等效競(jìng)爭(zhēng)多聚酶鏈反應(yīng)內(nèi)參照、制備方法及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：等效競(jìng)爭(zhēng)多聚酶鏈反應(yīng)內(nèi)參照、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地講是把一種病毒基因的一部分進(jìn)行突變，獲得的突變基因片段與擬檢測(cè)的目的片段等長(zhǎng)，以此充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)的內(nèi)參照，在PCR過(guò)程中內(nèi)參照與目的片段等效擴(kuò)增，可用于各種病毒基因的PCR定量檢測(cè)。PCR法是基因診斷技術(shù)中敏感度最高的一種方法，一開始用于定性檢測(cè)，后來(lái)擴(kuò)展到定量檢測(cè)。經(jīng)過(guò)多年的研究表明，采用PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，必須是競(jìng)爭(zhēng)PCR法，也就是說(shuō)必須設(shè)置內(nèi)參照，否則其定量結(jié)果不僅無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，而且很不精確。所以內(nèi)參照已成為PCR定量技術(shù)的關(guān)鍵成分。制備競(jìng)爭(zhēng)PCR內(nèi)參照(突變模板)應(yīng)注意的兩個(gè)最基本的問題是①最大限度地保證在PCR過(guò)程中突變模板與野生模板的等效擴(kuò)增；②簡(jiǎn)便而能精確地對(duì)產(chǎn)物中的突變片段和野生片段進(jìn)行鑒定分析。目前有文獻(xiàn)報(bào)告的最常用的方法有三種加長(zhǎng)法、截短法和加酶切位點(diǎn)法(DiviaccoS，NorioP，ZentilinL，etalGene1992；1223013，ClementiM，ManzoS，BagnareliP，etalPCRMethodsAppl1993；2191，WuJ，SullivanDEandGerberMAJVirolMethods1994；49331)。加長(zhǎng)和截短法所制備的突變模板，雖然在PCR產(chǎn)物分析時(shí)具有直觀、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但由于突變模板是在野生模板序列的基礎(chǔ)上加長(zhǎng)或縮短，和野生模板在長(zhǎng)度上的差異明顯，無(wú)法保證兩者擴(kuò)增效率的一致，影響競(jìng)爭(zhēng)PCR定量分析精確度；加酶切位點(diǎn)法所制備的內(nèi)參照與目的片段等長(zhǎng)，可以保證兩者等效擴(kuò)增，但該方法有兩個(gè)缺陷第一，選擇或增加合適的酶切位點(diǎn)有較高的難度，實(shí)際應(yīng)用時(shí)受到一定限制；第二，如不能保證對(duì)內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物的完全酶切，則會(huì)降低產(chǎn)物分析的精確度。1993年，Jalava等報(bào)告，把用于擴(kuò)增目的片段的上下游引物的互補(bǔ)序列分別加在一段異源DNA片段的兩側(cè)，再用這對(duì)引物作PCR后，亦得到與野生模板等長(zhǎng)的突變片段(JalavaT，LehtovaaraP，KallioABioTechniques1993；1134)。該方法仍有不足制備方法繁瑣；所選擇的異源片段序列的G+C含量與目的基因片段比較，不可避免地有一定差異，因而也可導(dǎo)致兩種片段擴(kuò)增效率的差別。有人采用化學(xué)合成法制備100bp左右、與野生片段等長(zhǎng)的突變內(nèi)參照(GerlichWH，HeermannKH，ThomssenRViralHepRev1995；153)，并引入產(chǎn)物雜交定量分析，比前述方法均有重大進(jìn)步，但目前人工合成100nt長(zhǎng)的寡核苷酸在技術(shù)上仍存在較大困難，僅為數(shù)甚少的實(shí)驗(yàn)室可以為之，況且由于產(chǎn)量很低而成本太高。另外，必須合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸，并經(jīng)過(guò)雜交成為雙鏈DNA后才可用作內(nèi)參照，不僅費(fèi)用更高，而且制備過(guò)程復(fù)雜。為此，本發(fā)明的目的是提供一種等效競(jìng)爭(zhēng)PCR內(nèi)參照，它是一種突變片段。本發(fā)明的另一目的是提供該內(nèi)參照的制備方法，是通過(guò)用突變引物和目的基因的下游引物，進(jìn)行PCR制得。本發(fā)明的又一目的是提供該內(nèi)參照的應(yīng)用，用于病毒基因的定量檢測(cè)。一、本發(fā)明提供一種在競(jìng)爭(zhēng)PCR中能與目的基因等效擴(kuò)增的內(nèi)參照，它是一種與目的片段長(zhǎng)度相等且A、C、T、G含量相同的突變片段，在第21-70位是突變部分，除突變部分的堿基序列與目的片段不同外，其余部位都與目的片段相同。二、本發(fā)明提供等效競(jìng)爭(zhēng)PCR內(nèi)參照的制備方法，它包括下列步驟1、突變引物的設(shè)計(jì)選擇擬定量檢測(cè)的病原體的保守區(qū)域序列作為目的基因，并根據(jù)目的基因的序列及其在基因組中的位置設(shè)計(jì)突變引物。突變引物由三個(gè)部分組成，即PCR上游引物序列，突變序列和連接序列。突變引物長(zhǎng)40-80個(gè)堿基。突變序列在第21-70位堿基，突變形式是隨機(jī)地改變突變部分的堿基順序，但堿基A、C、T、G的絕對(duì)數(shù)目不變，突變序列長(zhǎng)度為10-50個(gè)堿基，突變序列的Tm值，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體的能量值，均與原目的基因序列相同。2、突變片段的制備通過(guò)用突變引物和目的基因的下游引物，以目的基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR所得產(chǎn)物突變片段即是內(nèi)參照。這個(gè)突變片段與擬檢測(cè)的目的片段(或稱野生片段)的差別就在于第21-70位堿基序列，其它部位尤其是兩端的引物結(jié)合區(qū)完全相同，從而可以保證在作競(jìng)爭(zhēng)PCR時(shí)兩種片段的擴(kuò)增效率完全一致。3、突變片段的克隆與鑒定a、克隆克隆的目的有二第一，將突變片段插入一定的載體，得到含突變片段的質(zhì)粒，從而可以在大腸桿菌內(nèi)大量復(fù)制，成為內(nèi)參照的原料來(lái)源；第二，含突變片段的質(zhì)粒系環(huán)狀，且大小與待檢測(cè)的病毒基因組相似，因而更符合內(nèi)參照的要求，克隆方法是采用PCR產(chǎn)物TA克隆法，即應(yīng)用PCR克隆試劑盒，將新擴(kuò)增的突變片段直接克隆至載體中。挑選的陽(yáng)性克隆作進(jìn)一步鑒定。b、鑒定目的是證實(shí)突變片段是否已成功地插入了載體，同時(shí)還要證實(shí)突變序列的堿基序列是否與設(shè)計(jì)要求一致。方法如下(1)PCR法另合成了一根引物，其序列與突變引物的第1-20位堿基相同，將其與下游引物一起，對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA行PCR，擴(kuò)增陽(yáng)性者再作進(jìn)一步鑒定。(2)DNA序列分析取PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的質(zhì)粒DNA，對(duì)克隆片段作序列分析。保留序列正確的克隆。三、本發(fā)明等效競(jìng)爭(zhēng)PCR內(nèi)參照應(yīng)用于定量檢測(cè)病毒基因利用本發(fā)明所制備的內(nèi)參照，建立了競(jìng)爭(zhēng)PCR及其產(chǎn)物酶聯(lián)雜交技術(shù)，以定量檢測(cè)病毒基因。檢測(cè)包括兩個(gè)部分第一，競(jìng)爭(zhēng)PCR，在同一反應(yīng)管內(nèi)含有待測(cè)目的基因和內(nèi)參照，進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)；第二，酶聯(lián)雜交，以一種微孔反應(yīng)板作為固相載體，進(jìn)行酶聯(lián)雜交反應(yīng)。該檢測(cè)可以達(dá)到三個(gè)目的①區(qū)分?jǐn)U增后的野生片段和內(nèi)參照片段；②分別對(duì)上述兩種片段定量；③進(jìn)一步提高基因檢測(cè)的精確度和靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與常用的加長(zhǎng)法、截短法及加酶切位點(diǎn)法制備競(jìng)爭(zhēng)PCR內(nèi)參照技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)第一，制備方法的優(yōu)勢(shì)在目的片段上選擇理想的擴(kuò)增區(qū)域，并設(shè)計(jì)合適的突變引物，將突變引物與另一根配對(duì)引物及目的基因一起作一輪PCR即可獲得突變片段，與目前所有報(bào)道方法相比，這種方法最簡(jiǎn)單、方便、易行。第二，完全等效擴(kuò)增突變片段的長(zhǎng)度和A、T、C、G組成均與野生片段完全相同，因此可以保證兩種模板在PCR過(guò)程中等效擴(kuò)增，提高了定量分析的精確度。第三，為競(jìng)爭(zhēng)PCR產(chǎn)物的雜交檢測(cè)提供了最佳條件突變片段的第21-70位突變后的突變序列，是突變片段特異的雜交位點(diǎn)，而且這個(gè)雜交位點(diǎn)的所有雜交參數(shù)均與擬擴(kuò)增的目的片段的相應(yīng)部分相同，因此可在此基礎(chǔ)上建立競(jìng)爭(zhēng)PCR產(chǎn)物的酶聯(lián)雜交定量分析方法。與人工化學(xué)合成等長(zhǎng)DNA內(nèi)參照相比，在應(yīng)用原理方面有相同的特點(diǎn)，即既能保證與野生片段等效擴(kuò)增，又可在雜交檢測(cè)過(guò)程中與野生片段區(qū)分，但在制備方法上則比之更簡(jiǎn)單、易行和經(jīng)濟(jì)，任何一個(gè)具有最基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室均能實(shí)施。以下以HBV基因?yàn)槟康幕驗(yàn)槔Y(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。圖1．突變引物的結(jié)構(gòu)示意圖上行HBV基因第2278-2333位序列，其中第2299-2318位(黑線框內(nèi))為擬突變區(qū)域下行突變引物序列，長(zhǎng)度為56nt，紅線框內(nèi)為突變序列圖2．突變片段制備過(guò)程示意圖1．PCR反應(yīng)管內(nèi)加入突變引物、下游引物、野生模板等；2．雙鏈模板變性解鏈后突變引物和下游引物退火、延伸；3．第1個(gè)PCR循環(huán)后形成2個(gè)新的片段，一個(gè)為突變片段，另一個(gè)為野生片段；4．進(jìn)入第2個(gè)PCR循環(huán)；5．第2個(gè)PCR循環(huán)后形成3個(gè)突變片段和1個(gè)野生片段；6．經(jīng)過(guò)30～40個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物呈指數(shù)級(jí)放大，突變片段占絕大多數(shù)，極少量為野生片段(可忽略)。圖3．突變片段MS299與TA克隆載體pCR2．1重組示意圖實(shí)施例1．用突變引物制備突變片段(內(nèi)參照)一、突變引物的設(shè)計(jì)與合成HBV基因組的S基因系保守區(qū)，故在該區(qū)選擇待擴(kuò)增片段。采用電子計(jì)算機(jī)核酸序列分析軟件HYBsimulatorVersion4．0(購(gòu)自美國(guó)ACGT公司)進(jìn)行設(shè)計(jì)。要求待擴(kuò)增片段(野生片段)滿足以下條件①長(zhǎng)度為100-500bp；②第1-20位堿基和第21-40位堿基序列分別嚴(yán)格地符合引物和探針設(shè)計(jì)要求(包括Tm值、G+C含量、重復(fù)堿基數(shù)、形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體的能量值等等)；③第41-56位堿基較嚴(yán)格地符合引物設(shè)計(jì)條件。擬擴(kuò)增片段選定以后，分別列出第21-40位4種堿基(A、T、C、G)的數(shù)目，按每種堿基的絕對(duì)數(shù)隨機(jī)組合成多個(gè)20nt的寡核苷酸序列，把這些序列輸入電子計(jì)算機(jī)，用核酸序列分析軟件進(jìn)行分析，選出一至數(shù)個(gè)序列(稱之為突變序列)，其Tm值、形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體的能量值，均與野生片段第21-40位堿基序列相等或非常接近。取第1-56位野生片段序列，將其中的第21-40位堿基序列置換為突變序列(這段突變序列就是PCR產(chǎn)物雜交時(shí)的雜交位點(diǎn))即構(gòu)成突變引物。用這個(gè)引物與另一條下游引物去擴(kuò)增HBV基因組，就可以得到本發(fā)明需要的突變片段，用作內(nèi)參照。針對(duì)HBV基因S區(qū)設(shè)計(jì)的的突變引物(Pm)序列(56nt)包含了三個(gè)部分(圖1)第一部分(20nt)與競(jìng)爭(zhēng)PCR上游引物序列相同，位于5′端；第二部分為突變序列(20nt)，位于中間；第三部分為連接引物(16nt)，位于3′端，與待擴(kuò)增片段負(fù)鏈的第41-56位堿基互補(bǔ)。依靠這段起連接作用的引物，才有可能使突變引物與HBV基因退火，完成PCR的過(guò)程，得到突變片段，見圖2。二、制備突變片段(一)主要材料1．乙型肝炎病毒(adr型)質(zhì)粒DNA由adr型HBV全基因經(jīng)BamHI酶切后克隆至pBR322載體。質(zhì)粒由第二軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)教研室胡為江博士惠贈(zèng)。2．突變引物(Pm，56nt)由上海生工工程公司合成并用PAGE法純化，序列見圖1。3．常規(guī)PCR擴(kuò)增引物上游引物(Pu，20nt)序列5′-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAC-3′；下游引物(Pd，22nt)序列如下5′-GCCCCCAATACCACATCATC-3′。4．PCR緩沖液、Taq酶及底物等均為常規(guī)試劑，購(gòu)自上海華美生物工程公司和上海生工工程公司。(二)PCR擴(kuò)增突變片段取一只0．2ml薄壁PCR反應(yīng)管，按下述配方加樣成份加樣量(μl)10×緩沖液515mmol／LMgCl25dNTP混合液(各10mmol／L)2Pm(25μmol／L)1Pd(25μmol／L)1HBVDNA質(zhì)粒(μg/L)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1雙蒸餾水34PCR擴(kuò)增參數(shù)94℃5分鐘；94℃1分鐘、55℃30秒鐘、72℃30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。(三)PCR產(chǎn)物分析采用瓊脂糖凝膠電泳法將PCR產(chǎn)物上樣于1．5％瓊脂糖凝膠，電泳后溴化乙錠染色，紫外光下觀察，擴(kuò)增所得片段長(zhǎng)度為300bp左右，且無(wú)其他雜帶，與推測(cè)的結(jié)果一致，即初步確認(rèn)為突變片段，可進(jìn)行克隆。三、PCR產(chǎn)物(突變片段)的克隆與鑒定(一)克隆1．主要材料①TA克隆載體pCR2．1載體，25ng／μl；T4DNA連接酶(4．0Weiss單位／μl)及緩沖液(購(gòu)自COLONTECH公司)，②大腸桿菌DH5α株(本實(shí)驗(yàn)室保存)。2．操作過(guò)程如下(1)在0．5mlEppendorf管中依次加入新鮮PCR突變片段產(chǎn)物3μl10×連接緩沖液1μlPCR2．1載體1μl雙蒸水4μlT4DNA連接酶1μ總量10μl，混勻，置反應(yīng)管于14℃過(guò)夜；(2)按常規(guī)制備DH5α鈣化菌；(3)將連接物加入100μl鈣化菌中，4℃放置1小時(shí)，42℃水浴90秒；(4)加入LB培養(yǎng)基400μl，37℃恒溫?fù)u床緩慢振搖1小時(shí)；(5)離心，4000rpm，3分鐘。吸取上清，留存液約50μl，加20μlIPTG(100mmol／L)，5μlX-Gal(40mg／ml)，輕輕吸打管底，使細(xì)菌充分懸??；(6)將菌液涂布于含氨芐青霉素(50μg／ml)的固體LB-瓊脂培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)過(guò)夜；(7)挑取白色菌落，接種于含100μg／ml氨芐青霉素的5mlLB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫箱中，振搖(250轉(zhuǎn)／分)；(8)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)后期收集細(xì)菌，用分離柱提取和純化質(zhì)粒DNA；(9)分別用EcoRⅠ單酶切及BamHⅠ加XbaⅠ雙酶切，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以初步篩選陽(yáng)性克隆。內(nèi)參照片段插入載體的示意圖見圖3(二)鑒定陽(yáng)性克隆用PCR初步鑒定并進(jìn)一步作序列分析。1．PCR反應(yīng)體系配方成份加樣量(μl)10×緩沖液515mmol／LMgCl25dNTP混合液(各10mmol／L)2Pu(25μmol／L)1Pd(25μmol／L)1陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(μg／l)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1雙蒸餾水34PCR擴(kuò)增參數(shù)94℃5分鐘；94℃1分鐘、56℃30秒鐘、72℃30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物上樣于2％瓊脂糖凝膠，電泳并用溴化乙錠染色后確認(rèn)擴(kuò)增片段為300bp左右，留待進(jìn)一步鑒定。2．序列分析自動(dòng)測(cè)序法，測(cè)得擴(kuò)增產(chǎn)物位于HBVS基因區(qū)第2278-2576位，片段長(zhǎng)299bp。留存讀序正確的克隆，將其中一株命名為PCR2．1-MS299。四、重組質(zhì)粒PCR2．1-MS299的擴(kuò)增、純化和定量取重組質(zhì)粒PCR2．1-MS299再次轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，以大量擴(kuò)增該質(zhì)粒，用質(zhì)粒DNA分離柱(購(gòu)自上海華舜生物工程公司，按說(shuō)明書操作)純化后再用酚-氯仿抽提一次(常規(guī)方法)。純化品分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法定量。實(shí)施例2．競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)一、引物設(shè)計(jì)與合成上游引物序列為Pu，下游引物的序列為Pd(同實(shí)施例1)，但在5′端用生物素修飾，命名為Pb。引物合成與修飾由上海生工生物工程公司提供服務(wù)。二、制備HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品(一)HBVDNA質(zhì)粒擴(kuò)增和純化在本實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增，采用柱分離加酚氯仿抽提法純化。(二)質(zhì)粒鑒定和定量采用瓊脂糖凝膠電泳與定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比法及紫外分光光度計(jì)法。三、競(jìng)爭(zhēng)PCR取10只0．2ml薄壁PCR反應(yīng)管，首先按下述配方加樣成分加樣量(μl)10×緩沖液515mmol／LMgCl25DNTP混合液(各10mmol／L)2Pu(25μmol／L)1Pb(25μmol／L)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1雙蒸餾水33然后加入pADR-1DNA和PCR2．1-MS299各1μl，加樣量如下表(表1)表1．10支反應(yīng)管內(nèi)pADR-1DNA和PCR2．1-MS299的加樣量<tablesid="table1"num="001"><table>管號(hào)12345678910pADR-1DNA(fM／管)PCR2．1-MS299(fM／管)10-310-310-310-410-310-510-410-310-410-410-410-510-510-310-510-410-510-500</table></tables>PCR擴(kuò)增條件94℃5分鐘；94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒，共35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)存在目的條帶，再行產(chǎn)物雜交鑒定和定量。實(shí)施例3．酶聯(lián)雜交法檢測(cè)HBV基因競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一、主要材料(一)微量條排DNA雜交反應(yīng)板CoyningCostar公司生產(chǎn)。(二)鏈親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物(Say-Ap)及底物對(duì)-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)分別為Gibco公司和Merck公司產(chǎn)品。(三)探針設(shè)計(jì)與合成1．野生片段捕獲探針(CPw)5’-端用氨基修飾。該探針與野生片段(檢測(cè)HBV基因的目的片段)第21-40位堿基互補(bǔ)，序列如下5’-amine-TGAGACTAACCTCCGATTGA-3’。2．突變片段捕獲探針(CPm)5’-端用氨基修飾，該探針與突變片段(內(nèi)參照)正鏈突變序列的(第21-40位堿基)20個(gè)堿基互補(bǔ)，序列如下5’-amine-ACGTACTGAATAGCTGCTAC-3’。(四)緩沖液及配方1．結(jié)合緩沖液(Bb)50mmol／LNa2HPO4，1mmol／LEDTA，0．02％NaN3，pH8．52．20×SSC3mol／LNaCl，0．3mol／L枸緣酸鈉。3．封閉液結(jié)合緩沖液中含3％BSA，0．1mg／ml鮭魚精DNA，0．02％NaN3。4．2×雜交緩沖液10×SSC，0．2％N-lauroylsarcosine，0．1mg／ml鮭魚精DNA，0．05％NaN3，2．0％BSA，0．04％SDS。5．馬來(lái)酸鹽緩沖液0．1mol／L順丁烯二酸，0．15mol／LNaCl，pH7．5。6．Sav-Ap緩沖液馬來(lái)酸鹽緩沖液中含3％BSA，0．05％吐溫-20，0．02％NaN3。7．洗滌液Ⅰ2×SSC，含0．1％SDS。8．洗滌液Ⅱ馬來(lái)酸鹽緩沖液中含0．05％吐溫-20。9．AP底物(pNPP)緩沖液30mmol／L三乙醇胺，lmmol／LMgCl2。二、微反應(yīng)板酶聯(lián)雜交定量(一)包被用結(jié)合緩沖液(Bb)分別稀釋捕獲探針CPw和CPm，濃度為500nmol／L，取兩份DNA微量條排反應(yīng)板，分別加入稀釋后的CPw和CPm，每孔100μl，封孔后置37℃水浴箱，1hr，或4℃過(guò)夜。(二)封閉棄去孔內(nèi)包被物，每孔加200μl封閉液，置37℃水浴箱，30min，棄封閉液，拍干。(三)雜交將PCR產(chǎn)物用蒸餾水作10倍稀釋，100℃解鏈5min后立即置冰??；加等體積2倍雜交液后取50μl加入雜交孔內(nèi)，置反應(yīng)板于56℃水浴箱，30min；用洗液Ⅰ洗三次，每次56℃，5min，棄液拍干。(四)信號(hào)檢測(cè)每孔加50μl1∶1000稀釋的Sav-AP復(fù)合物；室溫下放置20min，甩干，用洗液Ⅱ洗四次，每次37℃，3min；拍干后用pNPP底物顯色；讀取405nmOD值。三、競(jìng)爭(zhēng)PCR及產(chǎn)物酶聯(lián)雜交定量檢測(cè)的結(jié)果表2顯示不同濃度內(nèi)參照模板和野生模板在九種不同組合時(shí)的PCR產(chǎn)物用酶聯(lián)雜交檢測(cè)的結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)參照的量和質(zhì)粒HBVDNA量相同時(shí)，ODm和ODw(ODm和ODw分別代表捕獲探針CPm和CPw包被孔所測(cè)的OD值)的比值非常接近于1．0，與期望值相符。表2．內(nèi)參照和野生模板不同濃度組合后PCR產(chǎn)物酶聯(lián)雜交檢測(cè)結(jié)果<tablesid="table2"num="002"><table>管號(hào)12345678910pADR-1DNA(fm／管)PCR2．1-MS299(fm／管)10-310-310-310-410-310-510-410-310-410-410-410-510-510-310-510-410-510-500ODm值ODw值ODm／ODw比值1．982．000．991．990．573．492．330．2111．100．462．110．221．661．601．041．720．295．930．542．140．250．661．690．391．671．591．050．030．04-</table></tables>四、HBV基因初始量的確定方法(公式法)按Clementi等(ClementiMetal．，PCRMethodsAppl1993；2191)介紹的競(jìng)爭(zhēng)PCR產(chǎn)物量計(jì)算公式M／W=M′／W′(1)。公式中M和W分別代表突變模板(即內(nèi)參照)和野生模板的初始量，M′和W′則分別為PCR產(chǎn)物中突變片段和目的基因片段量。公式(1)可改寫為M／W=ODm／ODw(2)。等式(2)中，W是未知數(shù)，M是已知數(shù)，ODm值，即PCR產(chǎn)物在CPm探針包被孔雜交后的OD值，ODw是CPm探針包被孔雜交后的OD值。由于酶聯(lián)反應(yīng)后所得OD值不與產(chǎn)物加樣量呈直線比例關(guān)系，只有在內(nèi)參照和質(zhì)粒HBVDNA初始量比較接近時(shí)，上述公式才成立，因此可通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，或每分析一份待測(cè)標(biāo)本使用3個(gè)以上內(nèi)參照濃度管，從而比較精確地求得待測(cè)標(biāo)本中HBVDNA含量。實(shí)施例4．競(jìng)爭(zhēng)PCR及其產(chǎn)物酶聯(lián)雜交定量檢測(cè)血清中HBVDNA一、主要材料(一)血清標(biāo)本共收集了30份HBsAg、HBeAg、抗HBcAg均陽(yáng)性(即所謂“大三陽(yáng)”)的血清標(biāo)本，均來(lái)自慢性乙型肝炎患者。上述所有標(biāo)本均PCR定性技術(shù)檢測(cè)證實(shí)乙型肝炎病毒基因(HBVDNA)陽(yáng)性。(二)PCR及酶聯(lián)雜交用材料見實(shí)施例2、3。二、血清標(biāo)本處理及擴(kuò)增反應(yīng)管的準(zhǔn)備采用血清直接煮沸法，即將100μl置于0．5mlEppendorf管內(nèi)，100℃煮沸5分鐘，吸取5μl上清用作PCR模板。每份標(biāo)本均設(shè)置3個(gè)擴(kuò)增管，3管中所含內(nèi)參照分別為10-5、10-3、10-1fmol／管，其他PCR試劑按常規(guī)加樣，反應(yīng)體積為50μl。三、擴(kuò)增條件PCR擴(kuò)增條件94℃5分鐘；94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒，共32個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)存在目的條帶，再行產(chǎn)物雜交定量。四、微反應(yīng)板酶聯(lián)雜交方法見實(shí)施例3。五、定量檢測(cè)結(jié)果30份標(biāo)本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析均見分子量在300bp左右得陽(yáng)性條帶。取2μl作酶聯(lián)雜交檢測(cè)，并按照前述公式計(jì)算血清標(biāo)本擴(kuò)增前HBVDNA含量。結(jié)果，30例乙型肝炎患者血清HBVDNA含量分布高低不等，最高者達(dá)3×108拷貝／ml，最低者4×103拷貝／ml。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的內(nèi)參照可用于競(jìng)爭(zhēng)PCR及酶聯(lián)雜交定量檢測(cè)HBV基因，并有臨床應(yīng)用價(jià)值。權(quán)利要求1.一種等效競(jìng)爭(zhēng)多聚酶鏈反應(yīng)內(nèi)參照，其特征在于是一種與目的片段長(zhǎng)度相等且各堿基含量相同的突變片段，在第21-70位是突變序列，除突變部分的堿基序列與目的片段不同外，其余部位都與目的片段相同。2.權(quán)利要求1所述等效競(jìng)爭(zhēng)多聚酶鏈反應(yīng)內(nèi)參照的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)選擇目的基因的保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)突變引物；(2)通過(guò)用突變引物和目的基因的下游引物，以目的基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR，所得產(chǎn)物即是內(nèi)參照。3.如權(quán)利要求2所述內(nèi)參照的制備方法，其特征在于根據(jù)目的基因保守區(qū)片段的序列及其在基因組中的位置設(shè)計(jì)突變引物。4.如權(quán)利要求2或3所述內(nèi)參照的制備方法，其特征在于所述突變引物由三個(gè)部分組成PCR上游引物序列、突變序列和連接序列。5.如權(quán)利要求2或3所述內(nèi)參照的制備方法，其特征在于所述突變引物長(zhǎng)40-80個(gè)堿基，突變序列在第21-70位堿基，隨機(jī)地改變突變部分的堿基順序，但各堿基的絕對(duì)數(shù)不變，突變序列的Tm值，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體的能量值，均與原目的基因序列相同。6.如權(quán)利要求4所述內(nèi)參照的制備方法，其特征在于所述突變序列長(zhǎng)度為10-50個(gè)堿基。7.權(quán)利要求1所述等效競(jìng)爭(zhēng)多酶鏈內(nèi)參照的應(yīng)用，其特征在于所述內(nèi)參照用于等效競(jìng)爭(zhēng)PCR及PCR產(chǎn)物酶聯(lián)雜交定量檢測(cè)病毒基因。8.如權(quán)利要求7所述內(nèi)參照的應(yīng)用，其特征在于所述PCR產(chǎn)物酶聯(lián)雜交定量檢測(cè)時(shí)是以突變序列為雜交位點(diǎn)。全文摘要在競(jìng)爭(zhēng)PCR中能與目的基因等效擴(kuò)增的內(nèi)參照,是一種與目的片段長(zhǎng)度相等且各堿基含量相同的突變片段,在第21—70位是突變部分。通過(guò)用突變引物和目的基因的下游引物進(jìn)行PCR獲得的突變片段,即是內(nèi)參照,可應(yīng)用于等效競(jìng)爭(zhēng)PCR及PCR產(chǎn)物酶鏈雜交定量檢測(cè)病毒基因。由于突變片段的長(zhǎng)度和堿基含量與目的片段相同,因此保證兩種模板在PCR過(guò)程中等效擴(kuò)增,提高了定量分析的精確度,且內(nèi)參照的制備方法簡(jiǎn)單、易行和經(jīng)濟(jì)。文檔編號(hào)C12Q1/04GK1281052SQ0011706公開日2001年1月24日申請(qǐng)日期2000年7月7日優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日發(fā)明者繆曉輝,徐文勝,潘怡,孔憲濤,戚中田申請(qǐng)人:上海長(zhǎng)征醫(yī)院