核酸擴增基因芯片雜交檢測儀的制作方法

專利名稱：核酸擴增基因芯片雜交檢測儀的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物芯片檢測儀器，尤其為一種核酸擴增基因芯片雜交檢測儀。
PCR技術主要是作為一種選擇性體外基因擴增方法，由于在經25～35輪循環后就可使DNA擴增106倍，多年來在科研和醫學檢驗中得到廣泛的應用。但由于PCR存在假陽性等缺陷，自98年6月起已被國家衛生部禁止用于臨床診斷。其主要原因是PCR過程中諸多實驗條件(引物的設計與選擇，材料配比，反應時間，溫度，循環周期)等造成的不穩定因素導致產生PCR的錯誤擴增。其二是，PCR過程的后續電泳檢測方法可判斷是不是得到特定長度的片段，而無法確定其具體序列。其三，PCR反應與檢測是兩個分立的過程，操作繁瑣且增加了污染的機會。因此，對于檢測條件和設備有限的中、小醫院，PCR的檢測的準確性受到了很大的影響。此外，當前PCR擴增過程對于操作人員的技術水平和素質有很高的要求。
生物芯片主要是指通過平面微細加工技術及超分子自組裝技術，在固體芯片表面構建的微分析單元和系統。生物芯片可把許多不同功能器件集成在一起，例如，生物樣品的預處理，遺傳物質的提取，特定基因片段的擴增，生物探針陣列以及毛細管電泳形成整體的微流體系統，以實現對化合物、蛋白質、核酸、細胞以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的篩選或檢測。基因芯片是最重要的一類生物芯片，它集成了大量的密集排列的基因探針，能夠在短時間內分析大量的基因，使人們可迅速地讀取和分析生命的程序。
生物芯片在生物檢測、醫學檢驗、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義。例如在生物學中，隨著分子生物學的不斷發展，特別是舉世矚目的人類基因組計劃實施以來，有關核酸、蛋白質序列和結構的數據呈指數增長。而下世紀最富挑戰性的工作就是人類基因織計劃完成后，即在后基因時代，我們如何運用大量的生物分子信息服務于人類社會，并使醫學、治療產生根本革命。在醫學中，“系統、器官、組織、細胞層次上的第二階段醫學”正在向“基因水平上的，DNA→RNA→蛋白質→蛋白質與核酸相互作用，以及它們與環境相互作用水平上的第三階段醫學”轉化。這種在分子層次上進行的基因診斷與基因治療，將根本地認識疾病產生的根源，并將有希望根本認識和治療包括癌癥在內的重大疾病。這些生物學、醫學的根本變革，一個根本的前提是基因序列的測定和分析。能否有效快速地進行基因測序與分析，將影響到人類基因組計劃的實施，從而影響生物學、醫學的進一步發展。傳統基因測序所采用的方法包括化學反應、凝膠電泳法等一系列繁雜的步驟，這些方法花費時間較長，且操作繁復，尤其在大規模測序方面費時、并且不適宜便攜化快速測序。在對傳統基因測序方法進行改進的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術應運而生。生物芯片技術是將生命科學研究中所涉及的許多不連續的分析過程，如樣品制備，化學反應和分析檢測等通過采用微電子，微機械等工藝集成到芯片中，使之連續化，集成化，微型化和自動化。這一技術的成熟和應用將在下世紀的疾病診斷和治療、新藥開發、司法鑒定、食品和環境等生命科學相關領域帶來一場革命，為生物信息的獲取及分析提供強有力的手段。
生物芯片(基因芯片)近年來一直是國際上的一個研究熱點，并正以驚人的速度向前發展。國際上已經有多家公司進入生物芯片領域，研究出把PCR與DNA陣列集成的生物芯片。這些系統通常在芯片上制備出一個PCR微反應池，通過控制微反應的溫度循環，進行基因擴增，接著將擴增后的基因引入雜交池中，與固相微陣列探針雜交，進行檢測。Affymetrix公司則把PCR微反應池進一步制成微流體通道。盡管已有將PCR技術芯片檢測合為一體的報導，但其特點是整個PGR過程在一個微反應池中進行。因而需對器件的同一部位反復地升溫、降溫，這將無法對PCR結合進行動態跟蹤和定量分析。而且目前升溫、降溫需一定時間，延長了工作時間。
本發明的目的是針對目前PCR檢測方法存在不足之處，提供一種核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，該儀器是基于PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片技術提出一種新型的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，它是集PCR過程、雜交過程、清洗過程、檢測過程于一體的自動檢測儀器，功能用于快速地進行PCR反應，同時自動定點檢測并自動給出檢測的結果。
為實現上述目的，本發明所及核酸擴增基因芯片雜交檢測儀是采用以下方案實現的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，是將PCR技術與基因微陣列探針技術，檢測技術等集成一起，構成新型的PCR檢測診斷儀器。本發明核酸擴增基因芯片雜交檢測儀是由機殼、機架、檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置、計算機及外圍設備組成，檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置安裝在機架上，電纜把上述各裝置電控、傳感輸入輸出接口與計算機的輸入輸出接口相連接，機殼固定在機架上，芯片固定在傳送裝置上，清洗管道與芯片的管道相連。
該技術方案中，所述的檢測裝置包括檢測傳動機構和檢測部件，檢測傳動機構安裝在機架上，該機構由包括X、Y、Z三個方向的運動部件及相應的定位機構所構成，三維運動部件中的X向步進電機與X向導軌安裝在垂直的機架上，X向滾珠絲杠通過固定在機架上的軸承支撐，X向步進電機與X向滾珠絲杠相連；Y向導軌安裝在X向平臺上，Y向滾珠絲杠通過固定在X向平臺上的Y向軸承支撐，Y向步進電機與Y向滾珠絲杠相連；Z向步進電機固定在Y向平臺上，同時，Z向導軌固定在Y向平臺上，X向絲桿帶動X向平臺運動，Y向絲桿帶動Y向平臺運動，Z向絲桿帶動Z向平臺運動，Z向滾珠絲桿通過固定在Y向軸承支撐；定位機構包括X、Y、Z三個方向的限位開關，X向限位開關安裝在機架上，Y向限位開關安裝在X向平臺上，Z向限位開關安裝在Y向平臺上；檢測部件固定在檢測傳動機構的Z向平臺上，該檢測部件可以是CCD或光學顯微鏡或光纖檢測頭。此外，檢測傳動機構的另一種結構形式是由Z方向運動部件及相應的限位開關所構成，Z方向運動部件通過絲桿或齒條與垂直的機架相連接，限位開關安裝在機架上，檢測部件固定在Z方向運動部件上，該檢測部件可以是CCD或光學顯微鏡或光纖檢測頭，被檢測芯片固定在傳送裝置上，實現三維傳動。
該技術方案中，所述的傳送裝置由步進電機、絲桿、導軌、X、Y二維驅動平臺、定位機構構成，X向步進電機和X向導軌安裝在機架上，X向滾珠絲桿通過固定在機架上的軸承與X向驅動平臺相連，Y向步進電機與Y向滾珠絲桿相連，芯片固定在Y向平臺上；定位機構包括X、Y兩個方向的限位開關，X向限位開關安裝在機架上，Y向限位開關安裝在X向平臺上。
該技術方案中，所述的溫控裝置包括加熱部件，熱空氣風扇，冷氣風機，風道，溫控傳感器，熱空氣風扇和芯片分別位于加熱部件的兩側，冷風風機位于風道的兩端。在熱空氣風扇、加熱部件與芯片之間設置若干個伸入風道中且長度、角度可調整的調節桿。
該技術方案中，清洗裝置包括有氣源、氣道、清洗液容器、壓力傳感器、電磁控制閥、集液容器，氣道連通氣源與清洗液容器，氣道還連通在清洗容器與被清洗芯片以及被清洗芯片與集液容器之間。
該技術方案中，所述的計算機內安裝有A/D卡，溫控硬件線路板，圖形卡、主板、多功能卡、D/A卡，計算機輸入輸出設備包括顯示器，鍵盤，鼠標和打印機。本發明所述檢測儀的工作過程大致如下PCR芯片安裝在傳送裝置上，通過步進電機驅動送入溫控區，溫度控制按照設定的溫控模式控制PCR過程的退火、擴增、延伸過程，在PCR循環過程完成后，溫控過程按設定的溫度進行雜交過程控溫，從而完成雜交過程。在雜交過程完成后，清洗裝置接收清洗指令對芯片進行清洗，清洗后的芯片由傳送裝置送入檢測區，進行檢測。檢測過程，芯片和檢測傳送裝置聯動，完成對芯片的定點自動檢測，檢測的結果通過專門的計算機進行識別。在檢測過程中，檢測裝置的位置信號，PCR芯片中反應點的位置信號，由傳感器(限位開關、CCD檢測部件)輸出到后面板接線槽并連接到計算機系統。通過機內A/D卡，將模擬信號轉換為數字信號，計算各信號的值，位置信號經過D/A轉換和后面板接線槽控制X、Y、Z向步進電機和氣缸驅動電機，從而可以定位獲得定點處的熒光信號。反應過程中的熒光信號由傳感器(光纖檢測部件)經過輸入、輸出口進計算機圖形卡，經過圖象處理獲得反應過程中的特征熒光譜線，從而定量確定PCR的結果，并由打印機打印。PCR溫度傳感信號經過電纜與計算機相連，經過硬件控制電路或軟件控制，計算機將溫控信號通過電纜輸出到PCR溫控裝置的熱風扇、冷風風機、加熱部件，控制各個溫區的恒定溫度。氣源通過氣路把清洗液壓到芯片上，把芯片上的非雜交物清洗。溫控裝置中，當風機和熱源一啟動，通過風場調節裝置使芯片加熱，而溫控裝置中上方的兩個風機同時啟動時，冷卻風傳送過來，使芯片降溫，從而達到溫控的目的。這種方式實現溫控，升降溫度可達到20℃/s。獨特的風場調節裝置的使用，使芯片加熱過程中自動產生激波諧振，加熱速度增大，提高了PCR的反應速度。
本發明所給出核酸擴增基因芯片雜交檢測儀的優點是，既可簡化操作步驟，縮短PCR時間，提高效率，又可將反應體系與外界進行嚴密有效的隔離，PCR擴增、探針雜交洗脫、熒光比色、檢測分析過程集于一體，不需進行電泳分析，而是直接由CCD和微機分析并給出檢測結果。由于探針雜交具有特色性，因而可排除電泳無法排除假陽性缺陷。更主要的是PCR循環中的變性、退火、延伸與微陣列探針芯片構成一個整體，變性、退火、延伸、雜交溫度分別控制，從而避免反復升溫、降溫過程以及由于溫控誤差帶來的影響，同時在生物芯片制造思想的指導下，在一個生物芯片上可以進行多種樣品的檢測。亦可以追蹤PCR每個循環的效率，進行動態定量分析。同時，由于系統采用自動控制，所以芯片更換、加樣、溫控CCD數采、分析、打印自動進行，減少測試工作強度，提高了分析的準確性，同時減少環境污染。


圖1本發明檢測儀系統組成示意圖。
圖2本發明檢測儀實施例內部結構示意圖。
圖3本發明檢測儀溫控裝置風場調節圖。
圖4本發明檢測儀清洗裝置示意圖。
圖5本發明檢測儀定位機構示意圖。
下面結合附圖介紹本發明的一個實施例。
本實施例具體結構如附圖2所示，圖2中，1是溫控裝置、2是加熱部件、3是芯片、4是風扇、5是檢測頭、6是液體容器、7是檢測傳動機構、8是控制部件即計算機、9是計算機外設、10是機架。
溫控裝置具體結構如附圖3所示，圖3中，11是溫控裝置的外殼，12是冷風風機，13是熱風風機、14是風場調節器(該風場調節器是由設置在加熱部件與芯片之間的若干個伸入風道中的、且伸入長度可調整的調節桿構成)、15是置于芯片中的溫度傳感器、16也是溫度傳感器、17是冷風風機。
本實例清洗裝置結構如附圖4所示，圖4中，18是氣源、19是清洗液、3是芯片、5是集液裝置、20是壓力表和21是氣路或氣道。
本實例中各可移動裝置的傳動、定位機構的具體結構如附圖5所示，圖5中，22是固定平臺，23是絲杠、24是限位開關(傳感器)、25是連接部件和26是驅動部件。
本實施例由PCR空氣加熱恒溫裝置、PCR傳送裝置、PCR芯片檢測裝置、以及儀器自檢報警裝置、清洗裝置、計算機及其外圍設備共同構成一個結構緊湊的檢測儀。
溫控裝置包括有加熱熱源(220V,1000VA～1500VA)，熱風風機，冷氣風機，風道，高靈敏度、小離散度的溫度傳感器，溫度控制的軟件等。溫控方式主要是傳感器15、16檢測溫區的溫度與設定的溫度比較，溫控軟件控制移相可控硅和風機系統的通斷。風機系統的通斷由開關電平控制，高電平為開，低電平為關。移相可控硅通過調節可控硅導通角獲得。溫控的精度要求在PCR加熱后，空氣溫度控制在±0.2℃,PCR芯片內部(標記傳感器)溫度控制精度±0.1℃。溫控溫度場在整個溫度區溫差±0.2℃。另外，該溫控裝置還具有報警、自檢功能，能同時按照給定的溫控曲線進行溫控。溫控的過程中，傳感器15、16檢測溫區的溫度然后按給定的溫控曲線控制加熱熱源2、風機系統12、13、17的動作，以獲得精確的溫度控制。溫控軟件系統同時能進行溫控時間、溫控方式、溫控使用者等日志的管理。使用者能自動設定溫控的模式、溫控的曲線，同時使用者在溫控過程中可以適時監控溫控的過程和中斷、暫停溫控過程及修改溫控曲線。溫控使用者只能對自己的溫控參數進行修改，無權修改他人的參數和數據。
檢測裝置包括檢測頭，三維精密傳動機構，數據采集系統，分析系統，封閉黑箱等組成。檢測頭主要由CCD系統或熒光顯微鏡系統LM1組成，檢測頭5在三維精密平臺的驅動下對雜交后的信號進行熒光檢測，同時給出分析的結果。三維精密傳動機構，實現檢測頭的三維空間運動，同時運動精度要求x方向±0.1mm,y方向±0.05mm,z方向±0.01mm，同時重復定位精度，x方向±0.2mm,y方向±0.05mm,z方向±0.01mm。三維精密傳動機構帶有三個方向的位置傳感器和伺服電機，適時顯示檢測位置相對于設計原點的坐標，傳感器的信號通過RS232與外部通信。數據采集系統主要是將熒光顯微鏡的信號數字化，同時分析系統進行分析；三維定位系統在軟件控制下能精確迅速地定位到需檢測的位置。在軟件運行的過程中，能適時顯示檢測的位置和進度，同時對檢測到的信號進行標記，并顯示和記錄檢測到的信號點的位置坐標。檢測結果自動按需要的格式進行記錄。
PCR芯片的傳送裝置由X、Y二維驅動平臺、驅動機構、定位機構構成，X向驅動平臺設置于機架上，Y向驅動平臺則設置于X向驅動平臺上，驅動機構分別與兩平臺連接，定位機構包括X、Y兩個方向的限位開關，X向限位開關安裝在機架上，Y向限位開關安裝在X向平臺上。該傳送裝置其功能是將PCR芯片自動地從機外運送到PCR反應區和檢測區，包括夾持機構和定位機構，同時在加熱溫控區芯片的溶液限制在有效的溫控區。該傳送裝置包括步進電機和位置傳感器，位置傳感器給出到位信號后(開關量)控制步進電機的運動。在PCR芯片由機外到溫控區，自動夾持機構完成對芯片的自動密封。
PCR芯片清洗裝置，其功能是在PCR反應完畢后，自動進行清洗工作。該裝置包括液壓泵和電磁控制閥、壓力傳感器。或者采用空氣(氣體)閥進行控制，在接受到反應完畢信息后，開啟清洗泵和電磁閥，對反應區進行清洗、回收。清洗控制軟件能設定清洗壓力和清洗時間，同時能進行手動的自動工作的切換。在自動工作狀態下，系統適時顯示各管道的壓力曲線和自動調整清洗壓力和時間。并給出報警信號。電磁閥的控制由開關量控制，高電平為開，低電平為關。
儀器、自檢報警裝置，打開電源后，儀器自檢，各種傳送、定位控制、加熱、風扇機是否正常，如不正確則報警。同時在工作過程中，各種控制參數越過閥值，或者各種定位位置不準時，發生報警指令顯示。
PCR雜交過程為，當PCR溫控結束后，在溫控區芯片停留一定時間，同時控制閥不停進行通斷控制溶液在芯片管內的震蕩，利于雜交的完成。
本實例通過專門編制的計算機應用軟件來實現該檢測儀運送、PCR溫控、清洗、檢測等過程的自動控制，即按照設定的制備程序進行運送、PCR溫控、清洗、檢測。
權利要求
1.一種核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于它由機殼、機架、檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置、計算機及外圍設備組成，檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置安裝在機架上，電纜把上述各裝置電控、傳感輸入輸出接口與計算機的輸入輸出接口相連接，機殼固定在機架上，芯片固定在傳送裝置上，清洗管道貌岸然與芯片的管道相連。
2.根據權利要求1所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于檢測裝置包括檢測傳動機構和檢測部件，檢測傳動機構安裝在機架上，該機構由包括X、Y、Z三個方向的運動部件及相應的定位機構所構成，三維運動部件中的X向步進電機與X向導軌安裝在垂直的機架上，X向滾珠絲杠通過固定在機架上的軸承支撐，X向步進電機與X向滾珠絲杠相連Y向導軌安裝在X向平臺上，Y向滾珠絲杠通過固定在X向平臺上的Y向軸承支撐，Y向步進電機與Y向滾珠絲杠相連；Z向步進電機固定在Y向平臺上，同時，Z向導軌固定在Y向平臺上，X向絲桿帶動X向平臺運動，Y向絲桿帶動Y向平臺運動，Z向絲桿帶動Z向平臺運動，Z向滾珠絲桿通過固定在Y向軸承支撐；定位機構包括X、Y、Z三個方向的限位開關，X向限位開關安裝在機架上，Y向限位開關安裝在X向平臺上，Z向限位開關安裝在Y向平臺上；檢測部件固定在檢測傳動機構的Z向平臺上，該檢測部件可以是CCD或光學顯微鏡或光纖檢測頭。
3.根據權利要求2所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于檢測傳動機構由Z方向運動部件及相應的限位開關所構成，Z方向運動部件通過絲桿或齒條與垂直的機架相連接，限位開關安裝在機架上，檢測部件固定在Z方向運動部件上，該檢測部件可以是CCD或光學顯微鏡或光纖檢測頭，被檢測芯片固定在傳送裝置上，實現三維傳動。
4.根據權利要求1所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于傳送裝置由步進電機、絲桿、導軌、X、Y二維驅動平臺、定位機構構成，X向步進電機和X向導軌安裝在機架上，X向滾珠絲桿通過固定在機架上的軸承與X向驅動平臺相連，Y向步進電機與Y向滾珠絲桿相連，芯片固定在Y向平臺上；定位機構包括X、Y兩個方向的限位開關，X向限位開關安裝在機架上，Y向限位開關安裝在X向平臺上。
5.根據權利要求1所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于溫控裝置包括加熱部件，熱空氣風扇，冷氣風機，風道，溫控傳感器，熱空氣風扇和芯片分別位于加熱部件的兩側，冷風風機位于風道兩端。
6.根據權利要求5所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于所述的溫控裝置，在熱空氣風扇、加熱部件與芯片之間設置若干個伸入風道中，且長度、角度可調整的調節桿。
7.根據權利要求1所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于清洗裝置包括有氣源、氣道、清洗液容器、壓力傳感器、電磁控制閥、集液容器，氣道連通氣源與清洗液容器，氣道還連通在清洗容器與被清洗芯片以及被清洗芯片與集液容器之間。
8.根據權利要求1所述的核酸擴增基因芯片雜交檢測儀，其特征在于計算機內安裝有A/D卡，溫控硬件線路板，圖形卡、主板、多功能卡、D/A卡，計算機輸入輸出設備包括顯示器，鍵盤，鼠標和打印機。
全文摘要
本發明提供一種核酸擴增基因芯片雜交檢測儀,它由機殼、機架、檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置、計算機及外圍設備組成,檢測裝置、傳送裝置、溫控裝置、清洗裝置安裝在機架上,電纜把上述各裝置電控、傳感輸入輸出接口與計算機的輸入輸出接口相連接,機殼固定在機架上,芯片固定在傳送裝置上,清洗管道貌岸然與芯片的管道相連。該檢測儀既可簡化操作步驟,縮短PCR時間,提高效率,又可將反應體系與外界進行嚴密有效的隔離,PCR擴增、探針雜交洗脫、熒光比色、檢測分析過程集于一體,不需進行電泳分析,而是直接由CCD和微機分析并給出檢測結果。
文檔編號C12Q1/68GK1321890SQ00112248
公開日2001年11月14日 申請日期2000年4月30日 優先權日2000年4月30日
發明者趙雨杰, 朱紀軍, 劉全俊, 陸祖宏, 何農躍 申請人:南京益來基因醫學有限公司