專利名稱：帶有人lgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子的制備方法及其制品的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，特別涉及帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子的制備方法及其制品的用途。
癌癥在全世界已成為僅次于的腦血管疾病的人類第二大殺手，是目前世界上最難征服的疾病之一。目前實體腫瘤臨床療法絕大部分是針對腫瘤細胞進行的，從根本上用抑制劑或阻斷劑來阻斷或抑制實體腫瘤血管再生及血液供應方面的療法卻很少，用帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin蛋白進行抗腫瘤血管再生治療在國內外尚未見報道。另外重組人的血管內皮細胞生成抑制因子大多是在大腸肝菌中表達，其表達量僅為15-20mg/升菌液，且可溶性差，生物活性低。
本發明的目的在于提供一種在酵母菌中高效表達的、可溶性的、無需復性、修飾及糖基化的、高活性帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子，用于抗腫瘤治療。
本發明方法步驟如下a.通過PCR方法從人胎兒腎臟細胞cDNA文庫中篩選得到人膠原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成兩種引物分別為CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎兒腎臟細胞cDNA庫為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個循環得到重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；b.將所得基因片段克隆入TA Vectohk質粒中，通過兩種內切酶酶切，經電泳純化得到576bp基因片段；c.然后再合成兩種引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎兒腎臟細胞cDNA庫為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個循環得到人IgG1Fc基因片段；d.將所得的基因片段克隆入TA Vectohk質粒中，通過兩種內切酶酶切，經電泳純化得到的729bp基因片段；e.將克隆得到的兩個基因片段用連接酶連接后再克隆入pPICZαA質粒的兩種內切酶位點中，構成PLW205基因載體；f.將得到的基因載體PLW205轉入X--33酵母菌中，構成基因工程菌株，用平板培養得到抗性菌株，經篩選得到高效表達的基因工程酵母菌株；g.經發酵誘導表達的菌液采用生物分離技術等手段純化得到帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子蛋白質；h.將純化得到的帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛腎上腺毛細血管內皮細胞培養液中，培養3天后通過細胞計數和細胞染色方法，測定抑制毛細血管內皮細胞增殖的活性。
上述得到的制品具有以下特性a.其基因載體為PLW205質粒，其質粒表達啟動子為醇氧化酶AOX1，替換酵母天然的醇氧化酶基因；b.PLW205內構建α-因子帶有分泌信號肽序列，目的蛋白分泌于細胞外；c.其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導型；d.其制品為可溶性、無需復性和修飾的具有生物活性的蛋白質。
帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin蛋白，其制品作為單制劑制備成生物制品用于抗腫瘤治療。
本發明與現有技術相比較具有如下優點(1)采用帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin的基因產物用于治療人實體腫瘤屬于同源性，而不易被人體所排斥，其效果優于用鼠重組Endsotatin蛋白。
(2)帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin基因是在酵母菌中表達，屬甲醇誘導型，表達量高達60-80mg/升菌液，其蛋白產物屬分泌型，為可溶性無需復性和修飾的高活性天然狀態蛋白質。
(3)帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin蛋白專一性抑制增殖的毛細血管內皮細胞，使腫瘤血管不能再生，導致腫瘤組織在沒有血管供給血液和營養物質的狀態下不斷的死亡和萎縮，而對人體其它細胞無抑制作用，實驗已證實了這種結論。
(4)與不帶人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮生成抑制因子Endostatin相比較可增加Endostatin半衰期，減少Endostatin用量的10倍，使其更具有藥理學、藥效學、藥代動力學等意義，對多種腫瘤具有治療作用。
圖1小鼠S180肉瘤對照組、治療組治療效果曲線圖。
實施例本發明的制備方法主要是經過基因克隆、酵母菌發酵、純化過程得到的制品，其步驟如下a.通過PCR方法從人胎兒腎臟細胞cDNA文庫中篩選而得到人膠原蛋白十八--human type XVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成兩種引物分別為CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以1微升人胎兒腎臟細胞cDNA為模板，加入上述兩種引物各2微升(濃度為每微升0.1微克)，加入5微升2.5MdNTP、5微升10×PCR緩沖液，各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR儀上94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共計30個循環，然后用15％瓊脂糖凝膠電泳分離得到重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin基因片段b.將上述所得基因片段克隆入TA Vectobk質粒中，通過xhol，BamHl兩種內切酶酶切，經電泳純化得到576bp基因片段c.然后再合成兩種引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR儀上94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共計30個循環，而得到人IgG1Fc基因片段；d.將上述所得基因片段克隆入TA Vectohk質粒中，通過BamHl，NotI兩種內切酶酶切，然后用15％瓊脂糖凝膠電泳分離得到729bp基因片段；e.將克隆得到的兩個基因片段用T4連接酶連接后形成一條新的基因片段，將該基因片段克隆入pPICZαA質粒兩個酶切位點中形成PLW205新的基因載體；f.將基因載體PLW205轉入X-33酵母菌中，使用YPD平板培養得到抗性菌株，經篩選得到高效表達的基因工程酵母菌株-LW205；g.經發酵誘導表達的菌液采用生物分離技術等手段純化而得到帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子蛋白質(蛋白質氨基酸序列及基因片段見附表一帶有人IgG1Fc片段分子結構的人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin基因，氨基酸全序列)。
h.采用牛腎上腺毛細血管內皮細胞(BCE)培養至24孔培養板上，細胞濃度為12500個細胞/孔，每孔加入1納克bFGF和不同濃度的帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin蛋白，培養3天后通過細胞計數和細胞染色方法來測定抑制毛細血管內皮細胞增殖的活性。
上述所得制品具有以下特性a.其基因載體為PLW205，其基因載體表達啟動子為醇氧化酶(AOX1)，替換酵母天然的醇氧化酶基因；b.PLW205基因載體內構建α-因子帶有分泌信號肽序列，可使目的蛋白分泌于細胞外；c.其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導型；d.其制品為可溶性的、無需復性和修飾的具有生物活性的蛋白質；將上述制品用于抗腫瘤血管生成治療，以動物實驗為例將小鼠皮下接種腫瘤細胞，使腫瘤長至100mm3左右時，將小鼠隨機分組，分別皮下注射高、中、低三種不同劑量的帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin蛋白及生理鹽水(對照組)，連續注射20天，實驗結果表明帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin對多種腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用，腫瘤組織明顯萎縮，與不帶人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin相比較可增加Endostatin半衰期，減少Endostatin用量的10倍使其更具有藥理學、藥效學、藥代動力學等意義，對多種腫瘤具有治療較明顯的效果。結果如下小鼠Lewis肺癌治療效果 帶有人IgG1Fc片段分子結構的人血管內皮細胞生成抑制因子Endostatin基因，氨基酸全序列 ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCT GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT CGT CCATAC TCT AAA GGA AGT TAA AAA TGA CGA CAA AAT AAG CGT CGT AGG AGG CGT AAT CGA CGA GGT Met Arg Pho Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala ProGTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCACAG TTG TGA TGT TGT CTT CTA CTT TGC CGT GTT TAA GGC CGA CTT CGA CAG TAG CCA ATG AGT Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp 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權利要求
1.一種帶有人IgG1Fc片段分子結構的重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin的制備方法是經過基因克隆、酵母菌發酵和純化過程制備而得，其步驟如下a.通過PCR方法從人胎兒腎臟細胞cDNA文庫中篩選得到人膠原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成兩種引物分別為CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎兒腎臟細胞cDNA庫為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個循環得到重組人血管內皮細胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；b.將新基因片段克隆入TA Vectohk質粒中，通過兩種內切酶酶切，經電泳純化得到的576bp基因片段；c.然后再合成兩種引物GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎兒腎臟細胞cDNA庫為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個循環得到的人IgG1Fc基因片段；d.將上述基因片段克隆入TA Vectohk質粒中，通過兩種內切酶酶切，經電泳純化得到的729bp基因片段；e.將克隆得到的兩個基因片段用連接酶連接后再克隆入pPICZαA質粒兩種內切酶位點中，構成PLW205基因載體；f.將上述基因載體PLW205轉入X--33酵母菌中，使用平板培養得到抗性菌株后，經篩選得到高效表達的基因工程酵母菌株-LW205；g.經發酵誘導表達的菌液采用生物分離技術等手段純化得到的帶有IgG1Fc重組人血管內皮細胞生成抑制因子Endostatin蛋白質；h.將純化得到的帶有IgG1Fc重組人血管內皮細胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛腎上腺毛細血管內皮細胞培養液中，培養3天后通過細胞計數和細胞染色方法，測定抑制毛細血管內皮細胞增殖的活性。
2.根據權利要求1所述得到的制品具有以下特性a.其基因載體為PLW205質粒，其質粒表達啟動子為醇氧化酶AOX1，替換酵母菌天然的醇氧化酶基因；b.PLW205質粒內構建α-因子帶有分泌信號肽序列，可使目的蛋白分泌于細胞外；c.其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導型；d.其制品為可溶性、無需復性和修飾的具有生物活性的蛋白質。
3.一種帶有人IgG1Fc分子結構片段的重組人血管內皮細胞生成抑制因子--Endostatin其制品作為單制劑制備成生物制品用于治療實體腫瘤。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域,涉及一種帶有人IgG
文檔編號C12N15/12GK1354186SQ0012334
公開日2002年6月19日 申請日期2000年11月30日 優先權日2000年11月30日
發明者陳林生, 李忠義, 劉秋江, 孫亦紅, 汪軍遠, 徐璐, 李寧 申請人:遼寧衛星生物制品研究所(有限公司)