新的原核增強子樣序列及其應用的制作方法

專利名稱：新的原核增強子樣序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的具有轉錄增強子樣活性的核苷酸序列、其克隆和篩選方法，以及所說的核甘酸序列在構建原核表達載體中的應用。可從大腸桿菌菌株或痘苗病毒基因組中克隆得到本發明的轉錄增強子樣序列。使用插入了本發明的增強子樣核苷酸序列并攜帶編碼感興趣的蛋白質編碼序列的重組表達載體轉化適當的宿主細胞，可顯著地提高重組基因的轉錄效率，從而大大增加所說是蛋白質表達產物的產率。
基因表達的調控是微生物學研究中的一個十分復雜的課題。已知外源基因的表達水平在轉錄和翻譯水平上受到許多功能性核苷酸序列和轉錄結合因子(如結合蛋白)的影響。真核基因轉錄的效率主要反映起始轉錄時限速反應的速率，并且受到兩類調節元件，即啟動子元件和調節子元件的控制。其中啟動子元件是精確有效地啟動轉錄開始所必需的，而調節子元件的功能在于增強或減弱啟動子的轉錄效率。調節子元件，特別是增強子則是當基因轉錄激活時可遠距離(一般在RNA轉錄起始位點100bp以上)對啟動子發揮順式作用的基因組元件。八十年代初，Banerji等人(Cell 27299-304，1981)首先發現真核病毒SV40基因組中存在有增強基因轉錄效率的增強子序列。繼后進一步發現這一基因轉錄調節序列廣泛存在于真核細胞及其病毒基因組中(參見Muller，M.M.et al.，J.biochem.178485-496，1988)。1985年，本發明人首次發現SV40的Hind III B片段在大腸桿菌內距離啟動子約1000bp處仍表現有明顯地增強外源基因(如HuINFα、β)表達的活性(吳淑華等，病毒學報，1385-388，1985；侯云德等，病毒學報，1278-281，1985)。同時，發現大腸桿菌glnA P2啟動上游有增強子樣序列(如參見McClure，W.R，Am.Rew.Biochem.54171-204，1985)。此后，研究者又相繼發現了一系列具有轉錄調節作用的增強子序列，其中包括調節氮源吸收和固定的Ntrc增強子(Back，M.et al.Nature 320374-378)和NifA增強子(Reiter，L.and Magasanik，B.，Cell 45785-792，1986)，以及T4晚期基因增強子(Herendeen，D.R.et al，Science 245952-958，1989)等。
研究者們已對原核增強子的結構特征和作用機理進行了廣泛地研究(如參見Kustu.S.et al，TIBS 16397-402，1991)，并在此基礎上為進一步闡明大腸桿菌DNA結合蛋白和轉錄激活機制進行了更為深入地探討。例如，已顯示大腸桿菌Trp和PL啟動子上游富含A/T區域對增強轉錄活性具有重要作用(Nishi，T.et al，Gene 4429-36，1986)，并可顯著地提高外源。結構基因的表達水平(Latta，M.DNA and Cell Biol.9129-137，1990)。特別是近年來在深入研究σ54型增強子的基礎上，進一步發現增強子實際上是以不同形式參予轉錄調節的多種蛋白質因子的DNA結合位點。
業已發現，這類原核增強子樣序列具有某些共同的特征1，可在距離啟動子上游0.3-1.0kb處發揮其作用，以致使結構基因的表達水平提高4-11倍；2，其轉錄增強效應沒有明顯的方向性，即增強子相對于啟動子的方向與其活性無關；3，位置效應，即增強子無論位于啟動子的上游或下游，均表現有轉錄增強活性；4，原核增強子對啟動子轉錄作用的增強活性與其來源關系不大，例如病毒或噬菌體來源的增強子對原核啟動子和痘苗病毒啟動子均有作用；5，具有一定的宿主特異性或組織專一性。
與此同時，為了開發原核增強子在生物工程產業中的應用，本發明人利用我們自己構建的篩選質粒和檢測質粒，建立了直接從大腸桿菌基因組中克隆并篩選具有原核增強子樣活性的DNA片段的方法(例如參見孫乃思等，分子遺傳學，南京大學出版社1990年版，中國南京)，并相繼從大腸桿菌(如JM103和MC1061細胞株)和真核細胞病毒(如乳頭狀瘤病毒、呼吸道合胞病毒及痘苗病毒)中發現并克隆了一系列具有重要的實用價值的原核增強子樣序列。例如，已授權的中國專利95106219.0公開了從大腸桿菌JM103染色體DNA中分離的具有增強子樣活性的894bp片段、RSV的G片段、痘苗病毒基因組中的HindIIIK片段和SV40 Hind III B片段。另外，該文獻還公開了這些片段在構建高效表達載體(如質粒PBV320及其衍生物)中的應用。
在已有研究成果的基礎上，本發明人利用我們自己構建的原核增強子檢測系統和工具載體，進一步從具有極好安全性的K12系大腸桿菌C600菌株和痘苗病毒天壇株中分離并克隆了具有原核增強子樣活性的新的核苷酸片段，初步分析了這些片段的結構和功能，并在此基礎上研究了這些片段在構建新的原核表達載體中的應用，從而完成了本發明。
本發明的一個目的是提供具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是大腸桿菌來源的，并且具有如


圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列。
本發明的另一個目的是提供具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是大腸桿菌來源的，并且具有如圖2(SEQ ID NO2)所示的核苷酸序列。
根據本發明上述目的的優選實施方案，其中所說的大腸桿菌是大腸桿菌C600菌株。
本發明的再一個目的是提供具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是痘苗病毒來源的，并且具有如圖5(SEQ ID NO3)所示的核苷酸序列。
本發明的再一個目的是提供具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是痘苗病毒來源的，并且具有如圖6(SEQ ID NO4)所示的核苷酸序列。
根據本發明上述目的的優選實施方案，其中所說的痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。
本發明的再一個目的是提供如上限定的具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物在構建重組表達載體并提高外源基因表達產物的產率中的應用。
圖1顯示具有原核增強子樣生物學活性的，來源于大腸桿菌C600并定名為3A的DNA片段的核苷酸序列。
圖2顯示具有原核增強子樣生物學活性的來源于大腸桿菌C600并定名為8A的DNA片段的核苷酸序列。
圖3顯示用于篩選本發明的大腸桿菌C600來源之原核增強子樣DNA片段的重組載體pKT和pKTK的構建。
圖4A顯示CAT基因序列轉錄本(mRNA)的斑點印跡雜交結果。其中泳道1和2分別為攜帶8A和3A片段的質粒DNA提取物，泳道3為pKN2對照質粒DNA提取物，泳道4為酵母tRNA樣品(陰性對照)。
圖4B顯示LacZ基因序列轉錄本(mRNA)的斑點印跡雜交結果。其中泳道1和2分別為攜帶8A和3A片段的質粒DNA提取物，泳道3為pKN2d對照質粒DNA提取物，泳道4為酵母tRNA樣品。
圖5顯示具有原核增強子樣生物學活性的，來源于痘苗病毒天壇株并定名為VV1的DNA片段的核苷酸序列。其中黑體字母顯示富含AT區，斜體字母顯示相鄰的24bp重復序列。
圖6顯示具有原核增強子樣生物學活性的，來源于痘苗病毒天壇株并定名為VV16的DNA片段的核苷酸序列。其中黑體字母顯示富含AT區。
圖7顯示痘苗病毒VV1和VV16 DNA片段對β-半乳糖苷酶表達水平的影響。
本發明提供了具有原核增強子樣活性的DNA片段，其克隆和篩選方法，以及所說的片段在制備重組表達載體中的應用。本發明的原核增強子樣序列可用于有效地提高原核啟動子的轉錄速率，從而顯著地提高表達載體中外源基因的表達產率，故具有很大的實用價值。
自發現原核增強子樣序列以來，人們在深入研究其結構特征和作用機理的同時，一直在試圖從各種來源尋找并分離具有原核增強子樣活性的DNA序列。由于大腸桿菌具有良好環境適應性，而且是研究基因轉錄激活和表達的良好模型，而痘苗病毒則具有龐大的基因庫，而且是研究真核—原核基因調控的良好模型，加之目前對它們較深的認知程度和其良好的安全性，因此本發明人特別選用這兩種生物體作為篩選和分離原核增強子樣序列的材料來源。
根據本發明的一個實施方案，為了從大腸桿菌基因組中分離并篩選具有原核啟動子轉錄增強活性的DNA片段，首先用本領域技術人員已知的方法(如參見Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Herbour Press，1989)經氯仿/異丙醇提取和乙醇沉淀，從活化的大腸桿菌菌株中制備細菌染色體DNA。用適當的限制性核酸內切酶消化后，以瓊脂糖凝膠電泳法分離并回收有預期大小的DNA片段。可使用已知的透析袋回收法或液氮凍溶法從瓊脂糖凝膠切塊中提取得到所需的DNA片段。
將如此得到的酶切片段(HalIII＋Sau3AI，HaeIII＋EcoRV等)分別插入到原核增強子篩選載體pRN2(參見潘衛等，生物工程學報6265-271，1990)中，或克隆到從攜帶氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)的質粒pKK232-8(Pharmacia)和攜帶Trp啟動子的質粒pBV321(參見薛水星等，自然科學進展7322-326，1997)構建的大腸桿菌增強子樣DNA序列篩選載體pKT及其類似物pKTR(圖3)中。用所得到的連接產物轉化適當的大腸桿菌菌株，得到轉化菌。在含有高濃氯霉素的LB-A瓊脂培養基(含有氨芐青霉素的LB培養基)上進行壓力篩選。結果得到分別攜帶大約669bp和大約451bp之插入片段并具有高氯霉素抗性的重組體菌株，從而得到分別定名為pAL 3A和pAL8A的重組質粒載體。
為了定量分析這些DNA片段的原核DNA轉錄增強活性，并確定這些片段相對于原核啟動子的方向不依賴性，進一步將這些片段再克隆到攜帶β-半乳糖苷酶報導基因(LacZ)的檢測載體pAL(參見謝明等，中國科學(C輯)27179-185，1997)中。用所得到的重組載體轉化適當的宿主細胞(如大腸桿菌JM103)并培養轉化體細胞后，檢測其中的β-半乳糖苷酶活性，借以定量分析在以正向或反向插入上述DNA片段的情況下，其對特定報告基因的轉錄速率和產物表達水平的影響。結果令人驚喜地發現，當在重組檢測載體中以正向插入上述3A或8A片段時，pAL質粒所表達的β-半乳糖苷酶活性分別提高7.8倍(3A)和8.2倍(8A)；而反向插入這些序列時，pAL質粒所表達的β-半乳糖苷酶活性分別提高3.2倍(3A)和3.6倍(8A)。
已知上述DNA序列對下游報導基因的表達增強活性可以表現在轉錄水平和/或翻譯水平上。為了分析按上述方法從大腸桿菌基因組中篩選并分離的DNA片段的基因轉錄增強活性，分別檢查了含有這些片段的細菌轉化株中CAT或LacZ基因之轉錄本(mRNA)的水平，使用不含有這些插入片段的空質粒載體轉化的相同細胞株作為陽性對照，使用酵母tRNA作為陰性對照，并分別以地高辛標記的LacZ基因序列和32P放射標記的CAT基因序列作為探針，進行RNA斑點雜交分析(參見Tao，K.et al.，Mol.Microbicl.7859-864，1993)。結果表明，帶有本發明的上述3A和8A片段的克隆顯著地提高報導基因CAT、LacZ之表達水平的生物學活性是發生在DNA轉錄水平上(圖4A和4B)。增強子樣序列以正向或反向插入時均能增強報導基因的轉錄，并且這種增強活性與上述酶活性的檢測結果完全相符。
進一步的核苷酸序列分析結果顯示，從大腸桿菌中分離的上述3A和8A片段與已報導的大腸桿菌(如大腸菌桿菌MG1655)基因組序列具有＞98％的序列同源性。基中3A片段含有ssvA基因的5′端部分；8A片段含有tetA和tetR基因的一部分。3A片段中，至少含有兩個可能構成蛋白結合位點的富含AT區(分別在核苷酸位置362-382和399-415)和至少一個富含GC區(核苷酸位置284-313)，其中AT和GC含量分別達84％和81％；8A片段的非編碼區僅約60bp，其中至少含有一個富含AT區(第313-332位核苷酸)，其中AT含量約占85％。
另一方面，為了確定按上述方法制備的原核DNA轉錄增強子樣序列的活性功能區，我們以長度約669bp的3A片段為例，進一步對其進行了缺失突變研究。分別按已知方法從3A片段的5′端和3′端對序列進行不同長度的缺失突變，并各選擇出7個截短序列的克隆。分離并純化后，將這些片段分別克隆到檢測載體pAL中，然后用所得到的重組載體轉化大腸桿菌。培養細胞后，檢測各缺失突變體表達產物的β-半乳糖苷酶活性，借以分析這些缺失突變對片段轉錄增強活性的影響。結果顯示，長約669bp的3A片段自5′端缺失300bp后對其錄轉增強活性基本上沒有影響。如繼續缺失110bp，其活性逐漸降低。當缺失至200bp時，3A片段的轉錄增強活性幾近完全喪失。
另外，當3A片段自3′端缺失170bp以上時，其原有的轉錄增強活性逐漸降低。當片段缺失350bp時活性明顯降低。當缺失至總長度不足250bp時，其轉錄增強活性幾近完全喪失。因此可以推測，本發明的3A片段的轉錄增強活性區域差不多位于距5′端約300至669bp的大約369bp范圍內。
根據本發明的另一個實施方案，基本上按照前述從大腸桿菌中分離并篩選具有原核DNA轉錄增強活性的DNA序列的方法，從痘苗病毒基因組中分離并篩選本發明的原核增強子樣DNA片段。為此目的，首先按照已知方法，利用預制備的雞胚原代細胞培養物增殖痘苗病毒天壇毒株(本實驗室保存，參見中國專刊95106219.0)。當細胞生長至足夠密度并產生細胞病變后，離心收集病毒懸液并按常規方法提取和純化病毒DNA。用具有4堿基和/或6堿基不同識別位點的限制性核酸內切酶單酶或雙酶充分消化所得的痘苗病毒基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA片段，并按照已知的透析袋電泳法(如參見Baratowski S.et al.，Call 56549-561，1989)或凍融法(如參見Zawel，L.and Reinberg，D.，Am.Rev.Biochem.64533-561，1995)從凝膠電泳帶中分離不同大小的DNA片段。將適當的病毒DNA片段插入到原核增強子檢測載體pKN2(參見潘衛等，生物工程學報6265-271，1990)的SmaI位點中，并用所得到的攜帶氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)基因(作為報導基因)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，并在CAT上游的多克隆位點處插入了上述痘苗病毒DNA片段的重組載體轉化感受態大腸桿菌細胞。將被轉化的大腸桿菌細胞接種在含有不同高濃度氯霉素的LB-A培養基上。37℃保溫過夜，對攜帶不同的痘苗病毒DNA片段的細菌細胞進行生長壓力篩選，從中選擇出能夠高水平表達CAT基因，從而能夠在高濃度氯霉素環境中生長的菌株，進而從眾多病毒DNA片段中初步篩選出7個具有轉錄增強子樣活性的片段。這些陽性克隆(pKN-VV)在含有青霉素的LB培養基中，均可耐受另外加入的濃度高達600-800μg/ml的氯毒素生長壓力。相反，被未插入病毒DNA片段的pKN2轉化的細菌細胞則只能耐受50-100μg/ml的氯霉素。因此可見，所說的病毒DNA片段的插入導致CAT基因的表達水平提高約6-10倍，從而初步推測這些病毒DNA片段具有在DNA轉錄水平上提高外源基因表達水平的生物學活性。
為了進一步檢測按上述方法篩選的DNA片段在原核表達系統中的增強子樣活性及其方向不依賴性將上述不同的病毒DNA片段按正反向克隆到攜帶β-半乳糖苷酶基因(LacZ)作為報導基因的檢測質粒pAL(參見謝明等，中國科學(C輯)，27179-185，1997)中，并用連接混合物轉化適當的宿主細胞(例如大腸桿菌JM109)。在適當的培養基中培養轉化體細胞后，按照已知方法(如參見Miller，J.H.，Experiments inMolecular Genetics，CSH，NY；Cold Spring Harbour，PP.352，1972)定量檢測轉化株的β-半乳糖苷酶表達水平(以計算的Miller單位數表示)，借以定量分析所插入的病毒DNA片段對LacZ基因轉錄的增強作用。結果表明，相對于未攜帶病毒DNA片段或攜帶其他病毒DNA片段的質粒載體pAL，其中攜帶痘苗病毒DNA片段VV1和VV16的重組質粒，pAL-VV1和pAL-VV16，可使LacZ基因在適當的大腸桿菌宿主中的表達水平顯著提高。當VV1和VV16片段以正向插入時，LacZ表達水平分別提高10.9倍和9.0倍；當VV1和VV16片段以負向插入時，LacZ表達水平分別提高3.8倍和4.1倍(參見圖7)。
按照已知方法對上述VV1和VV16片段進行DNA序列測定，結果顯示兩個片段與痘苗病毒基因組序列具有95％以上的同源性。進一步地序列分析表明，VV1片段為痘苗病毒DNA依賴性RNA聚合酶PR019基因的一部分。該片段全長度283bp，其中含有兩個長度24bp的重復序列和3個富含AT區域。VV16片段則是痘苗病毒DNA依賴性RNA聚合酶、polyA聚合酶亞單位和DNA聚合酶PRO30基因的一部分。該片段全長度為112bp，其中含有4個富含AT區。圖5(SEQ IDNO3)和圖6(SEQ ID NO4)中分別給出了痘苗病毒來源的原核增強子樣DNA片段VV1和VV16的核苷酸序列。特別值得注意的是，這些DNA序列的富含AT區具有特征性序列結構A2-4/CA2-4/CT。這樣的相對柔性結構，可能有助于增強子樣序列跨越中部隔離區與距離較遠的的啟動子序列聯系成環，并借助于某些與之結合的蛋白質因子促成轉錄起始。
為了探明按前述方法制得的VV1和VV16片段對基因表達的增強作用是否發生在轉錄水平上，用地高辛毒苷標記的LacZ DNA作為探針，采用本領域已知的RNA斑點印跡方法對攜帶或不攜帶有上述基因片段之菌株的LacZ mRNA含量進行測定和比較。結果顯示，增強子樣序列以正向或反向插入時均能增強報導基因的轉錄，并且增強活性與β-半乳糖苷酶活性檢測結果相符。因此可以推測，所說的片段對LacZ基因表達的調控作用是發生在轉錄水平上。
以上述VV1片段為例進行了必要的功能性部位研究。利用前述同樣方法分別從正向克隆的5′端開始造成一系列缺失突變體并分別從中選擇6-7個克隆。將選擇的缺失片段克隆到pAL增強子檢測載體中，測定缺失突變體對β-半乳糖苷酶活性的影響。結果表明，VV1片段5′端缺失10bp時活性下降至原活性的50％；繼續缺失10bp時活性下降至原活性的25％；而缺失45bp以上時其轉錄增強活性基本消失。同樣，3′端缺失10bp時活性下降至原始活性的50％，繼續缺失10bp時活性下降至25％，當缺失45bp以上時轉錄增強活性基本消失。
對VV1片段的末端缺失突變研究結果顯示，5′末端20bp的核苷酸序列和3′末端20bp的核苷酸序列對其活性具有重要作用。而且兩個區域并不能單獨起作用，因為缺失任意一個末端區域都會導致活性的大幅度下降。
本發明進一步涉及上述大腸桿菌和病毒來源的轉錄增強子樣序列在構建新的重組表達載體，并借以提高某些有用基因表達產物的產率中的應用。如前所述，自發現具有DNA轉錄增強活性的序列以來，人們在深入地研究真核和原核增強子樣序列的結構特征及其作用機理的同時，也一直在致力于尋找具有更強活性的新的不同來源的轉錄增強子樣序列，并試圖將其應用于以重組DNA技術生產各種生物學活性蛋白質的產業實踐中。
我們利用預構建的啟動子上游區帶有大腸桿菌來源之增強子樣序列的重組載體pC20，和其中帶有處于PRPL啟動子控制下之γ-干擾素(IFN-γ)編碼序列的表達質粒PBV220，研究了本發明的原核增強子序列對外源真核基因表達水平的增強作用。經用核酸內切酶EcoRI消化后，從pBV220中切下編碼IFN-γ的cDNA序列，并用瓊脂糖凝膠純化之。在T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，將IFN-γ編碼序列連接到經用EcoRI充分消化的PL啟動子上游帶有本發明的3A片段，并在PL啟動子下游帶有便于進行重組DNA操作的多克隆酶切位點(EcoRI、SmaI、BamHI和PstI)的重組質粒載體pC20上。用連接反應混合物轉化感受態大腸桿菌JM103宿主細胞。培養細胞后，按常規方法篩選陽性克隆并分離質粒DNA，經酶切鑒定及Southern印跡分析后，得到定名為pC20-γ-IFN的重組表達質粒。對表達產物的活性滴度分析結果表明，與不攜帶本發明的原核DNA轉錄增強子樣序列的對照質粒相比，pC20-γ-IFN陽性克隆的IFN-γ表達水平提高約3倍。
另一方面，按照上述的相似方法，使用PL啟動子上游區連接有本發明的痘苗病毒來源的轉錄增強子樣DNA序列(VV1片段)，并在PL啟動子下游包括多克隆位點(EcoRI、SmaI、BamHI和PstI)的表達載體pV20表達α2b型干擾素(IFN-α2b)。實驗結果顯示，相對于啟動子上游未插入本發明的轉錄增強子樣序列的對照質粒，用啟動子上游連接有所說的片段并在其下游適當的位點處連接有IFN-α2b基因的重組質粒(pV20-IFN-α2b)轉化的大腸桿菌宿主細胞的IFN-α2b表達水平提高約3倍。
下列實施例旨在結合附圖進一步舉例描述本發明的原核增強子樣序列的分離、克隆和篩選方法，以及這樣的典型序列在構建或修飾重組表達載體以提高外源目的基因的表達水平中的應用。除特別指出或注明者外，實施例中所涉及到的細胞的分離與培養、染色體或質粒DNA的提取與純化、DNA片段的切割與連接、宿主細胞的轉化與篩選、核苷酸片段的分離與鑒定、克隆化DNA的定點誘變與修飾、寡核苷酸的合成與標記、宿主細胞的轉化與篩選，以及蛋白質產物的分離純化與鑒定，基本上都是按照J.Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述的方法完成的。這些實施例并不以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。
實施例1以氯霉素乙酰基轉移酶基因作為報導基因的原核增強子檢測載體的構建按照已知的DNA操作技術，用核酸內切酶EcoRI和XbaI從重組質粒pBV321(薛水星等，自然科學進展7322-326，1997)上切下包括Trp啟動子區域的0.3kb EcoRI/XbaI片段，將其連接到已用Hind III切成線性的攜帶報導基因氯霉素乙酰基轉移酶基因(CAT)的質粒pKK232-8(Pharmacia)上，得到用于本發明的原核增強子檢測載體pKT。由于該載體中CAT基因上游沒有啟動子，而且多克隆位點前后分別包括有轉錄和翻譯終止信號，故可避免跨越待篩選的DNA片段發生不適當的讀碼過程，從而有利于構建用于本發明的檢測載體。
可以利用pAL(謝明等，中國科學(C輯)27179-185，1997)中的0.8kbClaI/ClaI片段對pKT的多克隆位點進行必要的位點修飾，得到具有更便于DNA切接的多克隆位點的檢測載體pKTR(參見附圖3)。
實施例2從大腸桿菌C600菌株染色體DNA中克隆具有原核增強子樣活性的片段使用抗生素(氯霉素)壓力篩選技術和已知的增強子樣序列檢測載體pKN2及實施例1中制備的pKT和或pKTR，從大腸桿菌菌株C600的染色體DNA中篩選并克隆具有原核增強子樣活性的片段。已知質粒pKN2(潘衛等，生物工程學報6265-271，1990)轉化的大腸桿菌對氯霉素的耐受能力為50--100μg/ml，而pKT和pKTR轉化的大腸桿菌對氯霉素的耐受能力約為300μG/ml。用限制性內切酶HacIII、Sau3A和HacIII/EcoRI充分消化大腸桿菌染色體DNA后，分離不同大小的酶切片段并將它們克隆到pKN2、pKT和pKTR載體的多克隆位點中。用連接產物轉化大腸桿菌宿主JM103后，在含有不同濃度(400-800ug/ml)氯霉素的LB-A瓊脂培養基(含有氨芐青霉素的LB培養基)上進行生長壓力篩選。由于檢測載體中攜帶有可表達的報導基因CAT，因此在待檢測序列具有轉錄增強子活性的情況下，被其中插入了該序列的質粒轉化的宿主細胞便能夠在含高濃度氯霉素的生長條件下生長。相反，如果被插入的待檢測序列不具有這樣的轉錄增強活性，由之轉化的宿主細胞便不能產生足夠高水平的CAT酶，因而便不能耐受高濃度氯霉素生長環境。本實驗中，在使用工具質粒pKT或pKTR的情況下，生長培養基中所含氯霉素的濃度約為800μg/ml。
37℃下將重組載體轉化的細胞培養10小時后，測定其各自OD600吸光率，并判斷含有外源大腸桿菌基因組片段之轉化株的抗氯霉素抗性，結果以這種方法初步篩選到具有顯著地CAT基因表達增強活性的兩個分別定名為3A(669bp)和8A(451bp)的核苷酸片段。
實施例3大腸桿菌來源的3A和8A片段的轉錄增強活性及特征。
本實施例中，使用另一個攜帶半乳糖苷酶基因(LacZ)的檢測載體pAL(謝明等，中國科學(C輯)27；179-185，1997)，進一步檢測按實施例2所述方法從大腸桿菌基因組DNA中初步篩選得到的3A和8A片段的活性及其特征。首先從實施例2中所述的pKN2中切取3A和8A片段，并將它們分別以正反兩個方向連接到已用Bgl II消化的，攜帶LacZ基因(作為報道基因)和上游KT啟動子的檢測載體pAL的Bgl II位點上。用連接反應混合物轉化宿主細胞后分別挑選以正向或反向插入了這些片段的克隆，并進一步檢測被轉化的JM103細胞的β-半乳糖苷酶的表達水平。結果顯示，相對于未插入發明的3A或8A片段的pAL質粒，用含有這些片段的重組質粒轉化的大腸桿菌顯著的提高了β-半乳糖苷酶的表達水平。在正向和反向插入這些片段的情況下，酶活性分別提高達7-8倍和3-4倍。
本實施例的研究結果有力地表明，本發明的大腸桿菌基因組DNA片段3A和8A均具有方向不依賴性，位置不依賴性和啟動子(例如痘苗病毒N2、P7.5啟動子和大腸桿菌Trp啟動子)非選擇性等原核DNA轉錄增強子樣序列的已知特征。
另外，使用地高辛標記的LacZ基因作為探針，按已知方法對不同稀釋度的上述重組體JM103細胞的總RNA進行斑點印跡雜交分析。結果顯示，本發明的3A和8A片段均明顯地提高了pAL中LacZ基因轉錄本(mRNA)的水平(參見圖4B)，并與上述β-半乳糖苷酶表達水平增強效果基本相符。該實驗結果還表明，這些基因組DNA片段的蛋白質產物表達增強作用發生在DNA轉錄水平上。
實施例4痘苗病毒染色體DNA來源的原核增強子樣片段的篩選及其鑒定首先，按照本領域已知的方法，使用原代雞胚細胞單層，增殖本實驗室保存的痘苗病毒天壇株(參見中國專利95106219.0)并從中制備和純化病毒DNA。使用核酸內切酶HaeIII，EcoRI＋BamHI或EcoRI＋ClaI單酶或雙酶消化病毒DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳法分離和純化不同大小的DNA酶切片段。按照常規方法將這些片段在適當的位點(SmaI)處插入到攜帶氯霉素已酰轉移酶基因(CAT)、氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和病毒N2啟動子及其上游多克隆位點的質粒pKN2中。以電轉化法將所得到的重組質粒轉化到感受態JM103大腸桿菌中。將被轉化的細胞接種于含有高濃度氯霉素的LB-A瓊脂平皿上并于37℃下保溫過夜，以初步篩選能夠耐受200ug/ml以上氯霉素壓力的陽性菌株pKN-VV1-18。
將如此得到的18個陽性克隆及pKN2原始克隆按1∶100稀釋度進一步接種于含600-800μg/ml氯霉素的LB-A培養基上再次37℃培養12小時，以根據細菌生長能力大致估計這些菌株的CAT報道基因的表達水平，從而推測外源病毒DNA片段對CAT基因表達的增強作用。結果篩選出分別攜帶VV1、VV2、VV14、VV15、VV16、VV17和VV18片段的7個陽性克隆。含原始質粒pKN2的菌株只能耐受50-100μg/ml的氯霉素。因此可推測，這些病毒DNA片段(VV1，2，14，15，16，17和18)的插入使由之轉化的大腸桿菌宿主中氯霉素乙酰基轉移酶基因的表達水平提高了6-10倍。
為了進一步檢測這些初步確定具有轉錄增強子樣活性的DNA片段的方向不依賴性，分別將7個片段按反方向克隆到攜帶β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的質粒PAL(參見謝明等，中國科學(C輯)27179-185，1997)中，得到重組質粒pAL-VV(-).用此重組質粒轉化大腸桿菌JM109并培養陽性轉化體細胞。當培養物的OD600值達到0.5至0.7時，按已知方法定量檢測pAC中LacZ基因的表達水平。結果發現，pAL-VV1(-)和pAL-VV16(-)相對于pAL具有明顯升高的β-半乳糖苷酶活性。在同樣條件下，進一步驗證以正向插入片段后得到的重組質粒pAL-VV1(+)和pAL-VV16(+)的LacZ基因表達水平。結果可見，pAL-VV1(+)和pAL-VV1(-)分別使LacZ基因的表達水平提高了10.9倍和3.8倍；pAL-VV16(+)和pAL-VV16(-)分別使LacZ基因的表達水平提高了9.0倍和4.1倍(圖7)。
對如上篩選的病毒基因組片段的DNA序列測定和同源性比較結果顯示，這些片段與痘苗病毒基因組DNA具有95％以上的同源性。VV1片段長度為283bp并具有如圖5(SEQ ID NO3)中所示的核苷酸序列。該片段中含有兩個長為24bp的重復序列和3個富含AT區。VV16片段長度為112bp，并具有如圖6(SEQ ID NO4)中所示的核苷酸序列。該片段中含有4個富含AT區。
實施例5攜帶大腸桿菌增強子樣序列的pC20質粒的構建及其在表達人γ-干擾素中的應用為了構建攜帶大腸桿菌增強子樣序列的高效表達質粒pC20，首先用限制性內切酶Bgl II消化含有PRPL啟動子的質粒pBV220(由中國預防醫學科學院病毒學研究所張智清教授提供)并分離質粒DNA大片段。同時用BamH I從質粒pSK3Aa中切下原核增強子樣DNA 3A片段。經分離純化后，在T4 DNA連接酶作用下連接到pBV220大片段上。用連接反應混合物轉化大腸桿菌JM103宿主細胞后，挑選陽性克隆并經酶切鑒定和Southern印跡分析得到PL啟動子上游連接有本發現的3A片段，并且在PL啟動子下游具有多克隆位點(EcoR I、SmaI、BamH I、Sal I和Pst I)的高效表達質粒pC20。
用EcoR I消化按上述方法制備的質粒pC20，并用EcoR I從質粒pBV220-γ中切下編碼人γ-干擾素(IFN-γ)的cDNA片段。分離純化這些片段后，在T4 DNA連接酶作用下進行兩片段的連接，用連接反應混合物轉化大腸桿菌JM103宿主細胞。培養轉化細胞并經酶切鑒定和Southern印跡分析后，得到以正確方向插入了人IFN-γ基因的重組表達質粒pC20-γ。進一步的實驗結果表明，在同樣培養條件下，與對照質粒pBV220-γ轉化的細胞相比，用帶有原核增強子樣序列(3A片段)的重組表達載體轉化的大腸桿菌的IFN-γ表達水平為對照質粒的3倍(數據未示出)。
實施例6攜帶痘苗病毒增強子樣序列的pV20質粒的構建及其在表達人α2b-干擾素中的應用為了構建攜帶痘苗病毒增強子樣序列的高效表達質粒pV20，首先用限制性內切酶Bgl II消化含有PRPL啟動子的質粒pBV220(由中國預防醫學科學院病毒學研究所張智清教授提供)并分離質粒DNA大片段。同時用BamH I和EcoR I從質粒pGEM-7ZfVV中切下原核增強子樣DNA VV1片段。經分離純化并用Klenow酶補平末端后，在T4DNA連接酶作用下將該片段連接到pBV220大片段上。用連接反應混合物轉化大腸桿菌JM103宿主細胞后，挑選陽性克隆并經酶切鑒定和Southern印跡分析得到PL啟動子上游連接有本發現的VV1片段，并且在PL啟動子下游具有多克隆位點(EcoR I、Sma I、BamH I、Sal I和Pst I)的高效表達質粒pV20。
用EcoR I和Pst I雙酶消化按上述方法制備的質粒pV20，并用EcoR I/Pst I從質粒pBV220-α2b中切下編碼人α2b-干擾素(IFN-α2b)的cDNA片段。分離純化這些片段后，在T4 DNA連接酶作用下進行兩片段的連接，用連接反應混合物轉化大腸桿菌JM103宿主細胞。培養被轉化的細胞并經酶切鑒定和Southern印跡分析后，得到以正確方向插入了人IFN-α2b基因的重組表達質粒pV20-α2b。進一步的實驗結果表明，在同樣培養條件下，與對照質粒pBV220-α2b轉化的細胞相比，用帶有原核增強子樣序列(VV1片段)的重組表達載體轉化的大腸桿菌的IFN-α2b表達水平平均提高了2倍，即為對照質粒的3倍(數據未示出)。
序列表(1)一般信息(I)申請人中國預防醫學科學院病毒學研究所(II)發明名稱新的原核增強子樣核苷酸序列及其應用(III)序列數4(IV)通訊地址(A)聯系人吳淑華(B)街道宣武區迎新街100號(C)城市北京(D)國家中華人民共和國(E)郵編100052(V) 計算機可讀形式(A)介體類型3.5寸軟盤(B)計算機2BM Pentium III667(C)操作系統WIN.98(D)軟件WORD97(VI)電訊信息(A)電話86-10-63519134(B)傳真86-10-63532053(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度669bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO1
10 20 3040 50CCTCCACGCA TGTAATGTGC GATCCTTCCGTACCCGCAAG TTACTTCTCA60 70 8090100ACCAGCGCGA ACTGGACTCC TTGTACGGTCGCGTCAATCG AGAAGCTATA110120 130 140150CCGTAGTGGC GCTCTCCCTG TACTGGAAAAATGCCTGGTG CAAAGTGAAA160170 180 190200ATCGGCGTCG CCAAAGGTAA GAAACAGCACGATAAACGTT CAGATATCAA210220 230 240250AGAGCGCGAA TGGCAGGTGG ATAAAGCACGTATCATGAAA AACGCCCACC260270 280 290300GTTAAACCTG CACTCCAATT ATTGACCAGTTCCTCACCGC GCCTCCCTCT310320 330 340350CCGGCGGCGC GAATGAACAT CTTATTGGCTATCACATCCG ACACAAATGT360370 380 390400TGCCATCCCA TTGCTTAATC GAATAAAAATCAGGCTACAT GGGTGCTAAA410420 430 440450TCTTTAACGA TAACGCCATT GAGGCTGGTCATGGCGCTCA TAAATCTGGT460470 480 490500ATACTTACCT TTACACATTG GGGCTGATTCTGGATTCGAC GGGATTTGCG510520 530 540550AAACCCAAGG TGCATGCCGA GGGGCGGTTGGCCCGAACCA GAAGTGGGGC560570 580 590600AGGAGACATC ACGTACAATC GTACAGATGAAGGCTGGCTG TATCTGGCAG610620 630 640650TGGTCATTGA CATGTGGTCA CGTGCCGTTATTGGGGGCTT AATGTCGCCA660669CGCATGACGG CGCAACTGG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度451bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO210 20 30 40 50CCGTGTACTT AAATGTACTT TTGCTCCATC GCGATGACTT AGTAAAGCAC60 70 80 90 100ATCTAAAACT TTTAGCGTTA TAACGTAAAA AATCTTGCCA GCTTTCCCCT110 120 130 140 150TCTAAAGGGC AAAAGTGAGT ATGGTGCCTA TCTAACATCT CAATGGCTAA160 170 180 190 200GGGTCGAGCA AAGCCCGCTT ATTTTTTACA TGCCAATACA ATGTAGGCTG210 220 230 240 250CTCTACACCT AGCTTCTGGG CGAGTTTACG GGTTGTTAAA CCTTCGATTC260 270 280 290 300CGACCTCATT AAGCAGCTCT AATGCGCTGT TAATCACTTT ACTTTTATCT310 320 330 340 350AATCTAGACA TCATTAATTC CTAATTTTTG TTGACACTCT ATCATTGATA360 370 380 390 400GAGTTATTTT ACCACTCCCT ATCAGTGATA GAGAAAAGTG AAATGAATAG410 420 430 440 450TTCGACAAAG ATCGCATGTT AAATTACGTT ACTCGATGCC ATGGGGATTG(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度283bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO310 20 30 40 50CCCCACCTGG GCACACTGCT GTCTCCTGCG CAGTCGAGCA TCAATCAATA60 70 80 90 100CCCTCAGGTC CATTTCTTCT TATGACACCA AGCTGGGAGG GAGTTATGAC110 120 130 140 150ACCAAGCTGG GAGGGAGCGT TGATCTGCCA GAGGGGAGAA GGGCACTACA160 170 180 190 200GAGGGACCAG GATAGACTGG ATCGATTGGC CACTGTATGT ACTCCTACAC210 220 230 240 250CTACTGGTGG TACAGTATGT ACAACAGCAC AACCAAATCC AAATCCAGGA260 270 280GCAGCATCTC AACAAAATCT CGCCGATATG GGG2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度112bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO410 20 30 40 50AATTCCTCTG AAAATAAATC CAAAATAACT AGACATTCTA TTTTTTGTGG60 70 80 90100ATTAGTGTAC TCTCTTCCTT CTATCATGTT CACTACTGGT GTCCACGATG110ATAAATATCT AG
權利要求
1.具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是大腸桿菌來源的，并且具有如
圖1(SEQ IDNO1)所示的核苷酸序列。
2.具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是大腸桿菌來源的，并且具有如圖2(SEQ IDNO2)所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2的DNA片段，其中所說的大腸桿菌是大腸桿菌C600菌株。
4.具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是痘苗病毒來源的，并且具有如圖5(SEQ IDNO3)所示的核苷酸序列。
5.具有原核DNA轉錄增強子樣活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所說的片段是痘苗病毒來源的，并且具有如圖6(SEQ IDNO4)所示的核苷酸序列。
6.根據權利要求3或4的DNA片段，其中所說的痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。
7.根據權利要求1至6的中任何一項的具有原核DNA轉錄增強活性的DNA片段或其功能等同物在構建重組表達載體并提高外源基因表達產物的產率中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有原核DNA轉錄增強子活性的DNA片段,其篩選和克隆方法及其在制備重組表達載體中的應用。本發明的新的增強子樣序列明顯的改善了外源基因的轉錄速率,進而明顯地提高了外源目的基因表達產物的產率。
文檔編號C12N15/34GK1339586SQ0012359
公開日2002年3月13日 申請日期2000年8月25日 優先權日2000年8月25日
發明者吳淑華, 何建新, 秘曉林, 韓峰, 曹茹, 王艷, 候云德 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所