專利名稱：重組枯激酶的生產方法及其生物活性的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。涉及生產重組枯激酶的方法，具體地說是建立一整套工程菌(PBV-NK/JM109)的發酵，從培養的發酵液中分離純化分泌的枯激酶的層析純化方法，以及培養熱誘導后，收集包涵體，溶解包涵體的變性、復性和純化蛋白質的方法及所獲得純化枯激酶的產品。
現有的天然枯激酶，最初是由日本學者須見洋行從納豆中分離的枯草桿菌(BacillusSubtilis)的發酵物中鑒定出的。它具有很強的纖溶活性和激活內皮細胞產生內源t-PA的功能。近年日本大力開發納豆食品作為保健食品，預防和治療血栓性疾病。但由于自然菌產生的枯激酶量少，發酵時間長，難以應用于大規模生產。
本發明的目的是，通過在天然枯激酶基礎上，以獲得工程菌株，產生重組枯激酶，解決由于自然菌產生枯激酶量少，發酵時間長，難以用于生產的問題。
實現本發明的具體技術措施是首先篩選分離出枯激酶菌種，在此條件下克隆枯激酶基因，測序，構建高效表達枯激酶的工程菌株，以獲得高表達工程菌株，并建立重組枯激酶的生產方法，經提取純化，活性檢測確定。其生產工藝方法包括工程菌種的發酵，飽和硫酸銨沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，用CM-纖維素CM-52進一步純化目的的蛋白。用PEG-10000濃縮目的蛋白，Sephadex G-100柱層析純化目的蛋白等步驟。
1.工程菌種及發酵，重組PBV-NK/JM109為本中心構建，從4℃保存的菌種平皿中，挑取單菌落接種在5mlLB培養液試管中，含Amp抗菌素100μg/ml，30℃培養，180轉/分鐘，振蕩培養18小時。按1∶50接種在200mlLB培養液/1000ml三角瓶中，氨芐為100μg/ml。30℃，150轉/分鐘，培養24小時后，離心，6000轉/分鐘，20分鐘，收集上清液，電泳檢測目的蛋白在發酵液中的含量。
2.飽和硫酸銨沉淀目的蛋白以60％飽和硫酸銨沉淀枯激酶。在0℃條件下，稱取硫酸銨，經粉碎后，緩慢地加入到上清液中，邊加邊攪拌，待全部加完后，在同樣條件，繼續攪拌2小時，4℃冰箱過夜，離心，6000rpm，20分鐘，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4，10mM磷酸緩沖液溶解沉淀物。
3.目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析上述溶解的沉淀物，在4℃對蒸餾水1200ml透析，3-4小時換水1次，透析24小時以上，所得透析液，再對10MmPBS(PH7.4)透析過夜，此時獲得的透析液，供層析分離用。
4.用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，由于目的蛋白在PH7.4時帶有正電荷，菌體蛋白為負電荷，因此，經過柱后，雜蛋白與DE-52發生離子交換而留在柱上，而目的蛋白流出，從而使大部分雜蛋白和色素被除去，獲得初步分離的枯激酶，樣品中目的蛋白濃度近50％。目的蛋白在DE-52柱層析時，保留在第2峰后部和整個第2個峰留份中。如圖2、圖4所示。從6000ml培養液得20-30mg目的蛋白。
5.用CM-纖維素CM-52進一步純化目的蛋白如圖3、圖4所示，用CM-52柱層析純化目的蛋白的層析曲線。
將DE-52分離的有活性餾份合并后，調PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，靜態交換吸附樣品，至少在4小時以上，然后抽濾收集CM-52，并用2-5倍體積的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，裝在層析柱中(0.0cm×100cm)，連接蛋白質檢測儀，280mM，繼續用PBS淋洗，在儀器基線走直后，改梯度洗脫，用0M與1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集樣品后，測定活性，并電泳檢測組分，合并單一目的蛋白餾份，轉入SephadexG-100柱純化。
6.用PEG-10000濃縮目的蛋白在CM-52柱梯度洗脫時，枯激酶在0.15-0.2MNaCl濃度時被洗下，收集后，用PEG濃縮為5ml左右，過SephadexG-100柱除鹽和進一步純化。
7.SephadexG-100柱層析純化目的蛋白SephadexG-100柱(0.8cm100cm)，經10mMPBS(PH7.4)平衡后，將5ml濃縮的CM-52柱樣品，緩慢加入，樣品進入膠后，加入10mMPBS(PH7.4)。開始洗脫。紫外280mμ檢測，收集峰餾份，洗脫峰呈對稱狀，所得活性餾份電泳檢測為單一條帶的枯激酶。為最終產品。
本發明是在天然枯激酶基礎上，獲得的工程菌株，產生的重組枯激酶，其優點在于用E.coli培養時間短，產酶量大，便于提取、純化，可工業化生產。
本發明所提供的附圖是
圖1，為本發明的工藝流程圖2，DE-52和柱層析純化曲線圖3，CM-52純化層析純化曲線圖4，DE-52(A)和CM-52(B)層析樣品SDS電泳5，Sephadex G-100純化蛋白電泳6，重組枯激酶包涵體的SDS-PAGE電泳7，洗滌包涵體的變性電泳8，純化枯激酶的SDS-PAGE電泳及電泳掃描圖9，體外纖溶結果
圖10，純化枯激酶的活性測定結果
圖11，純化枯激酶的HPLC
圖12，體外溶解血塊結果本發明結合實施例1、2對附圖進一步說明。
實施例1一，本實施例的技術要點1.細菌發酵為低密度高表達。
2.包涵體變性劑為尿素。
3.包涵體復性后，柱層析純化，兩步，DE-52柱和CM-52柱。
二、實驗操作步驟(
圖1)1.工程菌株，重組PBV-NK/E.coliJM109，為本中心構建。從4℃保存的工程菌平皿上挑取單菌落接種在5mlLB培養液管中(含氨芐青霉素100μg/ml)30℃，180轉/分鐘，振蕩培養16-18小時后，按2∶50接種于搖瓶中(含氨芐青霉素100μg/ml)，30℃，180轉/分鐘，振蕩培養16小時作為種子液。
2.發酵，按2∶50將種子液接入于200mlLB/1000ml三角瓶中(含氨芐表霉素100μg/ml)PH7.2，30℃，180轉/分，振蕩4-5小時，待菌密度達到OD600為0.3-0.4時，迅速升溫至42℃，誘導表達4-5小時，離心收集菌體，6000轉/分，20分鐘，電泳檢查目的蛋白表達量。濕菌體為5-7g/升。見圖6。
3.菌體的裂解離心收集菌體，棄去上清，稱菌體重量，按1∶10加入20mM/L PBS PH7.4洗菌體1次。離心后，仍按1∶10將菌體懸浮于緩沖液A中(緩沖液A50mM/L Tris HCL PH8.0 0.5mM/LEDTA，50mM/L Nacl，5％甘油，0.5mM/LDTT)，在超聲波細胞破碎儀上，超聲30分鐘，顯微鏡下檢查，破碎率在95％以上。向超聲液中加脫氧膽酸(DOC)達終濃度0.2％，混勻后，室溫放置10分鐘，4℃，12000轉/分，離心，15分鐘，棄去上清，沉淀稱重，即為包涵體。
4.包涵體的洗滌(1)以0.5％TritonX-100(用緩沖液A)配制，按1∶10重懸浮沉淀，(均勻，不得有顆粒)，室溫攪拌20分鐘，12000轉/分，20分鐘，棄上清，沉淀稱重。
(2)用2M/LNacl(緩沖液A配制)，1∶10洗滌包涵體，室溫攪拌1小時，12000轉/分，離心20分鐘，收集并稱重沉淀包涵體。
(3)用3M/L尿素(緩沖液A配制)洗滌包涵體室溫攪拌20分鐘，12000轉/分，離心20分鐘，棄上清收集沉淀包涵體，稱重。洗滌包涵體見圖7。
5.包涵體變性以8M/L尿素溶解變性包涵體。8M/L尿素(用緩沖液A配制)，按1∶5加入尿素溶液，37℃溶解2小時以上，12000轉/分，離心20分鐘，上清為包涵體變性液，應呈無色或微黃色溶液。
6.包涵體復性(1)2M/L尿素復性，包涵體變性液，測定其蛋白濃度，復性要將其濃度稀至100μg/ml蛋白時進行。2M/L尿素復性在4℃，過夜，復性液(用緩沖液A配制)應呈清，透明，無聚集現象，然后，對緩沖液A透析多次除去尿素。
(2)稀釋法復性。將變性液逐滴加入復性液中(100mM/L尿素的緩沖液A)，使蛋白質濃度達到0.1mg/ml，充分復性后，離心除去沉淀，超滬濃縮，透析除去尿素。
7.復性蛋白的柱層純化(1)用DEAE-Cellulose DE-52柱層析分離，將平衡好的DE-52裝入柱中(4×20cm)，以20mMPBS(PH7.4)平衡后，復性樣品調PH7.4，通過該柱，收集流出部，電泳檢查，將活性部分合并(見圖2、圖4A)。
(2)用CM-Cellulose CM-52柱純化。處理好的CM-52，稱取一定量，已經用20mMPBS PH6.5平衡的CM-52，加入到調PH6.5的上步活性餾份中，靜態交換，16小時以上。然后抽滬，保留上清，CM-52裝入柱中(0.8×60cm)，用平衡緩沖液洗去未交換或粘附的雜質，使檢測儀基線走直，改0-1.0M/LNaCl(用20mMPBS，PH6.5配)進行梯度洗脫，收集峰餾份，活性和電泳檢測，合并有活性，單一帶部分，為精制品(見圖3、圖4B)。
(3)用SephadexG-100層析純化，將CM-52活性餾份合并，PEG濃縮至10ml以下，過平衡好的SephadexG-100柱(0.8×60cm)，用同樣20mMPBS、PH7.4洗脫，出現單一對稱峰，為最終產品，合并凍干。結果見圖5及圖8，同時枯激酶的HPLC分析結果為單峰，純度在99％以上，見
圖11。
實施例2一、本實施例的技術要點1.重組枯激酶體外對纖維蛋白的溶解活性2.重組枯激酶體外對自然凝血塊的溶解作用二、實驗操作步驟1.體外對Agarose-纖維蛋白平板的溶圈活性，取Agarose(1％)溶液16.2ml，纖維蛋白原液16.2ml，凝血酶1.3ml，在45℃下，混勻后倒入到9cm×9cm×20cm的方盒中，室溫放置1小時后，將不同濃度的重組枯激酶10μl，點在平板表面，30分鐘后，放入到37℃，16-18小時，具有很大透明溶圈。表明重組枯激酶，體外對纖維蛋白的溶解作用。見圖9、
圖10。
2.體外溶解凝血塊的作用，抽取一定量的兔血，倒入平皿中，4℃凝血后，用PBS，PH7.4，洗滌后，分別稱取500mg，三塊，放在三個小燒杯中，然后加入①生理鹽水10ml，②含2mg重組枯激酶的10ml同樣溶液，③含2mg重組鏈激酶的10ml同樣溶液，37℃，振蕩30分鐘稱重1次，記錄血塊重量，連續3次即90分鐘，每次稱血塊重量記錄，結果如表1和
圖12所見。
表1枯激酶體外溶解血塊實驗結果
從表中結果可見，重組枯激酶具有很強的體外溶解血塊的功能。
總之，本發明公開了一種重組枯激酶的生產技術方法，包括工程菌的培養、誘導表達，包涵體的分離，洗滌，裂解變性，復性方法和蛋白質的純化工藝以及體外對纖維蛋白平板的血塊的溶解活性與活性測定。
本發明純化的產品可作為一種新的溶解血栓制劑，可以制成凍干粉供注射用，或制成片劑和膠囊供口服治療預防心腦血管栓塞疾病。
權利要求
1.一種重組枯激酶的生產方法包括工程菌種的發酵，飽和硫酸銨沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，用CM-纖維素CM-52進一步純化目的的蛋白。用PEG-10000濃縮目的蛋白，Sephadex G-100柱層析純化目的蛋白等步驟，其特征在于工程菌種及發酵，從4℃保存的菌種平皿中，挑取單菌落接種在5mlLB培養液試管中，含Amp抗菌素100μg/ml，30℃培養，180轉/分鐘，振蕩培養18小時。按1∶50接種在200mlLB培養液/1000ml三角瓶中，氨芐為100μg/ml。30℃，150轉/分鐘，培養24小時后，離心，6000轉/分鐘，20分鐘，收集上清液，電泳檢測目的蛋白在發酵液中的含量。
2.根據權利要求1所述的一種重組枯激酶的生產方法，其特征在于飽和硫酸銨沉淀目的蛋白。即以60％飽和硫酸銨沉淀枯激酶。在0℃條件下，稱取硫酸銨，經粉碎后，緩慢地加入到上清液中，邊加邊攪拌，待全部加完后，在同樣條件，繼續攪拌2小時，4℃冰箱過夜，離心，6000rpm，20分鐘，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4，10mM磷酸緩沖液溶解沉淀物。
3.根據權利要求1、2所述的一種重組枯激酶的生產工藝，其特征在于目的蛋白硫酸銨沉淀物的透析，是將溶解的沉淀物，在4℃對蒸餾水1200ml透析，3-4小時換水1次，透析24小時以上，所得透析液，再對10MmPBS(PH7.4)透析過夜，此時獲得的透析液，供層析分離用。
4.根據權利要求1所述的一種重組枯激酶的生產工藝，其特征在于用DEAE-纖維素DE-52柱層析分離目的蛋白，選擇目的蛋白在PH7.4時帶有正電荷，菌體蛋白為負電荷時，經過柱后，雜蛋白與DE-52發生離子交換而留在柱上，而目的蛋白流出，從而使大部分雜蛋白和色素被除去，獲得初步分離的枯激酶，此時目的蛋白濃度近50％。目的蛋白在DE-52柱層析時，保留在第2峰后部和整個第2個峰留份中。
5.根據權利要求1、4所述的一種重組枯激酶的生產工藝，其特征在于用CM-纖維素CM-52進一步純化目的蛋白。即將DE-52分離的有活性餾份合并后，調PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，靜態交換吸附，至少在4小時以上，然后抽濾收集CM-52，并用2-5倍體積的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，裝在層析柱中(0.0cm×100cm)，連接蛋白質檢測儀，280mM，繼續用PBS淋洗，在儀器基線走直后，改梯度洗脫，用0M與1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集目的蛋白，測定活性，并電泳檢測組分，合并單一目的蛋白餾份，轉入SephadexG-100柱純化。
6.根據權利要求1、5所述的一種重組枯激酶的生產工藝，其特征在于用PEG-10000濃縮目的蛋白。即在CM-52柱梯度洗脫時，枯激酶在0.15-0.2MNaCl濃度時被洗下，收集后，用PEG濃縮為5ml左右，過SephadexG-100柱除鹽和進一步純化。
7.根據權利要求1、6所述的一種重組枯激酶的生產工藝，其特征在于SephadexG-100柱層析純化目的蛋白。即SephadexG-100柱(0.8cm100cm)，經10mMPBS(PH7.4)平衡后，將5ml濃縮的CM-52柱樣品，緩慢加入，樣品進入膠后，加入10mMPBS(PH7.4)。開始洗脫。紫外280mμ檢測，收集峰餾份，洗脫峰呈對稱狀，所得活性餾份電泳檢測為單一條帶的枯激酶。
全文摘要
重組枯激酶的生產方法及其生物活性,本發明屬于生物工程技術,其主要解決自然菌產生枯激酶量少、發酵時間長,難以用于生產等問題。在自行篩選的Batillus Subtilis發酵產生枯激酶的基礎,克隆出該酶基因,建立了一整套基因工程菌發酵,誘導表達,包涵體分離,洗滌,裂解,變性,復性和蛋白質純化工藝,獲得重組枯激酶純品,其體外具有溶解纖維蛋白和凝結血塊能力,體內有促進內皮細胞產生t－PA縮短優球蛋白溶解時間,及強的纖溶酶樣活性。表明重組枯激酶可能作為新一代基因工程溶栓藥物。
文檔編號C12N15/52GK1336432SQ0011592
公開日2002年2月20日 申請日期2000年7月31日 優先權日2000年7月31日
發明者王春生, 楊志興, 吳晶, 林元通, 程漢強, 許文娟 申請人:武漢迪普生物技術有限公司