％，較佳為3％。由于以粗淀粉水解糖液作碳源，氮源添加量可減少，以酵母膏為例，一般地從0.5％的用量下降到0.2-0.3％。培養基中還包括常用的無機鹽。
通常，發酵條件還包括發酵溫度在25-35℃，較佳地為27-29℃；pH范圍為6.0-8.0，較佳為7.0-7.5。采用機械通風攪拌發酵罐，培養2-4天，較佳地為50-60小時。
可用于生產結冷膠的生產菌種可以是例如伊樂藻假單胞菌(Pseudomonaselodea)ATCC 53967，也可以是伊樂藻假單胞菌(Pseudomonas elodea)ATCC31461，或其它合適的菌種。
其次，本發明提供一種特制的適用于高粘度結冷膠發酵體系的機械攪拌發酵罐，其特征是內部裝有大直徑軸向流攪拌槳，罐體采用大高徑比設計。
目前，傳統機械攪拌發酵罐罐體高徑比1.5-1.7，槳直徑與罐直徑比為1/3左右。在高粘度發酵體系中，流體剪切效率隨離攪拌槳距離加大而迅速衰減，所以在罐壁附近和每級攪拌槳之間會出現死區。加大槳直徑與罐徑比值可克服這一缺點，但由于攪拌功耗隨攪拌槳直徑呈3次方倍率增加，加大槳直徑絕對值則單位體積功耗太大而不可取。所以應將罐徑變小，采用大高徑比罐體、增加攪拌槳級數的設計。另外，在高粘度發酵中采用軸向流攪拌槳，可迫使流體軸向流動，有助于消除多級攪拌槳葉之間的死區。
因此，本發明的發酵罐具有如下設計特征(1)發酵罐高徑比值為2-4，較佳地為2.5-3.5。
(2)具有3-6級攪拌槳級數，較佳地為4-5級攪拌槳級數。
(3)底層攪拌仍采用徑向流圓盤透平槳，以促進氣泡分散，而上層攪拌均采用軸向流攪拌槳；其中，軸向流攪拌槳可采用大葉面螺旋槳。
(4)槳直徑與罐直徑之比為1/2.5-1/2。
現參見附
圖1，本發明的一種發酵罐具有2個軸向流攪拌槳(1，2)和一個徑向流圓盤透平槳(3)，槳直徑與罐直徑之比1/2，且高徑比為3。
圓盤透平槳和軸流攪拌槳的結構分別示于圖2A和2B，以及圖3A和3B。
再次，本發明提供一套優化的從結冷膠發酵液中獲得脫酰基、透明結冷膠產品的提取技術。該提取技術的特征之一是采用先粗濾后微濾，并可引入少量脫色劑的方法，以獲得高澄清度的濾液；特征之二是用凝膠脫水工藝取代傳統的低級醇沉淀法分離結冷膠，將提取過程中的醇溶劑用量減至最少。
目前，提取工藝一般依次包括發酵液堿處理、過濾、濃縮和烘干步驟。
用于本發明方法的堿處理條件與現有技術沒有區別。目前所用的各種堿處理條件都可用于本發明。堿處理的目的是脫除結冷膠分子中的部分酰基以增強產品的凝膠性能。通常，堿處理條件如下；溫度為80-100℃，pH為9-12，處理10-45分鐘后將pH調至中性。較佳的條件溫度為85-90℃，pH10-11，時間15-20分鐘。
由于發酵液雜質多、顏色深，一步過濾難以得到澄清透明的結冷膠溶液，直接用微濾則負荷太大。因此，本發明設計了特別的過濾工藝，其特征是采用先粗濾后微濾，并在粗濾時引入少量脫色劑的方法，以獲得高澄清度的濾液。
粗濾的作用是除去大顆粒菌體碎片并吸附顏色以減輕微濾工序的壓力。粗濾通常在80-200目，較佳地100-150目，更佳地約120目條件下進行。對于助濾劑和脫色劑沒有特別要求，目前食品領域所用的各種助濾劑和脫色劑都可用于本發明。合適的助濾劑的例子包括(但并不限于)硅藻土、珍珠巖等，其用量通常為0.5-3％，較佳地為1-2％。脫色劑選用活性炭，其用量通常為0.2-1％，較佳地為0.2-0.5％。
一種較佳的粗濾條件為120目工業濾布，發酵液中加1-2％助濾劑(硅藻土)，0.2-0.5％脫色劑(活性炭)，趁熱經板框壓濾；微濾的作用是截留大分子蛋白等雜質得到清液。通常，微濾在0.2-1.0微米條件下進行。一種較佳的微濾條件為溫度70-80℃，濾膜孔徑為0.2-1.0微米。
為避免消耗大量醇溶劑，本發明用凝膠脫水工藝替代醇沉淀脫水工藝從溶液中分離結冷膠。采用凝膠脫水工藝的基礎是①有陽離子尤其是二價金屬離子存在時，脫酰基結冷膠溶液易凝膠；②較高的陽離子濃度下凝膠具有良好的析水性，尤其在受壓時；③濾液中殘存的可溶性蛋白，如用醇沉淀法會隨結冷膠一起沉淀，而用凝膠脫水法則易隨析出水除去，從而提高結冷膠產品純度。
本發明的凝膠脫水工藝包括凝膠化處理和凝膠壓榨兩個過程。
所述凝膠化處理過程為在熱濾液中加入含凝膠化劑(如氯化鈣)的溶液，使最終濃度達0.05-0.1％(以氯化鈣為例)，強制冷卻至室溫；所述的凝膠壓榨過程為將凝膠塊裝袋，液壓機壓榨除水。
壓榨所得的半干膠片含水60-75％，于50-70℃烘干后粉碎得成品。必要時用少量低級醇(如酒精、異丙醇)浸泡壓榨所得膠片，以脫去殘色和縮短烘干時間。
本發明的優點在于(1)使用粗淀粉水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)作為結冷膠發酵培養基的碳源，使發酵原料成本下降20-40％。
(2)采用大高徑比、大槳葉直徑與罐徑比的發酵罐使發酵液中結冷膠含量提高20％左右。
(3)采取了先粗濾后微濾，并引入少量脫色劑的過濾工藝。這一工藝克服了結冷膠提取中難以獲得高澄清度濾液的問題，保證了終產品的純度。
(4)以凝膠脫水法替代傳統的醇沉淀脫水法從溶液中分離結冷膠，使單位產品的醇溶劑損耗量下降80％左右，醇回收能源消耗量下降90％左右，使用于提取的輔料成本下降50％以上，使產品蛋白質含量減少20％左右。
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外，除非特別說明，否則所有的百分比都是重量百分比。
實施例1發酵生產結冷膠多糖A.種子制備從營養瓊脂斜面上將種子菌(Pseudomonas elodea ATCC 53967)接入肉湯培養基，30℃搖瓶培養24小時，是為一級種子；將上述種子液接入二級種子培養基營養成分同發酵培養基)，30℃培養16小時，然后以5％的量接入發酵培養基B.發酵工藝發酵培養基成分及用量見表l。
培養基用自來水配制，并以2N NaOH調節pH至7.5。發酵過程用10％NaOH控制pH7-7.5，溫度維持27℃-29℃，發酵時間為58小時。
表1結冷膠發酵培養基組成成份 用量(％)玉米水解糖 3.0(以葡萄糖計)酵母膏 0.2MgSO4.7H2O 0.01Na2HPO40.05KH2PO40.05C.發酵設備采用附
圖1所示的具有大高徑比發酵罐體和大直徑、軸向流攪拌槳的特制機械攪拌發酵罐。
D.結果如下進行發酵液中粗多糖含量測定將發酵液和兩倍于其體積的95％酒精混勻，取沉淀，60℃干燥2小時。結果表明，通過本實施例得到的發酵液中結冷膠粗多糖濃度為1.3g/100ml。成本下降約30％，多糖濃度比對照(常規發酵罐)高約20％。
實施例2脫酰基、澄清結冷膠的制備堿處理工藝A.將500L發酵液加熱至90℃；B.用NaOH調pH至10，保溫85℃-90℃，15分鐘；C.用稀鹽酸或稀硫酸調pH至6-8；過濾工藝D.加入發酵液體積1％的硅藻土，0.2％的活性炭，通過經預涂硅藻土的板框壓濾機過濾，壓力為0.2-0.3Mpa，待濾液的溫度為80-90℃；E.過濾得的濾液趁熱微濾(溫度大于70℃)，使用PallSepTM工業微濾器進行；凝膠工藝F.不斷攪拌下向熱濾液中緩慢加入10L 5％的氯化鈣溶液，冷卻至室溫形成凝膠；凝膠壓榨工藝G.將凝膠塊打碎裝入濾布制成的袋中，扎口，置于10Mpa液壓機下壓榨2小時；H.將含結冷膠量為30％的半干膠片放入2倍重量的酒精中浸泡半小時，脫去殘色；烘干和粉碎I.60℃烘干3小時，粉碎即為成品。
結果經測定，通過本實施例得到的結冷膠成品對結冷膠粗多糖的提取得率為55％。單位產品的酒精損耗量比使用傳統醇沉淀法下降80％左右，酒精回收的能源消耗下降90％以上。得到的產品具體性能見表2表2 脫酰基、透明結冷膠的產品性能產品外觀 類白色粉末(60目)干燥失重(％) 7.1灰份(％) 8.0蛋白含量(％) 1.50.5％濃度溶液外觀無色、澄清透明0.5％濃度溶液粘度(cP)300.5％濃度凝膠強度(g/cm2)1000實施例3脫酰基、澄清結冷膠的制備堿處理工藝A.500L發酵液加熱至90℃；B.用KOH調pH至10，保溫85℃-90℃，15分鐘；C.用稀鹽酸或稀硫酸調pH至6-8；過濾工藝D.加入發酵液體積1％的硅藻土，0.2％的活性碳，通過經預涂硅藻土的板框壓濾機過濾，壓力為0.2-0.3Mpa，待濾液溫度80-90℃；E.過濾得的濾液趁熱微濾(溫度大于70℃)，使用PallSepTM工業微濾器進行；凝膠工藝F.不斷攪拌下向熱濾液中緩慢加入5L 5％的氯化鎂溶液，冷卻至室溫形成凝膠；凝膠壓榨工藝G.將凝膠塊打碎裝入濾布制成的袋中，扎口，置于10Mpa液壓機下壓榨2小時；H.將含結冷膠量為30％的半干膠片置于2倍重量的酒精中浸泡半小時，脫去殘色；烘干和粉碎I.60℃烘干3小時，粉碎即為成品。
通過本實施例得到的結冷膠成品對結冷膠粗多糖的提取得率為54％；單位產品的酒精損耗量比使用傳統醇沉淀法下降80％左右，酒精回收的能源消耗下降90％以上。
應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種結冷膠的生產方法，它包括發酵步驟，所述的發酵包括將結冷膠生產菌接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中，在適合生長的條件下進行通風、攪拌培養，其特征在于，所述的碳源為粗淀粉水解糖液。
2.如權利要求1中所述的方法，其特征在于，氮源為酵母膏，并且培養條件是pH值7.0-7.5、溫度27-29℃，發酵時間50-60小時。
3.如權利要求1中所述方法，其特征在于，發酵是在高徑比為2-4的發酵罐中攪拌進行。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，它在發酵步驟之后還包括提取步驟(a)對發酵液進行堿處理，以去除結冷膠分子中的部分酰基；(b)對步驟(a)中經堿處理的發酵液先進行粗濾，再進行微濾；(c)對步驟(b)中經過濾處理的發酵液進行凝膠化處理，形成凝膠；(d)對步驟(c)中的凝膠進行壓榨除水；(e)烘干。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的結冷膠生產菌選自下組伊樂藻假單胞菌(Pseudomonas elodea)ATCC 53967和伊樂藻假單胞菌(Pseudomonas elodea)ATCC 31461。
6.一種提取結冷膠的生產方法，其特征在于，它包括步驟(a)對含結冷膠的發酵液進行堿處理，以去除結冷膠分子中的部分酰基；(b)對步驟(a)中經堿處理的發酵液先進行粗濾，再進行微濾；(c)對步驟(b)中經過濾處理的發酵液進行凝膠化處理，形成凝膠；(d)對步驟(c)中的凝膠進行壓榨除水，形成經壓榨的膠片；(e)對步驟(d)中的膠片進行烘干。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的粗濾是在80-200目條件下進行，而微濾是在0.2-1.0微米條件下進行。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的凝膠化處理是向熱濾液中加入終濃度為0.05-0.2％的凝膠化劑，并冷卻至室溫。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(d)和(e)之間，還包括步驟用少量低級醇浸泡壓榨所形成的膠片，以脫去殘色。
10.一種用于權利要求1所述方法的發酵罐，其特征在于，所述發酵罐的高徑比為2-4，攪拌級數為3-6級，且底層攪拌采用徑向流圓盤透平槳，上層攪拌采用軸向流攪拌槳，以及槳直徑與罐直徑之比為1/2.5-1/2。
全文摘要
本發明公開了一種結冷膠的生產方法,它包括發酵步驟,所述的發酵包括:將結冷膠生產菌接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中,在適合生長的條件下進行通風、攪拌培養,其中所述的碳源為粗淀粉水解糖液。本發明還提供了用于該方法的機械攪拌發酵罐。本發明還公開了一套從發酵液中提取結冷膠的方法,該方法可大幅度降低提取成本,并提高產品純度。
文檔編號C12M1/36GK1351172SQ00125858
公開日2002年5月29日 申請日期2000年10月26日 優先權日2000年10月26日
發明者張士楚, 陳亮, 尹洪波, 丁治 申請人:上海眾偉生化有限公司