專(zhuān)利名稱(chēng)：殺寄生蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌菌株ybt－1532及其殺蟲(chóng)晶體蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物殺蟲(chóng)農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌菌株的選育及其殺蟲(chóng)晶體蛋白的開(kāi)發(fā)。其國(guó)際專(zhuān)利分類(lèi)號(hào)為A0N63/00。
植物寄生線蟲(chóng)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲(chóng)之一。它們危害蔬菜、玉米、棉花、煙草和水稻等經(jīng)濟(jì)作物，可造成與昆蟲(chóng)相等的經(jīng)濟(jì)損失?；瘜W(xué)殺線蟲(chóng)劑的防治雖有一定作用，但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境以及對(duì)土壤的污染和對(duì)昆蟲(chóng)天敵的影響是巨大的，因此開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥防治線蟲(chóng)是當(dāng)前農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)綜合治理上急待解決的問(wèn)題。
捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、絲蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)是畜患、人類(lèi)、或人畜共患的寄生蟲(chóng)，化學(xué)藥物的防治往往有較強(qiáng)的毒副作用，而且經(jīng)常使用也容易使病原體產(chǎn)生抗藥性。
生物殺蟲(chóng)劑具有不污染環(huán)境、對(duì)人畜安全、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性和生產(chǎn)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)劑是目前最重要的生物殺蟲(chóng)劑。
自1988年以來(lái)，美國(guó)Mycogen公司分離到一些對(duì)動(dòng)物和植物寄生線蟲(chóng)有毒的蘇云金芽胞桿菌，作用對(duì)象包括對(duì)短體線蟲(chóng)、秀麗新桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)、原蟲(chóng)、絲蟲(chóng)，為血清型H4、H7、H3ab等，未發(fā)現(xiàn)對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)(世界上危害作物最嚴(yán)重的植物寄生線蟲(chóng))以及捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的毒力(http//www.patents.ibm.com；Feitelson等，Bio/Technology 10271-275，1992.)。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，選育對(duì)植物和動(dòng)物有特異性毒力的蘇云金芽胞桿菌菌株及其殺蟲(chóng)晶體蛋白。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的菌株，其特征在于，所述的菌株為YBT-1532(一種蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，CCTCC，NO.M94068保藏日期1994年11月4日)，它包括a.鞭毛抗原血清型為H10；b.該菌株產(chǎn)生菱形伴胞晶體；c.組成伴胞晶體的殺蟲(chóng)晶體蛋白分子量為130kDa；d.該晶體蛋白的N-末端氨基酸序列為Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
一種殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1532(一種蘇云金芽胞桿菌，CCTCC No.M94068，保藏日期1994年11月4日)，該菌株的殺蟲(chóng)晶體包括以下特征a.對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有毒殺作用；b.對(duì)動(dòng)物寄生蟲(chóng)有毒殺作用。
本發(fā)明的菌株YBT-1532對(duì)植物根結(jié)線蟲(chóng)具高毒力，屬H10，即血清型具特異性，其產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白與國(guó)外報(bào)道的不同，作用對(duì)象也不同下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述
一、蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1532的分離篩選采用醋酸鹽選擇培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)BPA培養(yǎng)基)，從土壤中分離，并以小菜蛾幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定，篩選獲得本發(fā)明菌株。
1.BPA培養(yǎng)基配方牛肉膏5克，蛋白胨10克，醋酸鈉34克，蒸餾水1000毫升，pH值7.2-7.4。
2.分離稱(chēng)取1克土壤樣品于BPA培養(yǎng)基中，充分振蕩后，置30℃搖床培養(yǎng)4小時(shí)，取出于75-80℃水浴熱處理10-15分鐘，稍靜置后，吸0.5毫升置于BPA平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑選3-5個(gè)類(lèi)似蘇云金芽胞桿菌的菌落接種到BPA斜面上，30℃培養(yǎng)72小時(shí)以上，石炭酸復(fù)紅染色鏡檢，將有伴胞晶體的分離體確定為蘇云金芽胞桿菌。
3.菌種培養(yǎng)、傳代和保藏在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0.5％蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，pH 7.2)斜面(18×180mm)上于30℃培養(yǎng)，可于4℃短期保藏，以冷凍管，或砂土管長(zhǎng)期保藏，作為原始菌種。生產(chǎn)菌種需從原始菌種中轉(zhuǎn)接，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上。
4.菌株YBT-1532的生物學(xué)及遺傳學(xué)特性①生物學(xué)特性菌體直桿狀，營(yíng)養(yǎng)體呈鏈狀或單生，長(zhǎng)3-5微米，寬1-1.2微米，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽胞呈圓柱狀或近橢圓，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣平滑，菌苔豐滿呈蠟質(zhì)狀，生長(zhǎng)溫度10-45℃，最適pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7％NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在核糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)酸，甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，芽胞生長(zhǎng)后期產(chǎn)生伴胞晶體，伴胞晶體呈菱形，大小不一。
②遺傳學(xué)特性蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1532為本申請(qǐng)人分離的特異性菌株，鞭毛抗原血清型為H10，伴胞晶體菱形，伴胞晶體蛋白為130kDa，其N(xiāo)-末端氨基酸序列為Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
二、毒力測(cè)定(本發(fā)明的效果)1.樣品制備將蘇云金芽胞桿菌分離體接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)72小時(shí)以上，加10ml無(wú)菌水洗下菌苔，打碎成均勻菌懸液作為原液。提純伴胞晶體，用堿溶解伴胞晶體得到殺蟲(chóng)晶體蛋白。2.對(duì)寄生線蟲(chóng)的毒力將毒素蛋白喂食線蟲(chóng)，測(cè)定對(duì)北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)(2齡幼蟲(chóng))、南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)(2齡幼蟲(chóng))、甘薯莖線蟲(chóng)(成幼蟲(chóng)混合)、短體線蟲(chóng)(Pratylenchus spp.)和苧麻短體線蟲(chóng)(成幼蟲(chóng)混合)等植物寄生線蟲(chóng)的毒力LC50分別為66.5μg/ml，70.6μg/ml，183.2μg/ml和134.7μg/ml；對(duì)動(dòng)物寄生蟲(chóng)有毒殺作用，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchus contortus)(2期幼蟲(chóng))的LC50為31.5μg/ml；0.11mg/ml殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)馬來(lái)絲蟲(chóng)具95％殺蟲(chóng)率；對(duì)感染伯氏瘧原蟲(chóng)的小鼠可延長(zhǎng)6天壽命；對(duì)日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)童蟲(chóng)的致死率在0.49μg/ml和0.98μg/ml分別為67.8％和96.8％。
本發(fā)明的應(yīng)用前景與已有技術(shù)相比，本發(fā)明開(kāi)拓了植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)防治的新途徑，它不僅擴(kuò)大了線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)高效低毒生物農(nóng)藥的范圍，而且減少了由于以往大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染以及線蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)對(duì)化學(xué)藥劑的抗性，有利于環(huán)境的保護(hù)和減少農(nóng)產(chǎn)品上農(nóng)藥的殘毒，是一種全新的動(dòng)植物病蟲(chóng)害的防治方案件。
一般情況下，防治寄生在植物的線蟲(chóng)比較困難，特別是對(duì)于根結(jié)線蟲(chóng)這樣的刺吸性線蟲(chóng)尤其如此。實(shí)施本發(fā)明除了直接毒殺植物、動(dòng)物寄生蟲(chóng)外，還可將殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，使殺蟲(chóng)晶體蛋白得以表達(dá)，從而開(kāi)發(fā)出一種具有重要應(yīng)用前景的防治線蟲(chóng)的方法。
此外，鑒于蘇云金芽胞桿菌的殺蟲(chóng)晶體蛋白具有較高的殺蟲(chóng)特異性，對(duì)人畜安全無(wú)毒，本發(fā)明可提供殺動(dòng)物寄生蟲(chóng)的蛋白，用于防治動(dòng)物寄生蟲(chóng)。
權(quán)利要求
1.一種殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的菌株，其特征在于，所述的菌株為YBT-1532(一種蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis CCTCC，NO.M94068，保藏日期1994年11月4日，它包括a.鞭毛抗原血清型為H10；b.該菌株產(chǎn)生菱形伴胞晶體；c.組成伴胞晶體的殺蟲(chóng)晶體蛋白分子量為130kDa；d.該殺蟲(chóng)晶體蛋白的N-末端氨基酸序列為Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1532(一種蘇云金芽胞桿菌，CCTCC No.M94068，保藏日期1994年11月4日)，其特征在于所述的殺蟲(chóng)晶體蛋白具有a.對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有毒殺作用；b.對(duì)動(dòng)物寄生蟲(chóng)有毒殺作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物殺蟲(chóng)農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種殺植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌高毒力菌株的選育。本發(fā)明的特征是,分離到一株對(duì)植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)有毒的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT－1532,其鞭毛抗原血清型為H10,產(chǎn)生菱形伴胞晶體,組成伴胞晶體的殺蟲(chóng)晶體蛋白分子量為130kDa,該蛋白對(duì)植物線蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)有毒殺作用。與已有技術(shù)相比,本發(fā)明的菌株及其殺蟲(chóng)晶體蛋白具有毒力高,特異性強(qiáng)等突出優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1345928SQ0011606
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月30日
發(fā)明者孫明, 喻子牛, 姚寶安, 王乾蘭, 趙俊龍, 劉子鐸, 劉斌 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)